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Biology

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट नाइट्रिक ऑक्साइड का आवेदन (सं •) जांच, geNOps, एकल कक्षों में सं • सिग्नल की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

Abstract

नाइट्रिक ऑक्साइड (NO •) एक छोटे से कट्टरपंथी, जो स्तनधारी, बैक्टीरिया और पौधों में कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों मध्यस्थता करता है। Vivo में इन विट्रो में सं • पता लगाने के लिए तरीकों की एक बड़ी संख्या के अस्तित्व के बावजूद, एकल कोशिका स्तर पर कोई • की वास्तविक समय की निगरानी बहुत चुनौतीपूर्ण है। सं • के शारीरिक या रोग प्रभाव वास्तविक एकाग्रता से निर्धारित है और इस कट्टरपंथी के समय ध्यान केन्द्रित कर रहे हैं। तदनुसार तरीके नहीं • की एकल कोशिका पता लगाने की अनुमति अत्यधिक वांछनीय हैं। हाल ही में, हम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग नाइट्रिक ऑक्साइड (NO •) जांच (geNOps) जो सीधे सेलुलर सं • उतार-चढ़ाव का जवाब और, इसलिए, इस जरूरत को संबोधित शुरू करने से सं • संकेतकों के फूस का विस्तार किया। यहाँ हम geNOps का उपयोग सं • दो अलग अलग रासायनिक -liberating अणुओं के जवाब में intracellular सं • संकेतों का आकलन करने के लिए प्रदर्शित करता है। हमारे परिणाम ए एल एसओ पुष्टि करते हैं कि हौसले से तैयार 3- (2-हाइड्रोक्सी-1-मिथाइल-2-nitrosohydrazino) एन मिथाइल-1-propanamine (एनओसी-7) intracellular सं • के स्तर में परिवर्तन पैदा करने के लिए एक बहुत उच्च क्षमता है के साथ तुलना में अकार्बनिक सं • दाता सोडियम nitroprusside (एसएनपी)। इसके अलावा, दोहरी रंग रहते सेल हरी geNOps (जी geNOp) और रासायनिक सीए 2 + सूचक Fura-2 का उपयोग कर इमेजिंग सीए 2 की तंग विनियमन कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया गया था निर्भर सं • एकल endothelial कोशिकाओं में गठन। ये प्रतिनिधि प्रयोगों दिखाना है कि geNOps उपयुक्त उपकरण विविध प्रयोगात्मक setups में वास्तविक समय पीढ़ी और एकल कोशिका सं • संकेतों की गिरावट जांच करने के लिए कर रहे हैं।

Introduction

हमने हाल ही में, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सं • जांच के लिए एक उपन्यास वर्ग का विकास किया है geNOps 1 कहा जाता है। ये सेंसर एक बस बनाया, बैक्टीरिया व्युत्पन्न, सं • बाध्यकारी डोमेन 2, जो एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन संयुग्मित है (एफपी) संस्करण 3 (सियान, हरे या नारंगी एफपी) से मिलकर बनता है। कोई geNOps भीतर गैर-हीम आयरन (II) केंद्र 4 के लिए बाध्य • तुरन्त प्रतिदीप्ति तीव्रता 1 कम करता है। महत्वपूर्ण बात है, geNOps प्रतिदीप्ति तेजी से और पूरी तरह से ठीक हो जाए intracellular सं • स्तरों से गिरावट जब 1। तदनुसार, geNOps (उप) सेलुलर सं • उतार चढ़ाव के वास्तविक समय इमेजिंग अनुमति देते हैं। हालांकि कोई • संवेदन geNOps की व्यवस्था अब तक अस्पष्ट रहते हैं, वे उत्कृष्ट सं • संवाददाताओं से हो सकता है, और इस तरह अनेक रंगों, मात्रात्मक सं • bioimagin के एक नए युग को खोलने के लिए शक्ति है सिद्ध कर दिया हैउच्च स्थानिक और लौकिक प्रस्तावों के साथ 1 ग्राम, 5। अन्य उपलब्ध फ्लोरोसेंट सं • जांच छोटे रासायनिक यौगिकों, जो कोशिकाओं में लोड करने की जरूरत है, और अचल द्वारा सं • 6 संशोधित कर रहे हैं पर आधारित हैं। सं • संवेदनशील छोटे fluorophores के अतिरिक्त नुकसान से अपनी क्षमता cytotoxicity और अपेक्षाकृत कम विशिष्टता है जो यह मुश्किल के लिए उन्हें एक विश्वसनीय, विश्लेषणात्मक और निर्णायक ढंग से 7, 8, 9 में उपयोग करने के लिए कर रहे हैं। हालांकि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जांच के प्रभावी उपयोग के कुशल जीन स्थानांतरण तकनीक की आवश्यकता है, एफपी आधारित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर अनिवार्य उपकरण है कि कोशिकाओं को 10, 11 की अंदरूनी कामकाज के बारे में हमारी समझ में क्रांति ला दी है के रूप में उभरा है। , एक एकल एफ एफ पी-आधारित geNOps के विकास से पहलेörster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित सं • सेंसर, के रूप में NOA-1 12, निर्माण किया गया था भेजा। सातो एट अल। इस अत्याधुनिक जांच है कि (SGC) सं • संवेदनशील घुलनशील guanylate साइक्लेज की दो यूनिटों, दोनों संयुग्मित को झल्लाहट आधारित सेंसर रिपोर्टिंग चक्रीय ग्वानोसिन मोनोफास्फेट (cGMP) के स्तर के होते हैं 12 बनाया गया है। इस जांच cGMP के लिए जवाब है, यह केवल परोक्ष रूप से intracellular सं • उतार चढ़ाव 12 होश। NOA -1 नैनो-दाढ़ श्रेणी में कोई • उन्नयन के लिए जवाब है हालांकि, इस उपकरण शायद उपलब्धता और इस भारी द्विपक्षीय सेंसर की साध्यता के बारे में सीमाओं के कारण अब तक अक्सर इस्तेमाल नहीं किया गया है।

