Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.
Abstract
Inhalation von Allergenen und Krankheitserregern entlockt mehrere Änderungen in einer Vielzahl von Immunzelltypen in der Lunge. Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik für die quantitative Analyse von Zelloberflächenproteinen auf Immunzellen, aber es gibt keine Informationen über die Lokalisierung und Migrationsmuster dieser Zellen in der Lunge. In ähnlicher Weise kann Chemotaxis - Assays durchgeführt werden , um das Potenzial der Zellen zu untersuchen , um chemotaktische Faktoren in vitro zu reagieren, aber diese Tests nicht die komplexe Umgebung des intakten Lunge reproduzieren. Im Gegensatz zu diesen oben genannten Techniken kann die Lage der einzelnen Zelltypen innerhalb der Lunge leicht durch Erzeugen von präzisionsgeschliffenen Lung Slices (PCLS), Anfärben sie mit handelsüblichen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Visualisierungen der Abschnitte durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. PCLS kann für beide verwendet werden, leben und Lungengewebe fixiert ist, und die Scheiben Bereiche so groß wie ein Querschnitt einer gesamten Lappen umfassen kann. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich die Position eine Vielzahl von Zelltypen in der Lunge, einschließlich verschiedenen Arten von dendritischen Zellen sichtbar zu machen, Makrophagen, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen, sowie Strukturzellen wie Lymph-, endotheliale und Epithelzellen. Die Fähigkeit, zelluläre Interaktionen sichtbar zu machen, wie die zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen, live, dreidimensionalen Lungengeweben kann zeigen, wie Zellen in der Lunge bewegen und miteinander in einem stabilen Zustand und während der Entzündung in Wechselwirkung treten. Somit wird, wenn in Kombination mit anderen Verfahren, wie Durchflusszytometrie und quantitative PCR verwendet wird, kann PCLS zu einem umfassenden Verständnis von zellulären Ereignissen beitragen, die allergischen und entzündlichen Erkrankungen der Lunge zu Grunde liegen.
Introduction
Nach Einatmen von proinflammatorischen Stimuli wie Lipopolysaccharide (LPS), gibt es eine koordinierte Bewegung von Immunzellen in die, innerhalb und aus der Lunge. Zum Beispiel werden Neutrophile Lungenparenchym und Atemwegs schnell rekrutiert. Darüber hinaus sind einige professionelle antigenpräsentierende als herkömmliche dendritische Zellen (cDCs) bekannten Zellen durchlaufen eine relativ komplizierte Migrationsmuster 1, 2. cDCs kann CD11c auf ihrer Anzeige des Oberflächenmarker, unter Verwendung von identifizierte Durchflusszytometrie, basierend teilweise. Distinct Subsets von DCs können durch die Differentialoberflächenexpression von CD11b CD103 und 3 unterschieden werden. Bei inhalativen Antigen Erwerb verlassen einige cDCs die Lunge und wandern durch die Lymphgefäße zu Lungen-Lymphknoten (LNS) , wo sie Peptide präsentieren 4 T - Zellen-spezifisches Antigen. Dies ist ein kritisches frühes Ereignis in der Einleitung der adaptiven Immun rAHMEN. Aus unbekannten Gründen jedoch nicht alle cDCs , die inhaliert Antigene erwerben lassen , die Lunge, und viele dieser Zellen bleiben in diesem Organ für mehrere Monate 5, 6. Diese Beobachtung kann teilweise durch die Entwicklungs Vorfahren dieser Zellen , da Monozyten abgeleiteten Zellen CD11c + erklärt werden , um den Chemokin - Rezeptor fehlen, CCR7, sind nicht in der Lage zu regionalen LNs 7, 8 zu wandern. Es scheint wahrscheinlich, dass das Migrationspotenzial von cDCs auch bestimmt ist, zumindest teilweise durch ihre anatomische Position innerhalb der Lunge. Jedoch ist die genaue Lokalisierung dieser verschiedenen Populationen von cDCs in der Lunge nicht vollständig charakterisiert. Eine verbesserte Kenntnis von Immunzellen Lokalisation innerhalb der Lunge und des Moleküls, die sie leiten, ist für ein besseres Verständnis davon, wie das Immunsystem der Lunge benötigt wird aktiviert.
