Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

Abstract

أكسيد النيتريك (NO •) هو صغير متطرف، الذي يتوسط متعددة الوظائف الخلوية الهامة في الثدييات، والبكتيريا والنباتات. وعلى الرغم من وجود عدد كبير من الطرق للكشف عن رقم • في المجراة في المختبر، ورصد في الوقت الحقيقي من NO • على مستوى خلية واحدة هو أمر صعب جدا. يتم تحديد تأثيرات فسيولوجية أو مرضية من NO • من التركيز الفعلي ويسكن الوقت من هذا راديكالية. وفقا لذلك، والأساليب التي تتيح الكشف عن خلية واحدة من NO • هي مرغوب فيه للغاية. في الآونة الأخيرة، قمنا بتوسيع البليت من NO • مؤشرات عن طريق إدخال واحد الفلورسنت القائم على البروتين المشفرة وراثيا أكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات (geNOps) التي تستجيب مباشرة لالخلوية NO • التقلبات، وبالتالي، يعالج هذه الحاجة. نحن هنا لشرح استخدام geNOps لتقييم الخلايا NO • إشارات ردا على اثنين من المواد الكيميائية المختلفة NO • -liberating الجزيئات. نتائجنا المرضس تأكيد أن طازجة 3- (2-هيدروكسي-1-ميثيل-2-nitrosohydrazino) -N-ميثيل-1-propanamine (NOC-7) لديه قدرة أعلى بكثير لاستحضار التغيير في الخلايا NO • مستويات بالمقارنة مع غير العضوية NO • نتروبروسيد الصوديوم المانحة (SNP). وعلاوة على ذلك، تم إجراء ثنائي اللون الخلية الحية التصوير باستخدام geNOps الأخضر (G-geNOp) والكيميائي الكالسيوم 2+ مؤشر FURA-2 لتصور تنظيم محكم من الكالسيوم 2+ معتمد على NO • تشكيل الخلايا البطانية واحدة. وتبين هذه التجارب التمثيلية التي geNOps هي الأدوات المناسبة للتحقيق في الجيل الوقت الحقيقي، وتدهور وحيدة الخلية NO • إشارات في الاجهزة التجريبية المتنوعة.

Introduction

لقد وضعت مؤخرا فئة جديدة من الفلورسنت NO • تحقيقات المشفرة وراثيا، ودعا geNOps 1. تتكون هذه المجسات من بني ببساطة، البكتيريا تستمد، NO ملزمة • نطاق 2، والذي يضاف إلى البروتين الفلوري متميز (FP) البديل 3 (السماوي والأخضر أو البرتقالي FP). NO • ملزمة لمركز الحديد غير هيم (II) 4 ضمن geNOps يقلل على الفور كثافة مضان 1. الأهم من ذلك، مضان geNOps يتعافى بسرعة وبشكل كامل عند الخلايا NO • مستويات انخفاض 1. وفقا لذلك، geNOps تسمح التصوير في الوقت الحقيقي من (الفرعية) الخلوية NO • التقلبات. على الرغم من أن آلية NO الاستشعار • من geNOps لا تزال غير واضحة حتى الآن، فقد ثبت أن تكون ممتازة NO • للصحفيين، وبالتالي لديها قوة لفتح عهد جديد من متعدد الألوان، كمية NO • bioimaginز مع القرارات المكانية والزمانية عالية 1، 5. تستند الأخرى المتاحة الفلورسنت NO • تحقيقات على مركبات كيميائية صغيرة، والتي تحتاج ليتم تحميلها إلى الخلايا، ويتم تعديلها بشكل لا رجعة فيه من قبل NO • 6. أضرار إضافية من لا • fluorophores صغيرة حساسة هي السمية الخلوية المحتملة ومنخفضة نسبيا خصوصية التي تجعل من الصعب استخدامها في موثوقة والتحليلية وقاطعة بطريقة 7، 8، 9. على الرغم من أن استخدام الفعال للتحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيا يتطلب كفاءة تقنيات نقل الجينات، برزت على أساس FP-أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا كأدوات لا غنى عنها التي أحدثت ثورة في فهمنا للعمل الداخلي للخلايا 10 و 11. قبل تطوير geNOps واحدة على أساس FP، واوörster نقل الطاقة الرنين (الحنق) المستندة إلى NO • استشعار، ويشار إلى، شيد نوا-1 12. ساتو وآخرون. صمم هذا التحقيق المتطورة التي تتكون من وحدتين فرعيتين من NO • -sensitive للذوبان محلقة guanylate (SGC)، وكلاهما مترافق أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لإعداد التقارير دوري غوانوزين الأدينوزين (المركب) مستويات 12. كما يستجيب هذا التحقيق إلى المركب، فإنه يستشعر إلا بصورة غير مباشرة داخل الخلايا NO • تقلبات 12. على الرغم من أن نوا-1 يستجيب لNO • الارتفاعات في نطاق نانو المولي، لم تستخدم هذه الأداة في كثير من الأحيان حتى الآن، وربما يرجع ذلك إلى القيود فيما يتعلق بتوافر والعملي لهذا المستشعر الثنائي ضخمة.

