Summary
Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.
Abstract
La inhalación de alérgenos y patógenos provoca múltiples cambios en una variedad de tipos de células inmunes en el pulmón. La citometría de flujo es una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de proteínas de superficie celular sobre las células inmunes, pero no proporciona información sobre los patrones de localización y migración de estas células dentro del pulmón. Del mismo modo, los ensayos de quimiotaxis se pueden realizar para estudiar el potencial de las células para responder a factores quimiotácticos in vitro, pero estos ensayos no reproducen el complejo entorno del pulmón intacto. En contraste con estas técnicas antes mencionadas, la ubicación de distintos tipos de células dentro del pulmón puede ser visualizado fácilmente mediante la generación de corte de precisión de pulmón rebanadas (PCLS), la tinción con anticuerpos disponibles comercialmente, marcado con fluorescencia, y la visualización de las secciones por microscopía confocal. PCLS se pueden utilizar tanto para vivir y fijan el tejido pulmonar, y las rodajas pueden abarcar áreas tan grandes como una sección transversal de un lóbulo completo. Hemos utilizado este protocolo para visualizar correctamente la localización de una amplia variedad de tipos de células en el pulmón, incluyendo distintos tipos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T y células B, así como células estructurales tales como linfático, endotelial, y células epiteliales. La capacidad de visualizar las interacciones celulares, tales como las que existen entre las células dendríticas y las células T, en el tejido pulmonar en vivo, tridimensional, puede revelar cómo las células se mueven dentro del pulmón e interactúan uno con el otro en el estado estacionario y durante la inflamación. Por lo tanto, cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos, como la citometría de flujo y la PCR cuantitativa, PCLS puede contribuir a una comprensión global de eventos celulares que subyacen en las enfermedades alérgicas e inflamatorias del pulmón.
Introduction
Tras la inhalación de los estímulos pro-inflamatorias tales como lipopolisacárido (LPS), hay un movimiento coordinado de las células inmunes en, dentro de, y desde el pulmón. Por ejemplo, los neutrófilos se reclutan rápidamente en el parénquima pulmonar y de las vías respiratorias. Además, algunas células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas convencionales (CDC) se someten a un patrón de migración relativamente complejo 1, 2. CDC se pueden identificar utilizando la citometría de flujo, basadas en parte en su pantalla del marcador de la superficie, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs se pueden distinguir por la expresión en la superficie diferencial de CD103 y CD11b 3. Al adquirir antígeno inhalado, algunos CDCs salen del pulmón y migran a través de los vasos linfáticos a los nodos linfáticos pulmonares de drenaje (LNS) donde presentan péptidos de antígeno específico de células T 4. Este es un evento temprano crítico en la iniciación de r inmune adaptativaesponses. Por razones desconocidas, sin embargo, no todos los CDCs que adquieren antígenos inhalados salen del pulmón, y muchas de estas células permanecen en ese órgano durante varios meses 5, 6. Esta observación puede explicarse en parte por la ascendencia de desarrollo de estas células porque CD11c derivadas de monocitos + células que carecen del receptor de quimioquinas, CCR7, son incapaces de migrar a los LN regionales 7, 8. Parece probable que el potencial de migración de los CDC también está determinada, al menos en parte, por su posición anatómica dentro del pulmón. Sin embargo, la localización precisa de estas diferentes poblaciones de CDC en el pulmón no se caracteriza completamente. Un mejor conocimiento de la localización de las células inmunes en el pulmón, y de las moléculas que lo dirigen, es necesaria para una mejor comprensión de cómo se activa el sistema inmunológico del pulmón.
PCLS se están aumentandoly utiliza como un enfoque ex vivo para visualizar posicionamiento celular y interacciones célula-célula, mientras se mantiene la integridad estructural de la arquitectura pulmonar 9, 10. PCLS se han utilizado para estudiar los pulmones de muchas especies, incluyendo ratones, vacas, monos, ovejas, caballos y seres humanos 11. Una ventaja principal de esta técnica es que aproximadamente 20 rebanadas se pueden preparar a partir de un único lóbulo de un pulmón de ratón, lo que reduce el número de animales necesarios para los experimentos individuales. Prácticamente todos los tipos de células inmunes, incluyendo DCs, macrófagos, neutrófilos y células T, están presentes en PCLS y mantener sus estructuras normales.