PCLS werden steigendely verwendete als ex - vivo - Ansatz zellulare Positionierung und Zell-Zell - Wechselwirkungen sichtbar zu machen , während die strukturelle Integrität der Lungenarchitektur 9, 10 aufrechterhalten wird . PCLS wurden verwendet Lungen vielen Arten zu untersuchen, darunter Mäuse, Rinder, Affen, Schafe, Pferde und Menschen 11. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass etwa 20 Scheiben aus einer einzigen Keule einer Mauslunge hergestellt werden können, wodurch die Anzahl von Tieren für die einzelnen Versuche benötigt reduzieren. Praktisch alle Immunzelltypen, einschließlich DCs, Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen, sind in PCLS und pflegen ihre normalen Strukturen.
PCLS 13 kann auch mit Acetylcholin oder Methacholin 12 zu studieren Calcium - Signalisierung und die Kontraktilität des Atemweg und glatten Muskelzellen nach der Behandlung verwendet werden. Bei diesem Ansatz ist nur ein kleiner Teil der Lunge einalyzed mikroskopisch, aber eine Studie berichtete , dass die Messungen der Atemwegskontraktion in PCLS nur etwa 10% von der Scheibe variieren zu schneiden, und diese Varianz vergleichbar ist , das zu 14 in intakten Tieren unter Verwendung von Lungenfunktionstests beobachtet. Andere Forscher haben PCLS als Ex - vivo - Ansatz verwendet zu untersuchen Veränderungen in der Zytokin - Expression und Zelloberflächenmarker nach der Inkubation mit LPS 15. PCLS haben auch in einem ex vivo - Modell der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion in kleinen intra acinar Arterien eingesetzt. Diese Schiffe sind im Teil der Lunge entfernt , die mit anderen Verfahren nicht erreicht werden können, darunter Aufnahmen von sezierten arterielle Segmenten oder Analyse von subpleural Gefäßen 16. Unser Labor hat PCLS zu visualisieren Immunzellortung in lebenden Lungengeweben in einem stabilen Zustand und nach einem In - vivo - Entzündungsreiz eingesetzt. Die Verfahren haben wir dafür entwickelt wurden, sind wie folgt.
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Protocol
Tierversuchsverfahren in diesem Dokument beschrieben sind, wurden durch die NIEHS Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.
1. Lung Vorbereitung
- Hausmäuse zwischen 6 und 12 Wochen alt ist in spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen vorgesehen Richtlinien.
HINWEIS: Abgebildete Mäuse können entweder naiv oder behandelt sein, abhängig von jedem spezifischen Interessen des Forschers. Hier beschreiben wir Immunzelllokalisierung in naiven Mäusen und in Mäusen, die mit 100 & mgr; g Ovalbumin (OVA) und 0,1 ug Lipopolysaccharid (LPS), unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Vehikel in einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l. Um oropharyngeally OVA / LPS in die Atemwege zu vermitteln, wurden die Tiere mit Isofluran anästhesiert und inhalative vertikal durch ihre Zähne mit einem Gummiband aufgehängt ist. Die Zunge wurde vorsichtig mit einer Pinzette ergriffen und zu einer Seite gehalten zu verhindern, Schlucken und 50 & #181; L der OVA / LPS - Lösung auf der Rückseite der Mundhöhle abgeschieden , wie zuvor beschrieben 17. - Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (100 mg / kg) und der Stift, das Tier zu einem Polystyrol-Basis.
- Öffnen der Bauchhöhle mit einer Schere durch Schneiden der Haut und Bauchfells von der Mitte des Bauches auf den Unterkiefer nach oben. Ziehen Sie den Darm beiseite mit Zange oder der stumpfen Kante der Schere, und schneidet die untere Hohlvene Blut abzulassen weg von Lungen. Durchstechen der Membran mit der scharfen Spitze der Schere Expansion des Brustkorbs zu erlauben, darauf achten, daß die Lungen zu schneiden.
- Klare Speicheldrüsen und andere Gewebe aus der Luftröhre entfernt, indem das Gewebe greifen und manuell entfernt von der darunter liegenden Luftröhre mit einem Pinzette herausziehen. Führe einen kleinen Einschnitt in der Luftröhre an der vorderen Seite des dicksten Bandes des Knorpels mit feinen Pinzetten oder Scheren, aufpassen, nicht dem ganzen Weg, obwohl die tra zu schneidenChea. Der Schnitt wird nur groß genug, um eine 20-G-Nadel zu ermöglichen, hindurchzutreten.
