Summary
Konformasjonelle fleksibilitet spiller en kritisk rolle i proteinfunksjon. Heri, beskriver vi bruken av tidsoppløst elektrosprayionisering massespektrometri koplet til hydrogen-deuterium-utveksling for sondering de hurtige strukturelle endringer som driver funksjon i bestilt og uordnede proteiner.
Abstract
Egen uordnede proteiner (revet) har lenge vært en utfordring for å strukturelle biologer på grunn av deres mangel på stabile sekundære strukturelementer. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) målt ved hurtige tidsskalaer er unikt tilpasset for å detektere strukturer og hydrogenbindings nettverk som er kort bygde, slik at for karakterisering av transiente konformerer i native ensembler. Kobling av HDX massespektrometri gir flere viktige fordeler, blant annet høy sensitivitet, lav prøven forbruk og ingen begrensning på proteinstørrelse. Denne teknikken har avansert kraftig i de siste tiårene, inkludert muligheten til å overvåke HDX merking ganger på millisekund tidsskalaen. I tillegg, ved å inkorporere den HDX arbeidsflyten på et mikrofluidplattformen rommer en sur protease-mikroreaktor, er vi i stand til å lokalisere dynamiske egenskaper ved peptidet nivå. I denne studien, tidsoppløst elektrospray-ionisering Massespektrometri (Tresi-MS) som er koplet til HDX was brukes til å gi et detaljert bilde av gjenværende struktur i tau-protein, så vel som konformasjonelle endringer indusert ved hyperfosforylering.
Introduction
I løpet av de siste tiårene, har betydelige fremskritt er gjort i utviklingen av analytiske teknikker utformet for å måle proteinstruktur og dynamikk 1, 2, 3, 4. Mens Røntgenkrystallografi forblir prinsippet verktøy for bestemmelse av proteinstruktur, blir høye konsentrasjoner av protein nødvendig, og omfattende optimalisering er nødvendig for å produsere diffraksjon kvalitet krystaller. Proteiner som er vanskelig å krystallisere, slik som membranbundne og egen uordnede proteiner er klassisk blitt studert ved hjelp av hydrogen-deuterium-utveksling (HDX) NMR 5. Men i de siste tiårene, kobling av elektrospray-ionisering massespektrometri (ESI-MS) for å HDX har raskt vunnet popularitet 6, 7.
Massespektrometri tilbyr en løsningtil mange av de begrensninger som følger av røntgenkrystallografi og NMR. Spesielt er svært følsom MS (nM til pM nødvendige konsentrasjoner), og det er praktisk talt ingen begrensning på proteinstørrelse. I tillegg er den høye driftssyklus av MS-analyse åpner for muligheten av å studere proteiner som de gjennomgår enzymatisk omsetning, misfolding, kompleksdannelse og andre biologisk relevante prosesser. Disse prosessene ofte forekommer på den andre millisekund til tidsskalaen og krever hurtig blanding av reagenser før analyse.
Utviklingen av Time-Løst elektrospray-ionisering (Tresi) av Wilson og Konermann i 2003 tillatt reaksjoner som skal overvåkes i pseudo-sanntid ved ESI-MS. Oppsettet deres innlemmet et kapillar-blander med en trinnløst innstillbar reaksjonskammer volum 8. Anordningen består av to konsentriske kapillærer, med den indre kapillær forseglet og et hakk skåret i dens side til å tillate blanding innenfor det smale inter-kapillærtey plass fra innsnittet til den ende av den indre kapillær (typisk 2 mm). Når det anvendes på HDX eksperimenter, vil det indre kapillarrør bærer for proteinet av interesse, bærer den ytre kapillarrør merkingen D2O løsning, som deretter underkastes blanding med proteinet før inntreden i regulerbar reaksjonskammeret slik at for HDX merking forut for direkte overføring til ESI kilde.