PCLS también se puede utilizar para estudiar la señalización del calcio y de la contractilidad de las células de las vías respiratorias y el músculo liso después del tratamiento con la acetilcolina 12 o metacolina 13. En este enfoque, sólo una pequeña porción del pulmón es unaalyzed microscópicamente, pero un estudio informó que las mediciones de contracción de las vías respiratorias en PCLS varían sólo alrededor del 10% a partir de la rebanada de cortar, y esta variación es comparable a la observada usando pruebas de función pulmonar en animales intactos 14. Otros investigadores han utilizado PCLS como un enfoque ex vivo para estudiar los cambios en la expresión de citocinas y marcadores de la superficie celular después de la incubación con LPS 15. PCLS también se han utilizado en un modelo ex vivo de la vasoconstricción pulmonar hipóxica en pequeñas arterias intra-acinares. Estos vasos se encuentran en la parte del pulmón que no puede ser alcanzado mediante otros procedimientos, incluyendo las grabaciones de segmentos o análisis de los vasos subpleurales 16 arteriales diseccionados. Nuestro laboratorio ha utilizado principalmente PCLS para visualizar la localización de células inmunes en el tejido pulmonar en vivo en estado estacionario, y tras un estímulo inflamatorio in vivo. Los procedimientos que hemos desarrollado para esto son las siguientes.
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Protocol
procedimientos experimentales con animales descritos en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de NIEHS (IACUC).
1. Pulmón Preparación
- Los ratones domésticos entre 6 y 12 semanas de edad en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices establecidas por los Comités de Cuidado y Uso de Animales institucional.
NOTA: Imaged ratones pueden ser ingenuo, o tratada, dependiendo de los intereses específicos de cada investigador. A continuación, describimos la localización de células inmunes en los ratones no tratados previamente y en ratones tratados con 100 mg de ovoalbúmina (OVA) y 0,1 g de lipopolisacárido (LPS), utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) como vehículo en un volumen total de 50! L. Para inculcar oropharyngeally OVA / LPS en las vías respiratorias, los animales fueron anestesiados con inhalación de isoflurano y verticalmente suspendidas por sus dientes con una banda de goma. La lengua se agarró suavemente con fórceps y se mantuvo a un lado para evitar que tragar, y 50 & #181; L de la solución de OVA / LPS depositado en la parte posterior de la cavidad oral como se describió anteriormente 17. - La eutanasia del ratón con inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg), y el pin del animal a una base de poliestireno.
- Abra la cavidad abdominal con tijeras cortando la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula. Tirar de los intestinos a un lado con fórceps o el borde romo de las tijeras y cortar la vena cava inferior para drenar la sangre desde los pulmones. Perforar el diafragma con la punta afilada de las tijeras para permitir la expansión de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar los pulmones.
- glándulas salivares y otros tejidos claros lejos de la tráquea por el acaparamiento y el tejido manualmente tirando de él lejos de la tráquea subyacente con unas pinzas. Hacer una pequeña incisión en la tráquea en la cara anterior de la banda gruesa de cartílago utilizando unas pinzas finas o tijeras, teniendo cuidado de no cortar todo el camino a través de la traChea. La incisión será lo suficientemente grande como para permitir que una aguja 20 G pase a través.
- Deslizar un 1,5 pulgadas, 20 aguja G sobre una sección de tubo de polietileno, dejando aproximadamente 1 cm de tubo más allá del extremo de la aguja. Corte el tubo en un ángulo de aproximadamente 45 ° para biselar el extremo, conecte la aguja a una jeringa de 1 ml, y la carga de la jeringa mediante la elaboración 0,8 ml de tibia (40 ° C) 2% de bajo punto de fusión de agarosa a través de la aguja.
- Coloque el extremo del tubo en la incisión de la tráquea e inyectar lentamente la agarosa en los pulmones. Sin mover la aguja o jeringa, la cinta de la jeringa a la base de poliestireno para asegurar la aguja permanece en la tráquea.
NOTA: Después de la inyección, los pulmones será más grande y se infla dentro del pecho. Los lóbulos derechos expanden primero, luego el lóbulo izquierdo. Si sólo hay un lóbulo se expande, la aguja se ha insertado demasiado profundamente (pasado el bronquio), y será necesario para tirar de él hacia fuera ligeramente antes de proceder. Esta parte de laprocedimiento que hay que hacer con relativa rapidez, antes de que la agarosa comienza a solidificarse. - Coloque el ratón, con la base y la jeringa aún insertada en la tráquea, en una habitación fría o en el refrigerador durante al menos 10 min. Si es necesario, el animal puede mantenerse allí por hasta varias horas, incluso si proceder a la migración de células de imagen por microscopía de vídeo.