सं •, जो प्रभाव मौलिक जैविक प्रक्रियाओं में अच्छी तरह से 13, 14 विशेषता किया गया है की बहुमुखी कार्य करता है। कई अध्ययनों से साबित कर दिया कि कोई • concentration कोशिकाओं और उप भीतर स्वास्थ्य और रोगों 14, 15, 16 में सेल भाग्य निर्धारित करता है। Mammalians में, सं • मुख्य रूप से enzymatically विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अच्छी तरह से विशेषता नाइट्रिक ऑक्साइड synthase (ओपन स्कूल) परिवार 17 से उत्पन्न होता है। अब तक, ओपन स्कूल के तीन isoforms 18 में वर्णित किया गया है, 19, 20; इन सीए 2 / calmodulin निर्भर endothelial ओपन स्कूल (एनोस या ओपन स्कूल-3) 18 और neuronal ओपन स्कूल (nNOS या ओपन स्कूल -1) 19, और सीए 2 / calmodulin स्वतंत्र अनिवार्यता से सक्रिय inducible ओपन स्कूल (INOS या NOS- हैं 2) 20। इसके अलावा, mitochondrial ओपन स्कूल (mtNOS) के अस्तित्व को भी 21 सुझाव दिया गया है। हालांकि, mtNOS nNOS की एक splicing प्रकार के रूप में माना जाता है, और इसलिए अलग से वर्गीकृत नहीं है एक isoform 21 के रूप में। एक और isoform, के अलावा स्तनधारी कोशिकाओं में उन लोगों से, तथाकथित बैक्टीरियल ओपन स्कूल (bNOS), मुख्य रूप से ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया 22 में पाया जाता है। सं • के enzymatic उत्पादन अत्यधिक नियंत्रित किया जाता है और इस तरह के निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (NADPH) के रूप में कई सहकारकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (एफएडी), tetrahydrobiopterin (BH4), आणविक ऑक्सीजन और एल arginine 17 पीला रंग। Cationic अमीनो एसिड एल arginine सब्सट्रेट कि कोई • उत्पादन 17 पर एल citrulline में बदल जाती है। सं • के उच्च विनियमित एंजाइमी पीढ़ी के अलावा, यह माने गया है कि कट्टरपंथी कमी वाली स्थिति 23 के तहत कम किया जा सकता माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा नाइट्राइट पूल से गैर enzymatically। एक बार कोई • एक कोशिका के भीतर उत्पादन किया जाता है, यह स्वतंत्र रूप biomembranes 14 के माध्यम से फैलाना कर सकते हैं,रेफरी "> 15। हालांकि, इस कट्टरपंथी के बहुत ही कम आधा जीवन मुख्य रूप से पर्यावरण की स्थिति से निर्धारित होता है, और विभिन्न रास्ते और रासायनिक प्रतिक्रियाओं कुशलता सं • स्तरों 24 नीचा। आखिरकार, गठन, प्रसार, और सं • की गिरावट निर्भर करता है विविध पर्यावरण मानकों पर जो अत्यधिक जैविक रूप से सक्रिय अणु 24 के प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण।

GeNOps प्रौद्योगिकी (उप) सेलुलर सं • अस्थिरता 1 की प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है और इसलिए reinvestigate करने के लिए उपयुक्त है, और नव तंत्र buildup और सेलुलर सं • संकेतों के अपघटन के लिए जिम्मेदार खोजने के लिए। यहाँ, हम सरल, प्रोटोकॉल और geNOps के उपयोग exogenously पैदा की कल्पना करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम और endogenously उत्पन्न सं • प्रोफाइल प्रदान व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर। इसके अलावा, geNOps प्रौद्योगिकी एपी के लिए अनुकूलित किया जा सकताअन्य सेल मॉडल प्रणाली में तह विविध सेलुलर उत्तेजनाओं और तनाव के लिए प्रतिक्रिया में कोई • गठन, प्रसार, और गिरावट की जटिल पैटर्न का अध्ययन करने के लिए।

Protocol

1. रासायनिक बफ़र और समाधान की तैयारी

  1. जिसमें 135 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, 2.6 मिमी 3 NaHCO, 0.44 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 0.34 मिमी ना 2 HPO 4, 10 मिमी डी एक भंडारण बफर तैयार ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, 1x सदस्य विटामिन, 1x सदस्य अमीनो एसिड, 1% कलम स्ट्रेप, और 1% amphotericin बी सभी घटकों आसुत जल में भंग और कमरे के तापमान पर एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर 20 मिनट के लिए बफर हलचल। 1 एम NaOH का उपयोग कर 7.44 पीएच को समायोजित करें। NaOH के dropwise अलावा पर है, जबकि लगातार क्रियाशीलता एक पीएच मीटर का उपयोग कर पीएच को मापने।
  2. एक शारीरिक सीए 2 युक्त बफर 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी डी ग्लूकोज, और 10 मिमी HEPES के होते हैं जो तैयार करें। 1.1 चरण में वर्णित के रूप में 7.4 NaOH का उपयोग करने के लिए पीएच को समायोजित करें।
  3. एक सीए 2 + मुक्त बफर में एक ही सामग्री के होते हैं जो तैयारके रूप में 1.2 चरण में सूचीबद्ध है। 1 मिमी EGTA बजाय 2 मिमी का प्रयोग करें।
  4. DMSO में Fura-02:00 solubilize एक 1 मिमी शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए। शेयर अप करने के लिए एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कसकर बंद शीशियों में समाधान और दुकान विभाज्य। तो जमे हुए, शेयर समाधान कम से कम 1 घंटा प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। 3.3 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1 मिलीलीटर भंडारण बफर (1.1 कदम) में Fura-02:00 शेयर समाधान पतला।
  5. आसुत जल में एक 100 मिमी हिस्टामिन शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर (7.0 पीएच) तैयार करें। 100 मिलीलीटर सीए 2 में 100 मिमी हिस्टामिन शेयर समाधान 100 माइक्रोन के हिस्टामिन का अंतिम एकाग्रता के लिए शारीरिक बफर युक्त पतला।
  6. Solubilize कैल्शियम युक्त शारीरिक बफर के 100 मिलीलीटर में Nω-नाइट्रो-एल arginine (एल NNA) 300 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर समाधान की दुकान तक एल NNA पूरी तरह से भंग कर रहा है।
  7. 10 मिलीग्राम solubilize एनओसी-7 आसुत पानी मेंआतंकवाद (7.0 पीएच) एक 10 मिमी शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए। कसकर बंद शीशियों में छोटे aliquots में शेयर समाधान विभाज्य और -70 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत दुकान। 10 माइक्रोन एनओसी-7 के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक शारीरिक बफर में एनओसी-7 शेयर समाधान पतला।
    नोट: एनओसी-7 एक छोटी सी रासायनिक यौगिक है जो अनायास एक कम आधा जीवन के साथ कोई विज्ञप्ति है। हमेशा काम बफ़र्स कि सिर्फ एक प्रयोग करने से पहले एनओसी -7 होते तैयार करते हैं।
  8. एक शारीरिक कैल्शियम बफर में 1 मिमी सोडियम nitroprusside (एसएनपी) समाधान करें और एक 10 माइक्रोन के कमजोर पड़ने तैयार करते हैं।
    नोट: हमेशा छोटी मात्रा में तेजी से गिरावट की दर की वजह से कोई-दाता के समाधान के लिए (~ 10 मिलीलीटर) तैयार करते हैं।
  9. एक फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 9.2 मिमी ना 2 से मिलकर HPO 4, और 1.5 मिमी के.एच. 2 4 पीओ तैयार करें। NaOH / एचसीएल के साथ 7.44 पीएच मूल्य को समायोजित करें।

