Summary
Konforma flexibilitet spelar en avgörande roll i proteinfunktion. Häri beskriver vi användning av tidsupplöst elektrosprayjoniseringsmasspektrometri kopplad till väte-deuterium utbyte mot sondering de snabba strukturella förändringar som driver funktionen i ordnade och oordnade proteiner.
Abstract
Egen oordnade proteiner (IDP) har länge varit en utmaning att strukturella biologer på grund av deras brist på stabila sekundära strukturelement. Väte-Deuterium Exchange (HDX) mätt vid snabba tidsskalor är unikt anpassad att detektera strukturer och vätebindningsnätverk som kortfattat är befolkade, vilket möjliggör karaktäriseringen av transienta konformer i nativa ensembler. Koppling av HDX för masspektrometri erbjuder flera viktiga fördelar, inklusive hög känslighet, låg provförbrukning och ingen begränsning på proteinstorleken. Denna teknik har avancerat kraftigt under de senaste årtiondena, inklusive möjligheten att övervaka HDX märkning gånger på millisekundtidsskalan. Dessutom genom att införliva den HDX arbetsflöde på en mikrofluidisk plattform inrymmer en sur proteas mikroreaktor, har vi möjlighet att lokalisera dynamiska egenskaper vid peptidnivån. I denna studie, Time-Resolved elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (Tresi-MS) kopplad till HDX was som används för att ge en detaljerad bild av kvarvarande struktur i tau-protein, såväl som konforma skift inducerats vid hyperfosforylering.
Introduction
Under de senaste årtiondena, har betydande framsteg gjorts i utvecklingen av analytiska tekniker utformade för att mäta proteinstruktur och dynamik 1, 2, 3, 4. Medan röntgenkristallografi förblir principen verktyg för att bestämma proteinstrukturen, är höga koncentrationer av protein som behövs och omfattande optimering krävs för att producera diffraktion kvalitetskristaller. Proteiner som är svåra att kristallisera, såsom membran-associerade och tätt oordnade proteiner har klassiskt studerats av väte-deuterium utbyte (HDX) NMR 5. Emellertid, under de senaste decennierna, koppling av elektrosprayjonisering masspektrometri (ESI-MS) till HDX har snabbt vunnit popularitet 6, 7.
Masspektrometri erbjuder en lösningtill många av de begränsningar som orsakas av röntgenkristallografi och NMR. I synnerhet, är MS högkänslig (nM till pM koncentrationer som erfordras), och det finns praktiskt taget ingen gräns för proteinstorlek. Dessutom kan den höga arbetscykeln för MS-analys ger en möjlighet att studera proteiner som de undergår enzymatisk omsättning, felveckning, komplexbildning och andra biologiskt relevanta processer. Dessa processer förekommer ofta på millisekund till andra tidsskala och kräver snabb blandning av reagens före analys.
Utvecklingen av tidsupplöst elektrosprayjonisering (Tresi) av Wilson och KONER i 2003 tillåtna reaktioner övervakas i pseudo-realtid genom ESI-MS. Sina inställningar inkorporerade ett kapillär bländare med en kontinuerligt justerbar reaktionskammarvolymen 8. Anordningen består av två koncentriska kapillärer, med den inre kapillären förseglades och en skåra skuren i dess sida för att medge för blandning inom det smala inter capillary utrymme från skåran till änden av den inre kapillären (typiskt 2 mm). När det appliceras på HDX experiment, den inre kapillären bär proteinet av intresse, bär den yttre kapillären märknings D 2 O lösningen, som därefter genomgår blandning med proteinet före inträdet i justerbara reaktionskammaren medger HDX märkning före direkt överföring in i ESI källa.