وظائف متعددة من NO •، التي تؤثر جوهريا العمليات البيولوجية وقد تميزت كذلك 13 و 14. أثبتت العديد من الدراسات أن NO • concentratioن داخل الخلايا والنطاقات الفرعية يحدد مصير خلية في الصحة والأمراض 14 و 15 و 16. في mammalians، NO • يتم إنشاؤها أساسا إنزيمي في مختلف أنواع الخلايا من قبل عائلة جيدا اتسم أكسيد النيتريك سينسيز (NOS) 17. حتى الآن، وقد وصفت ثلاثة الإسوية من NOS 18، 19، 20؛ هذه هي كا 2+ / التي تعتمد على كالمودولين البطانية NOS (أنوش أو NOS-3) 18 والعصبية NOS (nNOS أو NOS-1) 19، والكالسيوم 2+ / كالمودولين مستقل نشط بشكل جوهري محرض NOS (iNOS أو NOS- 2) 20. وعلاوة على ذلك، كما تم اقتراح وجود الميتوكوندريا NOS (mtNOS) 21. ومع ذلك، يعتبر mtNOS بوصفها البديل الربط من nNOS، وبالتالي فهي ليست مصنفة على حدة باعتبارها الإسوي 21. الإسوي آخر، وبصرف النظر عن تلك الموجودة في خلايا الثدييات، هو ما يسمى بكتيريا NOS (bNOS)، وجدت أساسا في البكتيريا إيجابية الجرام 22. إنتاج الأنزيمية من NO • يتم التحكم للغاية وتعتمد على توفر العديد من العوامل المساعدة مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NADPH)، فلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (FAD)، tetrahydrobiopterin (BH4)، الأكسجين الجزيئي ولام أرجينين 17. والموجبة الأحماض الأمينية L-أرجينين هو الركيزة التي يتم تحويلها إلى L-سيترولين على NO • إنتاج 17. بالإضافة إلى الجيل الأنزيمية منظم للغاية من NO •، وقد افترض أن جذرية يمكن أن تخفض غير إنزيمي من حمامات النتريت من الميتوكوندريا في ظل ظروف نقص الأوكسجين 23. مرة واحدة ويتم إنتاج NO • داخل الخلية، يمكن أن تنتشر بحرية من خلال biomembranes 14،المرجع "> 15. ومع ذلك، يتم تحديد قصيرة جدا نصف عمر هذا راديكالية أساسا من الظروف البيئية، ومختلف المسارات والتفاعلات الكيميائية تتحلل بكفاءة NO • مستويات 24. في نهاية المطاف، وتشكيل، ونشرها، وتدهور NO • يعتمد على العوامل البيئية المختلفة التي تحدد التركيز الفعال للجزيء غاية نشطة بيولوجيا 24.

التكنولوجيا geNOps يسمح للكشف المباشر (دون) NO الخلوي • تذبذب 1، وبالتالي هي مناسبة لإعادة التحقيق، واكتشاف حديثا الآليات المسؤولة عن تراكم وتحلل الخلوية NO • الإشارات. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات بسيطة ونتائج ممثلة لاستخدام geNOps لتصور أثار خارجيا ولدت التطور الطبيعي NO • لمحات، على مستوى الخلايا الفردية. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا geNOps يمكن تكييفها لا ف بالثني في نظم نموذج خلية أخرى لدراسة أنماط معقدة من NO • تشكيل ونشرها، وتدهور في الاستجابة للمؤثرات وضغوط الخلوية المتنوعة.

Protocol

1. إعداد المخازن الكيميائية وحلول

  1. إعداد عازلة التخزين التي تحتوي على 135 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 10 ملي HEPES 2.6 ملم NaHCO 3، 0.44 ملي KH 2 PO 4، 0.34 ملي نا 2 هبو 4، 10 ملم د- الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، الفيتامينات 1X MEM والأحماض الأمينية 1X MEM، 1٪ القلم بكتيريا، و 1٪ أمفوتيريسين ب ذوب كل المكونات في ماء مقطر وحرك المخزن المؤقت لمدة 20 دقيقة باستخدام محرك مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.44 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم. على إضافة قطرة قطرة من هيدروكسيد الصوديوم، وقياس درجة الحموضة باستخدام مقياس درجة الحموضة مع التحريك المستمر.
  2. إعداد الكالسيوم 2+ المحتوية العازلة الفسيولوجية التي تتكون من 140 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 10 ملي مد الجلوكوز، و 10 ملي HEPES. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم كما هو موضح في الخطوة 1.1.
  3. إعداد الكالسيوم 2+ عازلة خالية الذي يتكون من نفس المكوناتكما هو موضح في الخطوة 1.2. استخدام 1 ملي EGTA بدلا من 2 مم.
  4. إذابة FURA-02:00 في DMSO للحصول على 1 ملم حل سهم. قسامة الحل الأسهم في قارورة مغلقة بإحكام ومخزن في -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد. إذا المجمدة، والسماح للحل الأسهم للتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل محمية من الضوء. تمييع الحل الأسهم FURA-2:00 إلى 1 عازلة تخزين مل (الخطوة 1.1) للحصول على التركيز النهائي من 3.3 ميكرومتر.
  5. إعداد 1 مل من 100 ملي حل الأسهم الهستامين في الماء المقطر (7.0 درجة الحموضة). تمييع 100 ملي حل الأسهم الهستامين في 100 مل كا 2+ المحتوية العازلة الفسيولوجية لتركيز النهائي من 100 ميكرومتر الهستامين.
  6. إذابة Nω-نيترو-L-أرجينين (L-NNA) في 100 مل من العازلة الفسيولوجية التي تحتوي على الكالسيوم للحصول على التركيز النهائي من 300 ميكرومتر. تخزين الحلول عند 37 درجة مئوية الماء الحمام لا يقل عن 1 ساعة حتى يذوب L-NNA تماما.
  7. إذابة 10 ملغ NOC-7 في وا المقطرثالثا (7.0 درجة الحموضة) للحصول على 10 ملي حل الأوراق المالية. قسامة الحل الأسهم في قسامات صغيرة في قارورة مغلقة بإحكام وتخزن مباشرة في -70 درجة مئوية. تمييع الحل الأسهم NOC-7 في منطقة عازلة الفسيولوجية للحصول على تركيز النهائي من 10 ميكرومتر NOC-7.
    ملاحظة: المؤسسة الوطنية للنفط-7 هو مركب كيميائي صغير الذي يطلق عفويا NO مع نصف عمر قصير. إعداد دائما المخازن المؤقتة العاملة التي تتكون NOC-7 فقط قبل كل تجربة.
  8. جعل حل 1 ملم الصوديوم نتروبروسيد (SNP) في منطقة عازلة الكالسيوم الفسيولوجية وإعداد التخفيف 10 ميكرومتر.
    ملاحظة: إعداد دائما كميات صغيرة (~ 10 مل) من حلول NO-المانحين بسبب معدل التدهور السريع.
  9. إعداد محلول الفوسفات (PBS)، ويتألف من 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 9.2 ملي نا 2 هبو 4، و 1.5 ملي KH 2 PO 4. ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7.44 مع هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك.

