Summary
Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.
Abstract
A inalação de alérgenos e agentes patogénicos elicia várias alterações em uma variedade de tipos de células imunitárias no pulmão. Citometria de fluxo é uma técnica poderosa para a análise quantitativa das proteínas da superfície celular em células do sistema imunológico, mas não fornece nenhuma informação sobre os padrões de localização e de migração destas células dentro do pulmão. Do mesmo modo, ensaios de quimiotaxia pode ser realizada para estudar o potencial das células para responder a factores quimiotáticos in vitro, mas estes ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacta. Em contraste com estas técnicas acima mencionadas, a localização de tipos de células individuais dentro do pulmão pode ser facilmente visualizado através da geração de precisão de corte fatias de pulmão (PCLS), manchando-os com anticorpos comercialmente disponíveis, marcados por fluorescência, e visualizando as secções por microscopia confocal. PCLS pode ser utilizado tanto para viver e fixa o tecido pulmonar, e as fatias pode abranger áreas tão grandes como uma secção transversal de um lobo inteiro. Nós temos utilizado este protocolo para visualizar com sucesso o local de uma ampla variedade de tipos de células no pulmão, incluindo tipos distintos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T e células B, assim como células estruturais tais como linfático, endotelial e células epiteliais. A habilidade de visualizar as interacções celulares, tais como aquelas entre as células dendríticas e as células T, no tecido pulmonar vivo, tridimensional, pode revelar como células se movem no interior do pulmão e interagir uns com os outros no estado estacionário e durante a inflamação. Assim, quando usado em combinação com outros procedimentos, tais como citometria de fluxo e PCR quantitativa, PCLS pode contribuir para uma compreensão abrangente de eventos celulares que fundamentam as doenças alérgicas e inflamatórias do pulmão.
Introduction
Após a inalação de estímulos pró-inflamatórios, tais como lipopolissacáridos (LPS), há um movimento coordenado de células imunes para, dentro de, e do pulmão. Por exemplo, os neutrófilos são rapidamente recrutados para o parênquima pulmonar e das vias aéreas. Além disso, algumas células apresentadoras de antigénios profissionais conhecidos como células dendríticas convencionais (CDCs) sofrem um padrão de migração relativamente complexo 1, 2. CDCs podem ser identificados por citometria de fluxo, com base, em parte, a sua exposição do marcador de superfície, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs pode ser distinguida pela expressão de superfície diferencial de CD103 e CD11b 3. Após a aquisição de antigénio inalado, algumas CDCs sair do pulmão e migram através dos vasos linfáticos de drenagem pulmonares Nódulos Linfáticos (LNs) onde apresentam péptidos de antigénio-específica de células T 4. Este é um evento precoce crítico na iniciação de r imune adaptativaesponses. Por razões desconhecidas, no entanto, nem todos os CDCs que adquirem antígenos inalados deixar o pulmão, e muitas destas células permanecem nesse órgão durante vários meses 5, 6. Esta observação pode ser parcialmente explicado pela ascendência desenvolvimento destas células porque CD11c + células sem o receptor de quimiocina, CCR7 derivadas de monitos, são incapazes de migrar para LNs regionais 7, 8. Parece provável que o potencial de migração de CDCs também é determinado, pelo menos em parte, pela sua posição anatômica dentro do pulmão. No entanto, a localização exacta destas diferentes populações de CDCs no pulmão não está completamente caracterizada. Um melhor conhecimento de localização de células imunitárias no interior do pulmão, e das moléculas que dirigem-lo, é necessário para uma melhor compreensão de como o sistema imune do pulmão torna-se activado.
PCLS estão sendo cada vez maiorly usado como uma abordagem ex vivo para visualizar posicionamento celular e interacções célula-célula, enquanto mantém a integridade estrutural da arquitectura pulmonar 9, 10. PCLS têm sido usadas para estudar os pulmões de muitas espécies, incluindo ratos, gado, macacos, ovelhas, cavalos e seres humanos 11. Uma importante vantagem desta técnica é que cerca de 20 fatias pode ser preparado a partir de um único lóbulo do pulmão do rato, reduzindo assim o número de animais necessários para as experiências individuais. Virtualmente todos os tipos de células imunitárias, incluindo as DCs, macrófagos, neutrófilos e células T, estão presentes em PCLS e manter as suas estruturas normais.
