Abstract
Оксид азота (NO •) представляет собой небольшой остаток, который опосредует множество важных клеточных функций в организме млекопитающих, бактерий и растений. Несмотря на существование большого количества методов для обнаружения NO • в естественных условиях и в пробирке, мониторинг в режиме реального времени Нет • на уровне одной клетки является весьма сложной задачей. Физиологические или патологические эффекты NO • определяются фактической концентрации и времени выдержки этого радикала. Соответственно, методы, позволяющие выявлять одной ячейки NO • очень желательны. В последнее время мы расширили палитру NO • Индикаторы путем введения одного флуоресцентного белка на основе генетически кодируемых оксида азота (NO) • зонды (geNOps), которые непосредственно реагировать на колебания клеточных NO • и, следовательно, решает эту потребность. Здесь показано использование geNOps для оценки внутриклеточных NO • сигналы в ответ на два различных химических NO • -liberating молекул. Наши результаты ALSO Убедитесь, что свежеприготовленный 3- (2-гидрокси-1-метил-2-nitrosohydrazino) -N-метил-1-пропиламин (ННК-7) имеет гораздо более высокий потенциал, чтобы пробуждать изменение внутриклеточных НЕТ • уровней по сравнению с неорганические NO • нитропруссид донор натрия (SNP). Кроме того, двухцветные изображения живых клеток с использованием зеленых geNOps (G-GENOP) и индикатор химической Са 2+ Fura-2 проводили для визуализации жесткое регулирование Са 2+ -зависимая NO • образование в отдельных эндотелиальных клеток. Эти представительные эксперименты показывают, что geNOps являются подходящими инструментами для расследования генерации в режиме реального времени и деградации одноклеточных NO • сигналы в различных экспериментальных установках.
Introduction
Недавно мы разработали новый класс генетически кодируемых флуоресцентных зондов NO •, называют geNOps 1. Эти датчики состоят из просто построены, бактерии-производного, NO • 2 - связывающий домен, который конъюгирован с отчетливым флуоресцентного белка (ФП) вариант 3 (голубой, зеленый или оранжевый FP). НЕТ • привязка к центру 4 негемового железа (II) в пределах geNOps мгновенно уменьшает интенсивность флуоресценции 1. Важно отметить, что geNOps флуоресценция быстро и полностью восстанавливается при внутриклеточных NO • Уровни 1 снижаться. Соответственно, geNOps позволяют в режиме реального времени обработки изображений (суб) клеточных колебаний NO •. Хотя НЕТ • чувствительный механизм geNOps остаются неясными до сих пор, они оказались превосходными NO • репортеры, и, таким образом, имеют потенции, чтобы открыть новую эру полихроматическом, количественного NO • bioimaginг с высоким пространственным и временным разрешением 1, 5. Другие доступные флуоресцентные зонды НЕТ • не основаны на небольших химических соединений, которые должны быть загружены в клетки, и необратимо измененных NO • 6. Дополнительные недостатки НЕТ • чувствительных малых флуорофоров являются их потенциал цитотоксичность и относительно низкая специфичность , которые затрудняют их использовать в надежной, аналитической и убедительным образом 7, 8, 9. Хотя эффективное использование генетически кодируемых флуоресцентных зондов требует эффективных методов переноса генов, FP на основе генетически кодируемые сенсоры появились как незаменимые инструменты , которые произвели революцию в наше понимание внутреннего функционирования клеток 10, 11. До разработки отдельных geNOps FP основе, A Förster резонансной передачи энергии (FRET) не -На NO • датчик, называемый NOA-1 12, был построен. Сато и др. проектировали этот сложный зонд , который состоит из двух субъединиц NO • растворимой , чувствительными к гуанилатциклазы (SGC), оба сопряженными с FRET на основе датчиков отчетности циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) 12 уровней. Поскольку этот датчик реагирует на цГМФ, она лишь косвенно воспринимает внутриклеточных NO • колебания 12. Хотя NOA-1 реагирует на NO • возвышенностей в нано-молярная диапазоне, этот инструмент не часто используется до сих пор, вероятно, из-за ограничений в отношении доступности и практичности этого громоздкого двудольного датчика.
