Summary
यह पांडुलिपि फिजी आधारित खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज VirusMapper आदेश नैनो पैमाने संरचना का सटीक मॉडल उत्पन्न करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी छवियों एकल कण विश्लेषण लागू करने के लिए उपयोग करता है।
Abstract
सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वर्तमान में कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान क्रांति ला रहा है। इसकी क्षमता एनएम नैनो पैमाने जैविक परिसरों और प्रक्रियाओं की दिनचर्या इमेजिंग के लिए अनुमति देता है लगभग 300 के संकल्प सीमा को तोड़ने के लिए। संकल्प में यह वृद्धि भी मतलब है कि इस तरह के एकल कण विश्लेषण के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में लोकप्रिय तरीकों, आसानी से सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किया जा सकता है। सुपर संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ इस विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के संयोजन से, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अणु-विशिष्ट लेबलिंग क्षमता एक metastable ढांचे के भीतर आणविक तत्वों की संरचनात्मक नक्शे उत्पन्न करने के लिए का लाभ लेने के लिए संभव हो जाता है। VirusMapper - - एक आसान से उपयोग, उच्च प्रदर्शन, और उच्च throughput ImageJ प्लगइन के रूप में पैक यह अंत करने के लिए, हम एक उपन्यास एल्गोरिथ्म विकसित किया है। इस आलेख में इस सॉफ्टवेयर के लिए एक में गहराई से गाइड प्रस्तुत करता है, जैविक मीटर में उपन्यास संरचनात्मक विशेषताओं को उजागर करने की क्षमता का प्रदर्शनolecular परिसरों। यहाँ, हम संगत डेटा इकट्ठा और कैसे इस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के सुपर संकल्प छवियों एकल कण विश्लेषण लागू करने के लिए पर एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए कैसे प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
सुपर संकल्प (एसआर) माइक्रोस्कोपी आणविक विशिष्ट लेबलिंग उन्हें समझने के लिए महत्वपूर्ण के साथ छवि कुंजी आणविक प्रक्रियाओं करने की क्षमता प्रदान करके कोशिका जीव विज्ञान पर एक बड़ा असर पड़ा है। एसआर अब प्रस्तावों (20-150 एनएम) पहले से ही इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के साथ प्राप्त है, जबकि इस तरह के चित्र को जीवित कोशिकाओं 1, 2 की क्षमता के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रमुख लाभ, बनाए रखने के दृष्टिकोण प्रकाश माइक्रोस्कोपी सक्षम बनाता है। इसके अलावा, संरचनात्मक संरक्षण नैनो पैमाने स्तर पर पाया एकल कण विश्लेषण (SPA) एसआर आंकड़ों के, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल एक अवधारणा के आवेदन की अनुमति देता है। एसपीए का उपयोग करना, एक संरचना के कई उच्च संरक्षित प्रतियां ली गई और यह एक साथ औसतन से शोर संकेत संकल्प, शुद्धता, या कल्पना वस्तु का सुधार करने के लिए किया जा सकता है। जब एसआर साथ संयोजन में उपयोग, स्पा उच्च पी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैइस तरह के एचआईवी 7 और एचएसवी -1 8 के रूप में परमाणु ध्यान में लीन होना जटिल 4, 5 के घटकों, तारक काय 6, और वायरस, के recision मानचित्रण।
हालांकि, एसआर और स्पा की दिनचर्या संयुक्त आवेदन उपलब्ध सॉफ्टवेयर की कमी से चुनौती दी गई है। इस कारण से, हम VirusMapper, लोकप्रिय छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ImageJ / फिजी 9 करने के लिए एक प्लगइन का विकास किया। यह प्रतिदीप्ति छवियों 10 तेज, उपयोगकर्ता के अनुकूल, मल्टी चैनल भोली एसआर माइक्रोस्कोपी के साथ imaged संरचनाओं की औसत प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया के साथ सामान्यीकृत एसपीए के लिए पहले स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज है। हालांकि वायरस के लिए तैयार किया गया है, यह किसी भी macromolecular जटिल है, जिसमें विभिन्न आणविक प्रजातियों, imaged किया जा सकता है की पहचान की है, और स्थानीय के लिए लागू किया जा सकता है।
VirusMapper उच्च परिशुद्धता आणविक निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकिसी भी ज्ञात संरचना के मॉडल, औसत आयाम और अन्य पैरामीटर की गणना के लिए अनुमति देता है। एल्गोरिथ्म डिजाइन यह विशेष रूप से संरचनाओं की आबादी को अलग करने, अलग झुकाव या अलग रूपात्मक राज्यों के निर्धारण के लिए उपलब्ध कराने के लिए लाभदायक होती है। साथ ही, मल्टीचैनल इमेजिंग मामलों में एक संदर्भ चैनल रोजगार जहां अंतर्निहित संरचना में जाना जाता है, जिससे संदर्भ-आधारित संरचना की खोज की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। डाउनलोड करने और सॉफ्टवेयर इंस्टॉल करने के निर्देश पर प्रदान की जाती हैं https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper । उदाहरण डेटा भी पाया जा सकता है, और उपयोगकर्ताओं को अपने स्वयं पर लागू करने का प्रयास करने से पहले उदाहरण डेटा पर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अभ्यास करने के लिए सलाह दी जाती है।
इधर, इस प्लगइन का उपयोग कर एसपीए मॉडल कच्चे डेटा से निर्माण करने के लिए के लिए चरणों का वर्णन किया गया है। सॉफ्टवेयर एकल ओ युक्त कच्चे चित्र लेताr इनपुट के रूप में बहु लेबल संरचनाओं। यह देता है, अनेक मानदंड के रूप में सॉफ्टवेयर चलाया जाता है समायोजित कर रहे हैं कि करने के लिए विषय, imaged संरचनाओं का नाम दिया घटकों की औसत वितरण दिखा एसपीए मॉडल।
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य पाइपलाइन चित्रा 1 में उल्लिखित के अनुसार imaged संरचनाओं के भीतर घटकों की औसत स्थानीयकरणों दे सटीक एसपीए मॉडलों का उत्पादन करने के लिए है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया, सॉफ्टवेयर कार्यप्रवाह उपयोगी तीन चरणों में बांटा गया है। पहले चरण प्रत्येक चैनल के लिए कणों के ढेर में जिसके परिणामस्वरूप, खंड बड़ी छवियों के लिए है। इन कणों इकाइयों कि मॉडल बनाने के लिए और मॉडल पीढ़ी के लिए बीज का उत्पादन करने के लिए औसत कर लिया जाएगा। दूसरे चरण बीज छवियों, जो अंतिम चरण में कणों के पूरे सेट रजिस्टर करने के लिए उपयोग किया जाता है उत्पन्न करने के लिए है। यह एक संदर्भ चैनल चुनने और मैन्युअल रूप से इस चैनल कि रों के लिए योगदान देगा में कणों का चयन करके किया जाता हैeeds। बीज इस संदर्भ चैनल में चुना जाता है लेकिन सभी चैनलों के लिए उत्पन्न किया जा सकता। कण शुरू में इस चैनल में एक 2D गाऊसी फिटिंग द्वारा पुनः संगठित कर रहे हैं। सभी कणों कि चयनित किया गया है और पुनः संगठित तो कर रहे हैं एक बीज का उत्पादन करने के लिए औसत। प्रत्येक सामान्य संरचना डेटा है कि मॉडल किए जाने में देखा के लिए, कणों बीज जो स्पष्ट और सटीक है कि संरचना का प्रतिनिधित्व के रूप में चुना जाना चाहिए। इस स्तर पर भी इस तरह के इंटरफेस संरचनाओं के लिए डेटा को स्कैन करने के लिए उपयोगी है।
अंतिम चरण टेम्पलेट मिलान का उपयोग कर मॉडल उत्पन्न करने के लिए है। यह कणों मूल रूप से पार से संबंध द्वारा पिछले अनुभाग में उत्पन्न बीज छवियों निकाले के पंजीकरण के माध्यम से हासिल की है। पंजीकृत कणों के एक उप समूह एक साथ औसत निकाला जाता है, और इस प्रक्रिया को और अधिक मॉडल कम करने के लिए वर्ग त्रुटि मतलब है, अगर वांछित दोहराया है। इस उपसमुच्चय बीज कि संतुष्ट होना चाहिए के खिलाफ कम से कम समानता की स्थापना द्वारा निर्धारित किया जाता है। जब मॉडल बनानेकई चैनलों में एक साथ है, संयुक्त समानता, या प्रत्येक चैनल के लिए समानता की औसत, प्रयोग किया जाता है। परिणामी मॉडल और पंजीकृत कणों है कि उन्हें करने के लिए योगदान तो आगे का विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
नोट: यह प्रोटोकॉल और वीडियो मूल पत्र 10 और अधिक विस्तार में सॉफ्टवेयर पैकेज का वर्णन पूरक। पाठकों सॉफ्टवेयर के उपयोग के बारे में अतिरिक्त मार्गदर्शन के लिए ध्यानपूर्वक समीक्षा करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। वहाँ तीन मुख्य चरण हैं: कण निष्कर्षण, व्यक्तिगत कणों में कौन-से सेगमेंट बड़ी छवियों; बीज चयन, जहां आम संरचनाओं डेटा में पहचान की है और गठबंधन कर रहे हैं बीज, जो अंतिम चरण में उपयोग किया जाता है का उत्पादन करने के लिए; और मॉडल पीढ़ी, जहां इन बीजों के आधार पर टेम्पलेट मिलान निकाले कणों और औसत एक सबसेट एसपीए मॉडलों का उत्पादन संरेखित करता है।
1. सेटअप पहले चल रहा है सॉफ्टवेयर पैकेज के लिए
- एक coverslip पर या प्रासंगिक प्रयोगात्मक शर्तों में अध्ययन के तहत संरचना के नमूने तैयार करें।
- छवि इस तरह संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) 11 या stimula के रूप में सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ नमूने,टेड उत्सर्जन कमी (STED) 12 माइक्रोस्कोपी।
नोट: कैसे तैयार करने के लिए और छवि के नमूने, अध्ययन के तहत संरचना की प्रकृति पर बहुत निर्भर करता है इसलिए प्रासंगिक साहित्य परामर्श किया जाना चाहिए की सटीक जानकारी। उदाहरण के लिए, तैयार करने और इमेजिंग इस तरह यहां इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप चेचक वायरस के नमूने, के लिए सटीक तरीका, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित है। - संरचना या कण, अधिमानतः हजारों की अलग प्रतियां की एक बड़ी संख्या दिखा देखने के कई क्षेत्रों के चित्र बनाएं। छवि कणों कि रूप में अच्छी तरह संभव के रूप में एक दूसरे से अलग और सुनिश्चित करें कि छवियों गंदगी या अन्य फ्लोरोसेंट संरचनाओं कि ब्याज की नहीं हैं के लिए स्वतंत्र हैं कर रहे हैं।
- फिजी उपकरण पट्टी में फ़ाइलों को खींच कर या "फाइल" का चयन> "खोलें" द्वारा फिजी में कणों से युक्त सभी छवियों को खोलें।
- का चयन करें "छवि"> "ढेर"> "उपकरण"> को श्रेणीबद्ध करने के लिए "जुटना"एक भी ढेर में छवियों। तो फिर, अगर परिणामी छवि एक Hyperstack है, यह एक ढेर में "छवि"> "Hyperstacks"> "Hyperstack स्टैक करने के लिए" का चयन करके बदल जाते हैं।
ध्यान दें: अंतिम ढेर intercalated चैनलों होना चाहिए। दो चैनलों देखते हैं, तो ढेर में पहली टुकड़ा पहली छवि से चैनल 1 होना चाहिए, दूसरा टुकड़ा इसी चैनल 2, तीसरे टुकड़ा दूसरी छवि से चैनल 1 होना चाहिए, और इतने पर किया जाना चाहिए।
2. कण निकालें
- खंड के लिए चित्र चुनें और "वायरल संरचनाएं निकालें" का चयन करें। जहां निकाले कणों बचाने के लिए और "निकालें वायरल संरचनाएं" देखने का विकल्प चुनें संवाद (चित्रा 2)।
- इस प्रकार उन्हें "वायरल संरचनाएं निकालें" संवाद में दर्ज करके प्रारंभिक अनुमान के साथ निष्कर्षण पैरामीटर निर्दिष्ट करें। फ़ाइन-ट्यून छवि विभाजन पूर्वावलोकन के बाद इन मानकों।
- सुन्न सेटविभिन्न प्रतिदीप्ति चैनलों की संख्या कि imaged किया गया है के रूप में डेटासेट में चैनलों की एर (जैसे, 2)।
- संदर्भ चैनल जहाँ से कणों चैनल की पसंद का नंबर दर्ज करके उस चैनल में चोटियों का पता लगाने के द्वारा निकाले जाते हैं निर्धारित करें। सबसे सुसंगत चैनल का चयन करें; जो है, चैनल, जिसमें सबसे कणों एक ही उपस्थिति है।
ध्यान दें: यदि संभव हो, इस चैनल में कणों एक केंद्रीय अधिकतम होगा। - या न एक पूर्व का पता लगाने गाऊसी कलंक लागू करने के लिए। कोई कलंक लागू करने के लिए 0 करने के लिए पूर्व का पता लगाने गाऊसी कलंक सेट; अगर यह मान बढ़ जाती है, यह देखते हुए त्रिज्या का एक गाऊसी कलंक फिल्टर स्थानीय मॅक्सिमा का पता लगाने से पहले लागू किया जाता है। यदि संदर्भ चैनल एक केंद्रीय अधिकतम (जैसे, अंगूठी आकार) नहीं है इस सुविधा का उपयोग करें; धुंधला एक की उपस्थिति प्रेरित करता है।
नोट: ब्याज की खंडों क्षेत्रों (ROI को), उन्हें करने के लिए लागू गाऊसी कलंक की जरूरत नहीं है के रूप में यह सुविधा केवल इस्तेमाल होता हैघ संदर्भ चैनल में ROI को स्थान देने के लिए। - पिक्सल में लागत पर लाभ त्रिज्या (जो एक स्थानीय अधिकतम आसपास का गठन किया जाएगा) सेट करें। एक मूल्य ऐसी है कि कि ROI को इस तरह के 3 चित्र में के रूप में सबसे बड़ा कण, तुलना में थोड़ा बड़ा कर रहे हैं का चयन करें। उदाहरण के लिए, यदि सबसे बड़ा कणों लगभग 30 पिक्सल (आंख से मोटे तौर पर अनुमान) के एक व्यास दिखाई देते हैं, तो 20 पिक्सल के लिए लागत पर लाभ का दायरा सेट।
- 100 से नीचे एक प्रारंभिक, अपेक्षाकृत छोटे मूल्य के लिए फ्रेम प्रति उपयोग करने के लिए ROI की संख्या सेट करें।
- अधिकतम लागत पर लाभ ओवरलैप सेट करें। कणों अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं, इस छोटे से रखना; अगर कणों समूह है, इस ओवरलैप ROI को सक्षम करने के लिए वृद्धि हुई है।
- "शो पूर्वावलोकन" का चयन करें।
नोट: जब यह चुना जाता है, वर्तमान फ्रेम के साथ जुड़े संदर्भ चैनल के लिए निकाली गई ROI को दिखाई देगा। - लागत पर लाभ त्रिज्या, ROI की संख्या, और चारों ओर यथासंभव अधिक से अधिक कणों उपयुक्त आकार के ROI को करने के लिए अधिक से अधिक लागत पर लाभ ओवरलैप समायोजित करें, 3 चित्र में के रूप में।
- विभाजन को चलाने के लिए "ठीक" का चयन करें। छवि और लागत पर लाभ प्रबंधक को बंद करें।
नोट: कण सेट की फ़ाइलों के नाम परिवर्तित न करें। निम्न अनुभागों के लिए - इन नामों प्रारूप में होना चाहिए "channelX वायरल कणों"।
3. बीज का चयन करें
- का चयन करें "बीज उत्पन्न करें", जहां निकाले कणों सहेजे जाते हैं फ़ोल्डर का चयन करें, और "बीज उत्पन्न" संवाद और खिड़कियां (चित्रा 4) देखें।
- उन्हें, "बीज उत्पन्न" संवाद में प्रवेश के रूप में निम्नानुसार द्वारा प्रारंभिक बीज चयन पैरामीटर निर्दिष्ट करें।
- संदर्भ चैनल कि संरेखित और केंद्र के लिए सभी चैनलों लगाया जाएगा निर्धारित करें। एक चैनल है, जिसमें सबसे अधिक कणों एक ही उपस्थिति है और यह कि, एक केंद्रीय अधिकतम है यदि संभव हो तो चुनें।
- सभी चैनलों जिसके लिए एक बीज उत्पन्न किया जाना चाहिए के लिए बॉक्स का चयन करें।
- का चयन करता है, तो बीज rotat होना चाहिए90 डिग्री तक एड। संरेखण अन्य मॉडलों के साथ संगत के लिए इस सुविधा का उपयोग
- या न एक पूर्व संरेखण गाऊसी कलंक लागू करने के लिए। 0 करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए कलंक त्रिज्या सेट कोई कलंक लागू करने के लिए। पुनर्निर्माण से पहले दिए गए त्रिज्या का एक गाऊसी कलंक फिल्टर लागू करने के लिए यह मान बढ़ाएँ। अगर कणों एक केंद्रीय अधिकतम की जरूरत नहीं है इस सुविधा का उपयोग करें; धुंधला एक की उपस्थिति प्रेरित करता है।
नोट: के रूप में यह सुविधा केवल संगत संरेखण प्राप्त करने के लिए है बीज, कलंक लागू नहीं होगा। - चाहे वह पारी सुधार का उपयोग करने के लिए अलग से गैर संदर्भ चैनलों के लिए बीज केंद्र के लिए हालांकि उन्हें बारी बारी से नहीं, जाँच या प्रत्येक चैनल के लिए "Shift सुधार" बॉक्स अनचेक करके चयन करें।
नोट: इस करता है, तो चैनलों में अच्छी तरह से एक दूसरे के साथ गठबंधन नहीं कर रहे हैं का उपयोग करें; यह भी पूरी तरह से संदर्भ के अनुसार अन्य चैनलों संरेखित, पारी सुधार के बिना के लिए उपयोगी हो सकता है।
- बीज के रूप में उपयोग करने के लिए कणों का चयन करें। टी के माध्यम से खोजेंवह अनुक्रम कण एक कण है कि संरचना है कि मॉडलिंग की और फ्रेम संख्या रिकार्ड किए जाने जैसा दिखता है खोजने के लिए।
- बॉक्स "का उपयोग करने के फ्रेम्स" में संख्या दर्ज करें, और अधिक खिड़कियां (चित्रा 5) दिखाई देगा। अल्पविराम के द्वारा अलग कई फ्रेम नंबर दर्ज करें।
- खिड़कियों में दिखाई देने वाले बीज फ्रेम और उसके एवज में औसत बीज देखें।
ध्यान दें: लॉग औसत के समान बीज का सुझाव देगा। - बीज चयन प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए इतना है कि पाया बीज फ्रेम के एक नंबर के लिए एक समान उपस्थिति संदर्भ चैनल, गाऊसी कलंक त्रिज्या, और पारी सुधार विकल्प को समायोजित करें। जोड़ने के बीज जारी रखें जब तक औसत बीज बनाई गई हैं कि संतोषजनक ढंग से संरचना डेटा है कि मॉडल किए जाने में देखा के समान है।
- बीज को नाम और जहाँ वे करने के लिए सहेजा जाएगा और चयन "ठीक है" मॉडल पीढ़ी में बाद में उपयोग के लिए अंतिम बीज छवियों को बचाने के लिए।
4. मॉडल उत्पन्न
- Seलेवल "बीज के आधार पर मॉडल उत्पन्न करें", जहां निकाले कणों सहेजे जाते हैं फ़ोल्डर का चयन करें, और "मॉडल उत्पन्न" संवाद (चित्रा 6) में देखते हैं।
- चेकबॉक्स का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए बीज लोड करें।
नोट: बीज एक सबफ़ोल्डर है कि "बीज उत्पन्न" संवाद में नामित किया गया था में सहेज लिया जाएगा। डिफ़ॉल्ट नाम "विश्लेषण" है। बीज औसत, नहीं फ्रेम्स, जो भी संदर्भ के लिए सहेजे जाते हैं का चयन करने के ख्याल रखना। - उन्हें, "मॉडल उत्पन्न" संवाद में प्रवेश के रूप में निम्नानुसार द्वारा प्रारंभिक मॉडल पीढ़ी पैरामीटर निर्दिष्ट करें। फ़ाइन-ट्यून इन मानकों बाद में।
- चाहे संरेखण के लिए एक संदर्भ चैनल है, जो केवल संदर्भ चैनल से अनुवाद और रोटेशन की गणना करता है और उन्हें सभी चैनलों पर लागू होता है उपयोग करने के लिए का चयन करें। इस विकल्प का उपयोग करते हैं, तो चैनल संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए का चयन करें।
ध्यान दें: यह विकल्प केवल विशेष रूप से एक refere के रूप में एक चैनल का उपयोग करने से चुना जाना चाहिएnce, इस तरह अगर संदर्भ-आधारित संरचना की खोज कर रही है के रूप में। अन्यथा, यह कम सटीक मॉडल का परिणाम देगा। चैनलों में अच्छी तरह से इस विकल्प का उपयोग करता है, तो गठबंधन किया जाना चाहिए। - टेम्पलेट मिलान के दौरान छवि तीव्रता वर्ग का निर्णय लें। इस छोटे से मतभेद बढ़, इसलिए जब एक मॉडल है जो विशेष रूप से सूक्ष्म विशेषताएं है बनाने के लिए इस का उपयोग करेगा।
- "बीज के खिलाफ न्यूनतम समानता" स्लाइडर का उपयोग करके या बॉक्स में एक नंबर दर्ज करके बीज के खिलाफ कम से कम समानता का चयन करें।
नोट: केवल इस कट ऑफ उपयोग किया जाएगा से अधिक बीज के लिए एक समानता के साथ कणों। आम तौर पर 60-80% के साथ शुरू करने के लिए एक अच्छा विकल्प है। - 1 से पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या सेट बीज के खिलाफ कम से कम समानता का अनुकूलन, और बाद में इसे बढ़ाने के लिए, के रूप में की आवश्यकता है।
- मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया है कि दिखाई देगा के तत्वों का चयन करने के बॉक्स चुनें।
नोट: "बीज शो" बीज कि boxe के साथ भरी हुई किया गया है प्रदर्शित करेगासंवाद के शीर्ष पर है। "शो मॉडल" मॉडल कणों के सबसेट है कि बीज के खिलाफ कम से कम समानता को पूरा करती है औसत से बनाए जाते हैं के सभी पुनरावृत्तियों को प्रदर्शित करेगा। "शो एमएसई" एक मतलब चुकता त्रुटि (एमएसई) छवि है कि मॉडल है कि सबसे अधिक परिवर्तनशील हैं के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला गया प्रदर्शित करेगा। "शो कण" कणों कि मॉडल बनाने के लिए उपयोग किया जाता है के सबसेट, मॉडल प्रदर्शित होने के उच्चतम यात्रा के अनुसार पंजीकृत प्रदर्शित करेगा।
- चाहे संरेखण के लिए एक संदर्भ चैनल है, जो केवल संदर्भ चैनल से अनुवाद और रोटेशन की गणना करता है और उन्हें सभी चैनलों पर लागू होता है उपयोग करने के लिए का चयन करें। इस विकल्प का उपयोग करते हैं, तो चैनल संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए का चयन करें।
- पूर्वावलोकन मॉडल पैदा करते हैं और परिणाम देखने के लिए "पूर्वावलोकन दिखाएं" चुनें।
नोट: यह प्रक्रिया का सबसे कंप्यूटेशनल रूप से संवेदनशील कदम है। एक डेस्कटॉप पीसी पर पिक्सल के कुछ दसियों के व्यास के साथ कुछ हजार कणों का एक सेट के लिए समय से चल रहा है चारों ओर 10 मिनट का होना चाहिए। गणना समय एक मुद्दा है, तो उपयोगकर्ता पहले डेटा के एक छोटे सबसेट पर एल्गोरिथ्म की कोशिश या, कदम 2.2.4 में एक छोटे आरओआई दायरे का उपयोग करें यदि संभव हो जाना चाहिए। - उत्पन्न देखेंघ मॉडल और मानकों, विशेष रूप से बीज के खिलाफ कम से कम समानता का अनुकूलन। जब तक मॉडलिंग आकृति विज्ञान की ही सच्चा कणों मॉडल में शामिल किए गए बीज के खिलाफ कम से कम समानता बढ़ाएँ।
- स्लाइडर "पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या" का उपयोग करके या बॉक्स में एक नंबर दर्ज करके पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या बढ़ाने के लिए और मॉडल निर्माण प्रक्रिया को दोहराने में अनुमति देते हैं। अधिक से अधिक यात्रा के लिए 10 के आसपास एक मूल्य का उपयोग करें।
- मॉडल का नाम और मॉडल विकास के ढेर है कि अंतिम मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया के सभी पुनरावृत्तियों को शामिल बचाने के लिए चयन "ठीक है"।
नोट: यदि बीज के खिलाफ कम से कम समानता इतनी अधिक है कि कोई कण इस समानता है, कुछ भी नहीं अद्यतन किया जाएगा। प्लगइन जमे हुए प्रतीत होता है, तो संभावना है कि कम से कम समानता बहुत अधिक है पर विचार करें।
Representative Results
यहाँ, हम मॉडल poxvirus, चेचक वायरस पर सॉफ्टवेयर का प्रदर्शन। सबसे जटिल स्तनधारी वायरस, चेचक संकुल में से एक एक 350 x 270 x 250 एनएम 3 ईंट के आकार का कण 13, 14 के भीतर लगभग 80 विभिन्न प्रोटीन। तीन substructures इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष कर रहे हैं: एक केंद्रीय कोर, जो dsDNA जीनोम होता है; दो प्रोटीन संरचनाओं, पार्श्व निकायों, जो कोर पार्श्व कहा जाता है; और एक भी proteolipid दोहरी परत लिफाफा 15। बड़े आकार, जटिल संरचना, और पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैगिंग के ज़िम्मा चेचक एक उत्कृष्ट प्रणाली VirusMapper कार्यप्रवाह प्रदर्शित करने के लिए बनाते हैं।
यहां दिए गए अनुसार सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, चेचक विरिअन पर प्रोटीन की एक किस्म के वितरण प्रतिरूप बनाया जा सकता। एक प्रोटीन चिह्नित किया गया और imaged कोम्बी में संभवतः,एक संदर्भ के रूप में जाना जाता वितरण का एक और प्रोटीन, और सॉफ्टवेयर के साथ राष्ट्र के रूप में कण पर कि प्रोटीन का स्थानीयकरण की औसत मॉडलों का उत्पादन वर्णित किया जाता था। इस उदाहरण में, दो प्रोटीन मॉडलिंग कर रहे थे, भीतरी कोर प्रोटीन L4, और प्रमुख पार्श्व शरीर घटक F17।
एक पुनः संयोजक चेचक वायरस जो F17 है GFP के साथ टैग और L4 में चिह्नित mCherry 16 के साथ इस्तेमाल किया गया था। शुद्ध वायरस 1 मिमी Tris, पीएच 9 में पतला है, और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोटिंग द्वारा धोया, उच्च प्रदर्शन coverslips करने के लिए बाध्य किया गया था। नमूने फिर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% formaldehyde लगाने से सुधारा गया। Coverslips antifade बढ़ते मध्यम में स्लाइड पर तुरंत रखा। इमेजिंग एक वाणिज्यिक सिम माइक्रोस्कोप पर सिम द्वारा किया गया। विचार का एक क्षेत्र वायरस और छवियों के सैकड़ों युक्त चयनित किया गया था 5 चरण परिवर्तन और 561 एनएम के साथ 3 ग्रिड चक्र (32 सुक्ष्ममापी पे झंझरी का उपयोग कर प्राप्त हुए थेriod) और 488 एनएम (32 सुक्ष्ममापी झंझरी की अवधि) पराबैंगनीकिरण। छवियाँ एक sCMOS कैमरे का उपयोग कर हासिल कर लिया और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रोसेस किया गया। चैनल एक बहुरंगी मनका स्लाइड एक ही छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ imaged के आधार पर गठबंधन किया गया। सिम पुनर्निर्माण और चैनल संरेखण छवियों फिजी में खोला गया था और एक ही छवि ढेर में concatenated रहे थे के बाद।
वायरल कणों, संदर्भ के रूप में और किसी भी गाऊसी कलंक लागू किए बिना L4 चैनल का उपयोग कर छवियों से निकाले गए थे के रूप में इन कणों एक केंद्रीय अधिकतम है। लगभग 15,000 कणों इस प्रयोग में निकाला गया था।
चेचक की ज्यामिति के कारण, पार्श्व शरीर एक अलग वायरस रुचि के आधार पर उपस्थिति है। हम दो झुकाव, जिसमें या तो एक या दो पार्श्व निकायों प्रतिष्ठित किया जा सकता है कल्पना। हम ललाट और सैजिटल, सम्मान के रूप में इन झुकाव करने के लिए भेजाively।
ललाट और सैजिटल झुकाव के लिए अलग बीज "बीज उत्पन्न करें" चरण में कण सूची के माध्यम से खोज के द्वारा चयन किया गया था (आंकड़े 4 और 5); कणों कि एक अभिविन्यास में स्पष्ट रूप से थे या अन्य चुने गए हैं। L4 चैनल संदर्भ चैनल एक दूसरे के साथ बीज संरेखित करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया गया था। फिर से, कोई गाऊसी कलंक जरूरी हो गया था। प्रत्येक उन्मुखीकरण के लिए 5 कणों चयन किया गया था और बीज उत्पन्न करने के लिए औसत रहे थे।
मॉडल इन बीजों के आधार पर प्रत्येक उन्मुखीकरण के लिए उत्पन्न किया गया। न तो एक संदर्भ चैनल है और न ही चुकता तीव्रता मूल्यों इस्तेमाल किया गया। पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या 1 के लिए शुरू में स्थापित किया गया था, और न्यूनतम समानता प्रत्येक मामले है, जो प्रत्येक उन्मुखीकरण के लिए एक सुसंगत उपस्थिति दे दी है में 1000 के आसपास कणों शामिल करने के लिए स्थापित किया गया था। पुनरावृत्तियों की अधिकतम संख्या तो करने के लिए बढ़ा दिया गया थामॉडल के अभिसरण के लिए अनुमति देते हैं। मॉडल इस प्रकार (चित्रा 7) दो चैनलों में दो झुकाव के लिए उत्पन्न किया गया।
चित्र 1: VirusMapper कार्यप्रवाह। प्लगइन तीन मुख्य चरणों में व्यवस्थित होती। वायरल कणों बड़ी छवियों से निकाले जाते हैं, टेम्पलेट छवियों या बीज डेटा से अर्द्ध मैन्युअल रूप से चयन किया जाता है, और अंतिम एसपीए मॉडल बीज का हवाला देते हुए डेटा से उत्पन्न कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: संवाद "वायरल संरचनाएं निकालें"। जब का चयन "निकालें वायरल स्ट्रक्चरल डिजाइन es ", इस संवाद दिखाई देगा। पैरामीटर इष्टतम विभाजन के लिए प्रारंभिक अनुमान से भरा जाना चाहिए।" शो पूर्वावलोकन "तो चुना जा सकता है, की अनुमति के ROI को पूर्वावलोकन किया जा करने के लिए और मानकों परिष्कृत किया जाना है। एक को देखने के लिए यहां क्लिक करें इन आंकड़ों की बड़ा संस्करण।
चित्र 3: निष्कर्षण पैरामीटर सेट करना। ROI को कि निकाला जाएगा, लागत पर लाभ त्रिज्या, ROI की संख्या, और अधिकतम लागत पर लाभ ओवरलैप पूर्वावलोकन करने के बाद इस तरह एक स्थिति प्राप्त करने के लिए समायोजित कर रहे हैं। ROI को कणों तुलना में थोड़ा बड़ा सभी कणों एक लागत पर लाभ में शामिल हैं, और ROI को पर्याप्त रूप से ओवरलैप कर सकते हैं संकुल कणों को अलग किया जा करने की अनुमति कर रहे हैं।ank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: जनरेट कर रहा है टेम्पलेट मिलान बीज। "बीज उत्पन्न" संवाद (1) मानकों आवंटित करने के लिए निर्धारित करता है। संदर्भ कणों अनुक्रम (2) उपयोगकर्ता संदर्भ चैनल में कणों के माध्यम से स्कैन करने के लिए अनुमति देता है। जब एक कण संदर्भ कणों अनुक्रम में देखा जाता है, सभी चैनलों के लिए पुनः संगठित कणों को पुनः संगठित कण पूर्वावलोकन (3) में देखी जा सकती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: बीज चित्र जोड़ना। बीज के लिए जोड़ रहे हैं बॉक्स "फ्रेम्स उपयोग करने के लिए", सभी बीज (4) की औसत और इसमें शामिल फ्रेम (5) प्रदर्शित होते हैं। कण जो मौजूदा औसत बीज के समान हैं संवाद बॉक्स (6) में सुझाव दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: "मॉडल उत्पन्न" संवाद। जब का चयन "बीज के आधार पर मॉडल उत्पन्न," इस संवाद दिखाई देगा। मापदंडों इष्टतम मॉडल पीढ़ी के लिए प्रारंभिक अनुमान के साथ भरा जाना चाहिए, और मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया के तत्वों चयन किया जाना चाहिए गणना के दौरान दिखाया जाएगा। "शो पूर्वावलोकन" फिर चयनित किया जा सकता है, को चलाने के लिए मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया की इजाजत दी और मानकों को परिष्कृत किया जाना है।ftp_upload / 55,471 / 55471fig6large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 7: VirusMapper साथ उत्पन्न मॉडल। L4 कोर प्रोटीन mCherry के साथ टैग और F17 पार्श्व शरीर की प्रोटीन EGFP के साथ टैग के साथ चेचक virions सिम का उपयोग कर imaged किया गया। मॉडल तो प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, सॉफ्टवेयर के साथ उत्पन्न किया गया। दो झुकाव, ललाट और सैजिटल, पार्श्व निकायों की उपस्थिति से की जाती है। स्केल बार = 100 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
इस पद्धति से, शोधकर्ताओं ने आदेश उच्च परिशुद्धता, वायरस और अन्य macromolecular परिसर के प्रोटीन वास्तुकला का मल्टी चैनल 2 डी मॉडल उत्पन्न करने के लिए स्पा और एसआर माइक्रोस्कोपी की शक्ति गठबंधन करने के लिए सुसज्जित हैं। हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
बीज एक संरचना है कि लगातार देखा जा रहा है प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना जाना चाहिए। इस प्रकार, कच्चे डेटा का निरीक्षण किया जाना चाहिए ध्यान से पहले बीज चुना जाता है। यह पक्षपातपूर्ण मॉडल को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। विकल्प मॉडल में कणों की एक निश्चित संख्या में शामिल करने के लिए आवश्यक न्यूनतम समानता थ्रेसहोल्ड की परीक्षा द्वारा मान्य किया जा सकता है। जाहिर है, बीज के एक विकल्प के लिए, उच्च इस सीमा से कणों की दी गई संख्या के लिए होने की जरूरत है, और अधिक है कि संरचना डेटा में स्पष्ट है।
जब डेटा में विविधता है टेम्पलेट मिलान अवधारणा विशेष रूप से उपयोगी है। सभी विभिन्न संरचनाओं कि vi हैंअसंभव पहचान की जानी चाहिए और विभिन्न मॉडलों प्रत्येक मामले के लिए बनाया। एक चैनल में विषम संरचनाओं को अलग लेकिन एक साथ एक दूसरे चैनल में मॉडल बनाकर, पैटर्न सामने आ सकते हैं कि तुरंत स्पष्ट नहीं किया गया है।
एक अन्य विचार जब इस कलन विधि का उपयोग कि यात्रा प्रक्रिया स्टोकेस्टिक विषमता को अधिकतम जाएगा के बारे में पता किया जाना है। उदाहरण के लिए, जब दो सममित मॅक्सिमा के साथ एक संरचना मॉडलिंग, मॅक्सिमा के बीच सभी मामूली विषमताओं एक दूसरे के साथ यात्रा के दौरान गठबंधन किया जाएगा, और अंतिम मॉडल इस प्रकार अधिकतम विषम हो जाएगा। इस संरचना में एक ज्ञात समरूपता प्रतिबिंबित नहीं करता है मॉडल की जा रही है, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए। वर्तमान में, एक ही रास्ता इस अधिकतमकरण से बचने के लिए हालांकि एक संभावित विकास VirusMapper मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया में समरूपता के अक्ष को शामिल करने के लिए हो सकता है, 1 करने के लिए पुनरावृत्तियों की संख्या को सीमित करने के लिए है। VirusMapper के किसी भी नए संस्करण avai हो जाएगासंदर्भित वेबसाइट पर करने के लिए सक्षम है (देखें सामग्री तालिका)। उपयोगकर्ताओं को भी किसी भी आम प्रश्नों का जवाब करने के लिए यहाँ एक पूछे जाने वाले प्रश्न मिल जाएगा।
सॉफ्टवेयर के रूप में वर्णित किसी भी संरचना है कि सुविधाओं है कि उपयोगकर्ता मॉडल करने के लिए चाहता है कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है के लिए लागू है। एसपीए संकल्प में सुधार कर सकते हैं, यह स्पष्ट रूप से सुविधाओं है कि अन्यथा दिखाई नहीं देते हैं की दृश्यता में सुधार नहीं होगा। यह प्रोटोकॉल, इसलिए, एक विधि डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए नहीं है। किसी भी तकनीक, सावधान नमूना तैयार करने और अनुकूलन इमेजिंग रणनीति का साफ डेटा और सबसे अच्छा परिणामी मॉडल प्रदान करेगा के साथ होता है।
एसआर इमेजिंग साधन के चुनाव भी महत्वपूर्ण है और सामान्य रूप में, हाथ में नमूना पर निर्भर करेगा। VirusMapper सिम और STED 10 के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए मान्य किया गया है, और यह भी उच्च गुणवत्ता वाले स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी डेटा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ध्यान इस मामले में लिया जाना चाहिए,के रूप में विरल लेबलिंग विषमता अधिकतमकरण के समान ही समस्याओं का कारण बन सकता है।
वर्तमान में, VirusMapper प्रतिदीप्ति छवियों के एकल कण विश्लेषण और केवल सामान्य प्रयोजन 2 डी एसपीए औसत सॉफ्टवेयर के लिए केवल स्वतंत्र रूप से उपलब्ध एल्गोरिथ्म है। अन्य अध्ययनों से पता है कि एक ही सिद्धांतों 4, 6 का इस्तेमाल किया है, 8 कस्टम प्रत्येक विशेष अध्ययन के लिए विशेष सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया है। 3 डी डेटा के पुनर्निर्माण के लिए सामान्य प्रयोजन एल्गोरिदम, प्रकाशित किया गया है 5, 18, हालांकि कोई सॉफ्टवेयर प्रदान किया गया।
जब के रूप में इस आलेख में वर्णित करते थे, VirusMapper वायरस और अन्य परिसरों में से macromolecular प्रोटीन वास्तुकला का, सटीक, सही और मजबूत मॉडलों का उत्पादन किया जा सकता है। इन मॉडलों के साथ, शोधकर्ताओं struct की औसत आयाम की सटीक माप ले जा सकते हैंअध्ययन के तहत ures, संभवतः उन्हें जैविक निष्कर्ष है कि नहीं होगा अन्यथा संभव तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, इस तकनीक का मल्टी चैनल क्षमताओं के साथ, यह संभव परिसरों के भीतर प्रोटीन और घटकों के एक असीमित संख्या में मैप करने के लिए और उपन्यास प्रोटीन संगठन को खोजने के लिए है। इस तरह के एक वायरस जीवन चक्र के विभिन्न चरणों के रूप में विभिन्न जैविक रूप से प्रासंगिक की स्थिति, में नैनो पैमाने संरचना में परिवर्तन की जांच करना, संभावित जीव विज्ञान में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम मूल विकास और VirusMapper के सत्यापन के लिए उनके योगदान के लिए कोरिना बीर्ली, जर्ज़ी सामोलेज, पेड्रो माटोस परेरा, क्रिस्टोफर ब्लैक, और कैथरीन शेरेर धन्यवाद देना चाहते हैं। हम यह भी पांडुलिपि के बारे में उनकी महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए आर्टर यकिमोविच धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (बी बी / M022374 / 1) (आरएच); आण्विक सेल बायोलॉजी के लिए एमआरसी लेबोरेटरी के कोर धन, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन (जेएम); यूरोपीय अनुसंधान परिषद (649,101-UbiProPox) (जेएम); और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआर / K015826 / 1) (आरएच और जेएम)। आरजी इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (ईपी / M506448 / 1) द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiji | Open-source image analysis software | ||
| NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
| VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
| Elyra PS1 | Zeiss | ||
| ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
| High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |
References
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