2. सेल तैयार

नोट: ओ मेंrder एकल कक्षों में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO •) को मापने geNOps का उपयोग कर के प्रदर्शन में एकरूपता प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को एक लोहे (द्वितीय) / विटामिन आदेश फे 2 + बहाल करने के लिए बफर इमेजिंग प्रयोगों के लिए पहले से युक्त सी के साथ पूर्व incubated करने की आवश्यकता सं • -probes की सं • -binding डोमेन के भीतर। EA.hy926 और HEK293 कोशिकाओं के मामले में, आयरन (II) बूस्टर समाधान के साथ 20 मिनट के लिए ऊष्मायन सं • सेंसर का पूरा सक्रियण की ओर जाता है।

  1. 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में अगले दिन के लिए 5.5 x 10 5 EA.hy926 या HEK293 कोशिकाओं या अगले दिन के बाद दिन के लिए 3.5 x 10 5 कोशिकाओं, 30 मिमी माइक्रोस्कोप कवर चश्मे पर बीज। 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: स्तनधारी कोशिकाओं और वायरस निर्माण के adenoviral संक्रमण के बारे में विस्तृत जानकारी झांग एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। 25। यह कदम HEK 293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त जी geNOp के लिए लागू नहीं होता।
  2. भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और एंटीबायोटिक मुक्त Dulbecco के ईगल संशोधित मध्यम (DMEM) ले लो और जी geNOp (MOI के लिए जीन एन्कोडिंग ले जाने एडिनो से जुड़े वायरस प्रकार जोड़ने 5 (AAV5) वेक्टर: EA.hy926 कोशिकाओं के लिए 500 उपज लगभग 100 % सकारात्मक कोशिकाओं, MOI: 1 HEK293 कोशिकाओं के लिए कुशल है)।
    नोट: एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर उपयोग जोखिम समूह को सौंपा है 2. जैव सुरक्षा स्तर 2 रोकथाम आम तौर पर इस सदिश के साथ काम करने के लिए आवश्यक है। यदि आवश्यक हो, वायरस के संक्रमण भी मध्यम युक्त एफसीएस में प्रदर्शन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं क्षणिक लिपिड आधारित वाहक 1 का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है।
  3. संस्कृति के माध्यम से निकालें और साथ पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस कोशिकाओं धो लें। 1 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक पर DMEM / AAV5 माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। यह कदम HEK 293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त जी geNOp के लिए लागू नहीं होता।
  4. 10% एफसीएस के अंतिम एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक पर 20% एफसीएस युक्त DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं से AAV5 युक्त मीडिया न निकालें। सज्जनLy कुओं के भीतर मध्यम homogenize के लिए थाली झूला। 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। यह कदम HEK 293 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त जी geNOp पर लागू नहीं होता।
  5. 48 घंटे के बाद, पूर्व गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। इसके बाद प्रत्येक के लिए 2 मिलीलीटर पूर्व गर्म भंडारण बफर (धारा 1.1) अच्छी तरह से कम से कम 1 घंटा प्रकाश विकिरण से रक्षा के लिए कमरे आरटी पर कोशिकाओं को जोड़ने और सेते हैं।
  6. कमरे के तापमान पर 1 मिलीग्राम / लोहा (द्वितीय) बूस्टर समाधान की अच्छी तरह से (आरटी) के साथ भंडारण बफर बदलें। अंधेरे में ठीक 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: से अधिक या इष्टतम ऊष्मायन समय के रूप में इस सं • जांच की जवाबदेही को प्रभावित कर सकता है कम मत करो।
  7. भंडारण बफर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और प्रत्येक आदेश कोशिकाओं संतुलित करने के लिए अनुमति देने के लिए आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर भंडारण बफर के साथ अच्छी तरह से सेते हैं।
  8. , आरटी पर 45 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर भंडारण बफर में 3.3 माइक्रोन के Fura-02:00 के साथ भंडारण बफर बदलें संरक्षितप्रकाश से।
  9. कोशिकाओं में दो बार भंडारण बफर के साथ, एक बार फिर कम से कम 30 मिनट के लिए आदेश कोशिकाओं संतुलित करने के लिए अनुमति देने के लिए धोएं और सेते हैं।