- Una vez que el ratón es frío, escindir cuidadosamente los pulmones de agarosa-inflado con unas tijeras, y colocarlos en una placa de 3 cm con PBS enfriado en hielo. Mantener en hielo.
- Elige el lóbulo deseada para cortar en rodajas de tejido (por ejemplo, el lóbulo superior derecho). Asegúrese de que la parte interior de los pulmones (donde se conecta a la tráquea) está boca abajo en el plato.
NOTA: El lóbulo utiliza y su orientación en el émbolo determinará el tamaño de los vasos y las vías respiratorias que serán visibles. La orientación se describe aquí es ideal para la visualización de las vías respiratorias grandes, y el parénquima. Los ratones tienen un gran lóbulo izquierdo y cuatro lóbulos más pequeños de la derecha. porformación de imágenes PCLS después de la introducción de los alergenos en los pulmones a través de la orofaringe o aspiración intranasal, el lóbulo superior derecho está típicamente seccionado, en parte debido a que es un tamaño conveniente, pero también porque los agentes inhalados dispersar uniformemente dentro de ella. Sin embargo, otros lóbulos, especialmente el lóbulo izquierdo, también pueden ser estudiados. Al comparar las cepas de ratón o tratamientos, es importante comparar el mismo lóbulo.
2. Pulmón rebanar
NOTA: rebanadas utilizando una máquina de cortar automatizado, metal de refrigeración de bloque, el émbolo y la jeringa de metal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Ponga una pequeña gota de todo uso, sin plazo pegamento gel sobre el émbolo y separar el pegamento en un movimiento circular, teniendo cuidado de no dejar que el pegamento toque los lados de la jeringa de metal. Si el pegamento toca los lados de la jeringa, se pega la jeringa y el émbolo juntos.
- Inmediatamente después de cubrir el émbolo con pegamento, agarre suavemente ellóbulo extirpado con pinzas con el lado tráquea hacia abajo, DAB en un tejido para eliminar el exceso de líquido, y que lo coloque en la parte superior del émbolo. Se quita tejido adicional que se extiende más allá del borde del émbolo.
- Mover el émbolo hacia abajo de manera que los lados de la jeringa de metal se mueven hacia arriba y sobre el tejido, creando un bien con el de pulmón, pegada en la parte inferior, no más de varios centímetros de profundidad. Cinta alrededor de la parte inferior de la jeringa de metal para mantener esta posición en su lugar.
- Con cuidado, vierta 2% de agarosa de baja fusión a 40 ° C en el pozo por lo que sólo cubre la parte superior del lóbulo.
- Rodea la jeringa de metal con el bloque de refrigeración enfriado con hielo y enfriar el lóbulo y agarosa para 1 - 2 min.
NOTA: Un enfriamiento de tiempo más corto de la agarosa que rodea el tejido podría conducir a la desintegración de la agarosa durante el corte, lo que podría resultar en un PCLS desigual cortar. - Cargar la jeringa ejemplar en la máquina de cortar automatizado y llene el tanque tampón con PBS enfriado en hielo. alinear el el paso de accionamiento del motor con la jeringa de muestra y retirar el trozo de cinta de la parte inferior. Coloque el interruptor en la posición de avance rápido (FF) hasta que la unidad de motor paso a paso que toque la parte posterior del émbolo.
- Alinear la hoja fresca con la jeringa de la muestra. espesor Set tejido, continua / rebanada única, la oscilación y la velocidad en la máquina de cortar. Por ejemplo, el espesor del tejido: 150 m, corte continuo (cont.), La oscilación: 9, y la velocidad: 3 - 4. Pulse comienzo. Los ajustes anteriores necesitan ser ajustados a las especificaciones máquina de cortar automatizados específicos.
- Usando una espátula fina o pincel, recoger el PCLS uno a la vez a medida que caen en el tanque tampón y los colocan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS enfriado en hielo.
NOTA: Es importante mantener las rebanadas con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos. Aunque cada pulmón es diferente dependiendo de la edad, sexo y peso, el 10 de rebanada, por ejemplo, generalmente rendimientos de tamaño similar vías respiratorias.