Универсальные функции NO •, что воздействие фундаментальные биологические процессы были хорошо охарактеризованы 13, 14. Многие исследования показали, что NO • concentratioп внутри клеток и субдоменов определяет судьбу клеток в области здравоохранения и болезней , 14, 15, 16. В млекопитающим, НЕТ • в основном генерируется ферментативно в различных типах клеток с помощью семейства 17 хорошо изученным синтазы окиси азота (NOS). До сих пор, три изоформы NOS были описаны 18, 19, 20; они являются Ca 2+ / кальмодулин-зависимой эндотелиальной NOS (Енос или NOS-3) 18 и нейронный NOS (ННО или NOS-1) 19, и Ca 2+ / кальмодулин-независимый конститутивно активный , индуцируемый NOS (иОАС или NOS- 2) 20. Кроме того, существование митохондриальной NOS (mtNOS) также было предложено 21. Тем не менее, mtNOS рассматривается как сплайс вариант нОАС, и поэтому отдельно не классифицирован как изоформы 21. Другой изоформ, за исключением тех , в клетках млекопитающих, является так называемый бактериальный БДУ (bNOS), главным образом, в грам-положительных бактерий 22. Ферментативная производство NO • сильно контролируется и зависит от наличия нескольких кофакторов , таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), флавинадениндинуклеотид (ФАД), тетрагидробиоптерин (BH4), молекулярный кислород и L-аргинин 17. Катионный аминокислота L-аргинин является субстратом , который преобразуется в L-цитруллин на NO • производство 17. В дополнение к высокой регулируемой ферментативной генерации NO •, было постулировано , что радикал может быть уменьшена неферментативно из нитрита бассейнов в митохондриях в условиях гипоксических 23. После того, как НЕТ • продуцируется внутри клетки, он может свободно диффундировать через биомембран 14,исх "> 15. Тем не менее, очень короткий период полураспада этого радикала в основном определяется условиями окружающей среды, а также различные пути и химические реакции , эффективно деградировать NO • Уровни 24. В конце концов, образование, диффузия и деградация NO • зависит по различным экологическим параметрам , которые определяют эффективную концентрацию высоко биологически активной молекулы 24.
Технология geNOps обеспечивает прямое обнаружение (суб) сотовой связи NO • Колебание 1 и поэтому подходит повторно рассмотреть , и вновь открыть для себя механизмы , ответственные за раскачки и разложения клеточных NO • сигналов. Здесь мы приводим простые протоколы и репрезентативные результаты для использования geNOps визуализации экзогенно и эндогенно вызванных сгенерированные NO • профили, на уровне отдельных клеток. Кроме того, технология geNOps может быть адаптирована для арпликация в других модельных системах клеток для изучения сложных моделей образования NO •, диффузии и деградации в ответ на различные клеточные раздражений и стрессов.
Protocol
1. Получение химических Буферы и растворы
- Подготовка буфера для хранения , содержащего 135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 2,6 мМ NaHCO 3, 0,44 мМ KH 2 PO 4, 0,34 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ D- глюкоза, 2 мМ L-глутамина, 1x MEM витамины, 1x MEM аминокислоты, 1% перо Strep и 1% амфотерицин В. Растворить все компоненты в дистиллированной воде и размешать буфере в течение 20 мин с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. Доводят рН до 7,44 с помощью 1 М NaOH. После добавления по каплям раствора NaOH, измерения рН с помощью рН-метра при непрерывном перемешивании.
- Приготовьте физиологический Ca 2+ -содержащие буфер , который состоит из 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 10 мМ D-глюкозы и 10 мМ HEPES. Доводят рН до 7,4 с помощью NaOH, как описано на стадии 1.1.
- Приготовьте Ca 2+ -free буфер , который состоит из одних и тех же ингредиентовкак указано в пункте 1.2. Используйте 1 мМ EGTA вместо 2 мм.
- Солюбилизации фура-2АМ в ДМСО для получения 1 мМ маточного раствора. Алиготе маточного раствора в плотно закрытых флаконах и хранить при температуре -20 ° С в течение до одного месяца. Если заморожен, позволяют маточный раствор уравновешивают при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч, защищенном от света месте. Разбавляют исходный раствор Fura-2AM в 1 мл буфера для хранения (этап 1.1), чтобы получить конечную концентрацию 3,3 мкМ.
- Подготовка 1 мл 100 мМ гистамина исходного раствора в дистиллированной воде (рН 7,0). Разбавляют 100 мМ гистамина маточного раствора в 100 мл Ca 2+ -содержащий физиологическом буфере до конечной концентрации 100 мкМ гистамина.
- Солюбилизации Nω-Нитро-L-аргинин (L-NNA) в 100 мл физиологического буфера содержащего кальций, чтобы получить конечную концентрацию 300 мкМ. Хранить решения на C водяной бане 37 ° в течение по крайней мере 1 ч до тех пор, L-NNA полностью не растворится.