3. सं • और सीए व्यक्ति की कोशिकाओं में 2 + सिग्नल लाइव सेल इमेजिंग

  1. एक 30 मिमी कवर पर्ची एक धातु छिड़काव कक्ष में EAhy.926 या HEK293 कोशिकाओं (2.1 कदम से) के साथ लेपित फिक्स और माइक्रोस्कोप पर जगह है। बफर जलाशयों के लिए तांता ट्यूब और एक वैक्यूम पंप से तपका कनेक्ट करें। एक सुसंगत प्रवाह को सुनिश्चित करने और कवर पर्ची के draining से बचें।
  2. शारीरिक कैल्शियम बफर (1.2 कदम से) के साथ गुरुत्वाकर्षण संचालित छिड़काव शुरू एक अर्द्ध स्वचालित छिड़काव प्रणाली का उपयोग करते हुए।
    नोट: इस तरह की एक प्रणाली बफर जलाशयों, संबंधित ट्यूबिंग, चुंबकीय वाल्व है कि इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित कर रहे हैं और एक वैक्यूम पंप (देखें चित्रा 1 बी) के होते हैं। प्रवाह की दर 1 से 3 मिलीग्राम / मिनट, छिड़काव जलाशयों की ऊंचाई पर निर्भर है से लेकर कर सकते हैं। लगातार स्थानीय दवा appli के लिएकेशन, सभी का इस्तेमाल किया जलाशयों के प्रवाह की दर लगभग बराबर होना चाहिए। इस इमेजिंग प्रयोगों के लिए पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। विचार करें कि endothelial कोशिकाओं जो कठोर छिड़काव द्वारा प्रेरित किया जा सकता कतरनी तनाव में वृद्धि हुई है का जवाब।
  3. इमेजिंग प्रणाली पर स्विच और 30 मिनट के लिए सभी उपकरणों के लिए गर्म अनुमति देते हैं।
  4. इमेजिंग सेटिंग्स संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिभाषित करें। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का चयन 340 एनएम और Fura-2 इमेजिंग के लिए 380 एनएम और रोमांचक जी geNOp के लिए 480 एनएम। कम करने के लिए प्रतिदीप्ति विरंजन 4 के लिए कैमरा binning बढ़ाने के लिए और उत्तेजना तीव्रता और जोखिम बार कम। देखें भी 3.6-3.8 कदम।
    नोट: इमेजिंग सेटिंग्स और मापदंडों का इस्तेमाल किया उपकरणों पर निर्भर करती है, Fura-2 लदान क्षमता और जी geNOp अभिव्यक्ति के स्तर।
  5. कई फ्लोरोसेंट कोशिकाओं तक माइक्रोस्कोप के xyz-तालिका ले जाकर इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें ध्यान में हैं। तो ब्याज (ROIs) संबंधित सॉफ्टवेयर उपकरण के माध्यम के क्षेत्रों को परिभाषित। कई पूरे singl को कवर क्षेत्रों ड्राई इमेजिंग क्षेत्र मैन्युअल प्रति फ्लोरोसेंट कोशिकाओं। इसके अलावा, समान आकार की एक पृष्ठभूमि के क्षेत्र को परिभाषित।
    नोट: एक बार छवियों का अधिग्रहण किया गया है और संग्रहीत ROIs भी संबंधित इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आगे के विश्लेषण के लिए इमेजिंग प्रक्रिया के बाद नव परिभाषित किया जा सकता है (देखें सामग्री सूची)।
  6. एक रंग का प्रकाश स्रोत एक मोटर चालित नमूना मंच के साथ एक औंधा और उन्नत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, और पर डेटा इकट्ठा करने शुरू करो। वैकल्पिक रूप से क्रमश: 340 एनएम और Fura-02:00 के लिए 380 एनएम और जी geNOp के लिए 480 एनएम पर उत्तेजित। संबंधित जोखिम बार इतना तय है कि सभी चैनलों के लिए, एक स्पष्ट प्रतिदीप्ति संकेत समय के साथ detectable है। यह भी 3.4 चरण देखें।
    नोट: इस उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता और कैमरा binning पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, उत्तेजना प्रकाश का 15% तीव्रता, 4 की एक कैमरा binning और 340 एनएम के लिए 150 एमएस, 380 एनएम के लिए 50 एमएस, और 480 एनएम के लिए 300 एमएस का उपयोग करें। यह भी 3.4 चरण देखें।
  7. Fura-2 / AM के लिए 510 एनएम, जी Geno के लिए 520 एनएम पर प्रकाश उत्सर्जित लीजिएपी उपयुक्त फिल्टर 500 एनएम उत्तेजक, एक 495 एनएम dichroic और एक 510-520 एनएम emitter से मिलकर सेट के साथ एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग। रिकॉर्ड एक कुल फ्रेम हर 3 सेकंड।
  8. रिकॉर्ड पहले ही मिनट शारीरिक सीए 2 बफर (1.2) में (3 मिनट के लिए यदि आवश्यक हो तो) समय के साथ संबंधित प्रतिदीप्ति संकेतों के आधारभूत प्राप्त करने के लिए।
  9. एक बार एक स्थिर आधारभूत प्रतिदीप्ति मनाया जाता है, 100 माइक्रोन के हिस्टामिन या एटीपी (1 माइक्रोन या 100 माइक्रोन) के 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए शारीरिक सीए 2 बफर युक्त करने के लिए स्विच।
    नोट: EA.hy926 कोशिकाओं है कि एगोनिस्ट का जवाब Fura-2 अनुपात (प्रतिदीप्ति 340 एनएम प्रतिदीप्ति 380 एनएम पर उत्साहित के माध्यम से विभाजित पर उत्साहित) और जी geNOp प्रतिदीप्ति संकेत की एक स्पष्ट कमी की एक तेज वृद्धि दिखा।
  10. 5 मिनट के लिए हिस्टामिन या एटीपी और एल NNA बिना वापस शारीरिक सीए 2 बफर करने के लिए स्विच कोशिकाओं से यौगिकों को हटाने के लिए। यह कदम fluores तक लंबे समय तक किया जा सकता हैcence परिवर्तन पूरी तरह से बरामद कर रहे हैं।
  11. छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर 2 मिनट के लिए शारीरिक सीए 2 बफर में 10 माइक्रोन एनओसी-7 प्रबंधन। कोई दाता जोरदार जी geNOp प्रतिदीप्ति जो आमतौर पर 10 माइक्रोन के एनओसी-7 के जवाब में> 20% से कम हो जाती है को प्रभावित करता है। EA.hy926 कोशिकाओं में एनओसी-7 प्रभाव एगोनिस्ट प्रेरित जी geNOp प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए की तुलना में लगभग 3 गुना मजबूत है।
  12. शारीरिक सीए के साथ लगभग 10 मिनट के लिए कोई • -releasing यौगिक बाहर धो 2 + बफर और रिकॉर्डिंग एक बार बेसल प्रतिदीप्ति बरामद किया है बंद करो।

4. डेटा विश्लेषण

  1. निर्यात का अधिग्रहण समय के साथ एकल कक्षों का औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर करने के लिए।
  2. संबंधित पृष्ठभूमि मूल्यों घटाएँ और समय के साथ संबंधित Fura-2 प्रत्येक एकल कोशिका के संकेतों के 380 एनएम से 340 एनएम के अनुपात की गणना।
  3. वास्तविक FL प्राप्त करने के लिए जी-geNOp चैनल की पृष्ठभूमि मूल्यों घटाएँकिसी भी गणना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोई जांच (एफ) में समय के साथ की तीव्रता uorescence।
  4. आधारभूत प्रतिदीप्ति मान ले के रूप में एफ 0 (एफ 0 उत्तेजना के बिना समय पर कोई जांच की प्रतिदीप्ति है)। यह भी 4.5 कदम और चित्रा 1C देखें।
  5. निम्न समीकरण का उपयोग प्रतिदीप्ति विरंजन प्रभाव के लिए समय के साथ एक समारोह की गणना: एफ 0 = एफ inital • EXP (कश्मीर • समय) + F पठार। एफ inital: एक बार इमेजिंग अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति संकेत शुरू कर दिया है; कश्मीर: समय पर प्रतिदीप्ति विरंजन की दर लगातार; एफ पठार: प्रतिदीप्ति न्यूनतम समय के साथ ब्लीचिंग द्वारा पहुंच गया; इन्हें भी देखें 4.3- 4.4 और चित्रा 1C कदम।
    नोट: सन्निकटन के लिए, पहले और सेल उत्तेजना के बाद समय के साथ सभी प्रतिदीप्ति मूल्यों में इस्तेमाल किया जा सकता है। आगे की जानकारी बेंटले एट अल द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं। 27।
  6. समय के साथ जी-geNOp संकेत को सामान्य करने के लिए, की गणना 1-एफ / एफ0 (4.3-4.5 कदम)। चित्रा 1C और 1D देखें।