2. خلية التحضير

ملاحظة: في سrder لتحقيق التجانس في أداء وقياس أكسيد النيتريك (NO •) في الخلايا واحدة باستخدام geNOps، تحتاج إلى ما قبل المحتضنة مع الحديد (II) / فيتامين C الذي يحتوي المخزن قبل تجارب التصوير من أجل استعادة الحديد 2+ خلايا ضمن NO • -binding المجال من NO • -probes. في حالة الخلايا EA.hy926 وHEK293، حضانة لمدة 20 دقيقة مع الحل معززة الحديد (II) يؤدي إلى تفعيل كامل للNO • أجهزة الاستشعار.

  1. البذور 5.5 × 10 5 EA.hy926 أو HEK293 الخلايا لليوم التالي أو 3.5 × 10 5 خلايا لليوم بعد اليوم التالي، 30 مم نظارات غطاء المجهر في بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: معلومات تفصيلية عن عدوى الفيروسة الغدانية من خلايا الثدييات والبناء الفيروس قد تم وصفها تشانغ وآخرون. 25. هذه الخطوة لا ينطبق على الخلايا كلوة 293 التعبير عن مستقر G-geNOp.
  2. أخذ مصل الجنين العجل (FCS) والنسر تعديل المتوسطة Dulbecco و(DMEM) خالية من المضادات الحيوية وإضافة الغدة المرتبطة نوع الفيروس 5 (AAV5) ناقلات تحمل ترميز الجينات لG-geNOp (وزارة الداخلية: 500 لخلايا EA.hy926 تسفر تقريبا 100 خلايا٪ إيجابية؛ وزارة الداخلية: 1 غير فعال لخلايا HEK293).
    يتم تعيين استخدام ناقلات فيروسية الغدة المرتبطة إلى مجموعة المخاطر هو مطلوب عموما 2. السلامة الأحيائية مستوى 2 الاحتواء للعمل مع هذه النواقل: ملاحظة. إذا لزم الأمر، يمكن أن عدوى فيروس أيضا أن يؤديها في FCS تحتوي على المتوسط. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن transfected عابر استخدام الدهون على أساس ناقلات 1.
  3. إزالة المتوسطة الثقافة، وغسل الخلايا مع ما قبل تحسنت (37 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من DMEM / AAV5 المتوسطة على كل بئر لمدة 1 ساعة. هذه الخطوة لا ينطبق على الخلايا كلوة 293 التعبير عن مستقر G-geNOp.
  4. إضافة 1 مل من 20٪ FCS التي تحتوي على DMEM على كل بئر إلى تركيز النهائي من 10٪ FCS. لا تقم بإزالة وسائل الإعلام AAV5 التي تحتوي على من الخلايا. شخص مهذبمتأرجحة لاي لوحة لتجانس المتوسطة في الآبار. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5٪ CO 2. لا تنطبق هذه الخطوة لخلايا كلوة 293 التعبير عن مستقر G-geNOp.
  5. بعد 48 ساعة، وغسل الخلايا مع حرارة قبل برنامج تلفزيوني. وفي وقت لاحق إضافة 2 مل قبل تحسنت عازلة التخزين (القسم 1.1) إلى كل بئر واحتضان خلايا في غرفة RT لا يقل عن 1 ساعة محمية من أشعة الضوء.
  6. استبدال المخزن المؤقت التخزين مع 1 مل / بئر الحديد (II) حل معززة في درجة حرارة الغرفة (RT). احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة بالضبط في الظلام.
    ملاحظة: لا تتجاوز أو تقليل فترة حضانة الأمثل لأن ذلك قد يؤثر على استجابة NO • تحقيقات.
  7. غسل خلايا مرة واحدة مع العازلة تخزين واحتضان كل بئر مع العازلة تخزين 2 مل لمدة لا تقل عن 2 ساعة على RT من أجل السماح للخلايا للتوازن.
  8. استبدال المخزن المؤقت التخزين مع 3.3 ميكرومتر FURA-02:00 العازلة في تخزين 1 مل لمدة 45 دقيقة في RT، محميةبعيدا عن الضوء.
  9. غسل الخلايا مرتين مع العازلة تخزين واحتضان مرة أخرى لمدة 30 دقيقة على الأقل من أجل السماح للخلايا للتوازن.