- Schieben eine 1,5 Zoll, 20 G Nadel auf einen Abschnitt von Polyethylenschlauch, so dass etwa 1 cm des Schlauchs über das Ende der Nadel. Schneiden Sie das Rohr in einem Winkel von etwa 45 ° das Ende abzuschrägen, Befestigen der Nadel an einer 1 ml Spritze und laden die Spritze durch Ziehen 0,8 ml warmem (40 ° C) 2% niedrig schmelzender Agarose nach oben durch die Nadel.
- Das Ende der Rohrleitung in den Einschnitt der Trachea und spritzen langsam die Agarose in die Lunge. Ohne Bewegen der Nadel oder Spritze, kleben die Spritze an die Polystyrolbasis die Nadel bleibt in der Trachea sicherzustellen.
HINWEIS: Nach der Injektion wird die Lunge in der Brust größer und aufgeblasen werden. Die rechten Lappen erweitern zuerst, dann die linken Lappen. Wenn nur ein Lappen erweitert, hat die Nadel zu tief eingeführt worden ist (vorbei an der Bronchien), und es wird notwendig sein, um es leicht zu ziehen, bevor Sie fortfahren. Dieser Teil derVerfahren muss relativ schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose zu erstarren beginnt. - Platzieren Sie die Maus, mit der Basis und der Spritze noch in der Luftröhre eingeführt, in einem Kühlraum oder Kühlschrank für mindestens 10 min. Falls erforderlich, kann das Tier dort gehalten werden, bis zu mehreren Stunden, auch wenn Sie fortfahren zu Bildzellmigration durch Videomikroskopie.
- Sobald die Maus kalt ist, sorgfältig die Agarose aufgeblasenen Lungen mit einer Schere auszuschneiden und sie in einen 3-cm-Schale mit eiskaltem PBS. Halten Sie sich auf dem Eis.
- Wählen Sie die gewünschte Keulen für Gewebe Slicing (zB dem rechten oberen Lobus). Stellen Sie sicher, dass der innere Teil der Lunge (wo es zu Trachea verbindet) ist gegenüber in der Schale nach unten.
HINWEIS: Der Lappen verwendet und seine Ausrichtung auf den Kolben wird die Größe der Schiffe und der Atemwege bestimmen, die sichtbar sein wird. Die Orientierung beschrieben hier ist ideal für die Visualisierung großer Atemwege und Parenchym. Mäuse haben eine große linke Lappen und vier kleinere Lappen auf der rechten Seite. ZumPCLS Bildgebung nach der Einführung von Allergenen in die Lungen über oropharyngealen oder intranasal Bestrebung, die rechten oberen Lappens wird teil typischerweise geschnitten, weil es eine bequeme Größe ist, sondern auch, weil inhalierten Mittel verteilen sich gleichmäßig in ihr. Jedoch können auch andere Lappen, vor allem der linke Lappen, kann auch untersucht werden. Wenn Mausstämme oder Behandlungen zu vergleichen, ist es wichtig, die gleichen Lappen zu vergleichen.
2. Lung Slicing
HINWEIS: Stellen Sie Scheiben eine automatisierte Schneidemaschine mit Metallkühlblock, Kolben und Metallspritze, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bringe einen kleinen Tropfen Allzweck-, kein Gel-run superglue auf den Kolben und verteilt den Klebstoff in einer kreisförmigen Bewegung, dabei nicht der Klebstoff an den Seiten des Metall Spritze berühren zu lassen. Wenn der Klebstoff an den Seiten der Spritze berührt, wird sie die Spritze und Kleber zusammenzuDruckFläche.
- Unmittelbar nach den Kolben mit Leim bedeckt, greifen die sanftexzidiert Lappens mit einer Pinzette mit der Trachea-Seite nach unten auf einem Gewebe dab überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und vorsichtig auf der Oberseite des Kolbens zu legen. Schneiden Sie keine zusätzlichen Gewebe über den Rand des Plungers erstreckt.
- Bewegen Sie den Kolben nach unten, so dass die Seiten der Metall Spritze nach oben und über das Gewebe, die Schaffung einer gut mit der Lunge am Boden geklebt, nicht mehr als einige Zentimeter tief. Band um die Unterseite der Metall Spritze diese Position in Position zu halten.
- gießt vorsichtig 2% niedrig schmelzende Agarose bei 40 ° C in das Bohrloch, so dass es nur die Oberseite des Lappens erstreckt.