- Diseño de un panel de anticuerpos marcados con fluorescencia en función del tipo de célula de interés, teniendo en cuenta el potencial solapamiento espectral fluorescente y las capacidades de detección del microscopio.
NOTA: Como un ejemplo, un panel para la detección subconjunto DC es el siguiente: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitación: 405 nm, pico de emisión: 605 nm), CD324 / E-cadherina - Alexa 488 (AF488 ) (excitación: 488 nm, emisión de pico: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - ficoeritrina (PE) (excitación: 561 nm, emisión de pico: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (excitación: 633 nm , pico de emisión: 660 nm). Fluorescencia herramientas de visualización espectrales (ver Lista de Materiales) son útiles para diseñar paneles. - Hacer una cóctel de anticuerpos que contiene los anticuerpos deseados.
- Para imágenes PCLS estático, añadir 800 l de tampón de tinción, 100! L Fc blocker, 50! L de suero de ratón normal, y 50! L de suero de rata normal a un ml microcentrifu 1,5tubo gación para un volumen total de 1 ml. Para imágenes de células vivas, utilice 800 medio de l Leibovitz (1x) que contiene 10% de FBS (Leibovitz-10) en lugar de tampón de tinción.
- Añadir anticuerpos para ajustar una concentración final deseada de cada anticuerpo. Transferir la solución de anticuerpo a un plato de 3 cm, y mantener en la oscuridad hasta que esté listo para su uso.
NOTA: Las concentraciones finales necesitan ser optimizados para cada anticuerpo individuo (por lo general de 1 - 5 mg / ml).
- Elegir un PCLS con un área anatómica de interés, tales como las vías respiratorias grandes o periferia del pulmón, y el lugar en el plato 3-cm que contiene 1 ml solución de anticuerpo.
- PCLS la mancha en la oscuridad, en el hielo, mecedoras lentamente durante 30 o 60 min.
- Para la imagen PCLS estática, vaya a la sección 4. Para imágenes de células vivas, pase a la sección 5.
4. estática de imagen de PCLS
- Después de 60 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuague tque rebana dos veces con 1 ml de hielo frío PBS.
- Pipetear 50 l de PBS en un 3 cm plato de fondo redondo de vidrio. Usando una espátula o pincel, transferir la PCLS manchadas a la baja, manipular con cuidado el corte hasta que quede plano y hacia fuera. Retire el PBS con una pipeta. El corte debe estar lo más plana posible. Los procedimientos anteriores deben realizarse rápidamente para evitar photobleaching.
- Colocar 1 gota de medio de montaje temperatura ambiente sobre la rebanada y soltar suavemente un cubreobjetos de vidrio en el pozo de la placa. Mantenga PCLS en la oscuridad a 4 ° C durante hasta una hora antes de formación de imágenes.
- Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de "baldosas" para localizar y marcar los bordes del tejido en el ajuste "casco convexo". Esto ayudará a reducir el tiempo de la exploración del azulejo.
- Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada, especialmente a lo largo de los bordes, que los intervalosson apropiados.
NOTA: El Z-rango probable tendrá que ser mayor que el espesor del tejido en sí, ya que es muy difícil conseguir que el tejido se encontraba completamente plana. Por ejemplo, con un PCLS gruesa 150! M, probablemente tendrá que ser fijado a 200 el rango z-stack - 250 micras para acomodar los golpes y las curvas de la rebanada. Dependiendo del rango de z-pila y el tamaño del tejido, cada exploración de pulmón completo tomará entre 7-12 h con un objetivo 20X. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento.
5. Imágenes de células vivas de PCLS
- Después de 30 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuagar las rodajas dos veces con 1 ml fríos Leibovitz-10.
- Pipeta fresco 50 l Leibovitz-10 en una ranura de un cubreobjetos cámaras (8 ranuras). Use una espátula para transferir la PCLS al medio, manipular con cuidado hasta que el corte es plana y extenderse. Los procedimientos anterioresnecesario llevar a cabo rápidamente para evitar photobleaching.
- Eliminar el medio 50 l usando una pipeta. El corte está mintiendo a ser lo más plana posible.
NOTA: Es aceptable si los bordes de la rodaja estén levantados verticalmente contra la pared de la cámara. Además, si está disponible, un peso de platino metal puede ser utilizado para anclar la rebanada antes de proceder al siguiente paso. Ver la Lista de materiales adjunta de un ejemplo de alambre de platino que se puede cortar y doblar en pequeñas pesas. - En un 4 ° C habitación fría, mezclar 100 l de crecimiento reducido factor, fenol matriz extracelular libre de rojo con 100! L Leibovitz-10. Utilice puntas de pipeta preenfriados para esto, o la matriz extracelular se solidificará en la punta.
NOTA: Esta proporción de matriz y medio (1: 1) crea un gel suficientemente denso para mantener los PCLS en condiciones de cultivo de tejidos. - pipetear suavemente la matriz para mezclar, y la pipeta con cuidado en la parte superior de la PCLS, asegurándose de que el gel va en la parte superior de la lung rebanada, y que la rebanada no flota en la parte superior del gel. El gel debe trabajar como un peso, el anclaje de los PCLS hacia abajo sobre la parte inferior de la placa.
- transferir con cuidado el cubreobjetos con cámaras a una incubadora a 37 ° y dejar que la matriz se solidifique durante ~ 5 min.
- Transferir todo el cubreobjetos de cámara en la etapa de pre-calentado de un microscopio confocal. Mantener la cámara a 37 ° C en toda la imagen. No se requiere suministro de CO 2 durante la incubación de células cuando se utiliza medio de Leibovitz.
- Establecer el rango de gama Z-pila y el azulejo basado en el intervalo deseado entre bastidores. Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de "baldosas" para denotar el área de interés en el tejido, usando el ajuste "rejilla centrada" (por ejemplo, una cuadrícula de 2x2 centrada).
- Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada que los intervalos son apropiados.
NOTA: El zrange probable será igual al espesor del tejido. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento. azulejos 2x2 y 10 z-pilas generalmente resultará en ~ 1 marco / 2 min. Asegúrese de que la función de enfoque automático se activa antes de iniciar el experimento para minimizar xy y z-deriva durante el período de formación de imágenes.
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Representative Results
Para identificar la ubicación de dos subconjuntos de DC, CD11b CDCs hi y CD103 + CDC, PCLS de ratones C57BL / 6 fueron cortadas y teñidas con anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, y CD324 (E-cadherina). Los anticuerpos frente a células epiteliales de las vías respiratorias mancha CD324, CD88 y se visualiza en los macrófagos y neutrófilos, pero no CDCs 8. Esto nos permitió distinguir CDCs de CD11c + macrófagos, y observar la relación espacial de cada tipo de células a las vías respiratorias (Figura 1). Hemos encontrado que CD11b CDC hi localizan en el parénquima, mientras que CD103 + CDC residen principalmente en torno a las vías respiratorias y la zona subpleural. Aunque CD103 + CDC se detectaron fácilmente por tinción directa de CD103 de la superficie celular en este experimento, la detección de CD11b hi CDC se basó en la ausencia de CD88 y CD103 tinción. Para identificar directamente CD11bhi CDC, que primero intentó PCLS mancha usando un anticuerpo anti CD11b mAb (clon M1 / 70), que es ampliamente utilizado en inmunohistoquímica y citometría de flujo. Sin embargo, este mAb tenía un alto fondo y baja especificidad en esta solicitud, independientemente de que los fluorocromos se conjugaron con el mAb (Figura 2A, y los datos no presentados). Por el contrario, los anticuerpos para CD172a (SIRP1α) tiñeron CD11b hi CDC 18, pero las células no estructurales o CD103 + CDC (Figura 2B, y datos no mostrados). Por su cuenta, los anticuerpos para CD172a no podían discriminar entre CDC y monocitos o macrófagos. Sin embargo, por co-coloración con anticuerpos contra CD88 y CD172a, hemos sido capaces de distinguir los macrófagos alveolares (CD172a - CD88 +) a partir de macrófagos intersticiales (CD172a + CD88 +), y CD11b CDCs hi (CD172a + CD88 -), y muestran que las últimas células se localizan preferentemente en laparénquima, no el área sub-epitelial (Figura 2C - F), de acuerdo con nuestros resultados obtenidos por tinción indirecta de estas células.