3. يعيش التصوير خلية من NO • والكالسيوم إشارات 2+ في الخلايا الفردية

  1. إصلاح 30 مم زلة تغطية المغلفة مع EAhy.926 أو HEK293 الخلايا (من الخطوة 2.1) في غرفة نضح المعادن ووضعه على المجهر. توصيل أنبوب تدفق إلى خزانات عازلة وهروب رأس المال إلى مضخة فراغ. ضمان تدفق ثابت وتجنب استنزاف من انزلاق الغطاء.
  2. بدء نضح يحركها الجاذبية مع العازلة الكالسيوم الفسيولوجية (من الخطوة 1.2) باستخدام نظام نضح شبه التلقائي.
    ملاحظة: هذا النظام يتكون من خزانات عازلة، أنابيب منها، والصمامات المغناطيسية التي يتم التحكم فيها الكترونيا ومضخة فراغ (انظر الشكل 1B). معدل التدفق يمكن أن تتراوح من 1 إلى 3 مل / دقيقة، اعتمادا على ارتفاع الخزانات الارواء. لتطبيق صحيفة المخدرات المحلية متسقةالموجبة، يجب أن يكون معدل تدفق جميع الخزانات المستخدمة متساوية تقريبا. وينبغي اختبار هذا قبل تجارب التصوير. نعتبر أن الخلايا البطانية تستجيب إلى زيادة إجهاد القص التي يمكن أن يسببها نضح صارم.
  3. التبديل على نظام التصوير والسماح الاحماء لجميع الأجهزة لمدة 30 دقيقة.
  4. تحديد إعدادات التصوير باستخدام البرنامج منها. حدد الطول الموجي الإثارة 340 نانومتر و 380 نانومتر للFURA-2 التصوير و 480 نانومتر لإثارة G-geNOp. للحد من تبييض مضان زيادة binning الكاميرا إلى 4 والحد من شدة الإثارة والتعرض مرات. انظر أيضا الخطوات 3،6-3،8.
    ملاحظة: تعتمد إعدادات التصوير والمعلمات على الأجهزة المستخدمة، FURA-2 كفاءة التحميل ومستويات التعبير G-geNOp.
  5. تحديد المنطقة التصوير عن طريق تحريك الجدول XYZ المجهر حتى عدة خلايا الفلورسنت في التركيز. ثم تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) عن طريق أداة برمجية منها. رسم الأقاليم التي تغطي العديد من سينغل كلهخلايا الفلورسنت الإلكترونية في مجال التصوير يدويا. وبالإضافة إلى ذلك، تحديد المنطقة الخلفية من نفس الحجم.
    ملاحظة: مرة واحدة وقد تم الحصول على الصور وتخزينها رويس يمكن أيضا تعريف حديثا بعد عملية التصوير لمزيد من التحليل باستخدام منها برامج التحليل التصوير (انظر قائمة المواد).
  6. البدء في جمع البيانات على المجهر الفلورسنت المقلوب ومتقدمة مع مرحلة عينة الآلية، ومصدر ضوء أحادي اللون. تثير بالتناوب في 340 نانومتر و 380 نانومتر للFURA-2:00 و 480 نانومتر للG-geNOp، على التوالي. تعيين أوقات التعرض منها بحيث لجميع القنوات، إشارة واضحة مضان قابلا للاكتشاف على مر الزمن. انظر أيضا خطوة 3.4.
    ملاحظة: هذا يعتمد على شدة الضوء الإثارة وbinning الكاميرا. على سبيل المثال، استخدم 15٪ كثافة الضوء الإثارة، وهو binning كاميرا 4 و 150 مللي 340 نانومتر و 50 مللي 380 نانومتر، و 300 مللي ثانية ل 480 نانومتر. انظر أيضا خطوة 3.4.
  7. جمع الضوء المنبعث عند 510 نانومتر لFURA-2 / ص، 520 نانومتر لG-جينوص باستخدام جهاز (CCD) وكاميرا مزدوجة الشحن مع مجموعة مرشح ملائم، تتألف من المثير 500 نانومتر، وهو مزدوج اللون 495 نانومتر، وباعث 510-520 نانومتر. سجل إجمالي إطار واحد كل 3 ثوان.
  8. تسجيل أول دقيقة (إذا لزم الأمر ما يصل إلى 3 دقائق) في الفسيولوجي الكالسيوم 2+ عازلة (1.2) للحصول على خط الأساس من إشارات مضان منها مع مرور الوقت.
  9. مرة واحدة لوحظ مضان خط الأساس مستقرة، والتحول إلى 100 ميكرومتر الهستامين أو ATP (1 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر) التي تحتوي على الكالسيوم الفسيولوجية 2+ عازلة لتحفيز الخلايا لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: خلايا EA.hy926 التي تستجيب للمنبهات تظهر زيادة حادة في نسبة FURA-2 (مضان متحمس في 340 نانومتر تقسيم من خلال مضان متحمس في 380 نانومتر) وانخفاض واضح للإشارة مضان G-geNOp.
  10. يعود مرة أخرى إلى المخزن المؤقت الفسيولوجية الكالسيوم 2+ دون الهستامين أو ATP و L-NNA لمدة 5 دقائق لإزالة المركبات من الخلايا. قد تطول هذه الخطوة حتى fluoresيتم استرداد التغييرات cence تماما.
  11. تول 10 ميكرومتر NOC-7 في الفسيولوجي عازلة الكالسيوم 2+ لمدة 2 دقيقة باستخدام نظام الارواء. يؤثر على المانحة NO بقوة G-geNOp مضان مما يقلل عادة من قبل> 20٪ ردا على 10 ميكرومتر NOC-7. في الخلايا EA.hy926 تأثير NOC-7 هو ما يقرب من 3 أضعاف أقوى مقارنة ناهض التي يسببها G-geNOp مضان إخماد.
  12. تغسل NO • مجمع -releasing لحوالي 10 دقيقة مع الكالسيوم الفسيولوجية 2+ العازلة وإيقاف التسجيل مرة واحدة يتم استرداد مضان القاعدية.