PCLS também pode ser utilizado para estudar a sinalização de cálcio e a contractilidade de células das vias respiratórias e do músculo liso após o tratamento com 12 ou acetilcolina metacolina 13. Nesta abordagem, apenas uma pequena porção do pulmão é umalyzed microscopicamente, mas um estudo relatou que as medições de contracção das vias aéreas em PCLS variar apenas cerca de 10% a partir de fatia a fatia, e esta variação é comparável à observada usando testes da função pulmonar em animais intactos 14. Outros investigadores têm utilizado PCLS como uma abordagem ex vivo para estudar alterações na expressão de citoquinas e marcadores de superfície celular após incubação com LPS 15. PCLS também têm sido utilizados num modelo ex vivo de vasoconstrição pulmonar hipóxica em pequenas artérias intra-acinares. Estes vasos estão localizados na parte do pulmão que não pode ser alcançado utilizando outros processos, incluindo gravações de segmentos ou análise de vasos arteriais subpleurais 16 dissecados. O nosso laboratório tem usado principalmente PCLS para visualizar a localização de células imunitárias em tecidos de pulmão vivo no estado estacionário e na sequência de um estímulo inflamatório in vivo. Os procedimentos que desenvolvemos para isso são as seguintes.
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Protocol
procedimentos experimentais animais descritos no presente documento foram aprovados pelo Comité de Cuidados e NIEHS animal Uso (IACUC).
1. Preparação do pulmão
- ratos de casa entre 6 e 12 semanas de idade em condições específicos isentos de agentes patogénicos, de acordo com as orientações fornecidas pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional animais.
NOTA: Imaged ratos pode ser ingênuo, ou tratados, dependendo dos interesses específicos de cada pesquisador. Aqui, nós descrevemos a localização celular imune em ratinhos ncios e em ratos tratados com 100? G de ovalbumina (OVA) e 0,1 ug de lipopolissacárido (LPS), utilizando tampão fosfato salino (PBS) como veículo em um volume total de 50 uL. Para infundir oropharyngeally OVA / LPS para as vias aéreas, os animais foram anestesiados com inalação de isoflurano e verticalmente suspensas pelos seus dentes com uma banda de borracha. A língua foi gentilmente apreendido com uma pinça e segurou para um lado para evitar engolir, e 50 & #181; L da solução de OVA / LPS depositada na parte posterior da cavidade oral, como previamente descrito 17. - Eutanásia do ratinho com injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg), e fixar o animal a uma base de poliestireno.
- Abrir a cavidade abdominal com uma tesoura, cortando a pele e peritônio do meio do abdômen até a mandíbula. Puxe os intestinos de lado com fórceps ou a borda maçante da tesoura e cortar a vena cava inferior para drenar o sangue para fora dos pulmões. Perfurar o diafragma com a ponta afiada da tesoura para permitir a expansão da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar os pulmões.
- glândulas salivares claras e outro tecido para longe da traqueia, agarrando o tecido e manualmente puxando-o para longe da traqueia subjacente com uma pinça. Fazer uma pequena incisão na traquéia na face anterior da banda mais espessa da cartilagem usando uma pinça fina ou tesouras, tomando cuidado para não cortar todo o caminho que o trachea. A incisão será apenas suficientemente grande para permitir que uma agulha de 20 G a passar através.
- Deslize de 1,5 polegada, 20 L de agulha para uma secção de tubo de polietileno, deixando cerca de 1 cm de tubo para além da extremidade da agulha. Cortar o tubo com um ângulo de aproximadamente 45 ° para chanfrar a extremidade, colocar a agulha para uma seringa de 1 mL, e carregar a seringa por desenho 0,8 mL de água morna (40 ° C) 2% de baixo ponto de fusão de agarose-se através da agulha.
- Coloque a extremidade do tubo para a incisão da traqueia e lentamente injectar a agarose para dentro dos pulmões. Sem mover a agulha ou seringa, a seringa fita adesiva à base de poliestireno para assegurar que a agulha permanece na traqueia.