I korthet, HDX förlitar sig på ryggrads amid väten som genomgår utbyte med deuteriumatomer i lösning 9, 10. Utbytet är baskatalyserad vid fysiologiskt pH, med syra-katalys blir förhärskande vid pH under ca 2,6. Hastigheten för utbytet är baserat på fyra huvudfaktorer: pH, temperatur, lösningsmedelstillgänglighets och intramolekylär vätebindning. Som de tidigare två faktorer hålls konstanta genom hela experimentet, graden av utbyte, i synnerhet vid peptid ryggraden amid positioner, är i första hand dependent på proteinstrukturen 11. Tätt vikta regioner med omfattande, stabila vätebindande nät i a-spiraler och p-ark kommer att ta upp deuterium vid väsentligt lägre hastigheter jämfört med öglor och oordnade områden (och ibland inte alls) 12. Detta medger för global proteinanalys, där störningar i strukturen (t ex., Vid aggregation eller substratbindning) leder till olika deuterium-upptag (Figur 1).
Den kinetiska kapillär biandaren kan införlivas i en mikrofluidisk plattform innehållande proteolytisk kammare för lokalisering av deuterium upptag. Denna proteolytiska kammaren hålls vid lågt pH för att effektivt släcka utbytesreaktionen, och kräver en immobiliserad syra proteas för att smälta proteinet in lokaliserade peptider (Figur 2). Övervakning utbyte ryggraden vid millisekund till andra tidsskalor är särskilt viktigt förkarakterisering av konformationsförändringar inom svåra att karakterisera ögleregioner, smälta globuler, och inneboende oordnade proteiner (IDP) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX också användas för att karaktärisera proteiner som för närvarande inte har en löst atomstruktur genom metoderna för röntgenkristallografi och NMR, med användning av deuterium utbyte kopplad till COREX algoritm (DX-COREX) tillvägagångssätt 15, 16. Denna detaljerade protokoll gäller Tresi-HDX att studera tau, en IDP, i både det ursprungliga form, liksom det är patogena hyperfosforylerat tillstånd. Även infödda tau är en av de mest studerade internflyktingar, lite är känt om dess amyloidogena motsvarighet 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Kontakta alla relevanta material säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Gaser som bildas av laserablation av poly (metylmetakrylat) (PMMA) kan vara giftiga. Var noga med att lasergravören är ansluten till ett fungerande ventilationssystem. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder när man bygger mikroflödessystem enhet inklusive användning av tekniska kontroller (dragskåp, avfallsbehållare) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, ansiktsmask, handskar, skyddsrock, full längd byxor, slutna tå skor). Det är av yttersta vikt att använda högupplösande vätskekromatografi (HPLC) grade reagens när så är möjligt, med alla är av ACS-kvalitet eller högre för att minska störande föroreningar under analys.
1. Framställning av mikrofluidanordningen
- Byggandet av PMMA mikroflödes Platform
- Erhålla en standard PMMA block (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) och laser-ablation en ingångskanal för att införa reagensen, en Proteolys kammaren, och en utgångskanal med användning av en lasergravören 17, 18.
OBS: Etsa proteolys kammaren i en långsträckt oval form (30 x 5 x 0,05 mm). Ingångs- och utgångskanal måste sträcka sig till slutet av PMMA blocket och inte vara större än 75 pm i både bredd och djup för att rymma en 30 ga kapillär. - Skära en 30 ga rostfri metall kapillär i två stycken av ca 10 cm vardera med användning av ett roterande verktyg med en tjock brytskivan 1/64" . Använd sandpapper för att jämna ändarna av kapillärerna (detta kan underlättas genom betraktande under ett ljusmikroskop).
- Smält kapillärerna in i etsade poly (metylmetakrylat) -block med hjälp av en lödkolv. Ingångskanalen kommer att anslutas till automatiserade sprutpumpar, och utgångskanalen kommer att användas för koppling till nämnda MS.
- Erhålla en standard PMMA block (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) och laser-ablation en ingångskanal för att införa reagensen, en Proteolys kammaren, och en utgångskanal med användning av en lasergravören 17, 18.
- Byggandet av kontinuerligt flöde tidsupplöst Kinetic Mixer
- Erhålla en kondenseradkiseldioxid glaskapillär (ID: 75 um, OD: 150 um) av ca 40 cm, och för in den i en 28 ga rostfri metall kapillär av ungefär 15 cm. Beroende på reaktionstiden som erfordras, använda en längre yttre metall kapillär eller en med en större ID.
