Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Summary

Dette manuskriptet bruker Fiji-basert open-source programvarepakke VirusMapper å anvende enkeltpartikkelanalyse til super-oppløsning mikroskopi bilder for å generere nøyaktige modeller av nanoskala struktur.

Abstract

Super-oppløsning fluorescens mikroskopi for tiden revolusjonerer cellebiologi forskning. Dens evne til å bryte grensen oppløsningen på rundt 300 nm gjør det mulig for den rutinemessige avbildning av nanoskala biologiske komplekser og prosesser. Denne økningen i oppløsning betyr også at metoder populære i elektronmikroskopi, for eksempel enkeltpartikkelanalyse, kan lett anvendes på super oppløsning fluorescens mikroskopi. Ved å kombinere denne analytiske metode med super-oppløsning optisk avbildning, blir det mulig å dra nytte av molekylet-spesifikke merking kapasitet av fluorescens mikroskopi for å generere strukturelle kartene over molekylære elementer i en metastabil struktur. For å oppnå dette, har vi utviklet en ny algoritme - VirusMapper - pakkes som en lett-å-bruke, høy ytelse og høy gjennomstrømming ImageJ plugin. Denne artikkelen presenterer en grundig guide til denne programvare, som viser dens evne til å avdekke nye konstruktive trekk i biologisk molecular komplekser. Her presenterer vi hvordan man skal sette sammen data som er kompatible og gi en trinn-for-trinn-protokollen på hvordan man skal bruke denne algoritmen for å anvende enkeltpartikkelanalyse til super-oppløsning.

Introduction

Super-oppløsning (SR) Mikroskopi har hatt en stor innvirkning på cellebiologi å oppnå en mulighet til å bilde viktige molekylære prosesser sammen med den molekylære spesifikk merking avgjørende for forståelsen dem. SR muliggjør nå lysmikroskopi for å nærme seg de oppløsninger (20-150 nm) som tidligere bare oppnås med elektronmikroskopi (EM) ved opprettholdelse av de store fordelene med lysmikroskopi, slik som potensialet for bilde levende celler ^{1, 2.} Videre, den strukturelle bevaring funnet på nanoskala nivå tillater anvendelsen av enkeltpartikkelanalyse (SPA) til SR data, et begrep som brukes i stor utstrekning i elektronmikros ^3. Ved hjelp av SPA, kan mange høykonserverte kopier av en struktur skal avbildes, og i gjennomsnitt sammen for å forbedre oppløsning, nøyaktighet, eller signal-til-støy av visualisert objektet. Når den brukes i kombinasjon med SR har SPA blitt vist å være et kraftig verktøy for høy-precision kartlegging av komponenter av det nukleære pore-komplekset ^{4, 5, 6,} centrosomer og virus, så som HIV ⁷ og HSV-1 ^8.

Imidlertid har rutinen kombinert anvendelse av SR og SPA blitt utfordret ved en mangel på tilgjengelig programvare. Av denne grunn har vi utviklet VirusMapper, en plugin til det populære bildebehandlingsprogram ImageJ / Fiji ^9. Dette er den første fritt tilgjengelig programvarepakke for generalisert SPA med fluorescens bilder ¹⁰ utformet for å gi rask, brukervennlige, flerkanals naive midling av strukturer bilde av med SR mikroskopi. Selv om utformet for virus, kan det brukes et hvilket som helst makromolekylært kompleks i hvilket forskjellige molekylarter kan avbildes, identifisert, og lokalisert.

VirusMapper kan brukes til å produsere høy presisjon molekylmodeller av hvilken som helst kjent konstruksjon, slik at for beregning av midlere dimensjoner og andre parametere. Algoritmen utforming gjør den særlig egnet for separering av populasjoner av strukturer, som gir for bestemmelse av forskjellige orienteringer eller ulike morfologiske tilstander. Dessuten kan flerkanals avbildning benyttes til å anvende en referansekanal i tilfeller hvor den underliggende konstruksjon er velkjent, for derved å mulig referanse basert struktur oppdagelse. Instruksjonene for å laste ned og installere programvaren er gitt på https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Eksempel data kan også bli funnet der, og brukerne oppfordres til å øve på å bruke programvaren på eksempel data før du prøver å bruke den til sin egen.