I korthet er avhengig HDX på ryggraden amid-hydrogener som gjennomgår utveksling med deuterium-atomer i oppløsning 9, 10. Utvekslingen er basekatalysert ved fysiologisk pH, sammen med syre-katalyse blir fremherskende ved pH under omkring 2,6. Kursen som er basert på fire hovedfaktorer: pH, temperatur, oppløsningsmiddel tilgjengelighet og intramolekylær hydrogenbinding. Som de tidligere to faktorer holdes konstant gjennom hele forsøket, frekvensen av utveksling, særlig ved peptidryggraden amid-posisjoner, er i første rekke dependent på proteinstruktur 11. Tett foldet regioner med omfattende og stabile hydrogenbindingsnettverk i a-helikser og p-ark vil ta opp deuterium ved vesentlig lavere priser i forhold til løkker og uordnede regioner (og noen ganger ikke i det hele tatt) 12. Dette gjør det mulig for global proteinanalyse, hvor forstyrrelsene i struktur (f.eks., Ved aggregering eller substratbindende) føre til ulik deuterium-opptaket (figur 1).
Den kinetiske kapillære blanderen kan bli inkorporert i et mikrofluidplattformen som inneholder et proteolytisk kammer for lokalisering av deuterium-opptak. Dette proteolytiske kammeret opprettholdes ved lav pH for effektivt å stanse utvekslingsreaksjon, og krever en immobilisert sur protease for å fordøye protein inn i lokaliserte peptider (figur 2). Overvåking ryggrad utveksling på millisekund til andre tidsskalaer er spesielt viktig forKarakteriseringen av konformasjonelle endringer innen vanskelige å karakterisere sløyfeområdene tilgjengelige, smeltet globuler, og egen uordnede proteiner (revet) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX også benyttes for å karakterisere proteiner som for øyeblikket ikke har et løst atomstrukturen gjennom metoder for røntgen-krystallografi og NMR, ved hjelp av deuterium utveksling koblet til Corex algoritme (DX-Corex) tilnærming 15, 16. Denne detaljert protokoll skal gjelde Tresi-HDX å studere tau, en IDP, både i det opprinnelige form, så vel som det er sykdomsfremkallende hyperfosforylisert tilstand. Mens nativt tau er en av de mest studerte fordrevne, er lite kjent om dets amyloidogen motstykke 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Dampene som frembringes av laserfjerning av poly (metylmetakrylat) (PMMA) kan være giftig. Vær sikker på at laser gravør er koblet til en fungerende ventilasjonssystem. Bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved bygging av microfluidic enhet inkludert bruk av tekniske kontroller (avtrekkshette, beholder for spisse gjenstander) og personlig verneutstyr (vernebriller, ansiktsmaske, hansker, frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko). Det er av største viktighet å bruke High Performance Liquid Chromatography (HPLC) klasse reagenser når det er mulig, med alle er av ACS-kvalitet eller høyere for å redusere forstyrrende forurensninger i løpet av analysen.
1. Fremstilling av den mikrofluidenhets
- Byggingen av PMMA microfluidic Platform
- Oppnå en standard PMMA-blokk (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) og laser-avsmelte en inngangskanal for innføring av reagensene, en Proteolysekammeret, og en utgangskanal ved hjelp av en laser gravør 17, 18.
MERK: Etch proteolyse kammeret i en langstrakt oval form (30 x 5 x 0,05 mm). Inngangs- og utgangskanalen må strekke seg til enden av PMMA blokken og ikke være større enn 75 mikrometer i både bredde og dybde for å romme en 30 ga kapillær. - Skjær en 30 ga rustfritt stål, metall kapillær i to stykker på ca. 10 cm hver ved hjelp av et roterende verktøy med en 1/64" tykk cut-off-plate. Bruk sandpapir for å jevne ut endene av kapillærene (dette kan gjøres lettere ved betraktning under en lysmikroskop).
- Smelt kapillærene inn i det etsede poly (metylmetakrylat) blokk ved hjelp av en loddebolt. Inngangskanalen vil bli koblet til automatiske sprøytepumper, og utgangskanalen vil bli brukt for å koble inn i MS.
- Oppnå en standard PMMA-blokk (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) og laser-avsmelte en inngangskanal for innføring av reagensene, en Proteolysekammeret, og en utgangskanal ved hjelp av en laser gravør 17, 18.
- Byggingen av Continuous Flow Time-Løst Kinetic Mixer
- Skaff en smeltetsilika glasskapillar (ID: 75 um, ytterdiameter: 150 pm) på ca. 40 cm, og sette den inn i en 28 ga rustfritt stål, metall kapillær på ca. 15 cm. Avhengig av reaksjonstiden som kreves, bruke en lengre ytre metallkapillært eller en med en større ID.