NOTA: Após a injeção, os pulmões serão maiores e inflado dentro do peito. Os lobos direito expandir primeiro, depois o lobo esquerdo. Se apenas um lóbulo expande, a agulha foi inserida muito profundamente (passado o brônquio), e será necessário retirá-lo um pouco antes de continuar. Esta parte doprocedimento precisa ser feito de forma relativamente rápida, antes da agarose começa a solidificar. - Colocar o rato, com a base e a seringa ainda inserido na traqueia, num quarto frio ou um refrigerador por pelo menos 10 min. Se necessário, o animal pode ser mantido lá por várias horas, mesmo se proceder à migração de células de imagem por microscopia de vídeo.
- Uma vez que o rato é frio, cuidadosamente excisar os pulmões inflado-agarose com uma tesoura, e colocá-los num prato 3 cm, com PBS gelado. Manter em gelo.
- Escolha do lóbulo desejado para corte de tecidos (por exemplo, o lobo superior direito). Certifique-se a parte interior do pulmão (onde ele se conecta a traqueia) está virado para baixo no prato.
NOTA: O lóbulo usada e a sua orientação no êmbolo irá determinar o tamanho de vasos e vias aéreas que serão visíveis. A orientação aqui descrita é ideal para a visualização de grandes vias aéreas, e parênquima. Os ratos têm um grande lóbulo esquerdo e quatro lobos menores à direita. Paraimagiologia PCLS seguinte introdução de alérgenos para os pulmões através da orofaringe ou aspiração intranasal, o lobo superior direito está normalmente em corte, em parte, porque é um tamanho conveniente, mas também porque os agentes inalados dispersar uniformemente dentro dele. No entanto, outros lobos, especialmente o lobo esquerdo, também pode ser estudado. Ao comparar estirpes de ratinho ou tratamentos, é importante para comparar o mesmo lobo.
2. Lung Slicing
NOTA: fazer fatias utilizando um cortador de automatizado, de metal arrefecimento bloco, e êmbolo da seringa metálica, de acordo com as instruções do fabricante.
- Colocar uma pequena gota de todos os fins, não-funcionamento supercola gel sobre o êmbolo e espalhar a cola em um movimento circular, tendo o cuidado de não permitir que a cola de contacto com os lados da seringa de metal. Se a cola toca os lados da seringa, que vai colar a seringa e o êmbolo juntos.
- Imediatamente depois de cobrir o êmbolo com cola, o agarrar suavementelóbulo excisado com uma pinça com o lado da traqueia para baixo, DAB-lo sobre um tecido para remover o excesso de líquido, e cuidadosamente colocá-lo na parte superior do êmbolo. Aparar qualquer tecido extra que se estende para além do bordo do êmbolo.
- Mover o êmbolo para baixo de modo que os lados da seringa de metal, e mover-se ao longo do tecido, criando um poço com o pulmão colado na parte inferior, não mais do que alguns centímetros de profundidade. Fita em torno do fundo da seringa de metal para manter esta posição no lugar.
- Cuidadosamente verter 2% de agarose de baixa de fusão a 40 ° C no poço de modo que apenas cobre a parte superior do lóbulo.
- Cercar a seringa de metal, com o bloco de arrefecimento arrefecido com gelo e arrefecer o lóbulo e agarose para 1-2 min.
NOTA: Um arrefecimento de tempo mais curto do que a agarose em torno do tecido poderia conduzir à desintegração da agarose durante o corte, o que pode resultar num corte PCLS desigualmente. - Carregar a seringa espécime para o fatiador automatizado e encher o tanque tampão com PBS gelado. Alinhe a a etapa de accionamento do motor, com a seringa de amostra e remover o pedaço de fita adesiva a partir do fundo. Rode o interruptor para a posição de avanço rápido (FF) até que a unidade de motor passo apenas toca a parte de trás do êmbolo.
- Alinhar a lâmina fresco com a seringa espécime. Conjunto espessura do tecido, contínua / única fatia, oscilação e velocidade no fatiador. Por exemplo, a espessura do tecido: 150? M, de corte contínua (cont.), Oscilação: 9, e a velocidade: 3 - 4. Pressione início. As configurações acima necessitar de ser ajustada com as especificações slicer automatizados específicos.
- Usando uma espátula fina ou pincel, recolher o PCLS um de cada vez enquanto caem para o tanque tampão e colocá-los em uma placa de 24 pos contendo PBS gelado.