Representative Results

क्षणिक एप्लाइड सं दाताओं के जवाब में एकल सेल सं • प्रोफाइल के दृश्य

हम एक HEK सेल क्लोन जो स्थिरतापूर्वक व्यक्त जी geNOp (चित्रा 1 ए), क्रम में दो अलग नहीं-मुक्ति छोटे रासायनिक यौगिकों के जवाब में एकल कोशिका-स्तर पर कोई • संकेतों कल्पना करने में, एनओसी-7 और एसएनपी इस्तेमाल किया। सं • दाताओं लगातार एक गुरुत्व आधारित छिड़काव प्रणाली है कि सतत प्रवाह (चित्रा 1 बी) का उपयोग करते हुए यह सुनिश्चित किया इमेजिंग के दौरान करने के लिए आवेदन किया है और कोशिकाओं से हटा दिया गया। विभिन्न तीव्रताओं के साथ जी geNOp व्यक्त सभी कोशिकाओं को एक स्पष्ट एनओसी-7 और एसएनपी (चित्रा 1 सी) के जवाब में प्रतिदीप्ति की कमी देखी गई है, यह दर्शाता तेजी सं • सं • दाताओं के अलावा पर संचय कोशिकाओं के भीतर। सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति संकेतों (1-एफ / एफ 0) दिखा दिया है कि दोनों नहीं • दाताओं सजातीय cellula पैदा कीआर सं • उन्नयन है कि पूरी तरह से कोई • -releasing यौगिकों (चित्रा -1) के वार्शआउट पर बरामद किया। हालांकि, 10 माइक्रोन एसएनपी सेलुलर सं • संकेत का केवल 50% (9.63 ± 1.05%, एन = 3/38) प्रेरित किया है कि 10 माइक्रोन के एनओसी-7 (18.10 ± 1.20%, एन = 3/38, पी द्वारा पहुँच गया था < 0.0001)। आदेश में दोनों कोई दाताओं •, एसएनपी का 1 मिमी की एकाग्रता आवश्यक था (आंकड़े 1C, 1 डी) के साथ बराबर intracellular सं • स्तर को प्राप्त करने के लिए।

अगला, हम बनाम समाप्त हो गई एनओसी -7 तैयार HEK कोशिकाओं में intracellular सं • स्तर ऊंचा करने के लिए हौसले की क्षमता का परीक्षण किया। इस प्रयोजन के लिए, हम युक्त 5 सुक्ष्ममापी एनओसी-7 चार प्रयोगात्मक बफ़र्स तैयार किया। सं • दाता या तो माप के हौसले बस से पहले कहा, या 1 घंटा, 2 घंटा, और माप से पहले कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए जलाशयों के भीतर रखा गया था। विभिन्न बफ़र्स लगातार करने के लिए आवेदन किया है और हटा दिया गया था चजी geNOp व्यक्त एक छिड़काव प्रणाली (चित्रा 2 बी) का उपयोग कोशिकाओं ROM। यह दृष्टिकोण जलीय एनओसी-7 समाधान है जो, उम्मीद के रूप में, पता चला है intracellular सं • स्तर (आंकड़े 2A, 2 सी) तरक्की के लिए समय के साथ कम क्षमता की स्थिरता का अनावरण किया। दिलचस्प है, सं • संकेतों काफी तेजी से समाप्त हो गई है buffers के हटाने पर, intracellular सं • प्रतिक्रिया है कि नए सिरे से एनओसी-7 (चित्रा -2), सेलुलर घटकों पर बरकरार सं • -liberating अणुओं का शायद यह दर्शाता है आसंजन द्वारा पैदा किया गया था की तुलना में बरामद ।

सीए 2 का एक साथ दृश्य और सं • एकल endothelial कोशिकाओं में सिग्नल

सीए अध्ययन करने के लिए 2 + endothelial कोशिकाओं में सं • गठन -triggered, आमतौर पर इस्तेमाल endothelial अमर सेल सरोगेट, EA.hy926 सेल लाइन, टी थाransiently जी geNOp साथ ट्रांसफ़ेक्ट और Fura-2 / AM साथ भरी हुई (प्रोटोकॉल 2.8 देखें)। अभिकर्मक जी geNOp सकारात्मक endothelial कोशिकाओं का लगभग 10% झुकेंगे (एन = 6, चित्रा 3) है, जो सीए 2 रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त है एक endothelial कोशिकाओं के स्तर पर कोई • उत्पादन -evoked। हालांकि, हम लगभग 100% जी geNOp सकारात्मक EA.hy926 एक एडिनो से जुड़े वायरल वेक्टर का उपयोग कोशिकाओं हासिल की (एन = 6; प्रोटोकॉल 2.2 देखें)। मल्टीचैनल माप करने से पहले, कोशिकाओं 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भंडारण बफर में मिलकर एल NNA, एक शक्तिशाली अपरिवर्तनीय ओपन स्कूल-अवरोध 26 incubated रहे थे। नियंत्रण कक्षों के बिना एल NNA (प्रोटोकॉल 1.1 देखें) (चित्रा 3 बी) एक ही भंडारण बफर में रखा गया था। हिस्टामिन, एक शक्तिशाली inositol 1,4,5-trisphosphate (आईपी 3) -generating एगोनिस्ट, तुरन्त ऊपर उठाया साइटोसोलिक सीए 2 स्तरों के intracellular सं • एक क्रमिक वृद्धि के बाद जब तक एगोनिस्ट निकालें था के साथ नियंत्रण कक्षों का उपचारडी (आंकड़े -3 सी, 3 डी)। प्रकोष्ठों ओपन स्कूल-अवरोध के साथ पूर्व इलाज, इसी तरह साइटोसोलिक सीए 2 संकेतों से पता चला है, जबकि intracellular सं • स्तर हिस्टामिन के जवाब (चित्रा 3E) में लगभग अप्रभावित रहे। EA.hy926 कोशिकाओं जी geNOp व्यक्त भी 1 माइक्रोन के साथ इलाज किया गया और 100 आई पी 3 क्रम में परीक्षण करने के लिए किया जाए या नहीं geNOps दोनों कम शारीरिक और पूर्व शारीरिक के जवाब में कोई • संकेतों पर नजर रखने के लिए उपयुक्त हैं में एगोनिस्ट एटीपी -generating की सुक्ष्ममापी एक agonist (चित्रा 3F) की सांद्रता। Endothelial सेल लाइन 1 माइक्रोन एटीपी में एक स्पष्ट साइटोसोलिक सं • संकेत है, जो लगभग 100 सुक्ष्ममापी संकेत एटीपी (चित्रा 3F) के द्वारा प्राप्त की आधी थी पैदा की।

आकृति 1
चित्रा 1: अलग नहीं-Liberati के जवाब में intracellular कोई प्रोफ़ाइल एनजी अणुओं। (ए) HEK कोशिकाओं के व्यापक क्षेत्र छवियों स्थिरतापूर्वक साइटोसोलिक जी geNOp व्यक्त। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (बी) नियंत्रित आवेदन और एनओसी-7 और एसएनपी को हटाने के लिए एक गुरुत्व आधारित आधे स्वचालित छिड़काव प्रणाली के योजनाबद्ध चित्रण। (सी) प्रतिनिधि (बाहर के 3 स्वतंत्र प्रयोगों) गैर सामान्यीकृत एकल कोशिका प्रतिदीप्ति तीव्रता HEK कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक करने के लिए 10 माइक्रोन एनओसी-7, 10 माइक्रोन के एसएनपी जवाब में साइटोसोलिक जी geNOp व्यक्त करने का समय बनाम मनमाना इकाइयों में निशान, और 1 मिमी एसएनपी। काले बोल्ड वक्र 26 एकल कोशिका निशान की औसत वक्र (हल्के भूरे रंग घटता) का प्रतिनिधित्व करता है। बिंदीदार काले वक्र एफ 0, जो सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रतिनिधित्व करता है। (डी) सामान्यीकृत और उल्टे एकल निशान (1-एफ / एफ 0, हल्के भूरे रंग घटता), और 10 माइक्रोन के एनओसी-7, 10 माइक्रोन के एसएनपी, और 1 मिमी एसएनपी के जवाब में वक्र (काला बोल्ड वक्र) समय के साथ से निकाला मतलब पैनल सीes / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: स्थिरतापूर्वक जी geNOp व्यक्त HEK कोशिकाओं का उपयोग एनओसी-7 की स्थिरता का परीक्षण। स्थिरतापूर्वक जी GeNOps ताजा और पुराने एनओसी-7 बफर समाधान के आवेदन पर HEK कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए समय के साथ (ए) प्रतिनिधि सं • एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र। सभी एनओसी-7 युक्त बफ़र्स ही शेयर समाधान (50 मिमी) का उपयोग कर 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के साथ शुरू में तैयार किए गए थे। तैयारी के बाद संबंधित समाधान के बीत समय 1 घंटा, 2 घंटा, और 3 घंटा के लिए इमेजिंग मात्रा में जब तक के रूप में संकेत दिया। (बी) के लगातार जोड़ सकते हैं और इमेजिंग के दौरान एनओसी-7 युक्त समाधान निकालने के लिए एक गुरुत्वाकर्षण आधारित आधे स्वचालित छिड़काव प्रणाली के योजनाबद्ध चित्रण। (सी) के टेम्पोरल सहसंबंधजवाब में सेलुलर सं • संकेतों हौसले से तैयार है और पुराने एनओसी-7 बफ़र्स के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: NO • और सीए एकल EA.hy926 कोशिकाओं में 2 + संकेतों का एक साथ मल्टीचैनल इमेजिंग। (ए) EAhy.926 कोशिकाओं जी geNOp (बाएं पैनल) व्यक्त कि Fura-2 / AM (मध्य और सही पैनल) के साथ लोड कर रहे हैं के प्रतिनिधि व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति छवियों। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (बी) के एक छह अच्छी तरह से थाली माप से पहले के भीतर 500 माइक्रोन 20 मिनट के लिए Nω-नाइट्रो-एल arginine (एल NNA) के साथ EAhy.926 कोशिकाओं के इलाज के योजनाबद्ध चित्रण। (सी) Fura -2 (उत्तेजना का एक साथ रिकॉर्ड के प्रतिनिधि समय कोर्स: 340 एनएम / 380 एनएम emissआयन: 510 एनएम) और जी geNOp संकेतों (उत्तेजना: 480 एनएम, उत्सर्जन: 100 माइक्रोन के हिस्टामिन के जवाब में 520 एनएम)। संकेत दिया हिस्टामिन के बाद 3 मिनट के एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर हटा दिया गया था के रूप में। (डी) घटता साइटोसोलिक सीए के एक साथ रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व 2 + (ग्रे Fura-2 अनुपात का संकेत है, एफ 340 / एफ 380 ठोस लाइन) और कोई • संकेतों (सामान्यीकृत और उल्टे वक्र, 1-एफ / एफ 0 हरी ठोस लाइन है) एक भी Fura-2 / के समय के साथ endothelial सेल भरी हुई महिला क्षणिक जी geNOp व्यक्त। प्रकोष्ठों एक सीए 2 (2 मिमी CaCl 2) में 3 मिनट के बफर युक्त (एन = 8/3) के लिए 100 माइक्रोन के हिस्टामिन साथ प्रेरित किया गया। (ई) प्रतिनिधि एक साथ सीए 2 (ग्रे ठोस लाइन) दर्ज की गई और सं • (हरी ठोस लाइन) एक EA.hy926 सेल के समय के साथ संकेत है कि 500 माइक्रोन Nω-नाइट्रो-एल arginine (एल NNA) के साथ pretreated था प्रायर माप के लिए (एन = 3/12)। कोशिकाओं 2 मिमी की उपस्थिति में 100 माइक्रोन के हिस्टामिन साथ इलाज किया गयासीए 2। (एफ) साइटोसोलिक सं • 1 माइक्रोन एटीपी 100 माइक्रोन के एटीपी के साथ एक दूसरे सेल उत्तेजना के द्वारा पीछा के जवाब में संकेतों का प्रतिनिधित्व औसत घटता। बार्स 1 माइक्रोन एटीपी (सफेद पट्टी) और 4 स्वतंत्र प्रयोगों के 100 सुक्ष्ममापी एटीपी (हरी पट्टी) के जवाब में अधिक से अधिक ± जी geNOp संकेतों के एसडी मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व; पी <0.001 बनाम 1 माइक्रोन एटीपी। पी-मूल्य एक unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर की गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जीव विज्ञान के 28 में एक महत्वपूर्ण संकेत अणु के रूप में कोई • की खोज के बाद से, एकल कोशिकाओं, ऊतकों और एक व्यावहारिक और विश्वसनीय ढंग से उच्च संकल्प के साथ पूरी पशुओं में कट्टरपंथी के विशिष्ट वास्तविक समय माप आकांक्षी कर दिया गया है। यहाँ हम हाल ही में विकसित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सं • जांच (geNOps) कि सटीक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग कर कोई • संकेतों के लाइव सेल इमेजिंग सक्षम के आवेदन की रिपोर्ट।