تحليل 4. البيانات

  1. حصلت تصدير البيانات متوسط ​​كثافة مضان من الخلايا وحيدة مع مرور الوقت، إلى برامج تحليل البيانات.
  2. طرح القيم الأساسية منها وحساب نسبة 340 نانومتر 380 نانومتر من كل FURA-2 الإشارات من كل خلية واحدة على مر الزمن.
  3. طرح القيم الأساسية للقناة G-geNOp للحصول على فلوريدا الفعليuorescence شدة NO التحقيق (F) على مر الزمن باستخدام أي برنامج حساب.
  4. تأخذ القيم مضان الأساسية مثل F 0 (F 0 هو مضان من NO التحقيق مع مرور الوقت من دون التحفيز). انظر أيضا خطوة 4.5 والشكل 1C.
  5. حساب وظيفة مع مرور الوقت لآثار تبييض مضان باستخدام المعادلة التالية: F 0 = F inital • إكسب (-K • الوقت) + F الهضبة. F inital: بدء القصوى إشارة مضان مرة واحدة التصوير. K: معدل ثابت من تبييض مضان على مر الزمن؛ F هضبة: مضان الحد الأدنى الذي توصل إليه تبيض على مر الزمن؛ انظر أيضا الخطوات 4.3- 4.4 والشكل 1C.
    ملاحظة: للتقريب، كل القيم مضان على مر الزمن قبل وبعد تحفيز الخلايا يمكن استخدامها. يتم تحديد مزيد من التفاصيل من خلال بنتلي وآخرون. 27.
  6. لتطبيع إشارة G-geNOp مع مرور الوقت، وحساب 1-F / F0 (خطوات 4،3-4،5). انظر الشكل 1C و1D.

Representative Results

تصور وحيدة الخلية لا • لمحة في الاستجابة إلى عابر التطبيقية NO المانحين

كنا خلية استنساخ كلوة الذي يعبر عن ثبات G-geNOp (الشكل 1A)، من أجل رؤية NO • إشارات على مستوى خلية واحدة ردا على اثنين من مختلف المركبات الكيميائية الصغيرة تحرير NO، NOC-7 والحزب الوطني الاسكتلندي. تم تطبيق NO • المانحين على التوالي لوإزالتها من الخلايا أثناء التصوير باستخدام نظام نضح على أساس الجاذبية يضمن تدفق مستمر (الشكل 1B). وأظهرت جميع الخلايا معربا عن G-geNOp بدرجات متفاوتة من الشدة انخفاض واضح من مضان ردا على NOC-7 و SNP (الشكل 1C)، مشيرا سريع NO • تراكم داخل الخلايا على إضافة NO • الجهات المانحة. أظهرت إشارات مضان تطبيع (1-F / F 0) أن كلا من NO • المانحين أثارت cellula متجانسةص NO • الارتفاعات التي تعافت تماما على تبييض للNO • مركبات -releasing (1D الشكل). ومع ذلك، 10 ميكرومتر SNP الناجم٪ 50 فقط من رقم خلوي • إشارة (9.63 ± 1.05٪، ن = 3/38) الذي تم التوصل اليه بواسطة 10 ميكرومتر NOC-7 (18.10 ± 1.20٪، ن = 3/38، ص < 0.0001). من أجل تحقيق المساواة في داخل الخلايا NO • المستويات مع كل NO • الجهات المانحة، يستلزم تركيز 1 ملم من SNP (أرقام 1C، 1D).

المقبل، ونحن اختبار قدرة طازجة أعدت مقابل منتهية الصلاحية NOC-7 إلى رفع الخلايا NO • المستويات في خلايا كلوة. لهذا الغرض، ونحن على استعداد أربعة مخازن تجريبية تحتوي على 5 ميكرومتر NOC-7. وإما أضاف NO • المانحة حديثا قبيل القياس، أو أبقى داخل الخزانات لمدة 1 ساعة، 2 ساعة، و 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل القياس. وقد طبقت في مخازن مختلفة على التوالي لوإزالة وROM الخلايا معربا عن G-geNOp باستخدام نظام نضح (الشكل 2B). كشف النقاب عن هذا النهج استقرار المائية NOC-7 الحلول التي، كما هو متوقع، أظهرت انخفاض القدرات مع مرور الوقت لرفع الخلايا NO • المستويات (أرقام 2A، 2C). ومن المثير للاهتمام، NO • استعادت إشارات أسرع بكثير على إزالة مخازن منتهية الصلاحية، بالمقارنة مع الخلايا NO • الاستجابة التي تم حركها جديدة NOC-7 (الشكل 2C)، وربما يشير التصاق جزيئات سليمة NO • -liberating في المكونات الخلوية .

التصور في وقت واحد من الكالسيوم 2+ وNO • الإشارات في الخلايا البطانية واحدة

من أجل دراسة كا 2+ -triggered NO • تشكيل في الخلايا البطانية، وكان يشيع استخدامها البطانية خلد الخلية بديل، EA.hy926 خط الخلية، رtransfected ransiently مع G-geNOp ومحملة FURA-2 / صباحا (انظر بروتوكول 2.8). ترنسفكأيشن حقق ما يقرب من 10٪ من G-geNOp الخلايا البطانية الإيجابية (ن = 6، الشكل 3A)، وهو ما يكفي لتسجيل كا 2+ -evoked NO • الإنتاج على مستوى الخلايا البطانية واحدة. ومع ذلك، حققنا ما يقرب من 100٪ G-geNOp خلايا EA.hy926 الإيجابية باستخدام ناقلات فيروسية الغدة المرتبطة (ن = 6، وانظر بروتوكول 2.2). قبل لقياسات متعددة، وحضنت الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة العازلة في تخزين تتكون L-NNA، وهو قوي لا رجعة فيه NOS-المانع 26. تم الاحتفاظ بها الخلايا السيطرة في المنطقة العازلة تخزين نفسه دون L-NNA (انظر بروتوكول 1.1) (الشكل 3B). علاج الخلايا السيطرة مع الهستامين، وهي قوية إينوزيتول 1،4،5-trisphosphate (IP 3) -generating ناهض، ارتقى على الفور عصاري خلوي كا 2+ مستويات تليها زيادة تدريجية في الخلايا NO • حتى كان ناهض إزالةد (أرقام 3C، 3D). وأظهرت الخلايا ما قبل المعالجة مع NOS-المانع مماثلة عصاري خلوي كا 2+ الإشارات، في حين بقي داخل الخلايا NO • مستوى تتأثر تقريبا ردا على الهستامين (الشكل 3E). وعولج EA.hy926 الخلايا معربا عن G-geNOp أيضا مع 1 ميكرومتر و 100 ميكرومتر من IP 3 -generating ناهض اعبي التنس المحترفين من أجل اختبار ما إذا كان أو لا geNOps هي مناسبة لرصد NO • إشارات ردا على كل من أدنى الفسيولوجية وفوق الفسيولوجية تركيزات ناهض (الشكل 3F). في البطانية خط الخلية 1 ميكرومتر ATP أثار في عصاري خلوي واضح NO • إشارة، الذي كان ما يقرب من نصف إشارة التي حصل عليها 100 ATP ميكرومتر (الشكل 3F).