Her er fremgangsmåten for å bruke denne plugin for å produsere SPA modeller fra rådata beskrevet. Programmet tar rå bilder som inneholder enkelt- or multi-merkede konstruksjoner som inndata. Den returnerer, i henhold til et antall parametre som er justert som programmet kjøres, SPA modeller som viser de gjennomsnittlige fordelingen av de merkede komponentene i den avbildede strukturer.

Målet med denne protokollen er å frembringe presise SPA-modeller som gir de gjennomsnittlige lokaliseringer av komponenter innenfor avbildede strukturer i henhold til rørledningen skissert i figur 1. Som vist i figur 1, er programvaren arbeidsflyt med fordel deles inn i tre faser. Det første trinn er å dele opp store bilder, noe som resulterer i stabler av partikler for hver kanal. Disse partikler er enhetene som skal gjennomsnitt av for å lage modeller og for å produsere frø for modellgenereringen. Det andre trinnet er å generere frø bilder, som brukes til å registrere hele settet av partikler i det siste trinn. Dette gjøres ved å velge en referansekanal og ved manuelt valg av partiklene i denne kanalen som vil bidra til den seeds. Frø er valgt i denne referansen kanal, men kan bli generert for alle kanaler. Partikler blir først gjeninnrettet ved å tilpasse en 2D-gaussisk i denne kanalen. Alle partikler som har blitt valgt og realigned er så tatt gjennomsnitt av for å produsere et kim. For hver felles struktur sees i dataene som skal modelleres, bør partiklene velges som frø som klart og nøyaktig representerer den struktur. Grensesnittet på dette stadiet er også nyttig for å skanne data for slike strukturer.

Det siste trinnet er å generere modeller ved bruk av mal tilpasning. Dette oppnås ved registrering av partiklene som opprinnelig utvunnet til frøet bildene som genereres i det foregående avsnitt ved krysskorrelasjon. En undergruppe av registrerte partikler blir midlet sammen, og fremgangsmåten er videre iterert for å redusere modell gjennomsnittlig kvadratisk feil, om ønskelig. Dette undersett bestemmes ved å sette et minimums likhet mot frø som må være oppfylt. Ved oppretting av modellens samtidig i flere kanaler, felles likhet, eller gjennomsnittet av likhetene for hver kanal, blir brukt. De resulterende modeller og de registrerte partikler som bidro til dem kan deretter bli ytterligere analysert.

Protocol

MERK: Denne protokollen og video supplere den opprinnelige papir ¹⁰ beskriver programvarepakken i mer detalj. Leserne oppfordres til å dette nøye for ytterligere veiledning om bruk av programvaren. Det er tre hovedtrinn: Partikkel ekstraksjon, hvilke segmenter store bilder til individuelle partikler; for utvelgelse av såkorn, hvor vanlige strukturer er identifisert i dataene og innrettet for å produsere frø, som brukes i det avsluttende trinn; og modellgenerer, hvor malen tilpasning basert på disse frøene innretter de ekstraherte partikler og gjennomsnittene et undersett for å fremstille de SPA-modeller.

1. Setup før du kjører Software Package

1. Forberede prøver av den struktur som undersøkes på et dekkglass eller i de aktuelle forsøksbetingelser.
2. Bilde prøvene med super-oppløsning fluorescens mikroskopi, for eksempel strukturert belysning mikroskopi (SIM) ¹¹ eller stimulated utslipp uttømming (STED) ¹² mikroskopi.
   MERK: De nøyaktige detaljer om hvordan å forberede og bildeeksempler avhenger i stor grad av hva slags struktur under studien, slik at relevant litteratur bør konsulteres. Som et eksempel kan den nøyaktige metode for å fremstille og å avbilde prøver av vaccinia-virus, slik som de som benyttes her, er beskrevet i den representative resultater delen.
3. Lage bilder av forskjellige områder riss som viser et stort antall av enkeltkopier av strukturen eller partikler, fortrinnsvis tusener. Bilde partikler som er så godt adskilt fra hverandre som mulig, og sikrer at bildene er fri for smuss eller andre fluorescerende konstruksjoner som ikke er av interesse.
4. Åpne alle bildene som inneholder partiklene i Fiji ved å dra filene til verktøylinjen Fiji eller ved å velge "File"> "Open".
5. Velg "Image"> "Stack"> "Tools"> "Slå sammen" for å sette sammen denbilder i en enkelt stabel. Da, hvis den resulterende bildet er en Hyperstack, slå den inn i en stabel ved å velge "Image"> "Hyperstacks"> "Hyperstack å stable".
   MERK: Den endelige stabelen skal ha interkalerte kanaler. Hvis det er to kanaler, bør den første skive i stabelen være en kanal fra det første bildet, skulle det andre stykket være den tilsvarende kanal 2, den tredje skive bør være en kanal fra det andre bildet, og så videre.

2. Pakk partiklene

1. Velg bilde å segmentere og velge "Extract Viral Structures". Velg hvor du vil lagre ut partikler og vise "Extract Viral Structures" dialogboks (figur 2).
2. Tildel ekstraheringsparametre med det innledningsvis ved å skrive dem inn i "Viral Extract Structures" dialogen som følger. Finjustere disse parametrene etter forhåndsvisning av bildet segmentering.
   1. Sett nummener av kanaler i datasettet som det antall forskjellige fluorescens-kanaler som er avbildet (for eksempel 2).
   2. Sett referansekanalen fra hvilke partikler ekstraheres ved detektering av topper i den kanal ved å angi antallet av valg av kanal. Velg den mest konsekvente kanal; det vil si, den kanal i hvilken de fleste partikler har samme utseende.
      MERK: Hvis det er mulig, vil partiklene i denne kanal har en sentral maksimum.
   3. Velg om du vil bruke en pre-deteksjon Gaussian blur. Sett pre-gjenkjenning Gaussian blur til 0 for å søke ingen uskarphet; Hvis denne verdien økes, et gaussisk filter sløring av hvilken gitte radius påføres før lokale maksima deteksjon. Bruk denne funksjonen hvis referansekanalen ikke har en sentral maksimum (for eksempel ringform); uskarpe induserer utseendet av en.
      MERK: Segmentert regioner av interesse (Rois) ikke har Gaussian blur brukes på dem, så denne funksjonen er kun brukd for å posisjonere ROIs i referansekanalen.
   4. Angi radien ROI (som vil bli sett rundt hver lokale maksimum) i piksler. Velge en slik verdi at at ROIs er noe større enn de største partikler, som i figur 3. For eksempel, dersom de største partiklene synes å ha en diameter på rundt 30 piksler (beregnet omtrent på øyemål), så sette ROI radius til 20 piksler.
   5. Sett antall ROIs å bruke per ramme til en første, forholdsvis liten verdi under 100.
   6. Angi maksimal avkastning overlapping. Hvis partiklene er godt atskilt, holde denne lille; hvis partikler er samlet, øke denne for å muliggjøre ROIs å overlappe.
3. Velg "show preview".
   Merk: Når denne er valgt, vil de uttrukne ROIs for referansekanalen som er tilordnet den aktuelle ramme ut.
4. Juster radius ROI, antallet ROIs, og den maksimale ROI overlapping for å ha ROIs av passende størrelse rundt så mange partikler som mulig, Som i figur 3.
5. Velg "OK" for å kjøre segmentering. Lukke bildet og ROI manager.
   MERK: Ikke endre navn på filer av partikkel sett. Disse navnene må være i formatet "Viral partikler - channelX" for de neste avsnittene.

3. Velg Seeds

1. Velg "Generer Seeds", velg mappen der de utpakkede partikler blir lagret, og vise "Generer Seeds" dialog og vinduer (figur 4).
2. Tildel innledende frø-valgparametere ved å skrive dem inn i "Generer Seeds" dialog, som følger.
   1. Sett referansekanalen som vil bli tilpasset for å innrette og midt alle kanaler. Velge en kanal hvor de fleste partikler har samme utseende og som har en sentral maksimum, hvis mulig.
   2. Velg de bokser for alle kanaler for hvilke et frø skal genereres.
   3. Velg om frøene skal være rotered 90 °. Bruk denne funksjonen til å ha justering i samsvar med andre modeller
   4. Velg om du vil bruke en pre-justering Gaussian blur. Sett radius uskarphet for hver kanal til 0 for å bruke noe uskarphet. Øke denne verdien for å bruke en Gaussisk sløring filter for gitt radius før omstillingen. Bruk denne funksjonen hvis partiklene ikke har en sentral maksimalt; uskarpe induserer utseendet av en.
      MERK: Frø vil ikke ha uskarphet brukt, så denne funksjonen er bare for å få konsistent justering.
   5. Velges om korrigering skift for separat å sentrere frø for ikke-referansekanaler, men ikke rotere dem, ved å merke av eller fjerne de "dreiningskorreksjon" bokser for hver kanal.
      Merk Bruk denne dersom antallet kanaler leverer på linje med hverandre; Det kan også være nyttig for innretting av andre kanaler utelukkende i henhold til referanse, uten dreiningskorreksjon.
3. Velge partikler som kan brukes som frø. gjennom t søkhan partikkel-sekvens for å finne en partikkel som ligner strukturen som skal bli modellert og registrere rammenummeret.
4. Tast inn nummeret i "Frames å bruke" boksen, og flere vinduer vises (Figur 5). Legge inn flere rammenumrene separert med komma.
5. Vis frøet rammer og de resulterende gjennomsnittlig frøene i vinduene som vises.
   MERK: Loggen vil foreslå frø som ligner på gjennomsnittet.
6. Juster referansekanalen, den gaussiske sløringsradius, og skiftkorrigering for å optimalisere for utvelgelse av såkorn prosessen slik at en rekke frø rammer funnet har et lignende utseende. Fortsett tilsetning av kornene, inntil gjennomsnitts frø er skapt som en tilfredsstillende ligner konstruksjonen vist i de data som skal bli modellert.
7. Navn frøene og hvor de vil bli lagret og velg "OK" for å lagre den endelige frø bildene for senere bruk i modellen generasjon.

4. Generer Modeller

1. Select "Generer modeller basert på Seeds", velge mappen hvor de ekstraherte partikler blir lagret, og vise "Generer modeller" dialogboks (figur 6).
2. Laster frøene for hver kanal ved hjelp av boksene.
   MERK: Frø vil bli lagret i en undermappe som ble navngitt i "Generer Seeds" dialogen. Standardnavnet er "Analysis". Vær nøye med å velge frø Gjennomsnitt, ikke Rammer, som også er lagret for referanse.
3. Tildel innledende modellgenerer parametre ved å skrive dem inn i "Generer modeller" dialogen, som følger. Finjustere disse parametrene senere.
   1. Velges om en referansekanal for justering, som beregner translasjoner og rotasjoner bare fra referansekanalen, og anvender dem for alle kanaler. Hvis du bruker dette alternativet, velger du kanal som skal brukes som referanse.
      MERK: Dette alternativet bør bare velges spesifikt bruke en kanal som reference, for eksempel om å gjøre referanse basert struktur oppdagelse. Ellers vil det resultere i mindre nøyaktige modeller. Kanalene bør være godt justert om bruk av dette alternativet.
   2. Velg om du torget bildeintensiteter under mal matching. Dette vil fremheve små forskjeller, så bruke denne ved opprettelse av en modell som har meget subtile trekk.
   3. Velge en minimum likhet mot frø ved hjelp av "Minimum likheten mot frø" glideren eller ved å taste inn et nummer inn i boksen.
      MERK: bare partikler med en viss likhet til frøene som er større enn denne cut-off vil bli brukt. 60-80% er vanligvis et godt valg å begynne med.
   4. Angi det maksimale antall iterasjoner til 1, optimalisere den minste likheten mot frø, og øke den senere, etter behov.
   5. Velg de boksene for å velge elementene i modellen generasjon prosess som vil dukke opp.
      MERK: "Vis frø" vil vise frø som har blitt lastet med bokss på toppen av dialogboksen. "Vis modeller" vil vise alle gjentakelser av modellene som er opprettet fra midling av undergruppe av partikler som oppfyller minste likheten mot frø. "Show MSE" vil vise en gjennomsnittlig squared error (MSE) bilde som fremhever de områdene av modellen som er mest variable. "Vis partikler" vises med delsett av partikler som er brukt for å skape modeller, registrert i henhold til den høyeste iterasjon av den modell som er vist.
4. Velg "Forhåndsvisning" for å generere forhåndsvisning modeller og vise resultatene.
   MERK: Dette er den mest beregningsintensive trinn i prosessen. Kjøretiden for et sett av et par tusen partikler med diameter på noen få titalls piksler på en stasjonær PC bør være rundt 10 min. Dersom beregningen tid er et problem, bør brukerne først prøve algoritmen på en mindre undergruppe av dataene eller bruke en mindre avkastning radius i trinn 2.2.4, hvis mulig.
5. Se generereD modeller og optimere de parameterne, spesielt minimum likheten mot frø. Øke minimums likheten mot frø inntil eneste sanne partiklene av den modellerte morfologi er inkludert i modellen.
6. Øke det maksimale antall iterasjoner ved hjelp av "Maksimalt antall iterasjoner" glideren eller ved å taste inn et nummer inn i boksen og tillate modellen genereringsprosessen for å iterere. Bruk en verdi rundt 10 for maksimal iterasjon.
7. Navn modeller og velg "OK" for å lagre modell evolution stabler som inneholder alle gjentakelser av den endelige modellen generasjon prosessen.
   MERK: Hvis minimum likheten mot sæd er så høy at ingen partikler har denne likheten, vil ingenting bli oppdatert. Hvis plugin ser ut til å bli frosset, vurdere muligheten for at den minste likhet er for høy.

Representative Results

Her viser vi programvaren på modellen poxvirus, vacciniavirus. En av de mest komplekse pattedyrvirus, vaccinia-pakker rundt 80 forskjellige proteiner i en 350 x 270 x 250 nm ³ murstein-formet partikkel ^{13, 14.} Tre understellene er synlige ved hjelp av elektronmikroskopi: en sentral kjerne, som inneholder dsDNA-genomet; to proteinholdige strukturer, kalt sideorganer, som flankerer kjernen; og en enkelt proteolipid tolags konvolutten ^15. Den store størrelse, kompleks struktur, og medgjørlighet til rekombinant protein fluorescerende merking gjøre vaccinia et utmerket system for å demonstrere den VirusMapper arbeidsflyten.

Ved hjelp av den programvare som er beskrevet her, kan fordelingen av en rekke forskjellige proteiner på vaccinia virionet skal modelleres. Et protein ble merket og avbildes, eventuelt i kombinasjon med et annet protein med kjent fordeling som en referanse, og programvaren som ble anvendt som beskrevet for å fremstille en gjennomsnittlig modeller for lokalisering av dette protein på partikkelen. I dette eksempel ble to proteiner modellert, den indre kjerneproteinet L4, og de store sideveis kroppskomponent F17.

Et rekombinant vaccinia virus som har F17 merket med GFP og L4 merket med mCherry ¹⁶ ble anvendt. Renset virus ble fortynnet i 1 mM Tris, pH 9, og bundet til vasket med høy ytelse dekkglass ved å belegge dem i 30 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble deretter fiksert ved å anvende 4% formaldehyd i PBS i 20 min. Objektglassene ble montert umiddelbart på objekt i anti-bleking monteringsmedium. Imaging ble utført av SIM på kommersiell SIM mikroskop. Et synsfelt ble utvalgt som inneholder hundrevis av virus og bilder ble ervervet ved anvendelse av 5 faseforskyvninger og 3 grid rotasjoner med 561 nm (32 um gitter period) og 488 nm (32 um gitterperioden) lasere. Bilder ble ervervet ved hjelp av en sCMOS kamera og behandlet ved hjelp av mikroskop programvare. Kanaler ble justert basert på en multi-farget lysbilde vulst avbildes med samme bilde-innhentings innstillinger. Etter SIM gjenoppbygging og kanalopprettings bilder ble åpnet i Fiji og sammensatt til ett enkelt bilde stabel.

Virale partikler ble tatt ut fra bildene ved hjelp av L4 kanal som referanse, og uten å bruke noen gaussisk uskarphet, da disse partikler har en sentral maksimum. 15.000 partikler ble ekstrahert i dette eksperimentet.

På grunn av geometrien av vaccinia er sidelegemene har en distinkt forskjellig utseende basert på viruset orientering. Vi anskueliggjort to orienteringer hvor enten en eller to sidelegemer kan skilles. Vi henvist til disse orienteringene som frontal og sagittal, respektively.

Separate frø for de frontale og sagittal orientering ble valgt ved å søke gjennom partikkel listen til "Gene Seeds" stadium (figur 4 og 5); partikler som var tydelig i en retning eller den andre ble valgt. L4 kanal ble benyttet som referansekanalen for å justere frøene med hverandre. Igjen, ingen Gaussian blur var nødvendig. 5 partikler for hver orientering ble valgt ut og ble tatt i gjennomsnitt for å produsere frø.

Modellene ble generert for hver orientering basert på disse frøene. Heller ikke en referansekanal eller kvadrerte intensitetsverdier ble anvendt. Det maksimale antall iterasjoner opprinnelig ble innstilt til 1, og den minste likheten ble satt til å omfatte i området rundt 1000 partikler i hvert tilfelle, noe som ga et helhetlig utseende for hver orientering. Det maksimale antall iterasjoner ble deretter økt tiltillate for konvergens av modellen. Modellene ble generert på denne måten for de to orienteringer i de to kanalene (Figur 7).

Figur 1: VirusMapper arbeidsflyt. Den plugin er organisert i tre hovedtrinn. Virale partikler blir trukket ut fra store bilder, blir malbildene eller frø valgt delvis manuelt fra dataene, og endelig SPA-modeller genereres fra data ved å referere til frøene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: "Extract Viral Structures" dialog. Når du velger "Extract Viral Structur es", vil denne dialogen vises. Parametrene skal fylles med første estimatene for optimal segmentering. 'Show preview' kan da velges, slik at Rois å forhåndsvises og parametrene til å være finjustert. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Innstilling ekstraheringsparametre. Etter forhåndsvisning ROIs som skal trekkes ut, ROI radius, antall ROIs, og maksimal avkastning overlapping blir justert for å oppnå en slik situasjon. ROIs er litt større enn partiklene, alle partikler er inkludert i en ROI, og ROIs kan overlappe hverandre i tilstrekkelig grad til å tillate grupperte partikler som skal separeres.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Generere sjablon som passer frø. "Generer Seeds" dialogen (1) angir parametrene som skal tildeles. Den referansepartikler som sekvens (2) gjør det mulig for brukeren å lete gjennom partikler i referansekanalen. Når en partikkel er vist i referansepartikler som sekvensen kan realigned partikler for alle kanaler sees i realigned partikkelforhånds (3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: tilsetning av pode bilder. Som frø tilsettes til "Rammer å bruke" boksen, er gjennomsnittet av alle frø (4) og de rammer som er involvert (5) er vist. Partikler som er lik den løpende midlere frøene er foreslått i dialogboksen (6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: "Generer Modeller" dialogen. Ved valg av "generere modeller basert på frø," denne dialogboksen vises. Parametrene skal fylles med innledende estimater for optimal modell generasjon, og elementene i modellgenerer prosedyre for å bli vist under beregningen skal velges. "Vis forhåndsvisning" kan da bli valgt, slik at modellen genereringsprosessen til kjøre og parameterne for å finjusteres.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: modeller generert med VirusMapper. Vaccinia-viruspartikler med L4 kjerneproteinet merket med mCherry og F17 laterale kroppen protein merket med EGFP ble fotografert ved hjelp av SIM-kortet. Modeller ble deretter dannet med programvaren, slik det er beskrevet i protokollen. To orienteringer, frontal og sagittal, utmerker seg ved utseendet av sidelegemene. Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Med denne metoden er utstyrt forskere til å kombinere effekten av SPA og SR mikroskopi for å generere høy presisjon, flerkanals 2D modeller av proteinet arkitekturen av virus og andre makromolekylære komplekser. Imidlertid bør noen viktige hensyn tas i betraktning.

Frø bør velges for å representere en struktur som er konsekvent sett. Således skal de rå data kontrolleres nøye før frøene er valgt. Dette er viktig for å forebygge forspente modeller. Valgene kan bekreftes ved undersøkelsen av minste Likhetene terskler for å omfatte et visst antall partikler i modellene. Det er klart for et utvalg av frø, jo høyere denne terskelen må være for et gitt antall av partikler, er det mer at strukturen synlig i dataene.

Malen samsvar Konseptet er spesielt nyttig når det er heterogenitet i dataene. Alle ulike strukturer som er VISible bør identifiseres og ulike modeller opprettet for hvert tilfelle. Ved å skille heterogene strukturer i en kanal, men samtidig skape modeller i en andre kanal, kan det vise seg at mønstrene ville ikke ha vært umiddelbart innlysende.

En annen vurdering å være klar over når du bruker denne algoritmen er at gjentakelse prosedyren vil maksimere stokastisk asymmetri. For eksempel, ved modellering av en struktur med to symmetrisk maksima, alle små asymmetrier mellom maksima vil være på linje med hverandre under iterasjonen, og den endelige modell vil derfor være maksimalt asymmetrisk. Hvis dette ikke reflekterer en kjent symmetri i konstruksjonen som blir modellert, bør dette tas i betraktning. For tiden er den eneste måten å unngå dette på maksimering er å begrense antallet iterasjoner til en, selv om en eventuell utbygging ville være for VirusMapper å innlemme symmetriaksene til modellen genereringsprosessen. Eventuelle nye versjoner av VirusMapper vil være tilgjengelig på felleslable på den refererte nettsted (se Materialer tabell). Brukerne vil også finne en FAQ her for å svare på eventuelle vanligste spørsmålene.

Programvaren som beskrevet er anvendbar for en hvilken som helst struktur som kan avbildes med tilstrekkelig oppløsning for å visualisere de funksjonene som brukeren ønsker å modellere. Selv SPA kan forbedre oppløsning, er det helt klart ikke vil bedre synligheten av egenskaper som ellers ikke er synlige. Denne protokollen er derfor ikke en fremgangsmåte for å forbedre kvaliteten på dataene. Som med en hvilken som helst teknikk, forsiktig prøvepreparering og optimalisering av avbildnings strategi vil gi de reneste data og de beste resulterende modeller.

Valget av SR avbildningsmetoden er også viktig, og, generelt, vil avhenge av prøven for hånden. VirusMapper har blitt validert for å fungere godt sammen med SIM og STED ^10, og det kan også brukes med høy kvalitet lokalisering mikroskopi data, men forsiktighet bør utvises i dette tilfellet,så sparsom merking kan føre til problemer som ligner på de av asymmetri maksimering.

For tiden, er den eneste VirusMapper fritt tilgjengelig algoritme for enkeltpartikkelanalyse av fluorescensbilder og den eneste generell 2D SPA midling programvare. Andre studier som har gjort bruk av de samme prinsippene ^{4, 6, 8} har brukt tilpasset programvare spesialisert for hvert enkelt studium. Generelle algoritmer for gjenoppbyggingen av 3D-data har blitt publisert ^{5, 18,} selv om ingen programvare ble gitt.

Når den brukes som beskrevet i denne artikkelen, kan VirusMapper brukes til å produsere presise, nøyaktige, robuste og modeller av den makromolekylære proteinet arkitekturen av virus og andre komplekser. Med disse modellene, kan forskere ta nøyaktige målinger av de gjennomsnittlige dimensjoner av structmed figurene som studeres, potensielt gi dem muligheten til å nå biologiske konklusjoner som ikke ellers ville ha vært mulig.

Videre, med de flerkanals egenskapene til denne teknikk, er det mulig å kartlegge et ubegrenset antall av proteiner og komponenter i komplekser og for å oppdage nytt protein organisasjon. Undersøke endringer i nanoskala struktur i ulike biologisk relevante forhold, for eksempel ulike stadier av et virus livssyklus, har potensial til å gi verdifull innsikt i biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji			Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper	developed by the Henriques lab		Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium	Vector Labs	H-100
Elyra PS1	Zeiss
ZEN BLACK	Zeiss		Image processing software for SIM
High performance coverslip	Zeiss	474030-9000-000
TetraSpeck beads	ThermoFisher	T7279