OBS: Bestämning av 'sant' innerdiameter hos metall kapillären är kritisk för att erhålla noggranna reaktionstider. Detta kan göras genom att fästa metall kapillär till en HPLC, flytande lösningsmedel fastän kapillären, och registrering av mottryck. Ett mottryck till beräkning innerdiameter kan göras, och den sanna inre diametern hos metall kapillär bestämdes. Detta kan beräknas med hjälp av molekylvikten Calculator programvara (för Windows version 6,49). - Producera en 2 mm skåra med användning av låga gravörens inställningar för ström laser på ena änden av den inre glaskapillär och försegla denna ände av den inre glaskapillär (Figur 2). Alternativt gör skåran med hjälp av en glaskeramik capillary skärverktyg eller en roterande slipmaskin med en fin skärblad.
- Line-up inner glaskapillär med änden av metall kapillären (detta kan underlättas genom betraktande under ett ljusmikroskop).
- Bifoga denna kinetiska bländare till en ände av blandnings-T (fig 2).
- Bifoga en smält kiseldioxid glaskapillär (ID: 75 um, OD: 150 um) av ca 40 cm till den motsatta änden av den kinetiska blandaren på blandnings-T. Detta används för att leverera syra (5% ättiksyra, pH 2,4) för att släcka reaktionen.
OBS: Reaktanter tillföres till anordningen med gastäta sprutor genom polytetrafluoretylen (PTFE) slang med användning av automatiserade infusionspumpar.
- Erhålla en kondenseradkiseldioxid glaskapillär (ID: 75 um, OD: 150 um) av ca 40 cm, och för in den i en 28 ga rostfri metall kapillär av ungefär 15 cm. Beroende på reaktionstiden som erfordras, använda en längre yttre metall kapillär eller en med en större ID.
- pepsin Aktivering
- Väg upp 20 mg pepsin från porcin magslemhinna och suspendera den i en ml kopplingsbuffert (0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
- Väg upp 50 mg N-hydroxisuccinimid (NHS)-aktiverade agarospärlor, lägga till åter suspended proteas och rotera försiktigt över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera ner vid 1000 xg under 2 minuter vid rumstemperatur för att samla upp hartset.
- Aspirera obundna proteaset.
- Inkubera agaros i en ml blockeringsbuffert (1 M Tris-HCl, pH 6,0) och rotera försiktigt vid rumstemperatur under 1 h.
- Centrifugera ner vid 1000 xg under 2 minuter vid rumstemperatur för att samla upp hartset.
- Aspirera blockeringsbufferten.
- Inkubera pepsin-agaros med en ml av 5% ättiksyra, pH 2,4 under 5 min.
- Centrifugera ner vid 1000 xg under 2 minuter för att samla upp hartset.
- Aspirera supernatanten.
- Upprepa steg 1.3.8 - 1.3.10 för totalt tre tvättar.
- Lagra pärlorna i 1 ml ättiksyra vid 4 ° C under långtidsanvändning.
- Device Assembly
- Fylla proteolys kammaren med uppslamningen av aktiverade pepsin-agaroskulor i 5% ättiksyra med användning av en steril spatel.
- Placera PMMA mikroflödes platform mellan två tomma PMMA block som ett lock för att försegla enheten, fodrad med silikongummi för att skapa en vätsketät tätning.
- Använda metalliska klämplattorna för tryck-tätning anordningen.
OBS: Klämman var skräddarsydd för att passa mikroflödes plattformen och är sammansatt av två plattor med måtten 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Flöde 5% ättiksyra, pH 2,4 med en hastighet av 10 | il / min. Flöde 50 mM ammoniumacetat-buffert (pH 6,9), även om proteinet linjen vid en hastighet av 1 | il / min.
OBS: Det är mycket viktigt att ättiksyran kontinuerligt strömmar genom anordningen under hela helheten av experimentet. Säkerställa att det inte finns några läckor och att vätska utträder endast från utgångskanalen, vilket kommer att fungera som ESI-källa. - Par anordningen till den främre änden av en modifierad kvadrupol time-of-flight (Q-TOF) masspektrometer med användning av en justerbar isolerad skede för att uppnå optimala elektrospraybetingelser.