شكل 1
الشكل 1: لمحات NO بين الخلايا في الاستجابة لمختلف NO-liberati نانوغرام الجزيئات. (A) واسعة الصور مجال الخلايا كلوة يعبرون عن مستقر عصاري خلوي G-geNOp. شريط النطاق = 20 ميكرون. (ب) توضيح تخطيطي لنظام نضح خطورة على أساس نصف التلقائي لتطبيق رقابة وإزالة NOC-7 والحزب الوطني الاسكتلندي. يتتبع (C) الممثل (من 3 تجارب مستقلة) غير طبيعية كثافة وحيدة الخلية مضان في وحدات التعسفي مقابل الوقت من خلايا كلوة التعبير عن مستقر عصاري خلوي G-geNOp ردا على 10 ميكرومتر NOC-7 و 10 ميكرومتر SNP، و 1 ملي الحزب الوطني الاسكتلندي. يمثل أسود منحنى جريئة متوسط ​​منحنى من 26 آثار وحيدة الخلية (منحنيات رمادي فاتح). يمثل منقط المنحنى الأسود F 0، والذي تم استخدامه للتطبيع. (د) آثار واحدة تطبيع ومقلوب (1-F / F 0، منحنيات رمادي فاتح)، ويعني منحنى (منحنى عريض أسود) مع مرور الوقت استجابة ل10 ميكرومتر NOC-7 و 10 ميكرومتر SNP، و 1 ملي SNP المستخرجة من لوحة C.وفاق / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: اختبار استقرار NOC-7 باستخدام ثابت G-geNOp معربا عن الخلايا كلوة. (أ) الممثل NO • منحنى استجابة تركيز على مر الزمن من مستقر G-GeNOps معربا عن الخلايا كلوة بناء على طلب من شركة نفط الشمال العراقية-7 المحاليل الطازجة والقديمة. تم إعداد جميع المخازن التي تحتوي على NOC-7 في البداية مع تركيز النهائي من 5 ميكرومتر باستخدام محلول المخزون نفسه (50 ملم). الوقت مضي الحلول منها بعد إعداد حتى كميات التصوير إلى 1 ساعة، 2 ساعة، و 3 ساعة كما هو محدد. (ب) توضيح تخطيطي لنظام نضح نصف التلقائي استنادا إلى الجاذبية على التوالي إضافة وإزالة الحلول NOC-7 الذي يحتوي أثناء التصوير. (C) الارتباطات الزمانية للالخلوية NO • إشارات ردا على الطازجة والقديمة NOC-7 مخازن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): في وقت واحد التصوير متعددة من NO • والكالسيوم 2+ الإشارات في الخلايا EA.hy926 واحدة. (A) التمثيلية واسعة المجال الصور مضان من الخلايا EAhy.926 معربا عن G-geNOp (اللوحة اليسرى) التي يتم تحميلها مع FURA-2 / صباحا (منتصف ولوحات اليمين). شريط النطاق = 20 ميكرون. (ب) توضيح تخطيطي لعلاج الخلايا EAhy.926 مع 500 ميكرومتر Nω نيترو-L-أرجينين (L-NNA) لمدة 20 دقيقة في لوحة ستة جيدا قبل قياس. (C) دوام الممثل من سجل في وقت واحد FURA-2 (الإثارة: 340 نانومتر / 380 نانومتر emissايون: 510 نانومتر) وإشارات G-geNOp (الإثارة: 480 نانومتر، الانبعاثات: 520 نانومتر) استجابة إلى 100 ميكرومتر الهستامين. كما تمت إزالة الهستامين أشار بعد 3 دقائق باستخدام نظام نضح. (خط FURA-2 الإشارات النسبة، F 340 / F 380 هو رمادي الصلبة) (D) منحنيات تمثل التسجيلات في وقت واحد من عصاري خلوي كا 2+ وNO • (منحنى تطبيع ومقلوب، 1-F / F 0 هو خط الصلبة الأخضر) إشارات مع مرور الوقت من FURA-2 واحد / أنا تحميل خلية البطانية معربا عن عابر G-geNOp. وقد حفز الخلايا مع الهستامين 100 ميكرومتر لمدة 3 دقائق في كاليفورنيا 2+ (2 مم CaCl 2) التي تحتوي على العازلة (ن = 8/3). (E) الممثل سجلت في نفس الوقت كا 2+ (خط الصلبة الرمادي) وNO • (خط الصلبة الأخضر) إشارات مرور الوقت من خلية EA.hy926 التي كانت سابقة التجهيز مع 500 ميكرومتر Nω-نيترو-L-أرجينين (L-NNA) قبل لقياس (ن = 12/3). تم علاج الخلايا مع 100 ميكرومتر الهستامين في وجود 2 مم2+ كاليفورنيا. (F) متوسط منحنيات تمثل عصاري خلوي NO • إشارات ردا على 1 ميكرومتر ATP تليها تحفيز الخلية الثانية مع 100 ATP ميكرومتر. تمثل الحانات القيم يعني ± SD إشارات G-geNOp القصوى ردا على 1 ميكرومتر ATP (شريط أبيض) و 100 ميكرومتر ATP (الشريط الأخضر) من 4 تجارب مستقلة. ف <0.001 مقابل 1 ميكرومتر ATP. تم احتساب P ذات القيمة باستخدام أونبايريد اختبار (ت). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

