Summary
Dette håndskrift bruger Fiji-baserede open source software-pakke VirusMapper at anvende enkelt-partikel analyse til super-opløsning mikroskopi billeder for at generere præcise modeller af nanoskala struktur.
Abstract
Super-opløsning fluorescensmikroskopi øjeblikket revolutionere cellebiologi forskning. Dens evne til at bryde den grænse opløsning på omkring 300 nm muliggør rutinemæssig billeddannelse af nanoskala biologiske komplekser og processer. Denne stigning i opløsning betyder også, at metoder populære i elektronmikroskopi, såsom enkelt-partikel analyse kan let anvendes til super-beslutning fluorescensmikroskopi. Ved at kombinere denne analytiske fremgangsmåde med super-opløsning optisk billeddannelse, bliver det muligt at drage fordel af molekylet-specifikke kapacitet af fluorescensmikroskopi mærkning for at frembringe strukturelle kort af molekylære elementer inden en metastabil struktur. Til dette formål har vi udviklet en ny algoritme - VirusMapper - pakket som en nem-at-bruge, høj ydeevne, og high-throughput ImageJ plugin. Denne artikel præsenterer en grundig guide til denne software, fremvisning dens evne til at afdække hidtil ukendte strukturelle træk i biologisk molecular komplekser. Her præsenterer vi, hvordan man samler kompatible data og give en trin-for-trin-protokollen om, hvordan man bruger denne algoritme til at anvende enkelt-partikel analyse til super-opløsning.
Introduction
Super-opløsning (SR) mikroskopi har haft en stor indflydelse på cellebiologi ved at give mulighed for at billedet centrale molekylære processer sammen med den molekylære særlig mærkning afgørende for at forstå dem. SR nu gør det muligt lysmikroskopi at nærme de beslutninger (20-150 nm) tidligere kun opnåelige med elektronmikroskopi (EM) og beholde de store fordele ved lysmikroskopi, såsom potentialet til at afbilde levende celler 1, 2. Endvidere er den strukturelle bevarelse fundet i nanoskala niveau tillader anvendelsen af enkelt-partikel-analyse (SPA) til SR data, et begreb udbredt i elektronmikroskopi 3. Anvendelse SPA, kan mange højt konserverede kopier af en struktur afbildes og midles sammen for at forbedre opløsningen, præcision, eller signal-til-støj af det visualiserede objekt. Ved anvendelse i kombination med SR, er SPA vist sig at være et stærkt værktøj til high-precision kortlægning af komponenter i kerneporen kompleks 4, 5, centrosomer 6, og vira, såsom HIV 7 og HSV-1 8.
Imidlertid har den rutine kombineret anvendelse af SR og SPA blevet udfordret af en mangel på tilgængelig software. Derfor udviklede vi VirusMapper, et plugin til den populære billedbehandling software ImageJ / Fiji 9. Dette er den første frit tilgængelig software pakke til generaliseret SPA med fluorescensafbildninger 10 designet til at give hurtig, brugervenlig, multi-kanal naive gennemsnitsberegning af strukturer afbildet med SR mikroskopi. Selvom designet for virus, kan den anvendes på ethvert makromolekylære kompleks, hvor forskellige molekylspecies kan afbildes, der er konstateret, og lokaliseret.
VirusMapper kan anvendes til fremstilling af høj præcision molekylæremodeller af enhver kendt struktur, der giver mulighed for beregning af den gennemsnitlige dimensioner og andre parametre. Algoritmen design gør den særligt anvendelig til separation af populationer af strukturer, der giver til bestemmelse af definerede orientering eller forskellige morfologiske tilstande. Yderligere kan multikanal billeddannelse anvendes til at anvende en referencekanal i tilfælde, hvor den underliggende struktur er velkendt, hvilket tillader henvisning-baserede struktur opdagelse. Instruktionerne for at downloade og installere softwaren leveres på https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Eksempel data kan også findes der, og brugerne rådes til at øve bruge softwaren på eksemplet data, inden du forsøger at anvende den til deres egen.
Her beskrives de trin for at bruge dette plugin til at producere SPA modeller fra rådata. Softwaren tager RAW-billeder, der indeholder enkelt- or multi-mærkede strukturer som input. Den returnerer, med forbehold af en række parametre, der er indstillet som softwaren kører, SPA-modeller, der viser de gennemsnitlige fordelinger af de mærkede komponenter inden for de afbildede strukturer.
Målet med denne protokol er at producere præcise SPA modeller giver de gennemsnitlige lokaliseringer af komponenter inden afbildede strukturer ifølge rørledningen skitseret i figur 1. Som vist i figur 1, er softwaren workflow fordel opdeles i tre faser. Den første fase er at segmentere store billeder, hvilket resulterer i stakke af partikler til hver kanal. Disse partikler er de enheder, der skal midles til at skabe modeller og til at producere frø til model generation. Det andet trin er at generere seed billeder, som anvendes til at registrere det samlede sæt af partikler i den afsluttende fase. Dette gøres ved at vælge et referencekanalen og manuel udvælgelse partikler i denne kanal, der vil bidrage til seeds. Frø er valgt i denne reference kanal, men kan genereres for alle kanaler. Partikler indledningsvis udrettet ved at tilpasse en 2D Gauss i denne kanal. Alle partikler, der er blevet udvalgt og udrettet derpå midlet for at frembringe et frø. For hver fælles struktur set i de data, der skal modelleres, bør partikler udvælges som frø der klart og tydeligt repræsenterer denne struktur. Grænsefladen på dette stadium er også nyttig til scanning data for sådanne strukturer.
Den sidste fase er at generere modeller ved hjælp af skabelon matchning. Dette opnås gennem registrering af partiklerne oprindeligt ekstraheret til frøet billeder, der dannes i det foregående afsnit ved krydskorrelation. En undergruppe af registrerede partikler midles sammen, og fremgangsmåden er yderligere gentages for at reducere model betyde kvadrerede fejl, hvis det ønskes. Denne undergruppe bestemmes af minimumsspecifikationerne lighed mod frøet, der skal være opfyldt. Når du opretter models samtidigt i flere kanaler, fælles lighed, eller gennemsnittet af lighederne for hver kanal, anvendes. kan derefter analyseres yderligere de resulterende modeller og de registrerede partikler, der bidrog til dem.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol og video supplere den oprindelige papir 10 beskriver softwarepakke mere detaljeret. Læserne opfordres til at gennemgå dette omhyggeligt for yderligere vejledning med hensyn til brugen af softwaren. Der er tre hovedtrin: partikel ekstraktion, hvilke segmenter store billeder i individuelle partikler; frø udvælgelse, hvor fælles strukturer identificeret i data og tilpasset til frembringelse af frø, som anvendes i den afsluttende fase; og model generation, hvor skabelonsammenligning baseret på disse frø justerer ekstraherede partikler og gennemsnit en delmængde til frembringelse SPA modeller.
1. Opsætning Før Kørsel af softwarepakke
- Fremstille prøver af strukturen under undersøgelse på et dækglas eller i de relevante forsøgsbetingelser.
- Billede prøverne med super-opløsning fluorescensmikroskopi, såsom struktureret belysning mikroskopi (SIM) 11 eller stimulated emission depletion (STED) 12 mikroskopi.
BEMÆRK: De præcise detaljer om, hvordan man forbereder og image prøver afhænger i høj grad af arten af strukturen under undersøgelse, så den relevante litteratur bør høres. Som et eksempel, den præcise metode til fremstilling og billeddannelse prøver af vacciniavirus, såsom dem, der anvendes her, er beskrevet i afsnittet repræsentative resultater. - Skabe billeder af flere synsfelter, der viser et stort antal separate kopier af strukturen eller partikler, fortrinsvis tusinder. Billeddata partikler, der er så godt adskilt fra hinanden som muligt og sikre, at billederne er fri for snavs eller andre fluorescerende strukturer, som ikke er af interesse.
- Åbn alle billeder, der indeholder partiklerne i Fiji ved at trække filerne ind i Fiji værktøjslinjen eller ved at vælge "Filer"> "Åbn".
- Vælg "Image"> "Stack"> "Funktioner"> "Sammenkæde" til at sammenkæde denbilleder i en enkelt stak. Så, hvis det resulterende billede er en Hyperstack, gøre det til en stak ved at vælge "Billede"> "Hyperstacks"> "Hyperstack at stable".
BEMÆRK: Den endelige stak skal have indskudte kanaler. Hvis der er to kanaler, bør den første skive i stablen være kanal 1 fra det første billede, skal den anden skive være den tilsvarende kanal 2, den tredje skive bør være kanal 1 fra det andet billede, og så videre.
2. Pak Partikler
- Vælg billedet til segmentet og vælg "Udpak Viral Structures". Vælg hvor du vil gemme de udpakkede partikler og se "Uddrag Viral Structures" (Figur 2).
- Tildele ekstraktionsparametre med første skøn ved at indtaste dem i "Extract Viral Structures" dialog som følger. Finjuster disse parametre efter forpremiere billedet segmentering.
- Indstil følelsesløsare af kanaler i datasættet som antallet af forskellige fluorescens-kanaler, som er afbildet (for eksempel 2).
- Indstil referencekanalen hvorfra partikler ekstraheres ved påvisning af toppe i denne kanal ved at indtaste nummeret på valget af kanal. Vælg den mest konsekvente kanal; dvs. den kanal, hvori de fleste partikler har samme udseende.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, vil partikler i denne kanal har en central maksimum. - Vælg, om ikke at anvende en pre-afsløring Gauss sløring. Indstil den præ-afsløring Gauss sløring til 0 for at anvende uden slør; hvis denne værdi forøges, en gaussisk blur filter i given radius påføres før lokale maksima detektion. Brug denne funktion, hvis referencekanalen ikke har en central maksimum (fx ringform); sløring inducerer udseendet af en.
BEMÆRK: Segmenteret områder af interesse (ROI) har ikke den gaussisk sløring anvendt på dem, da denne funktion er kun brugd til position ROI'er i referencekanalen. - Indstil radius ROI (som vil blive sat omkring hvert lokalt maksimum) i pixel. Vælge en sådan værdi, at denne ROI'er er lidt større end de største partikler, såsom i figur 3. For eksempel, hvis de største partikler synes at have en diameter på omkring 30 pixels (anslået groft ved øjet), og sæt derefter radius ROI til 20 pixels.
- Indstille antallet af ROI'er at anvende per ramme til en indledende, relativt lille værdi under 100.
- Indstil den maksimale overlapning ROI. Hvis partiklerne er godt adskilt, holde denne lille; hvis partikler er grupperet, øge dette for at aktivere de ROI'er at overlappe.
- Vælg "show preview".
BEMÆRK: Når dette er valgt, vil de ekstraherede ROI'er for referencekanalen knyttet til den aktuelle ramme vises. - Justere radius ROI, antallet af ROI'er, og den maksimale ROI overlap at have ROI'er af passende størrelse rundt så mange partikler som muligt, Som i figur 3.
- Vælg "OK" for at køre segmentering. Luk billedet og lederen investeringsafkast.
BEMÆRK: Du må ikke ændre navnene på filerne partiklens sæt. Navnene skal være i formatet "Virale partikler - channelX" for de følgende afsnit.
3. Vælg Frø
- Vælg "Generer Seeds", skal du vælge den mappe, hvor de udpakkede partikler gemmes, og se "Generer Frø" dialog og vinduer (figur 4).
- Tildele startparametrene frø-udvælgelse ved at indtaste dem i dialogboksen "Generate Seeds" som følger.
- Indstil henvisningen kanal, der vil blive monteret til at tilpasse og centrum alle kanaler. Vælge en kanal, hvori de fleste partikler har samme udseende, og som har en central maksimum, hvis muligt.
- Vælg de bokse til alle kanaler for hvilke der bør genereres et frø.
- Vælg, om frøene skulle være rotated 90 °. Brug denne funktion til at få justeringen i overensstemmelse med andre modeller
- Vælg, om ikke at anvende en pre-alignment gaussisk sløring. Indstil sløring radius for hver kanal til 0 for at anvende uden slør. Forøg denne værdi til at anvende en gaussisk sløring filter i given radius før justeringen. Brug denne funktion hvis partiklerne ikke har en central maksimum; sløring inducerer udseendet af en.
BEMÆRK: Frø vil ikke have den sløring anvendt, da denne funktion er kun for at få ensartet justering. - Vælg om du vil bruge shift korrektion til separat centrere frø til ikke-referencepunkter kanaler, men ikke rotere dem, ved at markere eller fjerne markeringen af "Shift korrektion" kasser for hver kanal.
BEMÆRK: Brug dette, hvis kanalerne ikke er godt afstemt med hinanden; det kan også være nyttigt til at rette andre kanaler udelukkende ifølge referencen, uden skift korrektion.
- Vælge partikler til brug som frø. Søg gennem than partikelfølsomme sekvens for at finde en partikel, der ligner den struktur, der skal modelleres og registrere stelnummer.
- Indtast nummeret i "Rammer til at bruge" kasse, og flere vinduer vises (figur 5). Indtaste flere rammenumre adskilt med komma.
- Se frø rammer og de resulterende gennemsnitlige frø i vinduerne, der vises.
BEMÆRK: Loggen vil foreslå frø ligner gennemsnittet. - Juster referencekanalen, gaussisk udviskning radius, og skift Farvekorrigering at optimere frø udvælgelsesprocessen, så at et antal frø frames fundet har et lignende udseende. Fortsæt med at tilføje frø indtil gennemsnitlige frø er skabt, at tilfredsstillende ligne strukturen set i de data, der skal modelleres.
- Navngiv frøene, og hvor de vil blive gemt til og vælg "OK" for at gemme de endelige frø billeder til senere brug i model generation.
4. Generer Modeller
- select "Generér modeller baseret på Seeds" vælges den mappe, hvor de ekstraherede partikler gemmes, og se dialogen "Generate Models" (figur 6).
- Indlæse frøene for hver kanal ved hjælp af afkrydsningsfelterne.
BEMÆRK: Frø vil blive gemt i en undermappe, der blev navngivet i "Generer Seeds" dialog. Standard er "Analyse". Vær omhyggelig med at vælge de frø Gennemsnit, ikke de Rammer, som også gemmes som reference. - Tildel indledende model genereringsparametre ved at indtaste dem i dialogboksen "Generer Modeller", som følger. Finjuster disse parametre senere.
- Vælg om du vil bruge en reference kanal for tilpasning, der beregner oversættelser og rotationer kun fra referencekanalen og anvender dem på alle kanaler. Hvis du bruger denne mulighed, skal du vælge den kanal, der skal bruges som reference.
BEMÆRK: Denne indstilling bør kun vælges til specifikt at bruge en kanal som reference, såsom hvis gør henvisning-baserede struktur opdagelse. Ellers vil det resultere i mindre nøjagtige modeller. Kanalerne skal være godt afstemt, hvis du bruger denne mulighed. - Vælg, om at square billedstyrker under skabelon matchning. Dette vil forstærke små forskelle, så brug denne, når du opretter en model, der har særligt subtile funktioner.
- Vælge en minimal lighed mod frø ved hjælp af "Minimum lighed mod frø" slider eller ved at indtaste et nummer ind i feltet.
BEMÆRK: kun partikler med en lighed med frøene større end vil blive anvendt denne afskæring. 60-80% er typisk et godt valg til at starte med. - Indstille det maksimale antal iterationer til 1, optimere den mindste lighed mod frø, og øge det senere, efter behov.
- Vælg boksene til at vælge de elementer i modellen generation proces, som vil blive vist.
BEMÆRK: "Vis frø" vil vise frø, der er blevet læsset med de boxes øverst i dialogboksen. "Vis modeller" vil vise alle gentagelser af de modeller, der er oprettet ud fra gennemsnittet af delmængde af partikler, der opfylder den minimale lighed mod frø. "Vis MSE" vil vise en gennemsnitlig kvadreret fejl (MSE) billede, der fremhæver de områder af den model, der er mest variable. "Vis partikler" vil vise delmængde af partikler, der bruges til at skabe de modeller, der er registreret i henhold til den højeste iteration af den model, der vises.
- Vælg om du vil bruge en reference kanal for tilpasning, der beregner oversættelser og rotationer kun fra referencekanalen og anvender dem på alle kanaler. Hvis du bruger denne mulighed, skal du vælge den kanal, der skal bruges som reference.
- Vælg "Vis preview" for at generere forpremiere modeller og se resultaterne.
BEMÆRK: Dette er den mest regnekraft trin i processen. Køretiden for et sæt af et par tusinde partikler med diametre på et par snese pixels på en stationær pc bør være omkring 10 min. Hvis beregningstiden er et problem, skal brugerne først prøve algoritmen på en mindre delmængde af dataene eller bruge en mindre radius ROI i trin 2.2.4, hvis det er muligt. - Se generereD-modeller og optimere parametrene, især den mindste lighed mod frø. Øge den minimale lighed mod frø indtil eneste sande partikler af den modellerede morfologi er inkluderet i modellen.
- Øge den maksimale antal iterationer ved at bruge "Maksimalt antal iterationer" slider eller ved at indtaste et nummer ind i feltet og tillade model generation proces for at skifte. Brug en værdi omkring 10 for maksimal iteration.
- Navn modeller og vælge "OK" for at gemme model evolution stakke, der indeholder alle gentagelser af den endelige model generation proces.
BEMÆRK: Hvis den mindste lighed mod frø er så høj, at ingen partikler har denne lighed, vil intet blive opdateret. Hvis plugin ser ud til at være frosset, overveje muligheden for, at den mindste lighed er for høj.
Representative Results
Her demonstrerer vi softwaren på den model, koppevirus, vacciniavirus. En af de mest komplekse mammale vira, vaccinia pakker omkring 80 forskellige proteiner i en 350 x 270 x 250 nm 3 brikformede partikel 13, 14. Tre substrukturer kan skelnes ved hjælp af elektronmikroskopi: en central kerne, som indeholder dsDNA-genomet; to proteinholdige strukturer, kaldet laterale organer, som flankerer kernen; og en enkelt proteolipid dobbeltlag kuvert 15. Den store størrelse, kompleks struktur, og modtagelighed for rekombinant fluorescerende protein tagging gør vaccinia et fremragende system til at demonstrere VirusMapper arbejdsgang.
Brug af softwaren som beskrevet her, kan fordelingen af en række proteiner på vaccinia virion modelleres. Et protein blev mærket og afbildes, eventuelt i kombination med et andet protein med kendt fordeling som reference, og softwaren blev anvendt som beskrevet for at fremstille gennemsnitlige modeller af lokaliseringen af dette protein på partiklen. I dette eksempel blev to proteiner modelleret, den indre kerne protein L4, og de store laterale kropskomponent F17.
En rekombinant vacciniavirus der har F17 mærket med GFP og L4 tagget med blev anvendt mCherry 16. Oprenset virus blev fortyndet i 1 mM Tris, pH 9, og bundet til vaskes, højtydende dækglas ved at coate dem i 30 minutter ved stuetemperatur. Prøverne blev derefter fikseret ved at påføre 4% formaldehyd i PBS i 20 min. Dækglas blev monteret umiddelbart på objektglas i antiblegemiddel monterings medium. Imaging blev udført af SIM på et kommercielt SIM mikroskop. En synsfelt blev valgt indeholdende hundredvis af virus og billeder blev erhvervet ved anvendelse af 5 faseskift og 3 grid rotationer med 561 nm (32 um rivning period) og 488 nm (32 um gitterperiode) lasere. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en sCMOS kamera og behandles ved hjælp af mikroskop software. Kanaler blev justeret på grundlag af en flerfarvet perle slide afbildet med de samme indstillinger billedoptagelse. Efter SIM genopbygning og kanal alignment billeder blev åbnet i Fiji og sammenkædet til et enkelt billede stak.
Virale partikler blev ekstraheret fra billederne ved hjælp af L4 kanal som reference og uden at anvende nogen gaussisk slør, da disse partikler har en central maksimum. Omkring 15.000 partikler blev ekstraheret i dette forsøg.
På grund af geometrien af vaccinia, de laterale organer har en markant anderledes udseende baseret på virus orientering. Vi visualiseret to orienteringer, hvor enten en eller to laterale organer kunne skelnes. Vi henviste til disse retningslinjer som frontale og sagittale, respektively.
Separate frø til frontal og sagittale orienteringer blev udvalgt ved at søge gennem listen partikel på "Generate Seeds" stadium (figur 4 og 5); partikler, der var tydeligt i én orientering eller den anden blev valgt. L4 kanal blev anvendt som referencekanalen at tilpasse frøene med hinanden. Igen, ingen gaussisk sløring var nødvendig. 5 partikler for hver retning blev udvalgt og blev beregnet til at producere frø.
Modeller blev genereret for hver orientering efter disse frø. Hverken en referencekanal eller kvadrerede intensitetsværdier blev anvendt. Det maksimale antal iterationer blev sat i første omgang til 1, og den minimale lighed var indstillet til at omfatte omkring 1.000 partikler i hvert tilfælde, som gav en ensartet udseende for hver orientering. Det maksimale antal iterationer blev derefter forøget tilgive mulighed for konvergens af modellen. Modeller blev således frembragt for de to orienteringer i de to kanaler (Figur 7).
Figur 1: VirusMapper arbejdsgang. Dette plugin er organiseret i tre hovedfaser. Virale partikler ekstraheres fra store billeder, er skabelonbilleder eller frø udvalgt semi-manuelt fra dataene, og de endelige SPA modeller er genereret ud fra dataene ved at henvise til frøene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: "Extract Virale Structures" dialogen. Når du vælger "Uddrag Viral Structur es", vil denne dialog blive vist. Parametrene skal fyldes med første skøn for optimal segmentering. 'Show preview' kan derefter vælges, så de ROI'er at blive fremvist, og de parametre, der finjusteres. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Indstilling ekstraktionsparametre. Efter eksempelvisning af ROI'er, der vil blive udvundet, radius ROI, antal ROI'er, og maksimal overlapning ROI justeres for at opnå en situation som denne. ROI'er er lidt større end partiklerne, alle partikler er inkluderet i et ROI, og ROI'er kan overlappe tilstrækkeligt til at tillade klynger partikler, der skal separeres.ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Generering skabelonsammenligning frø. Den "Generate Seeds" dialog (1) fastlægger de parametre, der skal tildeles. Den referencepartikler sekvens (2) kan brugeren scanne gennem partikler i referencekanalen. Når en partikel betragtes i referencepartikler sekvens, kan således udrettet partikler for alle kanaler ses i de udrettet partikel previews (3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tilføjelse seed billeder. Som frø tilsættes til "Rammer for at bruge" boksen, gennemsnittet af alle frø (4), og rammerne er involveret (5) vises. Partikler, som ligner de nuværende gennemsnitlige frø er foreslået i dialogboksen (6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: "Generer Models" dialog. Når du vælger "Generer modeller baseret på Frø," denne dialog vises. Parametrene skal fyldes med indledende skøn for optimal model generation, og de elementer i proceduren modellen generation, der skal vises under beregningen bør vælges. "Vis preview" kan derefter vælges, så den model generation proces til at køre og de parametre, der finjusteres.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Modeller genereret med VirusMapper. Vaccinia virioner med L4 kerneproteinet tagget med mCherry og F17 laterale kropsprotein tagget med EGFP blev afbildet under anvendelse af SIM. Modeller blev derefter genereret med softwaren, som beskrevet i protokollen. To orienteringer, frontal og sagittale, udmærker sig ved fremkomsten af de laterale organer. Målestok = 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Med denne metode er forskere udstyret til at kombinere de kraftfulde SPA og SR mikroskopi for at generere høj præcision, multi-kanal 2D modeller af proteinet arkitektur virus og andre makromolekylære komplekser. Der bør dog tages hensyn til nogle vigtige overvejelser.
Frø bør vælges til at repræsentere en struktur, der ses konsekvent. Således bør de rå data efterses grundigt, inden frøene er valgt. Dette er vigtigt for at forhindre partiske modeller. Valg kan valideres ved gennemgangen af de minimumskrav lighed tærskler, der er nødvendige for at omfatte et vist antal af partikler i modellerne. Klart, for et udvalg af frø, jo højere denne tærskel skal være for et givet antal partikler, jo mere denne struktur fremgår i dataene.
Skabelonen matchende konceptet er især nyttig, når der er heterogenitet i dataene. Alle de forskellige strukturer, der er viligt bør identificeres og forskellige modeller skabt for hver enkelt sag. Ved at adskille heterogene strukturer i en kanal, men samtidig skabe modeller i en anden kanal, kan mønstre vise sig, at ikke ville have været umiddelbart indlysende.
En anden overvejelse at være opmærksom på, når du bruger denne algoritme er, at proceduren for iteration vil maksimere stokastisk asymmetri. For eksempel, når modellering en struktur med to symmetrisk maksima, alle små asymmetrier mellem maksima vil være på linie med hinanden under iteration, og den endelige model vil således være maksimalt asymmetrisk. Hvis dette ikke afspejler en kendt symmetri i strukturen, der modelleres, så dette bør tages i betragtning. I øjeblikket er den eneste måde at undgå dette maksimering er at begrænse antallet af iterationer til 1, skønt en udviklingspotentiale ville være for VirusMapper at inkorporere symmetriakser i modellen generation proces. Eventuelle nye versioner af VirusMapper vil være available på den refererede hjemmeside (se Materialer tabel). Brugerne vil også finde en FAQ her for at besvare eventuelle fælles forespørgsler.
Softwaren som beskrevet kan anvendes på en hvilken som helst struktur, der kan afbildes med tilstrækkelig opløsning til at visualisere de funktioner, som brugeren ønsker at modellere. Selvom SPA kan forbedre opløsningen, det klart vil ikke forbedre synligheden af funktioner, der ellers ikke er synlige. Denne protokol er derfor ikke en metode til at forbedre kvaliteten af data. Som med enhver teknik, omhyggelig forberedelse prøve og optimering af imaging strategi vil give de reneste data og de bedste deraf følgende modeller.
Valget af SR imaging modalitet er også vigtig, og generelt, vil afhænge af prøven ved hånden. VirusMapper er blevet valideret til at fungere godt sammen med SIM og STED 10, og det kan også bruges med høj kvalitet lokalisering mikroskopi data, men der bør udvises forsigtighed i denne sag,som sparsomme mærkning kan forårsage problemer svarende til dem af asymmetri maksimering.
I øjeblikket VirusMapper er den eneste frit tilgængelige algoritme for enkelt-partikel analyse af fluorescens billeder, og det eneste generelle formål 2D SPA gennemsnitsberegning software. Andre undersøgelser, der har gjort brug af de samme principper 4, 6, 8 har brugt brugerdefinerede software specialiseret for hver enkelt undersøgelse. Generelt-purpose algoritmer til genopbygning af 3D-data er blevet publiceret 5, 18, selv om ingen software blev leveret.
Når det anvendes som beskrevet i denne artikel, kan VirusMapper anvendes til fremstilling af præcise, nøjagtige og robuste modeller af makromolekylære protein arkitektur vira og andre komplekser. Med disse modeller, kan forskerne tage præcise målinger af de gennemsnitlige dimensioner af structstaltninger, der undersøges, potentielt giver dem mulighed for at nå frem til de biologiske konklusioner, som ikke ville have ellers været muligt.
Desuden vil der med de flere kanaler kapaciteter af denne teknik er det muligt at kortlægge et ubegrænset antal proteiner og komponenter inden komplekser og at opdage hidtil ukendte protein organisation. Undersøgelse ændringer i nanoskala struktur i de forskellige biologisk relevante forhold, såsom forskellige stadier af en virus livscyklus, har potentiale til at tilbyde værdifuld indsigt i biologi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck, og Kathrin Scherer for deres bidrag til den oprindelige udvikling og validering af VirusMapper. Vi vil også gerne takke Artur Yakimovich for hans kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); grundfinansiering til MRC Laboratoriet for Molekylær cellebiologi, University College London (JM); Det Europæiske Forskningsråd (649.101-UbiProPox) (JM); og Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH og JM). RG er finansieret af Teknik og Physical Sciences Research Council (EP / M506448 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiji | Open-source image analysis software | ||
| NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
| VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
| Elyra PS1 | Zeiss | ||
| ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
| High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |
References
- Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution. Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).
- Gustafsson, N., Culley, S., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun. 7, 12471 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341 (6146), 655-658 (2013).
- Broeken, J., Johnson, H., et al. Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy. Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003 (2015).
- Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication. Elife. , (2015).
- Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).
- Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat Commun. 6, 5980 (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Gray, R. D. M., Beerli, C. VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy. Sci Rep. 6, 29132 (2016).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Let. 19 (11), 780 (1994).
- Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles. J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).
- Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. Fields virology. , Ovid. (2010).
- Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion. Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).
- Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies. Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).
- Nanoj-virusmapper. , Available from: https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper (2016).
- Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept. IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).