- Umgeben die Metall Spritze mit dem eiskalten Kühlblock und Kühlen des Lappens und Agarose für 1 bis 2 min.
HINWEIS: Eine kürzere Zeit Kühlung des Agarose das umgebende Gewebe während des Schneidens zu einem Zerfall der Agarose führen könnte, was zu einer ungleichmäßig geschnitten PCLS führen könnte. - Legen Sie die Probenspritze in die automatische Schneidemaschine und füllen den Puffertank mit eiskaltem PBS. Richten Sie die Schrittmotorantrieb mit der Spritze Probe und Entfernen von der Unterseite des Bandstückes. Schalten Sie den Schalter auf die Schnellvorlauf (FF) Position, bis der Schrittmotorantrieb nur die Rückseite des Kolbens berührt.
- Richten des frischen Klinge mit der Probenspritze. Set Gewebedicke, kontinuierlich / scheibe, Schwingung und die Geschwindigkeit in der Slicer. Zum Beispiel Gewebedicke: 150 & mgr; m, kontinuierliches Schneiden (Forts.), Oszillation: 9 und Geschwindigkeit: 3 - 4. Start drücken. Die obigen Einstellungen müssen auf die spezifischen automatisierten Slicer Spezifikationen angepasst werden.
- Mit einem dünnen Spatel oder Pinsel, sammelt das PCLS einen nach dem anderen, wie sie in den Puffertank fallen und sie in einer 24-Well-Platte eiskalten PBS enthält.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Scheiben zu halten, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu halten. Obwohl jeder Lunge unterschiedlich ist , je nach Alter, Geschlecht und Gewicht, die 10. Scheibe, so ergibt zB Atemwege im Allgemeinen ähnlich dimensionierten.
- Entwerfen eine Gruppe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf dem Basis des Zelltyp von Interesse unter Berücksichtigung der potentielle fluoreszierende spektrale Überlappung und die Erfassungsfähigkeiten des Mikroskops.
HINWEIS: Als Beispiel wird ein Panel für DC-Untergruppe Erkennung ist wie folgt: CD11c / alpha X Integrin - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, Spitzenemission: 605 nm), CD324 / E-Cadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Anregung: 488 nm, Spitzenemission: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (Anregung: 561 nm, Spitzenemission: 578 nm), CD103 / alpha E Integrin - Allophycocyanin (APC) (Anregung: 633 nm , Spitzenemission: 660 nm). Fluoreszenz spektrale Betrachter Tools (siehe Materialliste) sind nützliche Platten zu entwerfen. - Stellen einen Antikörper-Cocktail die gewünschten Antikörper enthält.
- Für statische PCLS Bildgebung, fügen 800 & mgr; l Färbepuffer, 100 & mgr; l Fc-Blocker wurden 50 ul normales Mausserum und 50 & mgr; l normalem Rattenserum in ein 1,5 ml microcentrifugation Rohr für ein Gesamtvolumen von 1 ml. Für die Abbildung lebender Zellen, verwenden 800 & mgr; l Leibovitz-Medium (1x), das 10% FBS (Leibovitz-10) anstelle von Färbepuffer.
- eine gewünschte Endkonzentration jeden Antikörper hinzufügen Antikörper einzustellen. Übertragen Sie die Antikörperlösung auf eine 3-cm-Schale und halten im Dunkeln bis zur Verwendung.
HINWEIS: Die Endkonzentrationen werden müssen, für jeden einzelnen Antikörper optimiert (in der Regel 1 bis 5 & mgr; g / ml).
- Wählen Sie eine PCLS mit einem anatomischen Bereich von Interesse, wie beispielsweise große Atemweg oder der Peripherie der Lunge, und in der 3-cm-Schale, die 1 ml Antikörperlösung.
- Stain PCLS im Dunkeln auf Eis, Schaukel langsam für 30 oder 60 min.
- Für statische PCLS Bildgebung, geht in Abschnitt 5 mit dem Abschnitt 4 für die Abbildung lebender Zellen, Proceed.
4. Statische Imaging von PCLS
- Nach 60 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und spülen ter schneidet zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS.
- Pipettieren von 50 & mgr; l PBS auf ein 3 cm runden Glasbodenschale. Mit einem Spatel oder Pinsel, übertragen die gefärbten PCLS auf den Abfall, Manipulieren sanft die Scheibe, bis sie flach ist und sich auszubreiten. Entfernen Sie die PBS mit einer Pipette. Die Scheibe sollte so flach wie möglich liegt. Die oben genannten Verfahren müssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden.