منذ اكتشاف NO • بمثابة جزيء إشارة مهمة في علم الأحياء 28، وقد يتطلع قياس الوقت الحقيقي المحدد للراديكالية في زنازين انفرادية والأنسجة والحيوانات كلها مع ارتفاع القرار بطريقة مجدية ويمكن الاعتماد عليها. نحن هنا نورد تطبيق وضعت مؤخرا الفلورسنت NO • تحقيقات المشفرة وراثيا (geNOps) التي تمكن بالضبط التصوير تعيش خلية من NO • الإشارات باستخدام حقل واسع مضان المجهر 1.

للتحايل على إجراءات ترنسفكأيشن تفصيلا والغازية استنساخ الخلايا كلوة التي تعبر عن مستقر الفلورية الخضراء G-geNOp كان يستخدم لتحديد ولدت خارجيا وحيدة الخلية لا • لمحات. كما خلايا كلوة عادة لا تنتج لا • التطور الطبيعي 29، وهذا نوع من الخلايا هو مناسبة لجيل من خط الخلية استشعار تستند geNOp، والتي قد تكون مفيدة للعديد من التطبيقات الأخرى في ظروف ثقافة مشتركةمع NO • إنتاج الخلايا الأولية أو حتى في الحيوانات الحية 30. ومع ذلك، في هذه الدراسة أن نبرهن على قدرة مختلف المركبات NO • -liberating، من تركيزات وبثبات مختلفة، لاستحضار الخلايا NO • الإشارات باستخدام G-geNOp معربا عن نموذج خلية كلوة. وكشفت البيانات المتوفرة لدينا أن لا • -donor التركيز والجودة وطريقة التطبيق في نهاية المطاف تحديد أنماط NO الخلايا • لمحات. هذه المعلومات لا غنى عنها لفي الموقع توصيف الدوائية المختلفة NO • الجهات المانحة، والتي تدل على العديد من الأمراض. والجدير بالذكر، وقد ثبت geNOps للرد بشكل مستقر إلى التطبيقات المتكررة متعددة من NO • -donor البقول على مدى فترة زمنية طويلة جدا 1. وعليه، فإن التجارب باستخدام NO • -liberating المركبات المقدمة هنا، تسمح الاستنتاجات شبه الكمية المتعلقة بمختلف السعات وحركية NO الخلوية منها226؛ إشارات (الشكلان 1 و 2).

على الرغم من أن التعبير عن مستقر كلوة خلية استنساخ ينشأ على الأرجح من خلية واحدة، لوحظ وجود تباين واسع من مستويات التعبير G-geNOps (الشكل 1). هذا هو سمة مشتركة من الحيوانات المستنسخة خلية مستقرة كما نسخ من الجين (المتكاملة الجينوم) للاهتمام هو تحت سيطرة العديد من العوامل مثل الضغوط البيئية المتنوعة 31 التي تؤثر على معدلات نمو الخلايا 32، ووضع دورة الخلية 33. وgeNOps واحدة على أساس FP-هي تحقيقات غير ratiometric، وبالتالي، فإن NO • -induced فقدان زيادة كثافة مضان مع مستوى التعبير geNOp 1. وفقا لذلك، وتطبيع الإشارات geNOps أمر ضروري لقياس الخلوية NO • إشارات خاصة في حالة وجود تحليل مقارن. كما هو مبين في دراستنا الأخيرة، مشددة الخطية علاقة بإلى صف تم العثور على كثافة مضان القاعدية من geNOps وقوة تبريد مضان NO • -induced على طائفة واسعة من شدة مضان 1. هذا هو سمة هامة من سمات geNOps لتقدير المطلق للالخلوية NO • الإشارات. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وتطبيع الإشارات G-geNOps ردا على NOC-7 وكشف SNP متجانسة NO • الإشارات في الخلايا كلوة مختلفة من نفس لوحة، مشيرا إلى أن الخلايا كلوة ليست متنوعة فيما يتعلق قدرتها على تناول وتحط من NO • الراديكالي الذي ينشأ من NO • المانحة. في المقابل، وذلك باستخدام geNOps في خلايا هيلا أظهرت التغاير واضحة الخلوية NO • إشارات بين خلايا مختلفة في الاستجابة لNOC-7. وتشير هذه الاختلافات إلى نوع معين NO • التمثيل الغذائي وتحلل معدلات الخلايا، والتي قد يكون لها آثار متعددة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الخلوي، ويمكن الكشف عنها باستخدام geNOpالصورة التكنولوجيا.