OBS! En förbikopplareinförs för att simulera närvaron av en kommersiell ESI-källa. 17
2. Tids löst elektrosprayjonisering Hydrogen-deuterium Exchange
- Förvärv av Pepsin och protein endast Spectra
OBS: ESI-MS absorption genomförs i positiv jon-läge med en spänning av 4500 till 5000, 60-V declustering potential, och 250-V fokuserings potential. Spektra förvärvas över ett område av 350-1,500 m / z med en avsökningshastighet av 1 s -1.- Skaffa en pepsin endast spektrum. Några toppar som uppträder i detta spektrum subtraheras när proteinet tillsättes.
- Införa 50-100 pM tau / fosfo-tau-protein (rena och förbereda som tidigare beskrivits 13, 19) med en hastighet av 1 | il / min där den 50 mM ammoniumacetatbuffert tidigare flyter.
- Förvärva ett protein endast spektrum.
- förvärv of Time Points
- Medan 100 pM tau / fosfo-tau-protein strömmar med en mikroliter / min, introducera D 2 O med en hastighet av 3 ul / min via en tee-kontakt och låt reagera i den kinetiska biandaren. Möjliggöra för systemet att jämvikt under minst 10 min före förvärvet av spektrumet.
OBS: Efter utbytet, är märkningsreaktionen stoppades genom flödet av ättiksyra pH 2,4 vid 10 ul / min och digerering av det märkta proteinet uppträder i den proteolytiska kammaren. - I syfte att öka den tid märkning, manuellt dra tillbaka positionen för den inre glaskapillär för att uppnå blandningstider av 42 ms till 8 s. Möjliggöra för systemet att jämvikt under minst 10 minuter mellan varje pull-back.
- Medan 100 pM tau / fosfo-tau-protein strömmar med en mikroliter / min, introducera D 2 O med en hastighet av 3 ul / min via en tee-kontakt och låt reagera i den kinetiska biandaren. Möjliggöra för systemet att jämvikt under minst 10 min före förvärvet av spektrumet.
3. Data och statistisk analys
- Identifiering av peptider och beräkning av det procenttal av deuterium Exchange
- Utför MS-spektra analyserar använder mMass programvara, version 5.5.0 20
- Identifiera peptider som använder ExPASy FindPept proteomic servern och bekräfta genom kollision inducerad dissociation (CID) när så krävs 21.
OBS: Här var deuterium upptag inkorporering mäts med hjälp av en egenutvecklad FORTRAN program för isotopfördelningsanalys 22, 23. - Beräkna de teoretiska inneboende avgifter baserade på den primära sekvensen med hjälp av SPHERE webbverktyget 22, 24.
- Passar data med användning av enkel exponentiell icke-linjär regression och normalisera med användning av ett diagram och statistisk mjukvara (t.ex., Sigmaplot).
OBS: Förhållandet k int / kobs ger skyddsfaktor (PF), en semi-kvantitativt mått på den grad att en särskild region är strukturerad inom konforma ensemble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppslutnings profiler av nativt och fosfo-tau var liknande, vilket ger en sekvenstäckning av 77,1 och 71,7% respektive. Deuterium upptagsvärdena för varje peptid bestämdes genom att passa de observerade isotopfördelningar med de teoretiska fördelningar som genereras med användning av en egenutvecklad FORTRAN program. Den bäst anpassade fördelningar visas (figur 3a) tillsammans med de tillhörande deuterium upptagningsvärden. Upptags kinetiska profiler genereras sedan, och var väl beskrivet av enkel exponentiella uttryck. Kinetiska profiler för alla peptider observerade vid 3 eller fler märknings gånger (n = 3) analyserades. Dessa ensamstående exponentiella lämpligast för de observerade upptagningsvärden gav utbytet hastighetskonstanten kobs för varje peptid. Detta jämförs med den primära-sekvensberoende "random coil" inneboende hastighetskonstant k int. Den beräknade PF (k int / k </ em> obs) vid 1,52 s avbildas på representativa strukturer av nativt och hyperfosforylerat tau (fig 4).