MERK: Bestemmelse av den 'sanne' indre diameter av metall kapillær er kritisk for å oppnå nøyaktige reaksjonstider. Dette kan gjøres ved å feste metallet til en kapillær HPLC, flytende oppløsningsmiddel selv om den kapillære, og registrering av mottrykk. Et mottrykk til beregning indre diameter kan gjøres, og den virkelige indre diameter av metall kapillær bestemt. Dette kan beregnes ved hjelp av molekylvekt kalkulator programvare (for Windows versjon 6.49). - Dannelse av et 2 mm hakk ved hjelp av laveffektlaser gravør innstillinger på den ene ende av den indre kapillarrør av glass og forsegle denne ende av den indre glasskapillar (figur 2). Alternativt, få hakket ved hjelp av en keramisk glass kapillærtey kutter verktøy eller en roterende kvern med et fint skjæreblad.
- Linje opp det indre kapillarrør av glass med enden av metall kapillær (dette kan gjøres lettere ved betraktning under et lysmikroskop).
- Fest denne kinetiske blanderen til en ende av blande-T (figur 2).
- Fest et smeltet kisel glasskapillar (ID: 75 um, ytterdiameter: 150 pm) på ca. 40 cm til den motsatte enden av den kinetiske blanderen på den blande-T. Dette brukes til å levere syre (5% eddiksyre, pH 2,4) for å stanse reaksjonen.
MERK: Reaktanter blir tilført til enheten med gasstette sprøyter gjennom polytetrafluoretylen (PTFE) røret ved å benytte automatiserte infusjonspumper.
- Skaff en smeltetsilika glasskapillar (ID: 75 um, ytterdiameter: 150 pm) på ca. 40 cm, og sette den inn i en 28 ga rustfritt stål, metall kapillær på ca. 15 cm. Avhengig av reaksjonstiden som kreves, bruke en lengre ytre metallkapillært eller en med en større ID.
- pepsin Activation
- Vei ut 20 mg pepsin fra mageslimhinne fra svin og suspendere den i 1 ml koblingsbuffer (0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
- Vei opp 50 mg N-hydroksysuccinimid (NHS) -aktiverte agarosekuler, legge til re-suspended protease og rotere forsiktig over natten ved 4 ° C.
- Spinne ned ved 1000 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å samle harpiksen.
- Aspirere ubundet protease.
- Inkuber agarose i 1 ml blokkeringsbuffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) og forsiktig rotere ved romtemperatur i 1 time.
- Spinne ned ved 1000 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å samle harpiksen.
- Aspirer blokkeringsbufferen.
- Inkuber pepsin-agarose med 1 ml av 5% eddiksyre, pH 2,4 i 5 min.
- Spinne ned ved 1000 x g i 2 min for å samle harpiksen.
- Aspirer supernatanten.
- Gjenta trinn 1.3.8 - 1.3.10 for totalt tre vasker.
- Oppbevar perler i 1 ml eddiksyre ved 4 ° C for langvarig bruk.
- enhets~~POS=TRUNC Assembly
- Fyll proteolyse kammeret med oppslemmingen av aktiverte pepsin-agaroseperler i 5% eddiksyre ved hjelp av en steril spatel.
- Plasser PMMA microfluidic plattform;m mellom to tomme PMMA-blokker som et deksel for å forsegle enheten, foret med silikongummi for å danne en væsketett forsegling.
- Bruk metallisk klemplatene til trykk-tetning av enheten.
MERK: Klemmen ble skreddersydd for å passe til mikrofluidplattformen og er sammensatt av to plater som måler 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Strømnings 5% eddiksyre, pH 2,4 ved en hastighet på 10 pl / min. Strømnings 50 mM ammoniumacetat buffer (pH 6,9) skjønt proteinet linje med en hastighet på 1 mL / min.
Merk: Det er svært viktig at eddiksyren kontinuerlig strømmer gjennom innretningen gjennom helheten av eksperimentet. Sikre at det ikke er noen lekkasjer, og at fluid som kommer ut bare fra utgangskanalen, som vil tjene som en ESI-kilde. - Kople enheten til den fremre enden av en modifisert kvadropol time-of-flight (Q-TOF) massespektrometer ved å bruke en justerbar isolert trinn for å oppnå optimale elektrospray forhold.
MERK: En bypass switchinnføres for å simulere nærværet av en kommersiell ESI-kilde. 17
2. Tid-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling
- Oppkjøp av Pepsin og Protein Bare Spectra
MERK: ESI-MS anskaffelse utføres i positiv ionemodus med en spenning på 4500-5000, 60-V declustering potensial, og 250-V fokuseringspotensial. Spektra blir samlet inn over et område på 350-1,500 m / z med en skannehastighet på 1 s -1.- Erverve et pepsin bare spektrum. Noen topper som fremkommer i dette spekteret subtraheres når proteinet blir tilsatt.
- Innføre 50-100 uM tau / fosfo-tau-protein (rense og forberede som tidligere beskrevet 13, 19) med en hastighet på 1 mL / min, hvor 50 mM ammoniumacetatbuffer ble tidligere strømmer.
- Erverve et protein bare spektrum.
- oppkjøp of tidspunkter
- Mens 100 uM tau / fosfo-tau-protein strømmer med 1 pl / min, innføre D2O med en hastighet på 3 mL / min via en tee-kontakt og tillates å reagere i den kinetiske blanderen. Tillate systemet å komme i likevekt i minst 10 minutter før kjøp av spekteret.
MERK: Etter utvekslingen blir merkingsreaksjonen avbrutt ved strømningen av eddiksyre pH 2,4 ved 10 pl / min og spalting av det merkede protein forekommer i den proteolytiske kammeret. - For å øke den merkingstid manuelt å trekke tilbake den stilling av det indre kapillarrør av glass for å oppnå blandetider på 42 ms til 8 sek. Tillate systemet å komme i likevekt i minst 10 minutter mellom hver pull-tilbake.
- Mens 100 uM tau / fosfo-tau-protein strømmer med 1 pl / min, innføre D2O med en hastighet på 3 mL / min via en tee-kontakt og tillates å reagere i den kinetiske blanderen. Tillate systemet å komme i likevekt i minst 10 minutter før kjøp av spekteret.
3. data og statistiske analyser
- Identifisere Peptider og Beregne Andel Deuterium Veksling
- Utfør MS spektra-analyser ved hjelp mMass programvare, versjon 5.5.0 20
- Identifisere peptider ved hjelp av ExPASy FindPept proteomikk server og bekrefte ved kollisjonsfri dissosiasjon (CID) når det kreves 21.
MERK: Her deuterium opptak inkorporeringen ble målt ved hjelp av en egenutviklet FORTRAN programvare for isotop fordelingsanalyse 22, 23. - Beregn de teoretiske indre satser basert på primærsekvensen ved anvendelse av tjeneste-nettverktøyet 22, 24.
- Passe dataene ved bruk av enkelt eksponentiell ikke-lineær regresjon, og normalisere ved hjelp av en grafisk og statistisk programvare (f.eks, Sigmaplot).
MERK: Forholdet mellom k int / kobs gir den Protection Factor (PF), en semi-kvantitativt mål på den grad at en bestemt region er strukturert i den konformasjonelle ensemblet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordøyelse profiler av nativt og fosfo-tau var like, noe som gir en sekvens dekning på 77,1 og 71,7% respektivt. Deuterium opptak verdier av hvert peptid ble bestemt ved å tilpasse de observerte isotopiske fordelinger med de teoretiske fordelingene som genereres ved hjelp av en egenutviklet FORTRAN programvare. De best tilpassede fordelinger er vist (figur 3a) sammen med de tilhørende deuterium-opptaksverdier. Opptakskinetiske profiler blir så generert, og ble godt beskrevet av enkle eksponensielle uttrykk. Kinetiske profiler for alle peptidene som ble observert ved 3 eller flere merke ganger (n = 3) ble analysert. Disse enkelt sielle tilpasninger til de observerte verdiene opptaks dannelse av kursen konstanten kobs for hvert peptid. Dette er sammenlignet med den primære sekvensavhengig "tilfeldig spiral" indre hastighetskonstanten k int. Den beregnede PF (k int / k </ em> obs) ved 1,52 s kartlegges mot representative strukturer av nativt og hyperfosforylert Tau (figur 4).
Som forventet ble ingen PFS observert i området som normalt er forbundet med sekundærstrukturelementer som bekrefter at nativt tau oppviser svak indre hydrogenbinding. Signifikant beskyttelse observeres ved den N- og C-termini, det sentrale domenet, og aggregeringen ble utsatt heksapeptider (I og II) områder (figur 4). Etter 1,52 s, er 90% av proteinet deuterium, med full utveksling forekommer på under 2 min.
Den native protein kan sammenlignes med en endret tilstand, i dette tilfelle den amyloidogene hyperfosforylert tilstand, hvor vi observere en generell økning i deuterium-opptaket på tvers av proteinet. Det er en signifikant økning i den N- og C-termini, og i den H2-regionen. Den generelle økning i opptak støtter cjeldende hypotese at hyperfosforylering forårsaker at proteinet til å innta en utvidet struktur. Av de to hexapeptider, viser H2 den største økning i deuterium-opptak, fra å være en av de mest sterkt beskyttede regioner i nativ tilstand til nesten ingen beskyttelse i den hyperfosforylert tilstand. Dette tyder på at eksponering av H2 domenet er avgjørende for amyloidogenesis. På den annen side har noen av de områder som oppviser en minskning i opptak omfatte områder som strekker seg over L114 til Q124, og G326 til S352. Det sistnevnte område tilsvarer mikrotubul-assosiert R3 og R4 regioner i gjentakelsesdomenet. Denne strekningen av nydannet gjenværende struktur harmonerer med tidligere studier som viser at hyperfosforylert Tau har en redusert affinitet for binding mikrotubuli-25. Den region som spenner over L114 til Q124 er identifisert i den native tilstand som har en betydelig tilbøyelighet for spiralformet struktur, og den minskning i opptak kan knyttes til en høyere prevalens av seco ndary struktur i hyperfosforylert tilstand.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av et protein som gjennomgår HDX før massespektrometrianalyse. Proteinet av interesse blir fortynnet i en oppløsning av deuteriumoksyd (D2O), slik at for labile hydrogener ryggrad til å utveksle med deuterium over tid. Sterkt dynamiske områder skal utveksle raskt, og må overvåkes på millisekund til andre tidsskalaen. Andre områder som inneholder mer stive sekundære strukturer skal utveksle mer langsomt. Utvekslingen Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av syre (pH 2,4), som også utfolder proteinet slik at for fordøyelse med en sur protease (f.eks, pepsin). Fordøyelse lokaliserer nivået av deuterium opptak på tvers av forskjellige områder av proteinet. mager "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Forsøks oppsett for Tresi-HDX-MS. En detaljert visning av den kinetiske mikseren vises nederst. Blanderen er sammensatt av to konsentriske kapillærer, en indre smeltet kisel glasskapillar inne i en ytre metall kapillar. Et spor er gjort 2 mm fra enden av den indre kapillar med en plugget ende, slik at for proteinet for å gå ut av hakket, og blande seg med den innkommende deuterium. Denne kinetiske blanderen er festet til en blande-T. På motsatt side av blanderen, blir en kanal som leverer 5% eddiksyre (pH 2,4) er festet. Etter stopping av reaksjonen, passerer den deutererte protein gjennom proteolyse skammer pakket med pepsin-agarosekuler for å produsere peptisk peptider. Den distale kapillær brukes som en ESI-kilde.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Typisk arbeidsflyt fra rådata til kinetisk tomter for utvalgte peptider fra det native og hyperfosforylert protein. (A) rå spektrum for fire peptider (kolonner) er montert på forutsagte isotop-fordelinger for å bestemme% av deuterium opptak ved tre forskjellige tidspunkter (rader). (B) Observert kinetiske plott av% deuterium opptaket som funksjon av tiden for hvert peptid (heltrukket linje) anvendes for å ekstrahere kobs. Kinetiske tomter for alle peptidene ble observert ved 3 eller flere merke ganger (n = 3), Feilstolpene representerer SE Den beregnede "tilfeldig spiral" profil (stiplet linje) er vist for sammenligning. Gjengitt fra Zhu et al. 8 med tillatelse.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. HDX beskyttelse faktordata tilordnet på representative strukturer av (a) opprinnelig full lengde tau og (b) hyperfosforylert Tau. Strukturen av hyperfosforylert Tau ble generert ved hjelp av FRODAN simulering med påfølgende raffinering ved hjelp av Vadar. Grad av beskyttelse faktorer er farget som en regnbue ordning som er vist i forklaringen (venstre). Gjengitt fra Zhu et al. 8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens strukturbiologiske metoder, slik som røntgen-krystallografi og NMR er fordelaktige fordi de gir ekstremt detaljerte strukturer av proteiner, disse bildene er ofte statisk. Karakteriseringen av forbigående art og svakt strukturerte domener fortsetter å være unnvikende når undersøkt ved hjelp av disse konvensjonelle metoder. Derfor, for å få dynamisk innsikt i denne typen systemer er det viktig å arbeide på raske tidsskalaer. Vi har med hell brukt Tresi-HDX-MS for å få detaljert innsikt i de konforme endringer som skjer i løpet av en godt studert IDP på et lokalisert peptid nivå. En av de viktigste begrensninger i denne teknikken er at pepsin er en uspesifikk protease og på egen hånd, produserer sjelden full sekvens dekning. En måte å forbedre sekvens dekning og spesifisitet er å kombinere protease typen XIII fra Aspergillus saitoi til stabiliseringskammeret 26.
Det er viktig atfordøyelsen kammeret holdes på en pH-verdi på 2,4 under hele forsøket for effektivt å stanse utvekslingsreaksjonen og redusere mengden av tilbake utveksling 11. Det er viktig at eventuelle proteolyseseter trinn og påfølgende analyse utføres så raskt som mulig. Tidligere studier har optimalisert størrelsen av fordøyelse kammeret og foreslåtte strømningshastigheter for å holde nivået av tilbake-utveksling til et ubetydelig nivå (≤5%) ved værelsestemperatur 22. Det anbefales at størrelsen av kammeret er større enn dimensjonene som er oppført i denne protokollen. En sterkt strukturert protein vil ikke ta opp betydelige nivåer av deuterium i millisekund til andre tidsskala, og vil være vanskelig å fordøye i den tid som tillates av proteolyse kammeret. Slike proteiner er ikke anbefalt for studier ved hjelp av denne teknikken.
Selv om vi anbefaler bruk av 50 mM ammoniumacetat buffer (pH 6,9) for than proteinprøve, vil ikke alle proteiner være forenlig med denne konsentrasjon eller pH-verdi. Det er viktig å merke seg pl for proteinet, og justere buffer følgelig å være minst 1 pH-enhet over eller under. Dette vil sikre at proteinet har den nødvendige overflateladningen er nødvendig for riktig folding og forhindre aggregering. Økning av konsentrasjonen av ammoniumacetat er anbefalt for aggregering er utsatt proteiner for å øke løseligheten, men konsentrasjoner over 500 mM skal unngås.
Tresi-HDX-MS passer best til systemer bestående av store sløyfeområdene tilgjengelige, smeltede globuler eller forbigående sekundærstrukturelementer 22. I tillegg er det ulike økonomiske fordeler med denne teknikken som det er enkelt og relativt billig å gjennomføre. Nylig har det vært en økning i bruken av HDX-MS i den farmasøytiske industri for medisiner og utvikling 27. Over de siste ti årenes Det har vært en rask vekst av biologiske makromolekyler, særlig monoklonale antistoffer (mAbs), ble godkjent av FDA. Sammenlignet med småmolekylære stoffer, høyere ordens strukturer av proteiner og deres konformasjonelle dynamikk spiller en stor rolle i bestemmelsen av legemidlets effekt. HDX-MS har med hell blitt brukt som en bekreftelse verktøy for produksjon av antistoffer biosimilar 28, samt karakteriseringen av antistoff-antigen-29, 30, 31, og protein-ligand-interaksjoner 32. Fremskritt innen programvareutvikling og automatisering av eksperimentene vil fremskynde analyse ganger åpner for ytterligere utvidelse av denne teknikken i nær fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