- 1 Tropfen von Raumtemperatur Montagemedium auf die Scheibe sanft und ein Deckglas in die Vertiefung der Platte fallen. Halten PCLS im Dunkeln bei 4 ° C für bis zu einer Stunde vor der Bilderzeugung.
- Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x - Objektiv (siehe Materialliste). Mit der „Kachel“ Werkzeug zu lokalisieren und die Ränder des Gewebes in der „konvexen Hülle“ Einstellmarke. Dies wird dazu beitragen, die Zeit der Fliese Scan zu reduzieren.
- Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, insbesondere entlang der Kanten, dass die eingestellten Bereichegeeignet sind.
HINWEIS: Der z-Bereich wahrscheinlich brauchen wird größer zu sein als selbst die Dicke des Gewebes, weil es sehr schwierig ist, das Gewebe zu erhalten völlig flach zu legen. Beispielsweise mit einem 150 um dicken PCLS, der z-Stapelbereich muß wahrscheinlich auf 200 eingestellt werden - 250 um Beulen und Kurven in der Scheibe aufzunehmen. In Abhängigkeit von dem z-Stack-Bereich und der Größe des Gewebes, jede volle Lungenscan dauert zwischen 7 bis 12 h mit einem 20x-Objektiv. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden.
5. Live Cell Imaging von PCLS
- Nach 30 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und die Scheiben zweimal mit 1 ml kalten Leibovitz-10 spülen.
- Pipette 50 ul frische Leibovitz-10 in einen Schlitz eines Kammerdeckgläser (8 Slots). Verwenden eines Spatels PCLS die auf das Medium zu übertragen, Manipulieren es leicht, bis die Scheibe flach ist und sich auszubreiten. Die obigen Verfahrenmüssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden.
- Entfernen Sie die 50 & mgr; l Medium mit einer Pipette. Die Scheibe ist so flach wie möglich zu liegen.
HINWEIS: Es ist akzeptabel, wenn die Ränder der Scheibe sind vertikal an der Wand der Kammer nach oben geklappt. Des Weiteren kann, wenn vorhanden, ein Metall der Platingewicht verwendet werden, um die Scheibe zu verankern, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Siehe die beigefügte Materialliste für ein Beispiel aus Platindraht, der in kleine Gewichte geschnitten und gebogen werden kann. - In einem 4 ° C kalten Raum, Mischung 100 & mgr; l Wachstumsfaktor reduziert, Phenolrot-freier extrazellulärem Matrix mit 100 & mgr; l Leibovitz-10. Verwenden vorgekühlten Pipettenspitzen für diese, oder die extrazelluläre Matrix wird in der Spitze verfestigen.
Hinweis: Dieses Verhältnis von Matrix und Medium (1: 1) erzeugt ein Gel dicht genug, um die PCLS unten halten in Gewebekulturbedingungen. - Pipette vorsichtig die Matrix zu mischen, und Pipette vorsichtig auf der Oberseite der PCLS, um sicherzustellen, dass das Gel auf das lu gehtng Scheibe, und dass die Scheibe aufschwimmen nicht auf der Oberseite des Gels. Das Gel sollte als Gewicht arbeiten, die PCLS nach unten auf den Boden der Platte zu verankern.
- übertragen sorgfältig die Kammerdeckgläser auf einen 37 ° C Inkubator und lassen die Matrix für ~ 5 min verfestigen.
- Überträgt die gesamten Kammerdeckgläser auf die vorgewärmte Phase eines konfokalen Mikroskops. Pflegen die Kammer bei 37 ° C im gesamten Bildgebung. CO 2 -Zufuhr wird während der Zellinkubation erforderlich , wenn Leibovitz-Medium verwendet wird .
- Stellen Sie den Z-Stapel Bereich und Fliesenbereich basierend auf dem gewünschten Abstand zwischen der Frames. Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x-Objektiv (siehe Materialliste). Mit dem „Kachel“ Werkzeug den Bereich von Interesse in dem Gewebe zu bezeichnen, das „zentrierte Gitter“ -Einstellung verwendet ( zum Beispiel ein 2x2 Gitter zentriert).
- Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, ob die festgelegten Bereiche geeignet sind.