NOTA: É importante manter as fatias, a fim de manter a consistência entre os experimentos. Embora cada pulmão é diferente, dependendo da idade, sexo e peso, a 10 de fatia, por exemplo, geralmente origina similarmente dimensionados vias aéreas.
- Conceber um painel de anticorpos marcados por fluorescência com base no tipo de cula de interesse, tendo em conta o potencial sobreposição espectral fluorescente e as capacidades de detecção do microscópio.
NOTA: Como um exemplo, um painel para a detecção subconjunto de DC é como se segue: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitação: 405 nm, pico de emissão: 605 nm), CD324 / E-caderina - Alexa 488 (AF488 ) (Excitação: 488 nm, do pico de emissão: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Ficoeritrina (PE) (Excitação: 561 nm, do pico de emissão: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (Excitação: 633 nm , do pico de emissão: 660 nm). Fluorescência ferramentas espectador espectrais (ver Lista de Materiais) são úteis para projetar painéis. - Realizar uma mistura de anticorpos que contêm os anticorpos desejados.
- Para imagiologia PCLS estático, adicionar 800 de tamp de colorao, 100 uL Fc blocker, 50 uL de soro normal de rato, e 50 uL de soro normal de rato a uma mL microcentrifu 1,5gação tubo para um volume total de 1 mL. Para imagem de células vivas, utilizar 800 uL de meio de Leibovitz (1x) contendo 10% de FBS (Leibovitz-10) em vez de tampão de coloração.
- Adicionar anticorpos para ajustar uma concentração final desejada de cada anticorpo. Transferir a solução de anticorpo a um prato de 3 centímetros, e manter-se no escuro até estar pronto para usar.
NOTA: As concentrações finais têm de ser optimizada para cada indivíduo anticorpo (geralmente 1-5 ug / ml).
- Escolher um PCLS com uma área anatómica de interesse, tais como grandes vias respiratórias ou periferia do pulmão, e colocar no prato 3-cm contendo uma solução de anticorpo mL.
- PCLS mancha no escuro, em gelo, de balanço lentamente durante 30 ou 60 min.
- Para imagens PCLS estático, vá para a seção 4. Para imagens de células vivas, avance para a secção 5.
4. estática de imagem de PCLS
- Após 60 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar tque corta duas vezes com 1 mL de PBS gelado.
- Pipetar 50 mL de PBS para um 3 cm rodada prato de vidro de fundo. Usando uma espátula ou pincel, transferir os PCLS coradas para a gota, manipulando suavemente a fatia até que seja plana e se espalhar. Remover o PBS com uma pipeta. A fatia deve situar-se o mais plano possível. Os procedimentos acima referidos necessitam de ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação.
- Colocar uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente para a fatia e suavemente gota uma lamela de vidro para dentro do poço da placa. Manter PCLS no escuro a 4 ° C durante até uma hora antes de imagem.
- Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Use a ferramenta "telha" para localizar e marcar as bordas do tecido na configuração "casco convexo". Isso ajudará a reduzir o tempo da varredura telha.
- Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia, especialmente ao longo das extremidades, que as gamas conjuntosão adequados.
NOTA: O z-range provavelmente terá de ser maior do que a espessura do tecido em si, porque é muito difícil obter o tecido para colocar completamente plana. Por exemplo, com um PCLS espessura de 150 um, na gama de z-pilha vai provavelmente precisar de ser ajustada para 200-250? M para acomodar obstáculos e curvas no fatia. Dependendo do intervalo de z-pilha e o tamanho do tecido, cada varrimento de pulmão total levará entre 7-12 h com uma objectiva 20X. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento.
5. Imagens de células vivas de PCLS
- Após 30 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar as fatias duas vezes com 1 ml de solução fria Leibovitz-10.
- Pipetar 50 mL fresco Leibovitz-10 em um slot de uma lamela câmaras (8 slots). Usar uma espátula para transferir os PCLS para a forma, manipulando-a suavemente até que a fatia é plana e se espalhar. Os procedimentos acima referidosprecisam ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação.
- Remover o meio 50 ul usando uma pipeta. A fatia é para ser deitada tão plana quanto possível.