- Солюбилизации 10 мг NOC-7 в дистиллированной ватер (рН 7,0) для получения 10 мМ маточного раствора. Алиготе маточного раствора в виде небольших аликвот в плотно закрытых флаконах и хранить непосредственно при -70 ° С. Развести маточного раствора ННК-7 в физиологическом буфере, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкМ NOC-7.
Примечание: NOC-7 представляет собой небольшое химическое соединение, которое спонтанно высвобождает NO с коротким периодом полураспада. Всегда подготовить рабочие буферы, которые NOC состоит-7 непосредственно перед каждым экспериментом. - Сделать раствор 1 мМ нитропруссид натрия (SNP) в физиологическом буфере кальция и готовят 10 мкМ разбавление а.
Примечание: Всегда готовьте небольшое количество (~ 10 мл) NO-доноров решений из-за быстрой скорости деградации. - Приготовьте фосфатного буферного раствора (PBS) , состоящий из 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 9,2 мМ Na 2 HPO 4 и 1,5 мМ KH 2 PO 4. Отрегулируйте значение рН до 7,44 с помощью NaOH / HCl.
2. Подготовка сотового
Примечание: в оrder для достижения однородности при выполнении измерения оксида азота (NO) • в одиночных камерах с помощью geNOps, клетки должны быть предварительно инкубировали с железом (II) / витамин С , содержащий буфер перед экспериментами изображений с целью восстановления Fe 2+ в NO • -связывающим домена NO • -probes. В случае EA.hy926 и HEK293, инкубирование в течение 20 мин с раствором бустер железа (II) приводит к полной активации НЕТ • датчиков.
- Семенной 5,5 х 10 5 EA.hy926 или НЕК293 на следующий день или 3,5 х 10 5 клеток на следующий день после следующего дня, на 30-мм покровных стекол микроскопа в лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной среде с 5% CO 2.
Примечание: Подробная информация о аденовирусной инфекции клеток млекопитающих и конструкции вируса было описано Zhang и др. 25. Этот шаг не применяется для клеток НЕК 293, стабильно экспрессирующих G-GENOP. - Возьмем фетальной телячьей сыворотки (FCS) и антибиотиков свободный Eagle модифицированной среде Дульбекко (DMEM), и добавить адено- ассоциированный тип Вирус 5 (AAV5) вектор, несущий ген, кодирующий G-GENOP (MOI: 500 для клеток EA.hy926 дают почти 100 % положительных клеток; MOI: 1 эффективен для клеток НЕК293).
Примечание: Использование аденосателлитные вирусных векторов отнесен к группе риска 2. Уровень биологической безопасности 2 защитной оболочки, как правило, требуется для работы с этим вектором. При необходимости, вирусные инфекции также могут быть выполнены в FCS, содержащие среду. В качестве альтернативы, клетки могут быть трансфицированы с использованием липидной основе несущих 1. - Удалить культуральной среды и промыть клетки с предварительно нагретом (37 ° С) PBS. Добавить 1 мл DMEM / AAV5 среды на каждую лунку в течение 1 часа. Этот шаг не применяется для клеток НЕК 293, стабильно экспрессирующих G-GENOP.
- Добавить 1 мл 20% FCS, содержащей DMEM на каждой лунке до конечной концентрации 10% FCS. Не удаляйте AAV5-содержащий носитель из клеток. джентльменLY качели пластины для гомогенизации среды в лунках. Инкубируйте клетки в течение 48 ч при 37 ° C в увлажненной среде с 5% CO 2. Этот шаг не относится к клеткам НЕК 293, стабильно экспрессирующих G-GENOP.
- Через 48 ч промыть клетки с подогретого PBS. Затем добавляют 2 мл подогретого буфера для хранения (раздел 1.1) в каждую лунку и инкубировать клетки при комнатной комнатной температуре в течение не менее 1 ч, защищенном от светового излучения.
- Замените буфер хранения 1 мл / лунку железа (II) раствором бустера при комнатной температуре (RT). Инкубируйте клетки в течение ровно 20 мин в темноте.
Примечание: Не следует превышать или уменьшить оптимальное время инкубации, так как это может повлиять на отзывчивость NO • зондами. - Промыть клетки один раз буфером для хранения и инкубировать каждую лунку с 2 мл буфера для хранения в течение по меньшей мере 2 ч при комнатной температуре, с тем чтобы позволить клеткам уравновешиваться.
- Заменить буфер хранения с 3,3 мкМ фура-2 утра в буфере для хранения 1 мл в течение 45 мин при комнатной температуре, защищеныот воздействия света.