Estudio de la migración intra-tejido de leucocitos requiere la visualización de las células estructurales, incluidos los de los vasos linfáticos, a través del cual el tráfico de DCs de los tejidos periféricos a los LN regionales. En la piel y los LN, vasos linfáticos a menudo se identifican usando mAbs para LYVE-1 o Podoplanin. Sin embargo, hemos encontrado que en PCLS, mAbs para LYVE-1 y Podoplanin mancha una variedad de otros tipos celulares, incluyendo el endotelio vascular y el epitelio alveolar (datos no mostrados). Estos anticuerpos monoclonales son, por tanto, de utilidad práctica limitada para identificar específicamente los vasos linfáticos en PCLS. Sin embargo, los mAbs a CD90.2 (Thy1.2), un conocido marcador de células T, estructuras linfáticas marcadas, como se muestra anteriormente en otros tejidos 19, 20 (figuras 3A, B Prox1 21 (Figura 3A, C). PROX1 es un factor de transcripción maestro que es necesario para la linfangiogénesis 22. Prox1 tdTomato ratones transgénicos exhiben vasos linfáticos fluorescentes brillantes en los pulmones y otros tejidos tales como las células del hígado, lente, gyrus dentado y neuroendocrinas de la médula suprarrenal 21. De hecho, estos dos métodos de etiquetado dieron patrones de tinción que se solapan (Figura 3D). El uso de estos enfoques de etiquetado, hemos sido capaces de determinar que CD103 + CDCs estaban presentes en varias áreas anatómicas, incluyendo CD324-expresión de epitelio de las vías respiratorias, los vasos linfáticos, y el área subpleural (Figura 3A, E).
Además de proyección de imagen estática, el movimiento celular y celular para cell interacciones pueden ser grabados utilizando imágenes de células vivas de PCLS (Película 1). PCLS estaban recién preparados a partir de ratones que habían recibido inyecciones de células y la instilación de OVA y LPS OT-II T que expresan GFP, se tiñeron con mAbs contra CD103 (rojo) y el epitelio de las vías respiratorias (CD324, azul), y se obtuvieron imágenes para rastrear la movimiento de las células CD103 + CDCs y T 16 h después de OVA / LPS instilación. En el transcurso de la de vídeo (4 h), el movimiento dinámico de CD103 + DCs (rojo) y las células T específicos de OVA adoptiva transferidos (verde) y su interacción son claramente visibles (Película 1).
Figura 1. Ubicaciones anatómicas distintas de CDC subconjuntos según lo revelado por PCLS tinción y microscopía confocal. A) Total PCLS de un sin tratar ratones C57BL / 6 de pulmón de ratón teñidas con diversos anticuerpos. El color de cada molécula se indica por su color de la fuente (parte superior derecha). Tinción individual y combinatoria da los siguientes colores para tipos de células de interés: CD103 + CDC (CD103 + CD11c + CD88 -; blancos), CD11b hi CDC (CD11c + CD103 - CD88 -; rojo), macrófagos (CD11c + CD88 +; amarillo ), neutrófilos (CD11c - CD88 +; verde) y las células epiteliales de las vías respiratorias (CD324 +; azul). B - D) Mayor aumento de las inserciones en A. B) CD11b CDC hi localizan en el parénquima. C) CD103 + CDCs rodean las vías respiratorias. D) CD103 + CDC debajo de la pleura visceral. Las barras blancas representan 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tinción de las DC y los macrófagos. A) La tinción de PCLS con anticuerpos frente a CD11b (azul) da un alto fondo en PCLS. B) Los anticuerpos frente a CD172a (verde) tienen un fondo relativamente baja en PCLS y mayor especificidad para las células CD11b +. C) Total PCLS de ratones C57BL / 6 teñidas con mAbs cuyo color se indica por color de la fuente (parte superior derecha). CD11c (rojo), CD88 (cian), CD172a (verde) y CD324 (azul). CD11b CDCs HI (CD11c + CD88 - CD172a +; amarillo), los macrófagos alveolares (CD11c + CD88 + CD172a -; rosa), macrófagos intersticiales (CD11c + CD88 + CD172a +; blanco), neutrófilos (CD11c - CD88 +; cian) y vías respiratorias (CD324 +; azul). D - F) Mayor aumento de las insercionesrepresentado en C. D) Sub-pleural zona. E) Sub-epitelial zona. F) intersticio. macrófagos intersticiales se localizan en el parénquima, y los macrófagos alveolares están en los alvéolos. barras blancas sin etiquetas denotan 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. marcaje de las células estructurales en PCLS. A) PCLS enteros preparados a partir de Prox1 tdTomato ratón, y se tiñeron con mAbs a CD90.2 (verde), CD103 (blanco) y CD324 (azul). células Prox1 que expresan (rojo) están genéticamente etiquetados con tdTomato bajo la regulación del promotor Prox1 (Prox1-tdTomato). B - E) Un mayor aumento de la inserción en el
Película 1. T interactúan las células con CD103 + CDCs en el pulmón. Imágenes de células vivas de CD103 + CDC (rojo) que interactúa con las células T (verde). Células T CD4 + aisladas de ratones específicos de OVA gfp OT-II Nur77 se estimularon con DCs esplénicos y OVA in vitro, y de manera adoptiva transferidos a Rag - / - ratón. ingenio 2 h más tarde, el ratón receptor fue tratadoh OVA / LPS instilación a la vía aérea. 16 h después del tratamiento OVA / LPS, se hicieron PCLS, se tiñeron y la imagen durante 4 horas a 37 ° C. se muestra la grabación de imagen (min) Tiempo. Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
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Discussion
El protocolo descrito aquí fue desarrollado originalmente para visualizar las ubicaciones de dos subconjuntos de CDC dentro del pulmón. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar muchos tipos de células diferentes, mientras que el mantenimiento de la viabilidad celular y la arquitectura tridimensional de los pulmones. Esta última característica es una ventaja importante sobre los sistemas de cultivo celular y facilita la identificación de tipos de células raras. El método se basa en la generación de PCLS desde el pulmón, y una combinación adecuada de anticuerpos para identificar tipos específicos de células mientras se minimiza la tinción de fondo. En gran medida, esto es un ejercicio empírico porque los anticuerpos que funcionan bien en otras aplicaciones, incluyendo citometría de flujo, no necesariamente funcionan bien para la tinción PCLS. Ya hemos hecho progresos considerables en este sentido, pero los investigadores que desean estudiar los tipos de células que no se abordan aquí podríamos tener que probar diferentes anticuerpos y optimizar fluorocromos y concentraciones. Utilizando el protocolo descrito aquí, se encontró que CD103 + y CD11b CDC CDC hi residen en localizaciones distintas en el pulmón. En estado estacionario, CD103 + CDC se detectó alrededor de las vías respiratorias y en la región subpleural, mientras que CD11b CDCs hi se encontraron principalmente en el parénquima. Aunque el protocolo como se describe aquí no es adecuado para la tinción de moléculas intracelulares, es útil para los marcadores de la superficie celular de formación de imágenes, así como moléculas secretoras. Por lo tanto, hemos sido capaces de detectar la quimiocinas, CCL21 y CCL19, en PCLS (datos no mostrados). Si las señales fluorescentes solamente débiles se ven usando anticuerpos primarios, es posible utilizar anticuerpos secundarios para amplificar dichas señales.
Un reto importante al llevar a cabo en vivo de células de vídeo de imágenes de PCLS era para anclar suficientemente el tejido en medio de cultivo para evitar xy significativa y z-deriva durante el período de microscopía 4-h. Para hacer frente a esto, se ha experimentadocon diferentes relaciones de medio de Leibovitz a la matriz extracelular, que es sólido a temperatura ambiente, y se determina una relación 1: 1 mantiene una estructura estable, 3D con la viabilidad celular. Durante el procesamiento post-imagen, también utilizamos una serie de ImageJ plug-ins, llamado TurboReg y StackReg que eliminar cualquier xy incidental o z-shift adicional (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Con la herramienta de enfoque automático del microscopio confocal, la región de interés se mantuvo en el enfoque, especialmente en el z-gama, durante todo el período de exploración. Otro reto durante la imágenes de células vivas de PCLS estaba utilizando el escaneo de baldosas, z-pila, series de tiempo y funciones de enfoque automático del microscopio. Para reducir al mínimo el tiempo entre cada fotograma, una debe lograrse un equilibrio entre el tiempo dedicado a la exploración de cada baldosa. Para optimizar el tiempo de exploración en cada proyecto de investigación, el número z-pila, azulejos, y velocidades de exploración necesitan ser ajustados.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Jeff Tucker, Erica Scappini, y Agnes Janoshazi por su ayuda con la microscopía, Ligon Perrow por su gestión de la colonia de ratones, y Jun Chen y Michael Sanderson para obtener ayuda con la máquina de cortar el tejido, y Michael Fessler y Derek Cain para la lectura crítica el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la rama intramural del NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), que a su vez está patrocinado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
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