Som förväntat kunde inga PF observeras i det intervall som normalt förknippas med sekundärstrukturelement som bekräftar att nativt tau uppvisar svag intern vätebindning. Signifikant skydd observeras vid N och C-terminalerna, den centrala domänen och aggregering benägna (hexapeptider I och II) regioner (figur 4). Efter 1,52 s, är 90% av proteinet deutererad, med full utväxling som uppstår på under 2 min.
Det nativa proteinet kan jämföras med ett förändrat tillstånd, i detta fall den amyloidogeniska hyperfosforylerat tillstånd, där vi observerar en allmän ökning av deuterium upptagning tvärs proteinet. Det finns signifikanta ökningar vid N- och C-terminalerna och i H2-regionen. Den allmänna ökningen av upptag stöder cktuellt hypotesen att hyperfosforylering bringar proteinet att anta en utsträckt struktur. Av de två hexapeptider visar H2 den största ökningen av deuterium upptag, från att ha varit en av de mest skyddade områden i det nativa tillståndet till nästan inget skydd i hyperfosforylerat tillstånd. Detta tyder på att exponering av H2-domänen är avgörande för amyloidogenes. Å andra sidan, några av de områden som uppvisar en minskning i upptag omfattar områden som spänner L114 till Q124, och G326 till S352. Det senare området motsvarar de mikrotubulus-associerade R3 och R4 regioner i upprepningsdomän. Denna sträcka av nybildade reststruktur överensstämmer med tidigare studier som visar att hyperfosforylerat tau har en minskad affinitet för mikrotubuli-bindande 25. Den region som spänner över L114 till Q124 identifieras i det nativa tillståndet som att ha en signifikant benägenhet för helixstruktur, och minskningen i upptag kan tillskrivas en högre prevalens av seco ndary struktur i hyperfosforylerat tillstånd.
Figur 1. Schematisk avbildning av ett protein som genomgår HDX före masspektrometrianalys. Proteinet av intresse späds i en lösning av deuteriumoxid (D2O), vilket möjliggör labila väten ryggraden att utbyta med deuterium över tiden. Mycket dynamiska regioner kommer att utbyta snabbt och måste övervakas på millisekund till andra tidsskala. Andra regioner som innehåller mer rigida sekundärstrukturer kommer att utbyta långsammare. Utbytesreaktionen avslutas genom släckning med syra (pH 2,4), som också utvecklar sig det protein möjliggör spjälkning med ett surt proteas (t.ex. pepsin). Uppslutning lokaliserar nivån på deuterium upptaget mellan olika delar av proteinet. stripigt "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Experimentell set-up för Tresi-HDX-MS. En detaljerad vy av den kinetiska blandare visas längst ner. Biandaren består av två koncentriska kapillärer, ett inre sintrat kiselglas kapillär inuti ett yttre metall kapillär. En skåra görs 2 mm från änden av den inre kapillär med en igenpluggade änden, vilket möjliggör protein för att lämna skåran och blanda med den inkommande deuterium. Denna kinetiska biandaren är fäst vid ett blandnings-T. På den motsatta sidan av biandaren, en kanal som levererar 5% ättiksyra (pH 2,4) fastsatt. Efter släckning av reaktionen, passerar den deutererade proteinet genom proteolys kammaren packad med pepsin-agarospärlor för att producera peptiska peptider. Den distala kapillär används som en ESI-källa.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Typiskt arbetsflöde från rådata till kinetiska plottar för utvalda peptider från det nativa och hyperfosforylerat protein. (A) Rå spektrum för fyra peptider (kolumner) är monterade på förutsagda isotopfördelningar för att bestämma% av deuterium upptag vid tre olika tidpunkter (rader). (B) Observerad kinetiska plottar av% deuterium upptagning mot tiden för varje peptid (heldragen linje), som används för att extrahera kobs. Kinetiska kurvor för alla peptider observerades vid 3 eller fler märknings gånger (n = 3), felstaplar representerar SE Den beräknade "random coil" profil (streckad linje) visas som jämförelse. Reproduceras från Zhu et al. 8 med tillstånd.