ومع ذلك، فقد لاعتبار اثنين من السمات الهامة لgeNOps بعناية للاستخدام الصحيح للأجهزة الاستشعار وتفسيرات البيانات: ط) geNOps تتطلب الحديد الكافي (II) إلى الاستجابة الكاملة لNO • 1 و ب) تبعا لمتغير FP، يمكن geNOps يكون الرقم الهيدروجيني الحساسة 1. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم جدت لتكون مناسبة للالحديد غير سام (II) مكملات geNOps، التي يتم التعبير عنها في أي كلوة، هيلا أو خلايا EA.hy926 (انظر بروتوكول 2.6). بينما ثبت أن العلاج بالخلايا مع الحديد (II) / فيتامين C لم يؤثر على شكل الخلية، بقاء الخلية والنشاط الأيضي للخلايا 1، قد يكون من الضروري لتحسين هذه خطوة هامة لأنواع أخرى من الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، في بعض الظروف التجريبية، ومتطلبات الحديد (II) تحميل قد تحد من مدى انطباق geNOps. والجدير بالذكر، فقد تبين أن أسكوربات يمكن أن تقلل NO • 35 و أسكوربات الحديد (II) المجمعات قادرة على كنس NO • 36 و 37. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الحديد الزائد (II) وأسكوربات تحفز الاستجابات الالتهابية 39 و أنوش فك الارتباط بين 41. تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند استخدام التكنولوجيا geNOps هذه الآثار. فقد تبين أنه في ظل بعض الظروف التجريبية، ودرجة الحموضة داخل الخلايا يتأثر بشكل كبير 34، والتي لديها القدرة على التأثير على geNOps مضان 1. والجدير بالذكر أن السماوي والأخضر geNOps المتغيرات هي درجة الحموضة نسبيا حساسة تظهر انخفاضا من مضان على تحمض 1. وبالتالي، والتغيرات الحادة لل(الفرعية) الرقم الهيدروجيني الخلوية قد محاكاة NO كاذبة • إشارات عند استخدام geNOps حساسة درجة الحموضة. كما اقترح في عملنا السابق، والاستخدام الموازي للNO • geNOps حساسة (geNOps موت) كما كنترول السلبيةفمن المستحسن ليرة سورية لتشريح حقيقية الخلوية NO • إشارة من درجة الحموضة تغييرات 1. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أن تفقد تغييرات درجة الحموضة الخلوية باستخدام مجسات درجة الحموضة مثل SypHer 34.

وعلاوة على ذلك، فإننا تصور الأنزيمية NO • تشكيل الذاتية ردا على الفسيولوجية الكالسيوم 2+ -mobilizing ناهض في الخلية البطانية البديلة EA.hy926. خط الخلية EA.hy926 هو نظام النموذج المستخدم في كثير من الأحيان التعبير عن الدوام أنوش 38. استخدام geNOps أعرب عابر في الخلايا EA.hy926، وأكد أن الملكية الفكرية 3 بوساطة إشارات الكالسيوم 2+ تثير عميق NO • تشكيل في هذا نوع من الخلايا، والذي تم حظره تماما تقريبا L-NNA. من أجل ربط الزمان الكالسيوم 2+ مع NO • الإشارات، تم تحميل خلايا G-geNOp، معربا عن مع الأشعة فوق البنفسجية منفعل الكيميائية الكالسيوم 2+ -المؤشر FURA-2 / صباحا. الفصل الطيفي للكا 2+ ملزمة وغير منضم FURA-2 فلوو rescence من الإشارة G-geNOp يمكن أن يتحقق بسهولة مع تجاريا مرشح متاح يحدد 40. كشفت التصوير على حد سواء تحقيقات التي كا 2+ الأنزيمية -triggered NO • تشكيل يحدث أبطأ بكثير بالمقارنة مع ارتفاع الكالسيوم عصاري خلوي 2+ في هذا نوع من الخلايا البطانية. تم الإبلاغ عن حركية مماثلة من خلية واحدة لا • الإشارات في الخلايا البطانية من الشريان الرئوي البقري على العلاج بالخلايا مع IP 3 -generating البراديكينين ناهض، وكذلك الضغوط القص باستخدام نوا-1، وهي غير مباشر استشعار NO غاية • -sensitive 12 . وبناء على ذلك، تؤكد هذه البيانات التي كا 2+ -evoked أنوش المستمدة-NO • تشكيل يتطلب وقتا انطلاق معينة حتى يتم الوصول إلى النشاط الأنزيمي الكامل. على الرغم من أن حركية الخلوية NO • تشكيل ونشر وتدهور يمكن استخلاصها من البيانات الأخرى، مثل القياسات المأخوذة من التوتر NO • -induced استرخاء الأوعيةSS = "XREF"> 26، وفائدة كبيرة من NO فلوري • تحقيقات هو أنها مباشرة تحويل الخلوية NO • تقلبات إلى إشارات مرئية في الوقت الحقيقي. وبالتالي، والتصوير NO الخلوي • إشارات مع geNOps يوفر القرار المكانية والزمانية عالية، وتقدم إمكانيات فريدة من نوعها في (إعادة) التحقيق في (دون) الخلوية NO • التوازن. على سبيل المثال، والتصوير أنوش مكوكية 42 في تركيبة مع التكنولوجيا geNOps في الخلايا البطانية واحدة قد تكون مناسبة لربط NO • تشكيل لتوطين التحت خلوية والنبات من NO. • -producing الانزيم أو البروتينات الأخرى ذات الصلة مثل كالمودولين وcaveolin 43.

نحن هنا وصف التطبيق العملي من G-geNOp معربا عن كلوة وEA.hy926 خلايا لتصور خارجيا والتطور الطبيعي ولدت الخلوية NO • الإشارات على مستوى وحيدة الخلية وفي الوقت الحقيقي على التقليدية واسعة مضان الحقل مicroscope. يعني بياناتنا أن geNOps هي مناسبة لتتبع تحديدا (الفرعية) الخلوية NO • ديناميات تحت ظروف تجريبية مختلفة باستخدام كل أنواع من أنواع الخلايا مثيرة للاهتمام.

Disclosures

وقد رفعت EE، MW، RM وWFG، وأعضاء هيئة التدريس في جامعة جراتس الطبية، تطبيق المملكة المتحدة براءات الاختراع (طلب البراءة عدد WO2015EP74877 20151027، الأولوية رقم GB20140019073 20141027) التي تصف أجزاء من الأبحاث في هذا المخطوط. يتم توفير التراخيص المتعلقة بهذا براءات الاختراع إلى الجيل التالي الإسفار التصوير (NGFI) المحدودة ( http://www.ngfi.eu/ )، وهي شركة العرضية من كلية الطب بجامعة غراتس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30 mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. 40X objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
  6. Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 121، كاليفورنيا
تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H.,… More

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter