Summary
Vi beskriver ett förfarande för generering Precision-cut Lung skivor (PCLS) och immunfärgning dem att visualisera lokalisering av olika immuncelltyper i lungan. Vår protokoll kan utvidgas till att visualisera placeringen och funktionen hos många olika celltyper under olika förhållanden.
Abstract
Inandning av allergener och patogener framkallar flera ändringar i olika immuncelltyper i lungorna. Flödescytometri är en kraftfull teknik för kvantitativ analys av cellyteproteiner på immunceller, men det ger ingen information om de lokaliserings- och migrationsmönster av dessa celler i lungorna. På samma sätt kan kemotaxianalyser utföras för att undersöka potentialen hos celler att svara på kemotaktiska faktorer in vitro, men dessa analyser inte återge den komplexa miljö av den intakta lungan. I motsats till dessa tidigare nämnda metoder, kan placeringen av individuella celltyper inom lungan lätt visualiseras genom att generera Precision-cut Lung skivor (PCLS), färgning dem med kommersiellt tillgängliga, fluorescensetikette antikroppar, och visualisera sektionerna med konfokalmikroskopi. PCLS kan användas för både levande och fixerade lungvävnad, och skivorna kan omfatta områden som stor som en tvärsektion av en hel lob. Vi har använt detta protokoll för att framgångsrikt visualisera placeringen av ett stort antal olika celltyper i lungan, inklusive olika typer av dendritiska celler, makrofager, neutrofiler, T-celler och B-celler, såväl som strukturella celler såsom lymfatiska, endoteliala och epiteliala celler. Förmågan att visualisera cellulära interaktioner, såsom de mellan dendritiska celler och T-celler, i levande, tredimensionell lungvävnad, kan avslöja hur celler rör sig inom lungan och samverkar med varandra vid steady state och vid inflammation. Sålunda, när det används i kombination med andra förfaranden, såsom flödescytometri och kvantitativ PCR, kan PCLS bidra till en omfattande förståelse av cellulära händelser som ligger bakom allergiska och inflammatoriska sjukdomar i lungan.
Introduction
Efter inhalation av pro-inflammatoriska stimuli, såsom lipopolysackarid (LPS), finns det en koordinerad rörelse av immunceller till, inom och från lungan. Till exempel är neutrofiler snabbt rekryteras till lungparenkym och luftvägar. Dessutom är vissa professionella antigenpresenterande celler som är kända som konventionella dendritiska celler (CDCs) genomgå en relativt komplex migreringsmönster 1, 2. CDCs kan identifieras med användning av flödescytometri, delvis baserade på deras visning av ytan markör, CD11c. Distinkta undergrupper av DC: er kan särskiljas genom den differentiella ytexpression av CD103 och CD11b 3. Vid förvärvet inhalerad antigen, vissa CDCs lämna lungan och migrera genom lymfkärlen till lung-dränerande lymfkörtlar (LNS) där de presenterar peptider till antigenspecifika T-celler 4. Detta är en kritisk tidig händelse i inledningen av adaptiva immun responses. Av okänd anledning, dock inte alla CDCs som förvärvar inhalerade antigener lämna lungan, och många av dessa celler kvar i det organ i flera månader 5, 6. Denna observation kan delvis förklaras av den utvecklings anor av dessa celler eftersom monocyt-härledd CD11 + celler som saknar kemokinreceptorn, CCR7, är oförmögna att migrera till de regionala LNS 7, 8. Det verkar troligt att migrations potential CDCs också bestäms, åtminstone delvis, genom sin anatomiska position inom lungan. Emellertid är den exakta lokaliseringen av dessa olika populationer av CDCs i lungan inte fullständigt karakteriserad. En förbättrad kunskap om immunceller lokalisering i lungan, och de molekyler som styr det behövs en bättre förståelse för hur immunsystemet hos lungan blir aktiverad.
PCLS håller på att ökaly används som en ex vivo-metod för att visualisera cellulära positionering och cell-cellinteraktioner, under bibehållande av den strukturella integriteten hos lungarkitekturen 9, 10. PCLS har använts för att studera lungorna hos många arter, däribland möss, nötkreatur, apor, får, hästar och människor 11. En stor fördel med denna teknik är att ungefär 20 skivor kan framställas från en enda lob hos en mus lunga, vilket minskar antalet djur som behövs för individuella experiment. I stort sett alla immuncelltyper, inkluderande DCs, makrofager, neutrofiler och T-celler, är närvarande i PCLS och underhålla sina normala strukturer.
PCLS kan också användas för att studera kalciumsignalering och kontraktilitet av luftvägs- och glatta muskelceller efter behandling med acetylkolin 12 eller metakolin 13. I detta tillvägagångssätt är endast en liten del av lungan enalyzed mikroskopiskt, men en studie rapporterade att mätningar av luftvägssammandragning i PCLS varierar endast ca 10% från skivdel att skiva, och detta variansen är jämförbar med den som ses med användning av lungfunktionstest i intakta djur 14. Andra forskare har använt PCLS som en ex vivo tillvägagångssätt för att studera förändringar i cytokin expressions och cellytemarkörer efter inkubering med LPS 15. PCLS har också använts i en ex vivo modell av hypoxisk pulmonell kärlsammandragning i små intra-acinar artärer. Dessa fartyg är belägna i den del av lungan som inte kan nås med användning av andra förfaranden, inklusive inspelningar från dissekerade arteriella segment eller analys av subpleural kärl 16. Vårt laboratorium har främst använt PCLS att visualisera immunceller lokalisering i levande lungvävnad vid steady state och efter en in vivo inflammatorisk stimulans. Procedurerna vi har utvecklat för detta är följande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur experimentella procedurer som beskrivs i detta dokument har godkänts av NIEHS Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Lung Framställning
- Hus möss mellan 6 och 12 veckors ålder i specifika patogenfria förhållanden i enlighet med de riktlinjer som tillhandahålls av Institutional Animal Care och användning kommittéerna.
OBS: avbildas möss kan vara antingen naiv eller behandlas, beroende på varje forskarens specifika intressen. Här beskriver vi immuncell lokalisering i naiva möss och hos möss behandlade med 100 | j, g ovalbumin (OVA) och 0,1 ug lipopolysackarid (LPS), med användning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som en vehikel i en total volym av 50 | il. Att oropharyngeally ingjuta OVA / LPS i luftvägarna, sövdes djuren med isofluran inandning och vertikalt upphängd i sina tänder med ett gummiband. Tungan försiktigt förstått med pincett och höll åt sidan för att undvika att svälja, och 50 & #181; L i OVA / LPS-lösning avsattes på baksidan av munhålan såsom tidigare beskrivits 17. - Avliva musen med intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (100 mg / kg), och stift djuret till en polystyren-bas.
- Öppna bukhålan med en sax genom att skära huden och bukhinnan från mitten av buken upp till käken. Dra tarmarna undan med pincett eller tråkig kanten av sax och klippa den nedre vena cava rinna bort blod från lungorna. Punktera membranet med den vassa spetsen på saxen för att möjliggöra expansion av bröstkorgen, är noga med att inte skära i lungorna.
- Tydliga spottkörtlar och annan vävnad från luftstrupen genom att ta tag i vävnaden och manuellt dra bort den från den underliggande luftstrupen med pincett. Gör ett litet snitt i luftstrupen på den främre sidan av den tjockaste band av brosk med fin pincett eller sax, försiktigt så att inte skära hela vägen även om trachea. Snittet kommer att vara precis tillräckligt stor för att tillåta en 20 G nål för att passera igenom.
- Skjut en 1,5 tum, 20 G nål på en sektion av polyetenrör, vilket lämnar ungefär 1 cm av slangen förbi änden av nålen. Skär röret vid en vinkel av ungefär 45 ° för att fasa av änden, fast nålen till en 1 ml spruta, och ladda sprutan genom att rita 0,8 ml varmt (40 ° C) 2% lågsmältande agaros upp genom nålen.
- Placera änden av slangen i snittet av luftstrupen och långsamt injicera agarosen in i lungorna. Utan att flytta nålen eller sprutan, tejpa sprutan till polystyren bas för att säkerställa att nålen stannar kvar i luftstrupen.
OBS: Efter injektionen kommer lungorna vara större och uppblåst i bröstet. Rätt lober expanderar först, sedan vänster lob. Om endast en lob expanderar har nålen satts in för djupt (förbi luftrör) och det kommer att bli nödvändigt att dra ut något innan du fortsätter. Denna del avförfarande behöver göras relativt snabbt, innan agarosen börjar stelna. - Placera musen, med basen och sprutan fortfarande införd i luftstrupen, i ett kylrum eller kylskåp i minst 10 min. Vid behov kan djuret hållas där i upp till flera timmar, även om man går vidare till bildcellmigration av video mikroskopi.
- När musen är kall, noggrant excidera agarosen-uppblåsta lungor med hjälp av en sax, och placera dem i en 3 cm skål med iskall PBS. Håll på is.
- Välja den önskade loben för vävnadsskivning (t ex den högra överlägsen loben). Se till att den inre delen av lungan (där den ansluter till luftstrupen) är nedåt i skålen.
OBS! Loben som används och dess inriktning på kolven kommer att avgöra storleken på fartyg och luftvägar som kommer att vara synlig. Inriktningen som beskrivs här är idealisk för visualisering av stora luftvägarna och parenkymet. Möss har en stor vänster lob och fyra mindre flikar till höger. FörPCLS avbildning efter införandet av allergener in i lungorna via orofaryngeal eller intranasal aspiration, är den högra överlägsen lob typiskt sektionerad, delvis eftersom det är en bekväm storlek, utan även på grund inhalerade medel dispergeras likformigt inom det. Men andra lober, särskilt den vänstra lob, kan också studeras. När man jämför musstammar eller behandlingar, är det viktigt att jämföra samma lob.
2. Lung Skivning
OBS: skivor med hjälp av en automatiserad skivare, metall kylblock, kolven och sprut metall, enligt tillverkarens anvisningar.
- Sätt en liten droppe allrengöringsmedel, no-run gel superlim på kolven och sprida limmet i en cirkulär rörelse, var noga med att inte låta limmet vidrör sidorna av spruta metallen. Om limmet berör sidorna av sprutan, kommer det att lim sprutan och kolven tillsammans.
- Omedelbart efter att täcka kolven med lim, försiktigt tag iexciderades lob med pincett med luftstrupen sidan nedåt, sandskädda den på en vävnad för att avlägsna överskottsvätska, och försiktigt placera den på toppen av kolven. Trimma bort extra vävnad som sträcker sig bortom kanten av kolven.
- Förflytta kolven nedåt så att sidorna av sprutan metallen rör sig upp och över vävnaden, vilket skapar en brunn med lungan limmas på botten, inte mer än några centimeter djupa. Tejp runt botten av sprutan metallen för att hålla denna position på plats.
- Häll försiktigt 2% låg smält agaros vid 40 ° C i brunnen så att det bara täcker den övre delen av loben.
- Omger sprutan metall med den iskalla kylning blocket och kyla loben och agaros, 1 - 2 min.
OBS: En kortare tid kylning av agarosen omgivande vävnaden kan leda till sönderfall av agarosen under skivning, vilket kan resultera i en ojämnt skära PCLS. - Ladda provet sprutan i den automatiserade slicer och fylla bufferttanken med iskall PBS. Rikta in steg motordrivning med provet sprutan och ta bort tejpbit från botten. Vrid omkopplaren till läget snabbspolning framåt (FF) tills stegmotorn driv berör bara baksidan av kolven.
- Rikta in färska blad med provet sprutan. Uppsättning vävnadstjocklek, kontinuerlig / enkel skiva, oscillering och hastighet i skivaren. Till exempel, vävnadstjocklek: 150 pm, kontinuerlig skärning (forts.), Svängning: 9, och hastighet: 3 - 4. Tryck på start. Ovanstående inställningar måste anpassas till de specifika automatiserade slicer specifikationer.
- Med användning av en tunn spatel eller pensel, samla den PCLS en åt gången när de faller in i bufferttanken och placera dem i en 24-brunnsplatta innehållande iskall PBS.
OBS: Det är viktigt att hålla skivorna för att upprätthålla överensstämmelse mellan experiment. Även om varje lunga är olika beroende på ålder, kön och vikt, den 10: e skiva, till exempel, i allmänhet utbyten liknande storlek luftvägarna.
- Designa en panel av fluorescerande taggade antikroppar baserade på celltypen av intresse, med hänsyn tagen till potentiella fluorescerande spektral överlappning och detekteringsförmågan hos mikroskopet.
OBS: Som ett exempel är en panel för DC delmängd detektering enligt följande: CD11c / alfa X grin - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, Peak emission: 605 nm), CD324 / E-cadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Excitation: 488 nm, Peak emission: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - fykoerytrin (PE) (Excitation: 561 nm, Peak emission: 578 nm), CD103 / alfa E grin - allofykocyanin (APC) (Excitation: 633 nm , Peak emission: 660 nm). Fluorescens spektrala tittaren verktyg (se Material List) är användbara för att utforma paneler. - Göra en antikroppscocktail innehållande de önskade antikropparna.
- För statisk PCLS avbildning, tillsätt 800 pl färgningsbuffert, 100 pl Fc blocker, 50 mikroliter normalt musserum och 50 mikroliter normalt råttserum till en 1,5 ml microcentrifugation röret för en total volym av 1 ml. För levande cell imaging, använda 800 | il Leibovitz medium (1 x) innehållande 10% FBS (Leibovitz-10) i stället för färgningsbuffert.
- Lägga antikroppar för att justera en önskad slutlig koncentration av varje antikropp. Överföra antikroppslösningen till en 3 cm skål, och hålla i mörker tills det ska användas.
OBS: De slutliga koncentrationerna behöver optimeras för varje individuell antikropp (vanligen 1 - 5 | j, g / ml).
- Välj en PCLS med en anatomisk område av intresse, såsom stora luftvägar eller periferi av lungan, och placera i det 3-cm skål innehållande en ml antikroppslösning.
- Fläck PCLS i mörker, på is, gung långsamt under 30 eller 60 min.
- För statisk PCLS bildbehandling, gå vidare till avsnitt 4. För levande cell imaging, gå vidare till avsnitt 5.
4. Statisk Imaging av PCLS
- Efter 60 min inkubation av PCLS med antikroppar, avlägsna antikroppslösningen från skålen och skölj than skär två gånger med 1 ml iskall PBS.
- Pipettera 50 | il PBS på en 3 cm runda glas-nedre skålen. Med hjälp av en spatel eller pensel, överföra färgade PCLS till nedgången försiktigt manipulera skiva tills den är platt och sprida ut. Avlägsna PBS med en pipett. Segmentet ska ligga så plant som möjligt. Ovanstående procedurer måste utföras snabbt för att undvika fotoblekning.
- Placera en droppe rumstemperatur monteringsmedium på skiva och försiktigt släppa ett täckglas i brunnen i plattan. Hålla PCLS i mörker vid 4 ° C i upp till en timme innan avbildning.
- När du tittar på under ett konfokalmikroskop använder en 20X mål (se Material List). Använd "kakel" verktyg för att lokalisera och markera kanterna av vävnaden i inställningen "konvexa skrov". Detta kommer att bidra till att minska tiden för kakel scan.
- Medan inställning av z-stack intervall, kontrollera vid multipla områden av skiva, särskilt längs kanterna, att de fastställda intervallenär lämpliga.
OBS! Z-range kommer sannolikt att behöva vara större än tjockleken av vävnaden själv eftersom det är mycket svårt att få vävnaden att lägga helt platt. Till exempel, med en 150 | im tjock PCLS, z-stacken intervall kommer sannolikt att behöva ställas in till 200 - 250 | im för att rymma gupp och kurvor i segmentet. Beroende på z-stack intervall och storleken av vävnaden, kommer varje hel lunga avsökning ta mellan 7-12 h med ett 20X objektiv. Varje lunga är unik och inställningarna måste justeras för varje experiment.
5. Levande cell imaging av PCLS
- Efter 30 min inkubation av PCLS med antikroppar, avlägsna antikroppslösningen från skålen och skölj skivorna två gånger med 1 ml kall Leibovitz-10.
- Pipett färsk 50 mikroliter Leibovitz-10 in i en lucka av en kammarcoverglass (8 luckor). Använd en spatel för att överföra PCLS till mediet försiktigt manipulera tills skivan är platt och sprida ut. Ovanstående förfarandenmåste utföras snabbt för att undvika fotoblekning.
- Ta bort 50 | il medium med användning av en pipett. Segmentet är att ligga så platt som möjligt.
OBS: Det är acceptabelt om kanterna av skivan är vänt upp vertikalt mot väggen av kammaren. Vidare, om sådana finns, kan användas en metall platina vikt att förankra segmentet innan man går vidare till nästa steg. Se den bifogade Materiallista för ett exempel på platinatråd som kan klippas ut och böjas till små vikter. - I ett 4 ° C kallt rum, blanda 100 | il av tillväxtfaktorreducerade, fenolrött-fri extracellulär matris med 100 mikroliter Leibovitz-10. Använd förkylda pipettspetsar för detta, eller den extracellulära matrisen stelnar i spetsen.
OBS: Detta förhållande av matris och medium (1: 1) skapar en gel tillräckligt tät för att hålla ner de PCLS i vävnadsodlingsbetingelser. - pipett försiktigt matrisen för att blanda och försiktigt pipettera ovanpå PCLS och se till att gelen går ovanpå lung skiva, och att segmentet inte flyter upp ovanpå gelen. Gelén bör fungera som en vikt, förankra PCLS ner på botten av plattan.
- Noggrant överföra chambered coverglass till en 37 ° C inkubator och låt matrisen stelna under ~ 5 min.
- Överföra hela chambered coverglass på förvärmda steget i en konfokalmikroskop. Bibehålla kammaren vid 37 ° C under hela avbildning. CO 2 tillförsel krävs inte under cell inkubation vid användning av Leibovitz medium.
- Ställa in z-stack intervall och kakel område baserat på det önskade intervallet mellan ramarna. När du tittar på under ett konfokalmikroskop använder en 20X mål (se Material List). Använd "kakel" verktyg för att beteckna det intressanta området i vävnaden med hjälp av inställningen "centrerad grid" (t.ex. en 2x2 centrerad grid).
- Medan inställning av z-stack område, kontrollera vid flera områden av den del som de inställda intervallen är lämpliga.
OBS: ZRange kommer sannolikt vara lika med tjockleken av vävnaden. Varje lunga är unik och inställningarna måste justeras för varje experiment. 2x2 plattor och 10 z-stackar kommer i allmänhet att resultera i ~ en ram / 2 min. Se till att autofokus är aktiverad innan försöket att minimera xy och z-drift under bildperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att identifiera lokaliseringen av två DC-delmängder, CD11b hi CDCs och CD103 + CDCs, PCLS från C57BL / 6 möss skars ut och färgades med monoklonala antikroppar (mAb) som är specifika för CD11, CD88, CD103 och CD324 (E-kadherin). Antikroppar mot CD324 fläck epitelceller i luftvägarna och CD88 visas på makrofager och neutrofiler, men inte CDCs 8. Detta tillät oss att skilja CDCs från CD11 + makrofager, och att observera det spatiala förhållandet av varje celltyp till luftvägarna (figur 1). Vi fann att CD11b hi CDCs lokalisera i parenkymet, medan CD103 + CDCs bor främst kring luftvägarna och subpleural området. Även om CD103 + CDCs ades lätt detekteras genom direkt färgning av cellytan CD103 i detta experiment, detektion av CD11b hi CDCs förlitat sig på frånvaron av CD88 och CD103 färgning. För att direkt identifiera CD11bhi CDCs, första försökte vi fläck PCLS användning av en anti-CD11b mAb (klon M1 / 70), som ofta används i immunhistokemi och flödescytometri. Emellertid denna mAb hade en hög bakgrund och låg specificitet i denna ansökan, oavsett vilken fluorokromer konjugerades till mAb (figur 2A, och data ej visade). Däremot antikroppar mot CD172a (SIRP1α) färgades CD11b hi CDCs 18, men inte strukturella celler eller CD103 + CDCs (figur 2B, och data ej visade). På egen hand, kan antikroppar mot CD172a inte diskriminera mellan CDCs och monocyter eller makrofager. Men genom samtidig färgning med antikroppar mot CD88 och CD172a, kunde vi urskilja alveolära makrofager (CD172a - CD88 +) från mellanrumsmakrofager (CD172a + CD88 +), och CD11b hi CDCs (CD172a + CD88 -) och visar att de senare cellerna lokalisera företrädesvis iparenkym, inte sub-epiteliala område (figur 2C - F), i överensstämmelse med våra resultat erhållna genom indirekt färgning av dessa celler.
Studie av intra-vävnads migration av leukocyter kräver visualisering av strukturella celler, innefattande de av lymphatics, genom vilken DCs trafik från perifera vävnader till regionala LNS. I huden och LNS är lymfkärl ofta identifieras med hjälp av mAbs till LYVE-1 eller Podoplanin. Vi fann emellertid att i PCLS, mAbs till LYVE-1 och Podoplanin färga ett flertal andra celltyper, inklusive vaskulära endoteliet och alveolära epitelet (data ej visade). Dessa mAbs är därför begränsad praktisk användning för att specifikt identifiera lymfkärl i PCLS. Emellertid mAbs mot CD90.2 (Thy1.2), ett välkänt T-cellmarkör, märkta lymfatiska strukturer, såsom visas tidigare i andra vävnader 19, 20 (figurerna 3A, B Prox1 promotorn 21 (figur 3A, C). PROX1 är en mästare transkriptionsfaktor som är nödvändig för lymfangiogenes 22. Prox1 tdTomato transgena möss uppvisar ljust fluorescerande lymfatiska kärl i lungorna och andra vävnader, såsom levern, lins, dentate gyrus och neuroendokrina celler av binjuremärgen 21. Faktum är att dessa två märkningsmetoder gav överlappande färgningsmönster (Figur 3D). Med användning av dessa märkningsmetoder, kunde vi bestämma att CD103 + CDCs var närvarande i flera anatomiska områden, däribland CD324-uttryck luftvägsepitel, lymphatics och subpleural området (Figur 3A, E).
Förutom statisk avbildning, cellrörelse och cell till CELl interaktioner kan registreras med användning av levande cell imaging av PCLS (film 1). PCLS var nyligen framställd från möss som hade erhållit injektioner av GFP-uttryck OT-II T-celler och instillation av OVA och LPS, färgades med mAbs mot CD103 (röd) och luftvägsepitelet (CD324, blå), och avbildades för att spåra rörelse av CD103 + CDCs och T-celler 16 timmar efter OVA / LPS instillation. Under loppet av videon (4 h), den dynamiska rörelsen av CD103 + DC: er (röd) och de adoptivt överförda OVA-specifika T-celler (grön) och deras interaktion är klart synliga (film 1).
Figur 1. Distinkta Anatomiska Platser av CDC Delmängder som avslöjas av PCLS Staining och konfokalmikroskopi. A) Hel PCLS från en obehandlad C57BL / 6-mus lunga färgades med olika antikroppar. Färgen på varje molekyl anges av dess font color (överst till höger). Individuell och kombinato färgning ger följande färger för celltyper av intresse: CD103 + CDCs (CD103 + CD11 + CD88 -; vit), CD11b hi CDCs (CD11 + CD103 - CD88 -; red), makrofager (CD11 + CD88 +; gul ), neutrofiler (CD11c - CD88 +; grön) och luftvägsepitelceller (CD324 +, blå). B - D) Högre förstoring av de infällningar i A. B) CD11b hi CDCs lokalisera i parenkymet. C) CD103 + CDCs runt luftvägarna. D) CD103 + CDCs nedanför den viscerala lungsäcken. Vita staplar anger 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Färgning av DC: er och makrofager. A) Färgning av PCLS med antikroppar mot CD 11 b (blå) ger en hög bakgrund i PCLS. B) Antikroppar mot CD172a (grön) har en relativt låg bakgrund i PCLS och större specificitet för CD11b + celler. C) Sammanlagt PCLS av C57BL / 6-möss färgade med mAb vars färg indikeras av teckenfärg (överst till höger). CD11c (röd), CD88 (cyan), CD172a (grön) och CD324 (blå). CD11b hi CDCs (CD11c + CD88 - CD172a +; gul), alveolära makrofager (CD11c + CD88 + CD172a -; rosa), interstitiala makrofager (CD11c + CD88 + CD172a +; vit), neutrofiler (CD11c - CD88 +, cyan) och luftvägarna (CD324 +; blå). D - F) Högre förstoring av de inläggningaravbildas i C. D) Under pleural område. E) Under epiteliala område. F) interstitium. Interstitial makrofager lokalisera i parenkymet och alveolära makrofager är i alveolerna. Omärkta vita staplar betecknar 50 | am. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Märkning av struktur Celler i PCLS. A) Hela PCLS framställda från Prox1 tdTomato mus, och färgades med mAbs till CD90.2 (grön), CD103 (vit) och CD324 (blå). Prox1-uttryckande celler (röd) är genetiskt märkt med tdTomato under reglering av Prox1 promotor (Prox1-tdTomato). B - E) Högre förstoring av insatsen i
Film 1. T-celler interagera med CD103 + CDCs i lungan. Levande cell imaging av CD103 + CDCs (röd) som interagerar med T-celler (grön). CD4 + T-celler isolerade från OVA-specifika OT-II Nur77 gfp möss stimulerades med mjält DCs och OVA in vitro, och adoptivt överförd till Rag - / - mus. 2 h senare tillsattes mottagaren mus behandlad with OVA / LPS instillation till luftvägarna. 16 h efter OVA / LPS-behandling, var PCLS gjorts, färgas och avbildas för 4 h vid 37 ° C. inspelning bild (min) tid visas. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här utvecklades ursprungligen för att visualisera placeringen av två delmängder av CDCs i lungorna. Emellertid kan detta protokoll lätt anpassas för att studera många olika celltyper, medan cellviabiliteten och den tredimensionella arkitekturen hos lungan upprätthålla. Den sistnämnda funktionen är en viktig fördel jämfört med cellkultursystem och underlättar identifiering av sällsynta celltyper. Metoden förlitar sig på genereringen av PCLS från lungan, och en lämplig kombination av antikroppar för att identifiera specifika celltyper samtidigt minimera bakgrundsfärgning. Till stor del är detta en empirisk övning eftersom antikroppar som fungerar bra i andra program, inklusive flödescytometri, inte nödvändigtvis fungerar bra för färgning PCLS. Vi har redan gjort betydande framsteg i detta avseende, men utredarna som vill studera celltyper inte behandlas här kan behöva testa olika antikroppar och optimera fluorokromer och koncentrationer. Användning av det protokoll som beskrivs här, fann vi att CD103 + CDCs och CD11b hi CDCs bosatta olika lokaliseringar i lungan. Vid steady state var CD103 + CDCs upptäcks runt luftvägarna och i subpleural regionen, medan CD11b hi CDCs var främst i parenkymet. Även om det protokoll som vi beskriver här är inte lämplig för färgning intracellulära molekyler, är det användbart för avbildning cellytmarkörer, liksom sekretoriska molekyler. Således, kunde vi detektera kemokiner, CCL21 och CCL19, i PCLS (data ej visade). Om endast svaga fluorescerande signaler ses med användning av primära antikroppar, är det möjligt att använda sekundära antikroppar för att förstärka dessa signaler.
En stor utmaning vid genomförandet av levande cell video-avbildning av PCLS var att tillräckligt förankra vävnad i odlingsmediet för att förhindra betydande XY- och z-avdrift under 4-h mikroskopi perioden. För att lösa detta, vi experimenterademed olika förhållanden av Leibovitz medium till extracellulär matris, som är fast vid rumstemperatur, och bestäms en 1: 1-förhållande upprätthålls en stabil, 3D-struktur med cellviabilitet. Under efter bildbehandling, vi utnyttjade också en rad ImageJ plug-ins, som kallas TurboReg och StackReg som eliminerar ytterligare tillfällig xy eller z-shift (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? id = 18226). Använda autofokus verktyg konfokalmikroskop var det intressanta området hålls i fokus, i synnerhet i Z-range, under hela avsökningsperioden. En annan utmaning under levande cell imaging av PCLS ades med användning av kakel scan, z-stack, tidsserier, och autofokuseringsfunktioner för mikroskop. För att minimera tiden mellan varje bildruta måste en balans mellan den tid skanna varje platta. För att optimera scan tid i varje forskningsprojekt, z-stack nummer, kakel och scanningshastigheter behöva justeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Jeff Tucker, Erica Scappini och Agnes Janoshazi för deras hjälp med mikroskopi, Ligon Perrow för sin hantering av musen kolonin, och Jun Chen och Michael Sanderson för hjälp med vävnaden slicer, och Michael Fessler och Derek Cain för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats av intramural grenen av NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), som i sin tur sponsras av Department of Health and Human Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