NOTA: É aceitável, se as bordas da fatia são viradas para cima verticalmente contra a parede da câmara. Além disso, se disponível, um peso de metal platina pode ser utilizado para o ancorar a fatia antes de prosseguir para o próximo passo. Ver a Lista de Materiais ligado para um exemplo de fio de platina que pode ser cortado e dobrado em pequenos pesos. - Numa 4 ° C quarto frio, misturar 100 ul de crescimento reduzida-fator, fenol matriz extracelular livre de vermelho com 100 uL Leibovitz-10. Utilize pontas de pipeta pré-resfriada para isso, ou a matriz extracelular vai solidificar na ponta.
NOTA: O rácio da matriz e média (1: 1) cria um gel suficientemente denso para manter os PCLS para baixo em condições de cultura de tecidos. - Pipeta suavemente a matriz para misturar, e pipeta com cuidado em cima dos PCLS, certificando-se que o gel vai em cima da lung de fatia, e que a fatia não flutuar no topo do gel. O gel deve funcionar como um peso, ancorando as PCLS para baixo para o fundo da placa.
- transferir cuidadosamente as câmaras lamela para uma incubadora a 37 ° C e deixar a matriz para solidificar ~ 5 min.
- Transferir todo o lamela septadas para a fase pré-aquecido de um microscópio confocal. Manter a câmara a 37 ° C ao longo de imagiologia. Fornecimento de CO 2 não é necessário durante a incubação de células quando se utiliza meio de Leibovitz.
- Definir o intervalo de gama-z pilha e telha com base no intervalo desejado entre os quadros. Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Utilizar a ferramenta "telha" para denotar a área de interesse no tecido, usando a configuração de "rede" centrado (por exemplo, uma grade de 2x2 centrado).
- Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia que os intervalos definidos são adequados.
NOTA: O zrange provável será igual à espessura do tecido. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento. telhas 2x2 e 10 z-pilhas irá geralmente resultar em ~ um quadro / 2 min. Assegurar a função de auto-foco é activado antes de iniciar o experimento para minimizar XY e Z-tração durante o período de imagem.
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Representative Results
Para identificar a localização de dois subconjuntos de DC, CD11b CDCs hi e CD103 + CDCs, PCLS de ratinhos C57BL / 6 foram cortadas e coradas com anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, CD324 e (E-caderina). Os anticorpos para as células epiteliais das vias respiratórias, CD324 mancha e CD88 é apresentado sobre os macrófagos e neutrófilos, mas não CDCs 8. Isto permitiu-nos distinguir CDCs de CD11c + macrófagos, e de observar a relação espacial de cada tipo celular para as vias aéreas (Figura 1). Descobrimos que CD11b CDCs hi localizar no parênquima, enquanto CD103 + CDCs residem principalmente em torno das vias aéreas e da área subpleural. Embora CD103 + CDCs foram facilmente detectadas através de coloração directa de CD103 superfície celular nesta experiência, a detecção de CD11b oi CDCs baseou-se na ausência de CD88 e CD103 coloração. Para identificar diretamente CD11boi CDCs, primeiro tentaram PCLS mancha usando um mAb anti-CD11b (clone M1 / 70), que é amplamente usado em imuno-histoquímica e citometria de fluxo. No entanto, este mAb tinha um fundo elevado e baixa especificidade neste pedido, independentemente de qual fluorocromos foram conjugados com o mAb (Figura 2A, e dados não mostrados). Em contraste, os anticorpos para CD172a (SIRP1α) corado CD11b oi CDCs 18, mas as células não estruturais ou CD103 + CDCs (Figura 2B, e dados não mostrados). Por conta própria, anticorpos para CD172a não podiam discriminar entre CDCs e monócitos ou macrófagos. No entanto, por co-coloração com anticorpos contra CD88 e CD172a, fomos capazes de distinguir os macrófagos alveolares (CD172a - CD88 +) a partir de macrófagos intersticiais (CD172a + CD88 +), e CD11b CDCs hi (CD172a + CD88 -), e demonstram que as últimas células preferencialmente localizar noparênquima, não a área sub-epitelial (Figura 2C - F), em acordo com os nossos resultados obtidos por coloração indirecta destas células.
Estudo de migração intra-tecido de leucócitos requer a visualização de células estruturais, incluindo os dos vasos linfáticos, através do qual o tráfego de DC a partir de tecidos periféricos para LNs regionais. Na pele e linfonodos, vasos linfáticos são muitas vezes identificados utilizando mAbs para LYVE-1 ou podoplanina. No entanto, verificou-se que em PCLS, os mAbs para LYVE-1 e podoplanina manchar uma variedade de outros tipos de culas, incluindo endotio vascular e epitélio alveolar (dados não mostrados). Estes mAbs são, portanto, de utilização prática limitada para a identificação de vasos linfáticos especificamente em PCLS. No entanto, os mAbs para CD90.2 (Thy1.2), um marcador de célula T conhecido, estruturas linfáticas marcados, como se mostra anteriormente em outros tecidos 19, 20 (Figuras 3A, B Prox1 21 (Figura 3A, C). PROX1 é um factor de transcrição mestre que é necessário para a linfangiogénese 22. Prox1 TdTomato ratinhos transgénicos que exibem vasos linfáticos fluorescentes brilhantemente nos pulmões e outros tecidos tais como o fígado, lentes, o giro dentado e neuroendócrinos células da medula supra-renal 21. Com efeito, estes dois métodos de marcação deu padrões de coloração de sobreposição (Figura 3D). Usando estas abordagens de rotulagem, fomos capazes de determinar que CD103 + CDCs estavam presentes em várias áreas anatómicas, incluindo CD324-expressando epitélio das vias respiratórias, os vasos linfáticos, e a área subpleural (Figura 3A, E).
Além de imagem estática, movimento celular e celular para cell interacções podem ser gravados utilizando imagem de células vivas de PCLS (Filme 1). PCLS foram recentemente preparada a partir de ratinhos que tinham recebido injeces de células AT-II T-expressam GFP e instilao de OVA e LPS, coradas com mAbs contra CD103 (vermelho) e o epitélio das vias respiratórias (CD324, azul), e foram fotografadas para controlar a movimento de células CD103 + CDCs e T 16 h após a OVA / LPS instilação. Ao longo do vídeo (4 h), o movimento dinâmico de CD103 + DCs (vermelho) e as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos (verde) e da sua interacção são claramente visíveis (Filme 1).
Figura 1. Locais anatómicas distintas de CDC Subconjuntos como revelado por PCLS de coloração e microscopia confocal. A) PCLS inteiro de um C57BL / 6 não tratado de pulmão de rato corados com anticorpos diferentes. A cor da cada molécula é indicado pela sua cor da fonte (superior direito). Coloração individual e combinatória dá as seguintes cores para tipos de células de interesse: CD103 + CDCs (CD103 + CD11c + CD88 -; brancas), CD11b oi CDCs (CD11c + CD103 - CD88 -; vermelho), macrófagos (CD11c + CD88 +; amarelo ), neutrófilos (CD11c - CD88 +; verde) e células epiteliais das vias respiratórias (CD324 +; azul). B - D) Maior ampliação das inserções em A. B) CD11b CDCs hi localizar no parênquima. C) CD103 + CDCs redor das vias aéreas. D) CD103 + CDCs sob a pleura visceral. As barras brancas representam 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Coloração de DCs e macragos. A) Coloração de PCLS com anticorpos contra CD11b (azul) dá um fundo elevado no PCLS. B) Os anticorpos para CD172a (verde) tem um fundo relativamente baixa em PCLS e maior especificidade para culas CD11b +. C) PCLS Total de ratinhos C57BL / 6 coradas com mAbs cuja cor é indicado pela cor da fonte (superior direito). CD11c (vermelho), CD88 (ciano), CD172a (verde) e CD324 (azul). CD11b CDCs hi (CD11c + CD88 - CD172a +; amarelo), os macrófagos alveolares (CD11c + CD88 + CD172a -;-de-rosa), macrófagos intersticiais (CD11c + CD88 + CD172a +; branco), neutrófilos (CD11c - CD88 +; ciano) e das vias respiratórias (CD324 +; azul). D - F) Maior ampliação das inserçõesdescrito em C. D) Sub-pleural área. E) Sub-epitelial área. F) interstício. macrófagos intersticiais localizar no parênquima, e macrófagos alveolares estão em alvéolos. barras brancas não marcados denotar 50. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. marcação de células estruturais no PCLS. A) PCLS inteiros preparados a partir de Prox1 tdTomato rato, e coradas com mAb para CD90.2 (verde), CD103 (branco) e CD324 (azul). células que expressam Prox1 (vermelhas) são geneticamente marcado com TdTomato sob a regulação do promotor Prox1 (Prox1-TdTomato). B - E) Maior ampliação da inserção no
Filme 1. T células interagem com CD103 + CDCs no pulmão. Imagem de células vivas de CD103 + CDCs (vermelho) que interagem com células T (verde). As células T CD4 + isoladas a partir de murganhos GFP OVA específicas-OT-II Nur77 foram estimulados com DC esplénicas e OVA in vitro, e adoptivamente transferidos para Rag - / - de ratinho. wit 2 h mais tarde, o rato receptor foi tratadah OVA / LPS instilação para as vias respiratórias. 16 h após o tratamento OVA / LPS, PCLS foram feitas, coradas e fotografada durante 4 h a 37 ° C. a gravação de imagem (min) Tempo é mostrado. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Direito-clique para baixar).