HINWEIS: Die zrange wird die Dicke des Gewebes wahrscheinlich entsprechen. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden. 2x2 Fliesen und 10 Z-Stapel werden in ~ 1 Bild / 2 min im Allgemeinen zur Folge hat. Sicherstellen, dass die Autofokusfunktion aktiviert ist vor Beginn des Versuchs xy und z-Drift während des Bilderzeugungsperiode zu minimieren.
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Representative Results
Um die Position von zwei DC - Untergruppen, CD11b hallo cDCs und CD103 + cDCs, PCLS von C57BL / 6 - Mäusen wurden geschnitten und gefärbt mit monoklonalen Antikörpern (mAb) , spezifisch für CD11c, CD88, CD103 und CD324 (E-Cadherin) zu identifizieren. Antikörper gegen CD324 stain Atemwegsepithelzellen und CD88 auf Makrophagen und Neutrophile angezeigt, aber nicht mehr als 8 cDCs. Dies ermöglichte es uns cDCs von CD11c + Makrophagen zu unterscheiden, und die räumliche Beziehung von jedem Zelltyp in die Atemwege (Abbildung 1) zu beobachten. Wir fanden , dass CD11b Hallo cDCs im Parenchym lokalisieren, während CD103 + cDCs primär residieren um die Atemwege und der subpleural Bereich. Obwohl CD103 + cDCs leicht durch direkte Anfärbung von Zelloberflächen CD103 in diesem Experiment nachgewiesen wurde, stützte sich die Erkennung von CD11b Hallo cDCs auf dem Fehlen von CD88 und CD103 Färbung. Um direkt zu identifizieren CD11bhallo cDCs, versuchten wir zunächst Fleck PCLS unter Verwendung eines Anti-CD11b mAb (Klon M1 / 70), die weit in der Immunhistochemie eingesetzt wird und Durchflusszytometrie. Dies hatte jedoch einen hohen mAb Hintergrund und geringe Spezifität in dieser Anwendung, unabhängig davon , welche Fluorochromen zu dem mAb , konjugiert wurden (2A und Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu Antikörper gegen CD172a (SIRP1α) gefärbt CD11b Hallo cDCs 18, jedoch nicht die strukturellen Zellen oder CD103 + cDCs (2B und Daten nicht gezeigt). Auf ihrem eigenen, konnten Antikörper gegen CD172a nicht zwischen cDCs und Monozyten oder Makrophagen unterscheiden. Jedoch durch Co-Färbung mit Antikörpern gegen CD88 und CD172a konnten wir Alveolarmakrophagen (CD172a - CD88 +) unterscheiden von interstitielle Makrophagen (CD172a + CD88 +) und CD11b hallo cDCs (CD172a + CD88 -), und zeigt , dass die letztgenannten Zellen lokalisieren bevorzugt in derParenchym, nicht die subepithelialen Bereich (2C - F), in Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen durch indirekte Färbung dieser Zellen erhalten.
Studie der intra Gewebe Migration von Leukozyten erfordert Visualisierung von Strukturzellen, einschließlich derjenigen der Lymphgefäße, durch die DCs Verkehr von peripheren Geweben zu regionalen LNs. In der Haut und LNs wird oft Lymphgefäße identifiziert mAb an LYVE-1 oder Podoplanin verwenden. mAbs Jedoch fanden wir, dass in PCLS, LYVE-1 und Podoplanin eine Vielzahl von anderen Zelltypen befleckt, einschließlich vaskulären Endothel und Alveolarepithel (Daten nicht gezeigt). Diese mAbs sind daher nur bedingt für den praktischen Einsatz speziell Lymphgefäße in PCLS identifizieren. MAbs zu CD90.2 (Thy1.2) jedoch ein bekannter T - Zell - Marker, markierten lymphatische Strukturen, wie sie in anderen Geweben 19 zuvor gezeigt, 20 (Figuren 3A, B Prox1 21 (3A, C) kodiert. ProX1 ist ein Faktor, der für die Transkription Master Lymphangiogenese 22 notwendig ist. Prox1 tdTomato transgener Mäuse zeigen hell fluoreszierende Lymphgefäße in der Lunge und anderen Geweben wie der Leber, der Linse, Gyrus dentatus und neuroendokrine Zellen der adrenalen Medulla 21. Tatsächlich gab diese beiden Markierungsverfahren überlappende Färbungsmuster (3D). Unter Verwendung dieser Markierungsansätze konnten wir feststellen , dass CD103 + cDCs in verschiedenen anatomischen Bereichen vorhanden waren, einschließlich der CD324-exprimierenden Atemwegsepithel, den Lymphgefässen und dem subpleural Bereich (3A, E).
