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Biology

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

Abstract

산화 질소는 (• NO) 포유 동물, 박테리아와 식물의 여러 중요한 세포 기능을 매개하는 작은 급진적이다. 생체 내 및 시험 관내에서 NO • 검출 방법의 다수의 존재에도 불구하고, 단일 세포 수준에서 NO •의 실시간 모니터링은 매우 도전적이다. NO •의 생리 학적 또는 병리학 적 효과는 실제 농도에 의해 결정이 라디칼의 시간을 살고있다. 따라서, NO •의 단일 셀 검출을 허용 방법이 매우 바람직하다. 최근에, 우리는 직접 따라서, 이러한 요구를 해결, 휴대 NO • 변동에 대응하고 단일 형광 단백질 기반의 유전자 인코딩 된 산화 질소 (• NO) 프로브 (geNOps)를 도입하여 NO • 지표의 팔레트를 확장했다. 여기에서 우리는 NO • 두 개의 서로 다른 화학 -liberating 분자에 반응하여 세포 내 NO • 신호를 평가하는 geNOps의 사용을 보여줍니다. 우리의 결과 루게릭 병비하여 갓 3- (2- 하이드 록시 -1- 메틸 -2- nitrosohydrazino) -N- 메틸 -1- 프로판 아민을 제조 오 확인은 (NOC-7) 세포 NO • 레벨의 변화를 연상 할 수있는 매우 높은 전위를 갖는다 무기 NO • 기증자 나트륨 니트 로프 루시드 (SNP). 또한, 녹색 geNOps (G-geNOp) 및 화학 물질 칼슘 2 + 표시의 Fura-2를 사용하여 듀얼 컬러 라이브 세포 이미징은 칼슘의 엄격한 규제를 시각화 하였다 의존성 NO • 하나의 내피 세포에서 형성. 이러한 대표적인 실험 geNOps은 다양한 실험 설정에서 단일 셀 NO • 신호를 실시간으로 생성 및 분해를 조사하기에 적합한 툴이라는 것을 보여준다.

Introduction

우리는 최근, 유전자 인코딩 된 형광 NO의 • 프로브의 새로운 클래스를 개발 geNOps 일이라고했다. 이 센서는 서로 다른 형광 단백질 (FP) 변종 3 (시안 색, 녹색 또는 오렌지 FP) 접합 단순히 내장, 박테리아 유래, NO • 바인딩 도메인 2로 구성되어 있습니다. NO를 geNOps 내에 비 - 헴 철 (II) (4) 중심에 바인딩 • 즉시 한 형광 강도를 감소시킨다. 세포 NO • 레벨 1을 거절 할 때 중요한 것은, geNOps 형광 신속하고 완벽하게 복원한다. 따라서 geNOps은 (부) 셀룰러 NO • 변동 실시간 이미징을 허용한다. geNOps의 NO • 감지 메커니즘은 지금까지 불분명 남아 있지만, 그들은 우수한 NO • 기자, 그리고 따라서 다색, 양적 NO •의 bioimagin의 새로운 시대를 열 수있는 힘을 가지고 입증높은 공간 및 시간 해상도 1 g, 5. 사용할 수있는 다른 형광 아니오 • 프로브 세포에로드되어야하고, 비가 역적 NO • (6)에 의해 수정되는 작은 화학 화합물에 기초하지 않는다. NO • 민감한 작은 형광체의 추가적인 단점은 어려운 신뢰성 분석 및 결정적인 방식으로 7, 8, 9에서 사용할 수 있도록 잠재적 독성 및 비교적 낮은 특이성이다. 유전자 인코딩 된 형광 프로브의 효과적인 사용이 효율적인 유전자 전달 기술이 필요하지만, FP 기반 유전자 인코딩 된 센서는 셀 (10), (11)의 내부 기능에 대한 우리의 이해를 혁명 필수 불가결 한 도구로 등장했다. 하는 F 단일 FP 기반 geNOps의 개발 전örster 공명 에너지 전달 (FRET)을 아니오 • 센서 기반하지 NOA-1 (12)를 제조 하였다이라. 사토 등. 아니오 • 민감한 수용성 구아닐산 시클 라제의 두 개의 서브 유닛 (SGC), 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP) 수준 (12)을보고 모두 접합하는 FRET 기반 센서로 구성이 복잡한 프로브를 디자인했다. 이 프로브는 cGMP의 응답으로, 그것은 단지 간접적으로 세포 내 NO • 변동 (12)을 감지한다. NOA-1 나노 몰 범위 NO • 고도에 응답하지만,이 도구는 아마도이 부피가 큰 양자 센서의 가용성과 실용성에 대한 제한으로, 지금까지 자주 사용되지 않았습니다.

충격 기본적인 생물학적 과정이 아니라 13, 14을 특징으로 한 NO •의 다양한 기능을한다. 많은 연구가 입증 그 NO •의 concentration은 세포와 하위 도메인 내에서 건강과 질병 14, 15, 16 세포의 운명을 결정한다. mammalians에서, NO • 주로 잘 특성화 된 산화 질소 합성 효소 (NOS) 가족 (17)에 의해 다양한 세포 유형의 효소 생성됩니다. 지금까지 세 NOS 이성체 20 19 18 기재되어있다; 이들은 칼슘 / 칼 모듈 린에 의존하는 내피 NOS (eNOS의 또는 NOS-3) (18) 및 신경 NOS (nNOS에 또는 NOS-1) (19), 그리고 칼슘 / 칼 모듈 린 독립적 인 구성 적 활성 유도 NOS (iNOS의 또는 NOS- 있습니다 2) 20. 또한, 미토콘드리아 NOS (mtNOS)의 존재는도 21를 제안하고있다. 그러나 mtNOS는 nNOS에의 스플 라이스 변이체로 간주되고, 따라서 개별적으로 분류되지 이소 형 (21) 등. 다른 이성체가 분리 포유류 세포 에서와는 소위 세균 NOS (bNOS)가 주로 그람 양성균 (22)에서 발견된다. NO •의 효소 생산은 매우 아데닌 디 뉴클레오티드 (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), 산소 분자와 L 아르기닌 (17) 플라 빈, 제어 및 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 인산 (NADPH)와 같은 여러 가지 보조 인자의 가용성에 따라 결정된다. 양이온 성 아미노산 L- 아르기닌은 NO 생산 • 17에 L-시트룰린으로 변환되는 기판이다. NO •의 고도로 조절 효소 생성 이외에, 상기 라디칼은 저산소증 조건 하에서 23 미토콘드리아 아질산 풀에서 비 - 효소 적으로 감소 될 수 있음을 가정하고있다. NO • 셀 내에서 생성되면, 자유롭게 생체막 (14)를 통해 확산 될 수 있으며,REF "는> 15. 그러나,이 라디칼의 매우 짧은 반감기는 주로 환경 조건에 의해 결정되고, 다양한 경로와 화학 반응을 효율적으로 NO • 레벨 24 저하. 결국, NO •의 형성, 확산, 열화 의존 다양한 환경 변수에있는 고도의 생물학적 활성 분자 (24)의 유효 농도를 결정한다.

geNOps 기술 (부) 세포의 NO • 변동 (1)의 직접 검출을 허용하고 재조사하는 것이 적합하고, 새로운 세포의 NO • 신호의 축적 및 분해를 담당하는 메커니즘을 발견한다. 여기, 우리는 개별 세포의 수준에, 간단한 프로토콜과 외생 적 유발 시각화 geNOps의 사용에 대한 대표적인 결과와 내생 적으로 생성 된 NO • 프로파일을 제공합니다. 또한, geNOps 기술은 AP에 대해 적용 할 수있다다른 세포 모델 시스템의 습곡은 다양한 세포 자극과 스트레스에 반응하여 NO • 형성, 확산, 열화의 복잡한 패턴을 연구합니다.

Protocol

화학 버퍼 및 솔루션 1. 준비

  1. 135 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 2 mM의 CaCl2를, 1 ㎜의 MgCl 2, 10 mM의 HEPES, 2.6 mM의 NaHCO3을 0.44 mM의 KH 2 PO 4, 0.34 mM의 나 2 HPO 4, 10 mM의 D-을 함유하는 저장 완충액을 준비 글루코스, 2 mM L- 글루타민, 1X MEM 비타민, 1X MEM 아미노산, 1 % 펜 연쇄상 및 1 %의 암포 테리 신 B를 증류수에 모든 성분을 용해시키고, 실온에서 자기 교반기를 사용하여 20 분 동안 버퍼 교반한다. 1 M의 NaOH를 사용하여 7.44로 pH를 조정합니다. NaOH를 적가 한 후, 연속적으로 교반하면서, pH 미터를 이용하여 pH를 측정한다.
  2. 140 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 D-포도당, 10 mM의 HEPES 구성 생리적 칼슘 함유 버퍼를 준비합니다. 단계 1.1에 설명 된대로의 NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다.
  3. 동일한 성분으로 구성되어 칼슘 - 무료 버퍼를 준비로 단계 1.2에 나열된. 1 mM의 EGTA 대신 2 밀리미터를 사용합니다.
  4. 1 mM의 스톡 용액을 얻었다 DMSO에서의 Fura-오전 2시 가용화. 최대 1 개월 -20 ° C에서 주식 밀봉 유리 병에서 솔루션 및 저장소를 나누어지는. 고정 된 경우, 스톡 용액을 빛으로부터 보호 적어도 실온에서 1 시간 동안 평형을 허용한다. 3.3 μM의 최종 농도를 수득 한 용액 저장 버퍼 (단계 1.1)으로의 Fura-오전 2시 원액을 희석.
  5. 증류수 100 mM의 히스타민 스톡 용액 1 ㎖ (PH 7.0)을 준비한다. 100 μM 히스타민의 최종 농도로 생리 버퍼를 함유 100ml의 칼슘의 100 mM의 히스타민 원액을 희석.
  6. 300 μM의 최종 농도를 얻기 위해 칼슘 함유 생리 완충액 100㎖ 중에 Nω 니트로 - L- 아르기닌 (L-NNA)을 용해. L 자 NNA가 완전히 용해 될 때까지 적어도 1 시간 동안 37 ℃의 수욕에서 용액을 저장한다.
  7. 10 mg의 가용화 NOC-7 증류 워싱턴에서터 (PH 7.0), 10 mM 스톡 용액을 얻었다. 단단히 밀봉 유리 병에서 작은 분량 씩의 주식 솔루션을 나누어지는 및 -70 ° C에서 바로 저장합니다. 10 μM의 NOC-7의 최종 농도를 얻기 위해 생리 버퍼의 NOC -7- 원액을 희석.
    참고 : NOC-7 자발적으로 짧은 반감기와 NO를 방출하는 작은 화합물이다. 항상 직전에 각 실험에 NOC-7으로 구성 작업 버퍼를 준비합니다.
  8. 생리 칼슘 버퍼에 1 mM의 나트륨 니트 로프 루시드 (SNP) 솔루션을 확인하고 10 μm의 희석을 준비합니다.
    참고 : 항상 적은 양 때문에 빠른 분해 속도의 NO-기증자 솔루션 (~ 10 ㎖) 준비합니다.
  9. HPO 4 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 9.2 mM의 나 2로 구성된 인산염 완충 용액 (PBS), 1.5 mM의 KH 2 PO 4를 준비합니다. 수산화 나트륨 / HCl을 7.44로 pH 값을 조정합니다.

2. 셀 준비

주 : 오에RDER는 세포가 철의 Fe 2+를 복원하기 위해 이미징 실험 전에 버퍼를 포함하는 (II) / 비타민 C와 미리 배양해야 geNOps를 사용하여 단일 세포에서 일산화 질소 (• NO)를 측정 한 성능에 균일 성을 달성 아니오 • -probes의 NO • - 결합 도메인 내에서. EA.hy926 및 HEK293 세포의 경우에는, 철 (II), 부스터 용액을 20 분 동안 인큐베이션은 NO • 센서의 전체 활성화에 이르게.

  1. 6 잘 판의 우물에 30 mm 현미경 커버 유리에 다음 날 5.5 × 10 5 EA.hy926 또는 HEK293 세포 또는 다음날 다음날 3.5 × 10 5 세포를, 시드. 5 % CO 2로 습한 환경에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
    참고 : 포유 동물 세포 및 바이러스 건축 아데노 바이러스 감염에 관한 자세한 내용은 장 등의 알에 의해 설명되었다. 25. 이 단계는 안정적으로 G-geNOp을 발현하는 HEK 293 세포에 대한 적용되지 않습니다.
  2. 소 태아 혈청 (FCS) 및 항생제가없는 둘 베코 이글 변형 배지 (DMEM)를 가지고 G-geNOp (MOI 대한 코딩하는 유전자를 운반하는 아데노 - 연관 바이러스 타입 5 (AAV5) 벡터를 추가 EA.hy926 세포 (500)는 거의 100 수득 % 양성 세포, MOI : 1 HEK293 세포에 대한 효율적이다).
    참고 : 아데노 관련 바이러스 벡터의 사용은 2. 바이오 안전성 수준이 밀폐 일반적으로 벡터 작업에 필요한 위험 그룹에 할당됩니다. 필요한 경우, 바이러스 감염과 같은 매체를 포함하는 FCS 수행 될 수있다. 대안 적으로, 세포는 일시적 지질 - 기반 담체 (1)을 사용하여 형질 감염 될 수있다.
  3. 배지를 제거하고 미리 예열 (37 ° C) PBS로 세포를 씻어. 1 시간 동안 각 웰에 DMEM / AAV5 매체의 1 ML을 추가합니다. 이 단계는 안정적으로 G-geNOp을 발현하는 HEK 293 세포에 대한 적용되지 않습니다.
  4. 10 % FCS의 최종 농도로 각 웰에 20 % FCS 함유 DMEM 1 ㎖를 추가한다. 세포에서 AAV5 함유 매체를 제거하지 마십시오. 신사LY는 우물에서 매체를 균질화 접시를 시소. 5 % CO 2로 습한 환경에서 37 ° C에서 48 시간 동안 세포를 인큐베이션. 이 단계는 안정적으로 G-geNOp을 발현하는 HEK 293 세포에 적용되지 않습니다.
  5. 48 시간 후, 미리 예열 PBS로 세포를 씻어. 그 후 빛 방사선으로부터 보호 적어도 1 시간 동안 방 RT에서 세포를 각 웰에 2 ㎖의 사전 예열 저장 버퍼 (섹션 1.1)을 추가하고 품어.
  6. 실온 / 웰 철 (II), 부스터 용액 1 ㎖ (RT)와 함께 저장 버퍼를 교체. 어둠 속에서 정확하게 20 분 동안 세포를 품어.
    참고 : 초과 또는이는 NO • 프로브의 응답에 영향을 미칠 수있는 최적의 배양 시간을 단축하지 마십시오.
  7. 저장 버퍼로 한번 세척하고 세포를 세포가 평형을 허용하기 위해 RT에서 적어도 2 시간 동안 2 ml의 저장 완충액으로 각 웰을 배양한다.
  8. 실온에서 45 분 동안 1 ml의 저장 버퍼 3.3 μM의 Fura-오전 2시 함께 저장 버퍼를 교체 보호빛에서.
  9. 세포는 평형 수 있도록하기 위해, 적어도 30 분 동안 다시 한번 저장 버퍼로 두 번 세포를 세척하고 배양한다.

개별 세포에서 NO • 및 칼슘 신호 3. 라이브 셀 이미징

  1. 금속 관류 챔버 (2.1 단계)에서 EAhy.926 또는 HEK293 세포로 코팅 된 30mm 커버 슬립을 수정하고 현미경에 놓습니다. 버퍼 저수지에 유입 관과 진공 펌프의 유출을 연결합니다. 일관된 흐름을 확인하고 커버 슬립의 배출하지 마십시오.
  2. 반자동 관류 시스템을 사용하여 (단계 1.2에서) 생리 칼슘 버퍼 중력 중심의 관류를 시작합니다.
    참고 : 이러한 시스템 버퍼 저수지, 각각의 튜브, 자기 전자 제어 밸브 및 진공 펌프 (그림 1B 참조)로 구성되어 있습니다. 유량은 관류 저수지의 높이에 따라 1 내지 3 ㎖ / 분 범위 일 수있다. 일치하는 지역 약물 어플리에 대한양이온 모두 사용 저수지의 유량은 대략 동일해야한다. 이 영상 실험을하기 전에 테스트해야합니다. 내피 세포는 엄격한 관류에 의해 유도 될 수 전단 응력 증가에 응답하는 것이 좋습니다.
  3. 이미징 시스템을 전환하고 30 분 동안 모든 장치의 워밍업 할 수 있습니다.
  4. 각각의 소프트웨어를 사용하여 이미지 설정을 정의합니다. 선택 여기 파장 340 nm에서의 Fura-2 이미징을위한 380 nm의 흥미 진진한 G-geNOp 480 nm의. 형광 표백 4 카메라 비닝을 높이고 여진 강도 및 노출 시간을 줄이고 최소화한다. 보기는 3.6-3.8 단계를 반복합니다.
    주 : 이미지 설정 및 파라미터를 사용하는 장치에 의존의 Fura-2 로딩 효율 및 G-geNOp 발현 수준.
  5. 몇몇 형광 세포까지 현미경의 XYZ 테이블을 이동하여 촬상 영역을 선택 포커스에있다. 그런 다음 각각의 소프트웨어 툴을 통해 관심 (로아)의 영역을 정의합니다. 여러 전체 자장하게를 취재 영역을 그립니다수동으로 이미지 필드 당 전자 형광 세포. 또한, 비슷한 크기의 배경 영역을 정의합니다.
    주 : 화상 취득의 ROI는 각각 영상 분석 소프트웨어를 이용하여 추가 분석을 위해 이미징 공정 후에 새롭게 정의 될 수 저장된 후 (원료 목록 참조).
  6. 전동 시료 스테이지와 반전 고급 형광 현미경 및 단색 광원에 대한 데이터 수집을 시작. 다른 방법으로 각각 G-geNOp 340 nm에서의 Fura-오전 2시 380 내지 480 nm에서 흥분. 모든 채널에 대한 명확한 형광 신호가 시간이 지남에 따라 검출 할 수 있도록 각각의 노광 시간을 설정한다. 또한 3.4 단계를 참조하십시오.
    주 :이 여기 광의 강도와 카메라 비닝에 의존한다. 예를 들어, 15 여기 광의 강도 %, 4 카메라 비닝, 340 내지 150 밀리 초, 380 밀리 내지 50, 480 내지 300 밀리 초를 사용한다. 또한 3.4 단계를 참조하십시오.
  7. 의 Fura-2 / AM 510 nm의, G-제노 520 nm에서 방출 된 빛을 수집500 나노 여진하는 495 nm의 이색 및 510-520 nm의 방출 원으로 이루어지는 적절한 필터 세트 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 피. 녹음 한 총 프레임 매 3 초마다.
  8. 시간이 지남에 따라 각각의 형광 신호의 기저선을 수득 생리 칼슘 완충액 (1.2)에서 (최대 3 분까지 필요한 경우) 제 분을 기록한다.
  9. 안정적인베이스 라인 형광이 관찰되면, 3 분 동안 세포를 자극하는 생리적 칼슘 버퍼를 포함하는 100 μM 히스타민 또는 ATP (1 μM, 100 μM)로 전환합니다.
    참고 : 효능에 응답 EA.hy926 세포와 G-geNOp 형광 신호의 명확한 감소 (340 380 nm에서 흥분 형광을 통해 분할 nm에서 여기 형광)에의 Fura-2 비율의 급격한 증가를 보여줍니다.
  10. 세포에서 화합물을 제거하기 위해 5 분 동안 히스타민 또는 ATP 및 L-NNA없이 다시 생리 칼슘 2 + 버퍼로 전환합니다. 이 단계는 fluores까지 연장 될 수 있습니다cence 변경 완전히 복구됩니다.
  11. 관류 시스템을 사용하여 2 분 동안 생리 칼슘 완충액에 10 μM의 NOC-7을 관리하다. 아니오 기증자 강하게 보통 10 μM의 NOC-7에 대한 응답으로> 20 % 감소 G-geNOp 형광에 영향을 미칩니다. EA.hy926 세포에서 NOC -7- 효과가 G-geNOp 형광 급랭 의한 작용제에 비해 약 3 배 더 강하다.
  12. 버퍼 한 번 기초 형광 복구 녹화를 중지 2+ 생리 칼슘과 약 10 분 동안 NO • 이형제 화합물을 세척 할 것.

4. 데이터 분석

  1. 내보내기 데이터 분석 소프트웨어로, 시간이 지남에 따라 단일 세포의 평균 형광 강도 데이터를 취득했다.
  2. 각각의 배경 값을 빼고 시간 동안 각각의 단일 셀의 각각의 Fura-2 신호 (380) 내지 340 나노 미터에서의 비율을 계산한다.
  3. 실제 FL을 획득하기 위해 G-geNOp 채널의 배경 값 빼기모든 계산 소프트웨어를 사용하여 시간에 따른 NO 프로브 (F)의 세기 uorescence.
  4. F 0 (F 0 자극없이 시간이 지남에 따라 NO 프로브의 형광이다)로베이스 라인 형광 값을 가져 가라. 또한 4.5도 1c 단계를 참조하십시오.
  5. 다음 식을 이용하여 형광 표백 효과에 대해 시간의 함수를 계산한다 : F = 0의 F inital • 특급 (-K • 시간) + F 고원. F의 inital : 촬상 한번 최대 형광 신호가 시작된다; K : 시간이 지남에 따라 형광 표백의 속도 상수; F 고원 : 시간이 지남에 따라 표백 도달 형광 최소; 도 참조 4.3-1 4.4도 1c 단계를 반복합니다.
    참고 : 근사를 들어, 이전에 세포 자극 후 시간이 지남에 모든 형광 값을 사용할 수 있습니다. 더 자세한 사항은 벤틀리 등의 알에 의해 지정됩니다. 27.
  6. 시간이 지남에 따라 G-geNOp 신호를 정상화, 계산 1-F / F0 (4.3-4.5 단계). 그림 1C 및 1D를 참조하십시오.

Representative Results

일시적으로 적용 NO 기증자에 대한 응답으로 단일 셀 NO • 정보의 시각화

우리는 안정적 개의 상이한 NO-해방 작은 화학 화합물에 응답하여 상기 단일 세포 수준에서 아니오 • 신호를 가시화되지하기 위해 G-geNOp (도 1A)를 나타내고 HEK 세포 클론 NOC-7 및 SNP를 사용했다. 노 • 도너 연속적으로 연속적인 흐름 (도 1b)를 확보 중력 기반 관류 시스템을 사용하여 이미지화하는 동안 적용되고 셀로부터 제거 하였다. 다른 강도와 G-geNOp을 표현하는 모든 세포는 NO • 기증자의 추가에 따라 세포 내에서 빠른 NO • 축적을 나타내는 NOC-7 및 SNP (그림 1C)에 응답하여 형광의 명확한 감소를 보였다. 정규화 된 형광 신호 (1-F / F 0) NO • 양쪽 기증자가 균일 cellula을 유발 시연NO R • 완전히 NO • 이형제 화합물 (그림 1D)의 세척에 복구 고도. 그러나, 10 μM의 SNP는 10 μM NOC-7 (18.10 ± 1.20 %, N = 38분의 3, P에 의해 도달 한 만 50 휴대 NO의 • 신호 % (9.63 ± 1.05 %, N = 38분의 3)을 유도 < 0.0001). NO 공여체 •, SNP의 1mm의 농도가 요구되었다 (도 1C, 1D) 모두 동일한 세포 NO • 수준을 달성하기 위해서.

다음으로, HEK 세포에서 세포 내 NO • 레벨을 상승 만료 NOC -7- 대 갓 제조의 용량을 시험 하였다. 이를 위해, 우리는 5 μM의 NOC-7을 포함하는 4 개의 실험 버퍼를 준비했다. 노 • 공여체 중 새로 측정 직전에 첨가하거나, 1 시간, 2 시간, 및 측정 전에 실온에서 3 시간 동안 저장소 내에 유지 하였다. 다른 버퍼는 연속적으로인가하고 F를 제거하고관류 시스템 (도 2B)를 이용하여 G-geNOp 발현 세포를 ROM. 이 방식은 예상대로했다 세포 NO • 레벨 (도 2A, 2C)를 상승시키는 시간이 지남에 따라 용량이 감소 수성 NOC -7- 용액의 안정성을 공개했다. 신선한 NOC-7 (그림 2C), 세포 성분의 손상 NO • -liberating하지 분자의 아마 표시 부착에 의해 유발 된 세포 내 NO • 응답에 비해 흥미롭게도, NO • 신호가 만료 된 버퍼의 제거에 훨씬 빠르게 회복 .

동시 칼슘의 시각화 및 NO • 단일 내피 세포의 신호

칼슘을 연구하기 위해 2 + 내피 세포에서 NO • 형성을 -triggered 없습니다, 일반적으로 사용되는 내피 세포의 무한 증식 세포 대리, EA.hy926 세포주, t이었다ransiently G-geNOp로 형질과의 Fura-2 / 오전로드 (프로토콜 2.8 참조). 형질 G-geNOp 양성 내피 세포의 약 10 %를 수득 하였다 (N = 6,도 3a) 칼슘을 기록하기에 충분한 단일 내피 세포의 수준에서 아니오 • 생산 -evoked 없다. 그러나, 우리는 아데노 - 관련 바이러스 벡터를 이용하여 약 100 %의 G-geNOp 긍정적 EA.hy926 세포를 달성 (N = 6; 프로토콜 2.2 참조). 채널 측정에 앞서, 세포는 L-NNA, 강력한 비가역 NOS 억제제 (26)로 이루어진 저장 버퍼에 실온에서 20 분 동안 배양 하였다. 대조군 세포는 L-NNA (프로토콜 1.1 참조) (도 3b)없이 동일한 저장 버퍼에 보관 하였다. 히스타민, 강력한 이노시톨 1,4,5-trisphosphate (IP 3) -generating 작용제, 즉시 상승 세포질 칼슘 작용제는 제거가 될 때까지 세포 내 NO •의 점진적 증가에 따라 2+ 수준이 대조군 세포의 치료D (그림 3C, 3D). 세포 내에서 NO • 레벨 히스타민에 대한 응답 (도 3E)에 거의 영향을받지 않고 남아있는 반면 NOS 저해제로 미리 처리 된 세포가 유사한 세포 내 칼슘 신호를 보여 주었다. G-geNOp을 표현 EA.hy926 세포는 1 μM로 처리 하였다 100 geNOps 낮은 생리 위에 생리에 모두 응답 NO • 신호를 모니터 없음 적합 여부를 테스트하기 위해 작용제 ATP를 -generating는 IP 3 μM 작용제 (그림 3 층)의 농도. 내피 세포주 1 μM의 ATP에서 약 100 μM의 ATP (그림 3 층)에 의해 얻어진 신호의 절반이었다 명확한 세포질 NO • 신호를 유발.

그림 1
그림 1 : 다른 NO-liberati에 응답하여 세포 내 NO 프로필 분자 ng를. HEK 세포 (A) 넓은 시야 이미지 안정적 세포질 G-geNOp 표현. 스케일 바는 20 μm의 =. (B) NOC-7 및 SNP의 제어 응용 프로그램과 제거를위한 중력을 기반으로 반 자동 관류 시스템의 개략도 그림입니다. (C) 대표 (아웃 3 독립적 실험) 비정규 단일 셀 형광 강도는 밀리미터 안정 10 μM로 NOC-7, 10 μM SNP 응답 세포질 G-geNOp를 발현하는 HEK 세포의 시간 대 임의 단위로 추적 및 1 SNP. 검은 색 굵은 곡선은 26 단일 셀 추적의 평균 곡선 (밝은 회색 곡선)를 나타낸다. 곳곳에 검은 곡선은 정상화에 사용 된 F 0 나타냅니다. (D) 표준화와 반전 한 흔적 (1-F / F 0, 밝은 회색 곡선), 10 μM NOC-7, 10 μM의 SNP, 1 mM의 SNP에 응답하여 시간이 지남에 곡선 (검은 색 굵은 곡선)에서 추출한 의미 패널 C.에스 / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 안정적으로 G-geNOp가 표현하는 HEK 세포를 이용 NOC-7의 안정성 테스트. 신선하고 오래 NOC -7- 완충액인가시 HEK 세포를 안정적으로 발현하는 G-GeNOps의 시간에 따른 (A) 주제 NO • 농도 반응 곡선. 모든 NOC -7- 함유 버퍼 동일한 원액 (50 mm)를 사용하여 5 μM의 최종 농도로 초기 제조 하였다. 나타낸 바와 같이, 1 시간, 2 시간, 3 시간에 촬상 양까지 제조 후의 각 용액의 경과 시간. (B) 연속 추가 및 이미징 동안 NOC-7 함유 한 용액을 제거하기 위해 중력을 기반으로 반 자동 관류 시스템의 개략도 그림입니다. (C)의 시간적 상관응답 세포 NO • 신호 갓 준비하고 오래 NOC-7 버퍼합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : NO • 및 칼슘 단일 EA.hy926 세포에서 2 + 신호의 동시 다중 채널 영상. (A)의 Fura-2 / AM (중간과 오른쪽 패널)와로드 G-geNOp (왼쪽 패널)을 표현 EAhy.926 세포의 대표 넓은 필드 형광 이미지. 스케일 바는 20 μm의 =. (B) 측정에 앞서 여섯 웰 플레이트 내에서 20 분 동안 500 μM Nω 니트로 - L- 아르기닌 (L-NNA)와 EAhy.926 세포 치료의 도식화. (C)의 Fura-2 (여기의 동시 기록의 대표적인 코스 시간 : 340 ㎚ / 380 nm의 emiss이온 : 510 ㎚) 및 G-geNOp 신호 (여자 : 480 nm의, 방출 : 520 ㎚) 100 μM 히스타민에 응답한다. 표시 히스타민 3 분 관류 시스템을 사용하여 후에 제거하고있다. (D) 곡선은 세포질 칼슘의 동시 녹음을 대표하는 2 + (은 Fura-2의 비율 신호, F 340 / F (380)은 회색 실선) 및 NO • 신호 (정규화와 반전 곡선, 1-F / F 0 녹색 실선입니다) 하나의 Fura-2 /의 시간이 지남에 따라 일시적으로 G-geNOp을 표현하는 내피 세포를로드하고 있습니다. 세포는 3 버퍼를 포함하는 칼슘 (2 mM의 염화칼슘 2)의 분 (N = 8/3) 100 μM 히스타민 자극했다. (E) 대표를 동시에 칼슘 2 + (회색 실선) 기록 NO • 500 μM Nω 니트로 L 아르기닌 (L-NNA)로 전처리 된 EA.hy926 셀의 시간에 (녹색 실선) 신호 이전 측정에 (N = 12/3). 세포를 2 mM의 존재하에 100 μM 히스타민 처리 하였다칼슘. (F) 100 μM의 ATP와 제 2 셀 자극 다음 1 μM의 ATP에 응답하여 세포질 NO • 신호를 나타내는 평균 곡선. 바 1 μM의 ATP (흰색 막대), 4 독립적 인 실험의 100 μM의 ATP (녹색 막대)에 대한 응답으로 최대 G-geNOp 신호의 SD ± 평균 값을 나타냅니다; P <0.001 대 1 μM의 ATP. P 값은 짝 t-test를 이용하여 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

