Summary
flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.
Abstract
proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) têm sido um desafio para os biólogos estruturais devido à sua falta de elementos da estrutura secundária estável. Hidrogénio-deutério Exchange (HDX) medido em escalas de tempo rápidos é exclusivamente adequado para detectar estruturas e redes de ligação de hidrogénio que são rapidamente povoadas, permitindo a caracterização de confórmeros transientes em conjuntos nativas. Acoplamento de HDX para espectrometria de massa oferece diversas vantagens, incluindo alta sensibilidade, baixo consumo de amostra e sem restrição no tamanho da proteína. Esta técnica tem avançado muito nas últimas décadas, incluindo a capacidade de monitorar tempos de rotulagem HDX na escala de tempo de milissegundos. Além disso, por incorporação do fluxo de trabalho HDX para uma plataforma de microfluidos que aloja um microrreactor de protease ácida, que são capazes de localizar as propriedades dinâmicas ao nível péptido. Neste estudo,-tempo resolvido com ionização por electrospray Espectrometria de Massa (Tresi-MS) acoplado a HDX was usadas para fornecer uma imagem detalhada da estrutura residual na proteína tau, bem como as mudanças conformacionais induzidas mediante a hiperfosforilação.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram feitos no desenvolvimento de técnicas analíticas concebidas para medir a estrutura da proteína e da dinâmica 1, 2, 3, 4. Enquanto a cristalografia de raios-X permanece o princípio ferramenta para a determinação da estrutura de proteínas, altas concentrações de proteína são necessárias e optimização extensa é necessária para a produção de cristais de qualidade de difracção. As proteínas que são difíceis de cristalizar, tal como as proteínas associadas a membranas e intrinsecamente desordenados foram classicamente estudado por permuta hidrogénio-deutério (HDX) RMN 5. No entanto, nas últimas décadas, o acoplamento de espectrometria de massa por ionização por electropulverização (ESI-MS) para HDX foi rapidamente ganhou popularidade 6, 7.
espectrometria de massa oferece uma soluçãoa muitas das restrições impostas por cristalografia de raios X e RMN. Em particular, é altamente sensível MS (nM para as concentrações necessárias uM), e não há praticamente nenhum limite no tamanho da proteína. Além disso, o ciclo de alta de análise MS permite a possibilidade de estudar proteínas que se submetem a rotatividade enzimática, o enrolamento incorrecto, complexação e outros processos biologicamente relevantes. Estes processos muitas vezes ocorrem na milisegundo para a segunda escala de tempo e necessitam de uma rápida mistura dos reagentes antes da análise.
O desenvolvimento de resolvida no tempo com ionização por electrospray (Tresi) por Wilson e Konermann em 2003 reacções permitidos para ser monitorado em tempo real pelo pseudo-ESI-MS. A sua configuração incorporado um misturador capilar com um volume de câmara de reacção continuamente ajustável 8. O dispositivo consiste em dois capilares concêntricos, com o capilar interior selado e um entalhe cortado em seu lado para permitir a mistura no interior do estreito inter-capilary espaço do entalhe para a extremidade do capilar interna (tipicamente de 2 mm). Quando aplicada a experiências HDX, o capilar interior transporta a proteína de interesse, o capilar exterior leva a rotulagem D 2 O solução, que é então submetido a misturar com a proteína antes de entrar na câmara de reacção ajustável permitindo a etiquetagem HDX antes da transferência directa para o ESI fonte.
Resumidamente, HDX depende de hidrogénios de amida do esqueleto submetidos troca com átomos de deutério em solução de 9, 10. A troca é catalisada por base, a pH fisiológico, com ácido-catálise tornar-se predominante a um pH abaixo de aproximadamente 2,6. A taxa de conversão é baseada em quatro factores principais: pH, temperatura, solvente de acessibilidade e de ligação de hidrogénio intramolecular. À medida que os primeiros dois factores são mantidas constantes ao longo da experiência, a taxa de câmbio, particularmente nas posições amida esqueleto peptídico, é principalmente dependent na estrutura da proteína 11. Regiões com extensas, redes de ligação de hidrogénio estável em hices e folhas? Firmemente dobrado ocupará deutério a taxas substancialmente mais lentas em comparação com regiões de loops e desordenados (e, por vezes, não em todos) 12. Isto permite uma análise global de proteínas, em que as perturbações na estrutura (por exemplo., Mediante a ligação do substrato ou a agregação) conduzem a diferentes captação de deutério (Figura 1).
O misturador capilar cinética pode ser incorporada uma plataforma de microfluidos que contém uma câmara proteolítica para localização da absorção de deutério. Esta câmara proteolítica é realizada a um pH baixo, a fim de extinguir eficazmente a reacção de permuta, e requer uma protease ácida imobilizada, a fim de digerir a proteína em péptidos localizados (figura 2). Monitorando o Exchange backbone em milissegundo para escalas segunda vez é especialmente importante para ocaracterização de alterações conformacionais no difícil caracterizar regis de ansa, glóbulos fundidos, e proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) 13, 14. Alternativamente, Tresi-HDX também podem ser utilizados para caracterizar as proteínas que neste momento não têm uma estrutura atómica resolvido através dos métodos de cristalografia de raios-X e RMN, usando troca de deutério acoplado ao algoritmo Corex (DX-Corex) abordagem 15, 16. Este protocolo detalhado vai aplicar-Tresi HDX para estudar tau, um IDP, em ambos sua forma nativa, assim como o respectivo estado hiperfosforilado patogénico. Enquanto tau nativa é um dos DIs mais bem estudados, pouco se sabe sobre o seu homólogo amiloidog�ico 13.
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Protocol
NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Os fumos produzidos pela ablação a laser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pode ser tóxico. Certifique-se de que o gravador do laser está ligado a um sistema de ventilação funcionando. Use todas as práticas de segurança adequadas ao construir o dispositivo microfluídico incluindo o uso de controles de engenharia (exaustor, recipiente para objectos cortantes) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, máscara, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados). É de extrema importância de usar reagentes de grau Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), sempre que possível, com toda a ser de grau ACS ou superior para reduzir contaminantes interferentes durante a análise.
1. Preparação do Dispositivo de microfluidos
- Construção do Microfluidic Platform PMMA
- Se obter um bloco de PMMA corrente (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) e laser de ablação de um canal de entrada para a introdução dos reagentes, uma proteolise câmara, e um canal de saa usando um gravador a laser 17, 18.
NOTA: Etch a câmara de proteólise em uma forma oval alongada (30 x 5 x 0,05 milímetros). O canal de entrada e de saída deve estender-se para o fim do bloco de PMMA e não ser maior do que 75? M em largura e profundidade, de modo a acomodar um capilar de 30 ga. - Corte um capilar de aço inoxidável de metal 30 ga em dois pedaços de cerca de 10 cm cada, usando uma ferramenta rotativa com um disco de corte de espessura 1/64" . Use uma lixa para alisar as extremidades dos capilares (isto pode ser facilitado através da visualização sob microscópio óptico).
- Derreter os capilares para o poli gravado (metacrilato de metilo) bloco usando um ferro de soldar. O canal de entrada será ligada a bombas de seringa automatizada, e o canal de saída será usado para o acoplamento para a MS.
- Se obter um bloco de PMMA corrente (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) e laser de ablação de um canal de entrada para a introdução dos reagentes, uma proteolise câmara, e um canal de saa usando um gravador a laser 17, 18.
- Construção do Kinetic misturador contínuo-Flow Time-Resolvido
- Obter um fundidocapilar de vidro de sílica (ID: 75? m, OD: 150 um) de cerca de 40 cm, e inseri-lo em um capilar de aço inoxidável de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependendo do tempo de reacção necessário, utilizar um capilar de metal ou uma mais exterior com uma maior ID.