व्यापक और आक्रामक अभिकर्मक प्रक्रियाओं HEK सेल क्लोन कि स्थिरतापूर्वक हरी फ्लोरोसेंट जी geNOp व्यक्त exogenously उत्पन्न एकल कोशिका सं • प्रोफाइल यों इस्तेमाल किया गया था नाकाम करने के लिए। जैसा कि HEK कोशिकाओं सामान्य रूप से कोई • endogenously 29 की उपज नहीं है, इस प्रकार की कोशिका एक geNOp आधारित सेंसर सेल लाइन की पीढ़ी है, जो सह-संस्कृति की स्थिति में कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए उपयुक्त हैकोई साथ • प्राथमिक कोशिकाओं या यहां तक कि जानवरों 30 में रहने वाले का निर्माण किया। हालांकि, इस अध्ययन में हम विभिन्न सं • -liberating यौगिकों की क्षमता, विभिन्न सांद्रता और stabilities की, जी geNOp व्यक्त HEK सेल मॉडल का उपयोग कर intracellular सं • संकेतों पैदा करने के लिए प्रदर्शित करता है। हमारे डेटा से पता चला है कि सं • -donor एकाग्रता, गुणवत्ता और आवेदन की विधि अंततः intracellular सं • प्रोफाइल के पैटर्न का निर्धारण। इस तरह की सूचना अलग नहीं • दाताओं, जो कई रोगों का संकेत कर रहे हैं के बगल में फ़ार्माकोकायनेटिक लक्षण वर्णन के लिए अपरिहार्य है। विशेष रूप से, geNOps स्थिरतापूर्वक एक बहुत लंबे समय 1 से अधिक सं • -donor दालों के कई दोहराए आवेदन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है। तदनुसार, उपयोग नहीं कर • इस के साथ साथ प्रस्तुत यौगिकों -liberating प्रयोगों, विभिन्न आयाम और संबंधित सेलुलर सं के कैनेटीक्स के बारे में अर्द्ध मात्रात्मक निष्कर्ष अनुमति देते हैं226; संकेतों (आंकड़े 1 और 2)।

हालांकि स्थिरतापूर्वक व्यक्त HEK सेल क्लोन शायद एक एकल कोशिका से निकलती है, जी geNOps अभिव्यक्ति के स्तर की एक व्यापक विविधता (चित्रा 1) मनाया गया। के रूप में (जीनोम एकीकृत) ब्याज की जीन का प्रतिलेखन जैसे विविध पर्यावरण तनाव 31 कि सेल विकास दर 32 को प्रभावित के रूप में कई कारकों के नियंत्रण में है यह स्थिर सेल क्लोन की एक आम सुविधा है, और सेल चक्र स्थिति 33। एकल एफपी आधारित geNOps गैर ratiometric जांच कर रहे हैं और, इसलिए, कोई • geNOp अभिव्यक्ति के स्तर 1 के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है की हानि प्रेरित। तदनुसार, geNOps संकेतों को सामान्य बनाने में विशेष रूप से एक तुलनात्मक विश्लेषण के मामले में सेलुलर सं • संकेतों बढ़ाता के लिए आवश्यक है। हमारे हाल के एक अध्ययन, एक सख्त रैखिक संबंध ख में दिखाया गया हैetween geNOps के बेसल प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक व्यापक रेंज पर कोई • प्रेरित प्रतिदीप्ति शमन की ताकत 1 पाया गया है। इस सेलुलर सं • संकेतों के पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए geNOps की एक महत्वपूर्ण विशेषता है। एनओसी-7 के जवाब में चित्रा 1, जी geNOps संकेतों को सामान्य बनाने में दिखाया गया है और एसएनपी एक ही थाली से सजातीय सं • विभिन्न HEK कोशिकाओं में संकेतों का पता चला, यह दर्शाता है कि HEK कोशिकाओं को अपनी क्षमता को लेने के लिए के संबंध के साथ विविध नहीं हैं और नीचा सं • कट्टरपंथी कि कोई • दाता से निकलती है। इसके विपरीत, हेला कोशिकाओं में geNOps का उपयोग कर एनओसी-7 के जवाब में सेलुलर सं • विभिन्न कोशिकाओं के बीच संकेतों के स्पष्ट विषमताओं का प्रदर्शन किया। इन मतभेदों को सेल प्रकार विशिष्ट सं • चयापचय और अपघटन दरों को इंगित, सेल शरीर विज्ञान और विकृति में कई निहितार्थ हैं हो सकता है, और geNOp का उपयोग कर पर्दाफाश किया जा सकताप्रौद्योगिकी।