28 생물학에서 중요한 신호 분자로서 NO •의 발견 이래, 하나의 세포, 조직 및 가능하고 신뢰성있는 방식으로 고해상도의 전체 동물 라디칼의 비 실시간 측정이 갈망되고있다. 여기에서 우리는 넓은 필드 형광 현미경 (1)을 사용하여 정확한 NO • 신호의 라이브 셀 이미징을 사용 최근에 개발 된 유전자 인코딩 된 형광 NO의 • 프로브 (geNOps)의 응용 프로그램을보고합니다.

정교하고 침략 형질 전환 절차를 안정적으로 외생 생성 된 단일 셀 NO • 프로필을 정량화하는 데 사용 된 녹색 형광 G-geNOp을 표현 HEK 세포 클론을 회피합니다. HEK 세포를 통상 NO • 내생 29 발생하지 않기 때문에, 이러한 세포 유형은 공동 배양 조건에서 다른 많은 애플리케이션에 유용 할 수도 geNOp 기반 센서 셀 라인의 발생에 적합NO로 • 기본 세포 또는 동물 (30) 생활에서의 생산. 그러나 본 연구에서 우리는 G-geNOp 발현하는 HEK 세포 모델을 사용하여 세포 내 NO • 신호를 연상 상이한 농도 안정성 및 다양한 아니오 • -liberating없는 화합물의 능력을 입증. 우리의 데이터는 응용 프로그램의 NO • -donor 농도, 품질 및 방법은 결국 세포 내 NO • 프로필의 패턴을 결정하는 것으로 나타났습니다. 이러한 정보는 여러 가지 질병을 나타내는 서로 다른 NO • 기증자의 현장에서의 약동학 적 특성에 필수적이다. 특히, geNOps 안정적 매우 오랜 시간이 1 위에 NO • -donor 펄스의 여러 반복적 인 애플리케이션에 대응하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 명세서 화합물을 -liberating • NO를 사용하여 실험, 다양한 진폭과 각 세포의 NO의 반응 속도에 관한 반 정량적 인 결론 허용(226); 신호 (도 1 및도 2).

안정하게 발현하는 HEK 세포 클론 아마도 단일 세포에서 유래하지만, G-geNOps 발현 수준의 넓은 이질성 (도 1)을 관찰 하였다. 이것은 관심있는 (게놈 통합) 유전자의 전사는 세포 성장률 (32)에 영향을 미치는 다양한 환경 스트레스 31 많은 요소가 제어으로 안정한 세포 클론의 공통적 인 특징이며, 세포주기 상태 33. 단일 FP 기반 geNOps는 따라서, NO는 • geNOp 발현 수준 1 형광 강도 증가의 손실을 유도 된 비 비율 적 프로브이며. 따라서, geNOps 신호 정규화는 특히 비교 분석시 세포 NO • 신호들을 정량화 필수적이다. 우리의 최근 연구 엄격한 선형 상관 (B)에 도시 된 바와 같이etween geNOps의 기저 형광 강도와 형광 농도의 넓은 범위에 걸쳐 NO • 유도 된 형광 소광의 강도는 1 밝혀졌다. 이 휴대 NO • 신호의 절대 정량 geNOps의 중요한 기능입니다. NOC-7에 대한 응답으로 그림 1의 G-geNOps 신호의 정상화에 도시 SNP는 HEK 세포를 차지하기 위해 자신의 능력에 관해서 다양하지 않은 것을 나타내는, 같은 판에서 다른 HEK 세포에서 균일 NO • 신호를 계시 그리고 NO • 기증자에서 유래 라디칼 NO • 저하. 반면, HeLa 세포에 사용 geNOps는 NOC-7에 대한 응답으로 다른 세포 중 세포 NO • 신호의 명확한 이질성을 보여 주었다. 이러한 차이는 세포의 생리와 병리에 여러 영향을 미칠 수 및 geNOp를 사용하여 발견 될 수있는 세포 유형 별 NO • 대사와 분해 속도를 가리의 기술.