NOTA: A determinação do diâmetro 'verdadeiro' interior do tubo capilar metálico é crítico para a obtenção de tempos de reacção precisas. Isto pode ser feito ligando o capilar de metal para um HPLC, fluindo solvente embora o capilar, e a gravação a pressão de retorno. Uma contrapressão para cálculo diâmetro interior pode ser feita, e o diâmetro interior real do capilar de metal determinada. Isto pode ser calculado usando o software Molecular Weight Calculator (para Windows versão 6.49). - Produzir um entalhe 2 mm utilizando configurações do gravador laser de baixa potência em uma extremidade do capilar de vidro interior e selar esta extremidade do capilar de vidro interior (Figura 2). Como alternativa, faça o entalhe usando um capilar de vidro cerâmicaFerramenta de corte de y ou um moinho rotativo com uma lâmina de corte fino.
- Linha-se o capilar de vidro interior com a extremidade do capilar de metal (isto pode ser facilitado por observação sob um microscópio de luz).
- Anexar este misturador cinética a uma extremidade do T de mistura (Figura 2).
- Anexar um capilar de vidro de sílica fundida (ID: 75? M, OD: 150 um) de cerca de 40 cm para a extremidade oposta do misturador cinética no T de mistura. Esta é usada para fornecer ácido (ácido acético a 5%, pH 2,4) para extinguir a reacção.
NOTA: Os reagentes são fornecidos para o dispositivo com seringas de gás estanque a tubagem politetrafluoroetileno (PTFE), utilizando bombas de infusão automatizadas.
- Obter um fundidocapilar de vidro de sílica (ID: 75? m, OD: 150 um) de cerca de 40 cm, e inseri-lo em um capilar de aço inoxidável de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependendo do tempo de reacção necessário, utilizar um capilar de metal ou uma mais exterior com uma maior ID.
- Ativação pepsina
- Pesam-se 20 mg de pepsina a partir de mucosa gástrica porcina e suspendê-lo em 1 ml de tampão de acoplamento (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0).
- Pesam-se 50 mg de N-hidroxissuccinimida (NHS) de pérolas de agarose activadas, adicionar à re-sprotease uspended e girar suavemente durante a noite a 4 ° C.
- Girar a 1000 xg durante 2 min à temperatura ambiente para recolher a resina.
- Aspirar a protease não ligado.
- Incubar a agarose em 1 mL de tampão (1 M Tris-HCl, pH 6,0) de bloqueio e girar suavemente à temperatura ambiente durante 1 h.
- Girar a 1000 xg durante 2 min à temperatura ambiente para recolher a resina.
- Aspirar o tampão de bloqueio.
- Incubar a pepsina-agarose com ácido acético a 1 mL de 5%, pH 2,4 durante 5 min.
- Girar a 1000 xg durante 2 minutos para colectar a resina.
- Aspirar o sobrenadante.
- Repita os passos 1.3.8 - 1.3.10 para um total de três lavagens.
- Armazenar as pérolas em 1 ml de ácido acético a 4 ° C para uso a longo prazo.
- Assembléia dispositivo
- Encher a câmara de proteólise com a suspensão de pérolas de pepsina-agarose activadas em ácido acético a 5% usando uma espátula estéril.
- Coloque o Platfor microfluídico PMMAm entre dois blocos de PMMA em branco como uma tampa para selar o dispositivo, alinhado com borracha de silicone para criar uma vedação estanque aos líquidos.
- Utilizar placas de fixação metálico a pressão de selagem do dispositivo.
NOTA: O grampo foi feito à medida, a fim de se ajustar à plataforma de microfluidos e é composto de duas placas medindo 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Fluxo de 5% de ácido acético, pH 2,4, a uma taxa de 10 mL / min. Fluxo 50 mM de tampão de acetato de amónio (pH 6,9), embora a linha de proteína a uma taxa de 1 mL / min.
NOTA: É extremamente importante que o ácido acético é continuamente que flui através do dispositivo ao longo de todo o experimento. Certifique-se de que não existem fugas e que o fluido que está a sair apenas a partir do canal de saída, que vai servir como fonte de ESI. - Acoplar o dispositivo à extremidade dianteira de um (Q-TOF) espectrómetro de massa de quadrupolo modificado de tempo-de-voo usando uma fase de isolamento ajustável para alcançar as condições óptimas de electropulverização.
NOTA: A chave de bypassé introduzido, de modo a simular a presença de uma fonte de ESI comercial. 17
2. Troca de ionização electrospray hidrogênio-deutério resolvida no tempo
- Aquisição de pepsina e Proteína Só Spectra
NOTA: aquisição ESI-MS é realizada em modo de ião positivo com uma voltagem de 4500-5000, de 60 V potencial desagrupamento, e 250-V potencial de focagem. Os espectros foram adquiridos ao longo de um intervalo de 350-1,500 m / z com uma velocidade de varrimento de 1 s -1.- Adquirir uma única espectro pepsina. Quaisquer picos que aparecem neste espectro são subtraídas uma vez que a proteína é adicionada.
- Introduzir 50-100 uM tau / protea fosfo-tau (purificar e preparar como anteriormente descrito 13, 19) a uma taxa de 1 mL / min, onde o tampão de acetato de amónio 50 mM foi previamente fluir.
- Adquirir uma proteína única espectro.
- aquisição oPontos f Tempo
- Enquanto a proteína tau 100 M / fosfo-tau está fluindo a 1 mL / min, introduzir D 2 O a uma taxa de 3 mL / min através de um conector T e deixar reagir no misturador cinética. Permitir para o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 10 min antes da aquisição do espectro.
NOTA: Após a troca, a reacção de marcação é extinta pelo fluxo de pH ácido acético 2,4 a 10 uL / min e a digestão da proteína marcada ocorre na câmara proteolítica. - A fim de aumentar o tempo de rotulagem, puxar para trás manualmente a posição do capilar de vidro interior para alcançar tempos de mistura de 42 ms a 8 s. Permitir para o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 10 minutos entre cada impulsão traseira.
- Enquanto a proteína tau 100 M / fosfo-tau está fluindo a 1 mL / min, introduzir D 2 O a uma taxa de 3 mL / min através de um conector T e deixar reagir no misturador cinética. Permitir para o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 10 min antes da aquisição do espectro.
3. Dados e Análise Estatística
- Identificar Peptídeos e cálculo do percentual de deutério Exchange
- Realizar análises de MS espectros usando software mMass, versão 5.5.0 20
- Identificar péptidos que utilizam o servidor proteómica ExPASy FindPept e confirmar por dissociação induzida por colisão (CID) quando necessário 21.
NOTA: Aqui, incorporação captação de deutério foi medida utilizando um software Fortran in-house desenvolvido para análise da distribuição isotópica 22, 23. - Calcular as taxas intrínsecas teóricos baseados na sequência primária utilizando a ferramenta da web ESFERA 22, 24.
- Ajustar os dados utilizando regress exponencial única não-linear e normalizar utilizando uma representação gráfica e software estatístico (por exemplo, Sigma-Plot).
NOTA: O rácio de k int / kobs produz o factor de protecção (FP), uma medida semi-quantitativa do grau de que uma determinada região é estruturado dentro do conjunto conformacional.
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Representative Results
perfis de digestão de tau-fosfo nativa e foram semelhantes, dando origem a uma cobertura sequência de 77,1 e 71,7% respectivamente. valores de absorção de deutério de cada péptido foi determinada por ajustamento dos distribuições isotópicas observadas com as distribuições teóricas geradas usando um software Fortran desenvolvido internamente. Os melhores distribuições de montagem são mostrados (Figura 3a), juntamente com os valores de absorção de deutério associados. perfis cinéticos de absorção são então gerado, e foram bem descritas por expressões exponencial simples. perfis cinéticos para todos os péptidos observados em 3 ou mais vezes de rotulagem (n = 3) foram analisados. Estes ajustes individuais exponenciais aos valores de absorção observadas produzir a taxa de câmbio constante kobs para cada péptido. Isto é comparado com a sequência primária-dependente "helicoidal aleatia" taxa intrínseca constante k int. A PF calculada (k int / k </ em> obs) a 1,52 s é mapeado sobre estruturas representativas de tau hiperfosforilada e nativa (Figura 4).
Como esperado, não há FPs foram observadas na gama normalmente associado com os elementos de estrutura secundária e confirmação de que a tau nativo exibe fraca ligação hidrogénio interna. Protecção significativa é observada no extremo N e C-terminais, o domínio central e a agregação propensas (hexapéptidos I e II) regiões (Figura 4). Depois de 1,52 s, 90% da proteína é deuterado, com troca completa que ocorre em menos de 2 min.
A proteína nativa pode ser comparado a um estado alterado, neste caso, o estado hiperfosforilado amiloidogénico, onde se observa um aumento geral na absorção de deutério em toda a proteína. Há aumentos significativos no N- e C-terminais e na região de H2. O aumento geral na captação suporta a current hipótese de que a hiperfosforilação faz com que a proteína de adoptar uma estrutura estendida. Dos dois hexap�tidos, H2 mostra o maior aumento na captação de deutério, de ser uma das regiões mais bem protegidas no estado nativo para quase nenhuma proteção no estado hyperphosphorylated. Isto sugere que a exposição do domínio H2 é crucial para amiloidog�nese. Por outro lado, algumas das áreas que exibem uma diminuição na absorção incluem regiões que abrangem L114 para Q124, G326 e para S352. A última região corresponde a regiões associadas a microtúbulos R3 e R4 no domínio de repetição. Este troço de estrutura residual recém formada coincide com estudos anteriores demonstrando que a proteína tau hiperfosforilada possui uma afinidade diminuída para a ligação de microtúbulos 25. A região que atravessa L114 para Q124 é identificado no estado nativo como tendo uma propensão significativo para a estrutura helicoidal, e a diminuição na tomada pode ser atribuída a uma maior prevalência de seco estrutura Ndary no estado hiperfosforilado.
Figura 1. Representação esquemática de uma proteína a sofrer HDX antes da análise por espectrometria de massa. A proteína de interesse é diluída para uma solução de óxido de deutério (D 2 O), permitindo hidrogios do esqueleto lábil a troca de deutério com o passar do tempo. regiões altamente dinâmicos vão trocar rapidamente, e deve ser monitorada no milésimo de segundo para a segunda escala de tempo. Outras regiões contendo estruturas secundárias mais rígidas irão trocar mais lentamente. A reacção de permuta é terminada por desactivação com ácido (pH 2,4), que também se desenrola da proteína permitindo a digestão com uma protease ácida (por exemplo, pepsina). Digestão localiza o nível de absorção de deutério em diferentes áreas da proteína. lank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Montagem experimental para Tresi-HDX-MS. Uma vista detalhada do misturador cinética é mostrado na parte inferior. O misturador é composto por dois capilares concêntricos, um capilar de sílica fundida de vidro interior dentro de um capilar de metal externo. Um entalhe é feito 2 mm a partir da extremidade do capilar interno com uma extremidade ligada, permitindo uma proteína a sair do entalhe e misturar com o deutério de entrada. Este misturador cinética é ligado a um T de mistura. No lado oposto do misturador, um canal de fornecimento de 5% de ácido acético (pH 2,4) é anexado. A seguir à camuflagem da reacção, a proteína deuterado passa através da câmara de proteólise empacotada com esferas de agarose-pepsina a fim de produzir péptidos pépticas. O capilar distai é utilizado como fonte de ESI.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. típico fluxo de dados em bruto para parcelas cinéticos para os péptidos seleccionados a partir da proteína nativa e hiperfosforilado. (A) espectro cru por quatro péptidos (colunas) estão equipados para distribuições isotópica prevista para determinar a% de absorção de deutério em três momentos diferentes (linhas). (B) Observado parcelas cinéticas de absorção de deutério% em função do tempo para cada péptido (linha sólida) utilizado para extrair kobs. parcelas cinéticos para todos os péptidos foram observados a 3 ou mais vezes de rotulagem (n = 3), as barras de erro representam SE A calculado "helicoidal aleatia" perfil (linha a tracejado) é mostrado para comparação. Reproduzido de Zhu et al. 8 com permissão.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura dados do factor de protecção 4. HDX mapeado sobre estruturas representativas de (a) tau inteira nativo e (b) a tau hiperfosforilada. Estrutura de tau hiperfosforilada foi gerado utilizando simulação FRODAN com refinamento posterior usando Vadar. Grau de fatores de proteção são coloridos como um esquema do arco-íris, como mostrado na legenda (à esquerda). Reproduzido de Zhu et al. 8 com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Enquanto os métodos de biologia estrutural, tais como cristalografia de raios-X e RMN são vantajosos porque proporcionam estruturas extremamente detalhadas de proteínas, estas imagens são frequentemente estático. A caracterização das espécies transientes e domínios fracamente estruturados continua a ser elusiva quando estudados por estes métodos convencionais. Portanto, a fim de obter insights dinâmicos sobre estes tipos de sistemas é importante para trabalhar em escalas de tempo rápido. Temos aplicado com sucesso Tresi-HDX-MS para obter conhecimentos detalhados sobre as mudanças conformacionais que ocorrem dentro de um PDI bem estudado em um nível peptídico localizada. Uma das principais limitações para esta técnica é que a pepsina é uma protease inespecífica e, por si só, raramente produz cobertura sequência completa. Uma forma de ajudar a melhorar a cobertura da sequcia e especificidade é para combinar protease tipo XIII, a partir de Aspergillus saitoi para a câmara de digestão 26.
É fundamental quea câmara de digestão é mantido a um pH de 2,4 durante a totalidade da experiência, a fim de extinguir eficazmente a reacção de permuta e reduzir a quantidade da parte de trás da bolsa 11. É imperativo que quaisquer medidas proteólise e posterior análise ser feito o mais rápido possível. Estudos anteriores optimizado o tamanho da câmara de digestão e sugeriu taxas de fluxo, a fim de manter o nível da parte de trás da bolsa para níveis insignificantes (≤5%) à temperatura ambiente, 22. Recomenda-se fortemente que o tamanho da câmara não é maior do que as dimensões listadas neste protocolo. Uma proteína altamente estruturada não irá tomar-se níveis significativos de deutério no milisegundo para a segunda escala de tempo e irá ser difícil de digerir no tempo permitido pela câmara de proteólise. Tais proteínas não são recomendados para estudo utilizando esta técnica.
Embora não seja recomendável a utilização de tampão de 50 mM de acetato de amónio (pH 6,9) para o tele amostra de proteína, nem todas as proteínas irão ser compatível com esta concentração ou valor pH. É importante notar o pi da proteína, e ajustar o tampão de acordo com pelo menos uma unidade de pH acima ou abaixo. Isto irá assegurar que a proteína tem a carga de superfície requerida, necessária para a dobragem adequada e evitar a agregação. O aumento da concentração de acetato de amónio é recomendado para proteas propensas à agregação, a fim de aumentar a solubilidade, no entanto, concentrações superiores a 500 mM é para ser evitado.
Tresi-HDX-MS é melhor aplicada a sistemas compostos de grandes regis de ansa, glóbulos fundidos, ou elementos da estrutura secundária transientes 22. Além disso, existem várias vantagens econômicas a esta técnica como é simples e relativamente barato de implementar. Recentemente, tem havido um aumento na utilização de HDX-MS na indústria farmacêutica para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos 27. Ao longo dos últimos dez anoss tem havido um rápido crescimento de macromoléculas biológicas, os anticorpos mais notavelmente monoclonais (mAbs), sendo aprovado pela FDA. Em comparação com fármacos de moléculas pequenas, estruturas de ordem mais elevada de proteínas e sua dinâmica conformacionais desempenhar um papel importante na determinação da eficácia da droga. HDX-MS tem sido utilizado com sucesso como uma ferramenta de confirmação para a produção de anticorpos biológicos similares 28, bem como a caracterização de anticorpo-antigénio 29, 30, 31, e as interacções proteína-ligando 32. Avanços no desenvolvimento de software e automação de experimentos irá acelerar os tempos de análise que permite uma maior expansão desta técnica no futuro próximo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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