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. HDX skydd faktoruppgifter mappas på representativa strukturer av (a) nativt fullängds tau och (b) hyperfosforylerat tau. Struktur av hyperfosforylerat tau alstrades med användning FRODAN simulering med efterföljande förfining med användning Vadar. Grad av skyddsfaktorer är färgade som en regnbåge schema som visas i förklaringen (till vänster). Reproduceras från Zhu et al. 8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan strukturbiologiska metoder såsom röntgenkristallografi och NMR är fördelaktiga eftersom de tillhandahåller extremt detaljerade strukturer av proteiner, dessa bilder är ofta statiska. Karakterisering av transienta arter och svagt strukturerade domäner fortsätter att vara svårfångade när studerats av dessa konventionella metoder. Därför är det för att få dynamiska insikter om dessa typer av system viktigt att arbeta vid snabba tidsskalor. Vi har framgångsrikt tillämpats Tresi-HDX-MS för att få detaljerade insikter om de strukturförändringar som sker inom en väl studerad IDP på en lokal peptid nivå. En av de viktigaste begränsningar för denna teknik är att pepsin är ett ospecifikt proteas och på egen hand, sällan ger fullständig sekvenstäckning. Ett sätt för att förbättra sekvenstäckning och specificitet är att kombinera proteas typ XIII från Aspergillus saitoi till rötkammaren 26.
Det är viktigt attrötkammaren hålls vid ett pH av 2,4 under helheten av experimentet för att effektivt släcka utbytesreaktionen och minska mängden av back-utbyte 11. Det är viktigt att alla proteolys steg och efterföljande analys göras så fort som möjligt. Tidigare studier har optimerat storleken av rötkammaren och föreslog flödeshastigheter för att hålla nivån av back-utbyte till försumbara nivåer (≤5%) vid rumstemperatur 22. Det rekommenderas starkt att storleken av kammaren inte är större än dimensionerna listade inom detta protokoll. En i hög grad strukturerad protein kommer inte att ta upp betydande nivåer av deuterium på millisekund till andra tidsskala och kommer att vara svåra att smälta i den tid som tillåts av proteolys kammaren. Sådana proteiner rekommenderas inte för studier med den här tekniken.
Medan vi rekommenderar användning av 50 mM ammoniumacetat-buffert (pH 6,9) för than proteinprov, kommer inte alla proteiner vara kompatibla med denna koncentration eller pH-värde. Det är viktigt att notera pl för proteinet, och justera bufferten enlighet därmed för att vara minst en pH-enhet över eller under. Detta kommer att säkerställa att proteinet har den erforderliga ytladdning behövs för korrekt veckning och förhindra aggregation. Ökning av koncentrationen av ammoniumacetat rekommenderas för aggregering benägna proteiner i syfte att öka lösligheten, men koncentrationer över 500 mM skall undvikas.
Tresi-HDX-MS är bäst tillämpas på system som består av stora slingregioner, smälta globuler eller transienta sekundära strukturelementen 22. Dessutom finns det olika ekonomiska fördelar med denna teknik eftersom den är enkel och relativt billig att implementera. På senare tid har det skett en ökning i användningen av HDX-MS inom läkemedelsindustrin för läkemedelsforskning och utveckling 27. Under de senaste tio årens det har skett en snabb tillväxt av biologiska makromolekyler, varvid notably monoklonala antikroppar (mAbs), godkänts av FDA. Jämfört med småmolekylära läkemedel, högre ordning strukturer av proteiner och deras konformationsdynamik spela en stor roll vid bestämning av läkemedelseffektivitet. HDX-MS har framgångsrikt använts som en bekräftelse verktyg för produktion av biologiskt likartade antikroppar 28, samt karakterisering av antikropp-antigen 29, 30, 31, och protein-ligand-interaktioner 32. Framsteg inom mjukvaruutveckling och automatisering av experiment kommer att påskynda analystider möjliggör ytterligare expansion av denna teknik inom en snar framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