फिर भी, geNOps की दो महत्वपूर्ण विशेषताएं सेंसर और डेटा व्याख्याओं के सही उपयोग के लिए ध्यान से विचार किया जाना है: i) geNOps पर्याप्त लोहे की आवश्यकता होती है (द्वितीय) पूरी तरह से नहीं • 1 के लिए प्रतिक्रिया करने और ii) एफपी संस्करण पर निर्भर करता है, geNOps कर सकते हैं पीएच संवेदनशील 1 हो। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि geNOps, जो या तो HEK, हेला या EA.hy926 कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2.6 देखें) में व्यक्त कर रहे हैं की nontoxic आयरन (II) पूरकता के लिए उपयुक्त होने के लिए पाया गया है का वर्णन है। हालांकि यह दिखा दिया है कि लोहे के साथ सेल उपचार (द्वितीय) / विटामिन सी सेल आकृति विज्ञान, सेल व्यवहार्यता और कोशिकाओं 1 की चयापचय क्रिया को प्रभावित नहीं किया है, यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों के लिए यह महत्वपूर्ण कदम अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि, कुछ प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, लोहा (द्वितीय) लोडिंग की आवश्यकता geNOps की प्रयोज्यता की सीमा हो सकती है। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि एस्कॉर्बेट एन कम कर सकते हैंहे • 35 और एस्कॉर्बेट लोहा (द्वितीय) परिसरों • 36 सं मांजना, 37 में सक्षम हैं। इसके अलावा, अतिरिक्त लौह (द्वितीय) और एस्कॉर्बेट भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 39 और uncouple एनोस 41 पैदा कर सकते हैं। इस तरह के प्रभाव जब geNOps प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विचार किया जाना चाहिए। यह दिखाया गया है कि कुछ प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, intracellular पीएच काफी 34 प्रभावित होता है, जो संभावित geNOps प्रतिदीप्ति 1 को प्रभावित करने की है। विशेष रूप से, सियान और हरे रंग geNOps वेरिएंट अपेक्षाकृत पीएच संवेदनशील अम्लीकरण 1 पर प्रतिदीप्ति की कमी दिखा रहे हैं। इसलिए, (उप) सेलुलर पीएच की तीव्र परिवर्तन झूठी सं • संकेतों जब पीएच संवेदनशील geNOps का उपयोग कर अनुकरण सकता है। हमारे पिछले काम नहीं, कोई • असंवेदनशील geNOps के समानांतर उपयोग (geNOps mut) नकारात्मक विवाद के रूप में सुझाव के रूप मेंरास काटना करने के लिए वास्तविक सेलुलर सं • संकेत पीएच परिवर्तन 1 से सिफारिश की है। इसके अलावा सेलुलर पीएच परिवर्तन जैसे SypHer 34 के रूप में पीएच जांच का उपयोग कर निरीक्षण किया जा सकता है।

इसके अलावा, हम endothelial सेल किराए की EA.hy926 में एक शारीरिक सीए 2 -mobilizing एगोनिस्ट के जवाब में अंतर्जात enzymatic सं • गठन कल्पना। EA.hy926 सेल लाइन एक बार उपयोग किया मॉडल प्रणाली लगातार व्यक्त एनोस 38 है। GeNOps क्षणिक EA.hy926 कोशिकाओं में व्यक्त का प्रयोग करें, इस बात की पुष्टि आईपी 3 मध्यस्थता कि सीए 2 संकेतों आह्वान गहरा सं • इस सेल प्रकार है, जो लगभग पूरी तरह से एल NNA द्वारा अवरुद्ध किया गया था में गठन। आदेश में अस्थायी 2+ सहसंबंधी सीए सं • संकेतों के साथ में, जी geNOp व्यक्त कोशिकाओं यूवी उत्तेजनीय रासायनिक सीए 2 -indicator Fura-2 / AM साथ भरी हुई थी। सीए के वर्णक्रमीय जुदाई 2 + बाध्य और अबाध Fura-2 Fluo जी geNOp संकेत से rescence आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर सेट 40 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इमेजिंग दोनों जांच का अनावरण किया कि सीए 2 -triggered एंजाइमी सं • गठन इस प्रकार endothelial सेल में साइटोसोलिक सीए 2 वृद्धि की तुलना में बहुत धीमी होती है। आईपी 3 -generating एगोनिस्ट ब्रैडीकाइनिन के साथ सेल उपचार पर एकल कोशिका सं • गोजातीय फेफड़े के धमनी से endothelial कोशिकाओं में संकेतों के इसी तरह के कैनेटीक्स, साथ ही कतरनी तनाव का उपयोग कर सूचना दी गई है NOA -1, एक अप्रत्यक्ष अत्यधिक सं • प्रति संवेदनशील सेंसर 12 । तदनुसार, इन आंकड़ों पर जोर सीए 2 -evoked कि एनोस व्युत्पन्न सं • गठन के लिए एक निश्चित मूल्य उस समय तक पूर्ण enzymatic गतिविधि पर पहुंच गया है की आवश्यकता है। सेलुलर सं • गठन, प्रसार और गिरावट के कैनेटीक्स अन्य डेटा से निकाला जा सकता है, जैसे कोई • के तनाव आधारित माप पोत छूट प्रेरितएस एस = "xref"> 26, फ्लोरोसेंट सं • जांच के महान लाभ यह है कि वे सीधे वास्तविक समय में दिखाई संकेतों में सेलुलर सं • उतार चढ़ाव परिवर्तित। इसलिए, इमेजिंग geNOps के साथ सेलुलर सं • संकेतों उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान प्रदान करता है, और (आरई) में अद्वितीय संभावनाएं प्रदान की जांच (उप) सेलुलर सं • homeostasis। उदाहरण के लिए, इमेजिंग एनोस एकल endothelial कोशिकाओं में geNOps तकनीक के साथ संयोजन में 42 चक्कर subcellular स्थानीयकरण और एंजाइम या ऐसे calmodulin और caveolin 43 के रूप में अन्य प्रासंगिक प्रोटीन उत्पादक की सं • translocation के साथ कोई • गठन सहसंबंधी करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

यहाँ हम HEK और EA.hy926 कोशिकाओं को एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मीटर पर एकल कोशिका स्तर पर और वास्तविक समय में exogenously कल्पना और endogenously उत्पन्न सेलुलर सं • संकेतों को व्यक्त जी geNOp का साध्य आवेदन का वर्णनicroscope। हमारे डेटा मतलब है कि geNOps विशेष ट्रैक करने के लिए (उप) दिलचस्प प्रकार की कोशिकाओं के सभी प्रकार का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत सेलुलर सं • गतिशीलता उपयुक्त हैं।

Disclosures

ईई, मेगावाट, आरएम और WFG, ग्राज़ के चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्टाफ के सदस्यों, ब्रिटेन के एक पेटेंट आवेदन (पेटेंट आवेदन नंबर WO2015EP74877 20151027, 20141027 प्राथमिकता नंबर GB20140019073) है कि इस पांडुलिपि में अनुसंधान के कुछ हिस्सों का वर्णन दायर की है। इस पेटेंट से संबंधित लाइसेंस अगली पीढ़ी प्रतिदीप्ति इमेजिंग (NGFI) GmbH (करने के लिए प्रदान की जाती हैं http://www.ngfi.eu/ ), एक स्पिन ग्राज़ के चिकित्सा विश्वविद्यालय की कंपनी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30 mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. 40X objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome

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References

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