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Discussion
O protocolo aqui descrito foi originalmente desenvolvido para visualizar os locais de dois subconjuntos de CDCs dentro do pulmão. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar muitos tipos de células diferentes, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade celular e a arquitectura tridimensional do pulmão. A última característica é uma vantagem importante em relação aos sistemas de cultura de células e facilita a identificação de tipos de células raras. O método baseia-se na geração de PCLS do pulmão, e de uma combinação adequada de anticorpos para identificar tipos específicos de células, enquanto minimiza a coloração de fundo. Em grande medida, este é um exercício empírico porque os anticorpos que funcionam bem em outras aplicações, incluindo citometria de fluxo, não necessariamente funcionam bem para a coloração PCLS. Já fizemos progressos consideráveis a este respeito, mas os investigadores que desejam estudar os tipos de células não tratadas aqui pode ter que testar diferentes anticorpos e otimizar fluorocromos e concentrações. Usando o protocolo aqui descrito, verificou-se que CD103 + CDCs e CD11b CDCs hi residir em localizações distintas no pulmão. No estado estacionário, CD103 + CDCs foram detectados em torno das vias aéreas e na região subpleural, enquanto que CD11b CDCs hi foram encontrados principalmente no parênquima. Embora o protocolo aqui descrito não é adequado para a coloração de moléculas intracelulares, que é útil para marcadores de superfície celular de imagem, bem como moléculas de secreção. Assim, nós fomos capazes de detectar o quimiocinas, CCL21 e CCL19, em PCLS (dados não mostrados). Se os sinais fluorescentes fracos única são vistos usando anticorpos primários, é possível a utilização de anticorpos secundários para amplificar os sinais.
Um desafio importante na condução da célula de vídeo de imagens ao vivo de PCLS era suficientemente para fixar o tecido no meio de cultura para evitar a significativa XY e Z-tração durante o período de microscopia de 4 h. Para resolver isso, nós experimentamoscom diferentes relações de meio de Leibovitz a matriz extracelular, que é sólido à temperatura ambiente, e uma determinada proporção de 1: 1 mantido, de uma estrutura 3D estável com a viabilidade celular. Durante o processamento pós-imagem, que também utilizada uma série de ImageJ plug-ins, chamado TurboReg e StackReg que eliminam qualquer xy incidental ou z-deslocamento adicional (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? ID = 18226). Usando a ferramenta de auto-foco do microscópio confocal, a região de interesse foi mantido em foco, especialmente no z-range, durante todo o período de digitalização. Outro desafio durante a imagens de células vivas de PCLS estava utilizando a digitalização azulejo, z-stack, séries temporais, e as funções de focagem automática do microscópio. Para minimizar o tempo entre cada quadro, um equilíbrio deve ser atingido entre o tempo gasto a digitalização de cada telha. Para otimizar o tempo de verificação em cada projeto de pesquisa, o número de z-stack, azulejos, e velocidades de digitalização precisam ser ajustadas.
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Disclosures
Os autores não têm qualquer conflito de interesses a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Jeff Tucker, Erica Scappini, e Agnes Janoshazi por sua ajuda com a microscopia, Ligon Perrow por sua gestão da colônia rato, e Jun Chen e Michael Sanderson para obter ajuda com o cortador de tecido, e Michael Fessler e Derek Cain para a leitura crítica o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo ramo intramural do NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), que por sua vez é patrocinado pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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