Neben statischer Bildgebung, Zellbewegung und Zelle cell Wechselwirkungen können unter Verwendung lebender Zellen von PCLS aufgezeichnet (Film 1). PCLS wurden frisch aus Mäusen hergestellt, die Injektionen von GFP-exprimierenden OT-II T-Zellen und Instillation von OVA und LPS, gefärbt mit mAbs gegen CD103 (rot) und das Atemwegsepithel (CD324, blau) erhalten hatte, und wurden bebildert die verfolgen Bewegung von CD103 + cDCs und T - Zellen 16 h nach der OVA / LPS Instillation. Im Laufe des Videos (4 h), die dynamische Bewegung von CD103 + DCs (rot) und den adoptiv übertragen OVA-spezifischen T - Zellen (grün) und deren Interaktion ist deutlich sichtbar (Film 1).
Abbildung 1. Distinct Anatomische Standorte von cdc Subsets als enthüllt durch PCLS Staining und konfokaler Mikroskopie. A) insgesamt PCLS aus einer unbehandelten C57BL / 6 - Mauslunge mit verschiedenen Antikörpern gefärbt. Die Farbe jedes Molekül zeichnet sich durch seine Schriftfarbe (oben rechts) angegeben. Individuelle und kombinatorische Färbung gibt die folgenden Farben für Zelltypen von Interesse: CD103 + cDCs (CD103 + CD11c + CD88 -; weiß), CD11b hallo cDCs (CD11c + CD103 - CD88 -, rot), Makrophagen (CD11c + CD88 +, gelb ), Neutrophile (CD11c - CD88 +; grün) und Atemwegs - Epithelzellen (CD324 +; blau). B - D) Eine stärkere Vergrößerung der Einfügungen in A. B) CD11b Hallo cDCs lokalisiert im Parenchym. C) CD103 + cDCs um die Atemwege. D) CD103 + cDCs unter der Pleura. Weißen Balken bezeichnen 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Färbung von DCs und Makrophagen. A) Färbung von PCLS mit Antikörpern gegen CD11b (blau) verursacht einen hohen Hintergrund in PCLS. B) Antikörper gegen CD172a (grün) haben einen relativ niedrigen Hintergrund in PCLS und eine größere Spezifität für CD11b + Zellen. C) insgesamt PCLS von C57BL / 6 - Mäuse , gefärbt mit mAbs , deren Farbe durch Schriftfarbe angezeigt (oben rechts). CD11c (rot), CD88 (cyan), CD172a (grün) und CD324 (blau). CD11b hallo cDCs (CD11c + CD88 - CD172a +; gelb), Alveolarmakrophagen (CD11c + CD88 + CD172a -; pink), interstitielle Makrophagen (CD11c + CD88 + CD172a +; weiß), Neutrophile (CD11c - CD88 +; Cyan) und Atemwege (CD324 +; blau). D - F) Eine stärkere Vergrößerung der Einsätzein C dargestellt. D) Teilbereich Pleura. E) subepithelialen Bereich. F) Interstitium. Interstitielle Makrophagen lokalisieren im Parenchym und Alveolarmakrophagen sind in Alveolen. Unbeschriftet weißen Balken bezeichnen 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Kennzeichnung von Strukturzellen in PCLS. A) insgesamt PCLS hergestellt aus Prox1 tdTomato Maus und mit mAb an CD90.2 (grün), CD103 (weiß) und CD324 (blau gefärbt). Prox1-exprimierenden Zellen (rot) sind genetisch mit tdTomato unter der Regulation des Promotors Prox1 (Prox1-tdTomato) markiert. B - E) Eine stärkere Vergrößerung des Einsatzes in
Film 1. T - Zellen interagieren mit CD103 + cDCs in der Lunge. Mikroskopische Untersuchungen von Zellen von CD103 + cDCs (rot) der Interaktion mit T - Zellen (grün). CD4 + T - Zellen , isoliert aus OVA-spezifischen OT-II Nur77 gfp - Mäuse wurden mit OVA und splenic DCs in vitro stimuliert und in adoptiv übertragen Rag - / - Maus. 2 h später wurde die Empfängermaus behandelt with OVA / LPS Einträufeln in die Atemwege. 16 h nach dem OVA / LPS-Behandlung, PCLS wurden hergestellt, gefärbt und für 4 h bei 37 ° C abgebildet. Zeiterfassung Bild (min) gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich die Positionen von zwei Untergruppen von cDCs in der Lunge sichtbar zu machen entwickelt. Jedoch kann dieses Protokoll ohne weiteres viele verschiedene Zelltypen zu untersuchen, während die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und die dreidimensionale Architektur der Lunge angepasst werden. Das letztere Merkmal ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber Kultursysteme Zelle und erleichtert die Identifizierung von seltenen Zelltypen. Das Verfahren beruht auf der Erzeugung von PCLS aus der Lunge, und eine geeignete Kombination von Antikörpern, die spezifisch Zelltypen zu identifizieren, während der Hintergrundfärbung zu minimieren. Zu einem großen Teil ist dies eine empirische Übung, weil Antikörper, die auch in anderen Anwendungen arbeiten, einschließlich Durchflusszytometrie, müssen auch nicht funktionieren PCLS für die Färbung. Wir haben bereits erhebliche Fortschritte in dieser Hinsicht gemacht, aber die Ermittler, die hier nicht angesprochen studieren Zelltypen wünschen können verschiedene Antikörper getestet zu werden und optimieren Fluorochrome und Konzentrationen. Unter Verwendung der hier beschriebene Protokoll, fanden wir , dass CD103 + cDCs und CD11b hallo cDCs wohnen an unterschiedlichen Lokalisationen in der Lunge. Im stationären Zustand wurden CD103 + cDCs um die Atemwege festgestellt und in der Region subpleural, während CD11b Hallo cDCs hauptsächlich im Parenchym gefunden wurden. Obwohl das Protokoll wir hier beschreiben, zum Färben von intrazellulären Molekülen nicht geeignet ist, ist es für die Bildgebung Zelloberflächenmarker nützlich, sowie sekretorische Moleküle. So konnten wir die Chemokine CCL21 und CCL19 erkennen, in PCLS (Daten nicht gezeigt). Wenn nur eine schwache Fluoreszenzsignale werden unter Verwendung von primären Antikörpern zu sehen ist, ist es möglich, Sekundärantikörper zu verwenden, um diese Signale zu verstärken.
Eine große Herausforderung bei der Lebendzell Video-Bildgebung von PCLS leitenden war ausreichend um das Gewebe in Kulturmedium zu verankern, während der 4-Stunden-Mikroskopie Periode signifikante XY- und Z-Drift zu verhindern. Um dies zu adressieren, experimentierten wirmit verschiedenen Verhältnissen von Leibovitz-Medium, an extrazelluläre Matrix, die bei Raumtemperatur fest ist, und bestimmt, um ein 1: 1-Verhältnis gehalten, um eine stabile, 3D-Struktur mit der Lebensfähigkeit der Zellen. Während der post-Bildverarbeitung, verwenden wir auch eine Reihe von ImageJ Plug-in, genannt TURBOREG und STACKREG, dass zusätzliche Neben xy oder z-Verschiebung zu beseitigen (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Unter Verwendung des Autofokuswerkzeug des konfokalen Mikroskops wurde die interessierende Region im Fokus gehalten wird, insbesondere in der z-Bereich, während der gesamten Abtastperiode. Eine weitere Herausforderung bei der Abbildung lebenden Zellen von PCLS wurde unter Verwendung des Tile Scan, Z-Stapel, Zeitreihen, und Autofokus-Funktionen des Mikroskops. Um die Zeit zwischen den einzelnen Bildern zu minimieren, muss ein Gleichgewicht zwischen der Zeit getroffen werden, um jede Fliese verbrachte scannen. Um die Zykluszeit in jedem Forschungsprojekt, z-Stapelzahl, Fliesen, und Scangeschwindigkeiten optimieren müssen angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Jeff Tucker, Erica Scappini und Agnes Janoshazi für ihre Hilfe bei der Mikroskopie Ligon Perrow für ihre Verwaltung der Maus Kolonie, und Jun Chen und Michael Sanderson um Hilfe mit dem Gewebe Hobel, und Michael Fessler und Derek Cain für kritische Lektüre das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den intra-Zweig des NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09) finanziert, die von der Abteilung für Gesundheit und Human Services gesponsert wiederum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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