그럼에도 불구하고, geNOps의 두 가지 중요한 기능은 센서와 데이터 해석의 올바른 사용을 위해 신중하게 고려되어야한다 : ⅰ) geNOps 적절한 철분을 필요로 (II) 완전히 NO • 1에 대응하고 ⅱ) FP 변형에 따라 geNOps는 수 1 민감한 pH를합니다. 여기에서 우리는 HEK, 헬라 또는 EA.hy926 세포 (프로토콜 2.6 참조) 중 하나에 표현된다 geNOps의 독성 철 (II) 보충에 적합한 것으로 밝혀졌다 프로토콜을 설명합니다. 이 철 세포 치료 (II) / 비타민 C는 세포 형태학, 세포 생존 및 셀 (1)의 대사 활동에 영향을 미치지 않았 음을 입증 하였지만, 다른 종류의 세포 및 조직이 중요한 단계를 최적화하는 것이 필수적 일 수도있다. 그러나, 일부 실험 조건에서, 철 (II)의로드 요구 geNOps의 적용을 제한 할 수있다. 특히, 이는 아스코르브가 N을 감소시킬 수 있음을 보여왔다O • 35 아스코르브 산염 철 (II) 단지는 37, 36 • NO 폐품을 할 수 있습니다. 또한, 과량의 철 (II) 및 아스코르브은 염증 반응 (39)와 커플 해제 된 eNOS (41)을 유도 할 수있다. 이러한 효과는 geNOps 기술을 사용할 때 고려되어야한다. 이는 특정 실험 조건 하에서 세포 내 pH를이 geNOps 형광 한 영향을 미칠 가능성이있는 34 크게 영향 것으로 나타났다. 특히, 시안과 녹색 geNOps 변형 산성화 1시 형광의 감소를 나타내는 민감한 상대적으로 pH가 있습니다. 산도 민감한 geNOps를 사용하는 경우 따라서, (부) 세포의 pH의 급성 변화는 거짓 NO의 • 신호를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 음 contro 우리의 이전 작업, NO • 문자를 구분 geNOps의 병렬 사용 (geNOps의 MUT)에 제안LS는 pH가 1 변경에서 실제 휴대 NO • 신호를 해부하는 것이 좋습니다. 또한 세포의 pH 변화는 이러한 SypHer 34의 pH 프로브를 사용하여 검사 될 수있다.

또한, 우리는 내피 세포 대리 EA.hy926의 생리적 칼슘 -mobilizing 작용제에 대한 응답으로 내생 효소 NO • 형성을 시각화. EA.hy926 세포주는 지속적으로 38에서 eNOS 발현 자주 사용하는 모델 시스템이다. 일시적 EA.hy926 세포에서 발현 geNOps 사용하면, IP 3 칼슘 신호는 거의 L-NNA 의해 차단이 셀 타입에 깊은 NO • 형성 연상 - 매개 함을 확인 하였다. 시간적 NO • 신호와 칼슘 2를 상관하기 위해 G-geNOp 발현 세포는 UV-흥분성 화학 칼슘 지시등에의 Fura-2 / AM과 함께 로딩 하였다. 칼슘의 스펙트럼 분리 2+ 바운드 및 언 바운드은 Fura-2 FLUO G-geNOp rescence 신호로부터 쉽게 상업적으로 이용 가능한 필터 (40)를 세트로 얻을 수있다. 이미징 프로브 모두 칼슘 -triggered 효소 NO • 형성이 내피 세포 유형에서 세포 내 칼슘 증가에 비해 훨씬 느리다 발생 선보였다. 는 IP 3 -generating 작용제 브라 디 키닌과 세포 치료시 소 폐동맥에서 내피 세포의 단일 셀 NO • 신호의 유사 반응 속도뿐만 아니라 전단 응력을 사용하여보고 된 NOA-1, 간접 높은 NO • 민감한 센서 (12) . 따라서, 이들 데이터는 CA가 2+ 완전한 효소 활성에 도달 할 때까지 eNOS에 유래 NO • 형성이 소정의 개시 시간을 필요 -evoked 것을 강조한다. 셀룰러 NO • 형성, 확산 및 분해 반응 속도가 다른 데이터로부터 추출 될 수 있지만, NO •의 예 장력 계 측정은 혈관 이완 - 유도SS = "외부 참조"> (26), 형광 NO의 • 프로브의 가장 큰 장점은 그들이 직접 실시간으로 볼 수 신호로 휴대 NO • 변동을 변환하는 것입니다. 따라서, geNOps와 영상 휴대 NO의 • 신호는 높은 공간 및 시간 해상도를 제공하며, (부) 휴대 NO • 항상성을 조사하고 (재)에 고유 한 가능성을 제공합니다. 예를 들어, 영상 eNOS의 단일 내피 세포의 geNOps 기술과 함께 (42)를 왕복하는 효소 또는 칼 모듈 린과 카베 올린 (43)와 같은 다른 관련 단백질 -producing 아니오 •의 세포 내 현지화 및 전위와 NO • 형성의 상관 관계 없음 적합 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 HEK 및 EA.hy926 세포가 기존의 넓은 필드 형광 m의 단일 세포 수준에서 실시간으로 생성 세포의 NO • 신호를 외생를 시각화하고 내생에 표현 G-geNOp의 실용적인 응용 프로그램을 설명icroscope. 우리의 데이터는 geNOps 특별히 흥미로운 세포 유형의 모든 종류를 사용하여 다양한 실험 조건 (하위) 셀룰러 NO • 역학을 추적하기에 적합한 것을 의미한다.

Disclosures

EE, MW, RM 및 WFG, 그라츠의 의과 대학의 직원이 원고의 연구의 일부를 설명 영국 특허 출원 (특허 출원 번호 WO2015EP74877 20151027, 우선 순위 번호 GB20140019073 20141027)를 제출했다. 이 특허에 관한 라이센스는 차세대 형광 이미징 (NGFI) GmbH의 (에 제공된다 http://www.ngfi.eu/ ), 그라츠의 의과 대학의 스핀 오프 회사입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30 mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. 40X objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome

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