- Промыть клетки два раза буфером для хранения и инкубировать, еще раз в течение не менее 30 мин, чтобы позволить клеткам уравновешивания.
3. Живая ячейки изображения НЕТ • и Ca 2+ сигналов в отдельных клетках
- Закрепите крышку 30 мм скольжения, покрытую EAhy.926 или HEK293 клетки (со стадии 2.1) в металлической перфузионной камере и поместите его на микроскоп. Подключите наплывом трубку к буферу водохранилищах и оттоку с вакуумным насосом. Обеспечить непрерывный поток и избежать осушение покровным.
- Начало тяжести управляемой перфузию физиологическим буфером кальция (со стадии 1.2), используя полуавтоматическую систему перфузии.
Примечание: Такая система состоит из буферных резервуаров, соответствующей трубки, магнитные клапаны, которые с электронным управлением и вакуумным насосом (смотри рисунок 1В). Скорость потока может находиться в диапазоне от 1 до 3 мл / мин, в зависимости от высоты перфузионных резервуаров. Для получения стабильных местных приме наркотиковКатион, скорость потока всех используемых резервуаров должны быть приблизительно равными. Это должно быть проверено перед экспериментами с изображениями. Учтите, что эндотелиальные клетки отвечают возросшим касательное напряжение, которое может быть вызвано строгой перфузией. - Включите системы формирования изображения и позволяет разогреть всех устройств в течение 30 мин.
- Определение параметров изображения с использованием соответствующего программного обеспечения. Выбор длины волны возбуждения 340 нм и 380 нм для фура-2 изображения и 480 нм для возбуждения G-GENOP. Для того, чтобы свести к минимуму флуоресценции отбеливания увеличить биннинга камеры 4 и уменьшения интенсивности возбуждения и времени экспозиции. Смотрите также шаги 3.6-3.8.
Примечание: настройки и параметры визуализации зависят от используемых устройств, фура-2 эффективность погрузки и уровни экспрессии G-GENOP. - Выберите область изображения, перемещая АБВ стол микроскопа до нескольких флуоресцирующих клеток находятся в фокусе. Затем определите области интереса (трансформирования) с помощью соответствующего программного средства. Draw регионах, охватывающих несколько весь оде флуоресцентные клетки в области формирования изображения вручную. Кроме того, определяют область фона аналогичного размера.
Примечание: После того, как изображения были получены и сохранены трансформирования также могут быть определены заново после процесса формирования изображения для дальнейшего анализа с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см список материалов). - Начать сбор данных на перевернутом и передовой флуоресцентный микроскоп с моторизованным стадии образца, а также монохроматического источника света. В качестве альтернативы возбуждают при 340 нм и 380 нм для Фура-2АМ и 480 нм для G-GENOP соответственно. Установить соответствующие моменты времени экспозиции, так что для всех каналов, четкий сигнал флуоресценции можно обнаружить в течение долгого времени. Смотрите также шаг 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это зависит от интенсивности возбуждающего света и биннинга камеры. Например, можно использовать 15% интенсивности возбуждающего света, камера биннинга от 4 до 150 мс для 340 нм, 50 мс для 380 нм и 300 мс для 480 нм. Смотрите также шаг 3.4. - Соберите испускаемого света при длине волны 510 нм для фура-2 / ч, 520 нм для G-Генор используя прибор с зарядовой связью (CCD) камера с соответствующим набором фильтров, состоящей из 500 нм возбудителем, в 495 нм дихроичных и 510-520 нм эмиттера. Запись один общий фрейм каждые 3 секунды.
- Запись первых минут (при необходимости до 3 мин) в физиологическом буфере Ca 2+ (1.2) , чтобы получить базовый уровень соответствующих сигналов флуоресценции в течение долгого времени.
- После того, как стабильный базовый уровень флуоресценции наблюдается, перейти на 100 мкМ гистамина или АТФ (1 мкМ или 100 мкМ) , содержащей физиологический Ca 2+ буфера стимулируют клетки в течение 3 мин.
Примечание: EA.hy926 клетки, которые реагируют на агонисты показывают резкое увеличение соотношения фура-2 (при возбуждении флуоресценции при длине волны 340 нм, деленная через флуоресценции возбужденной при 380 нм) и явное уменьшение сигнала флуоресценции G-GENOP. - Вернитесь в физиологическом буфере Ca 2+ без гистамина или АТФ и L-NNA в течение 5 мин для удаления соединений из клеток. Этот шаг не может быть продлен до fluoresИзменения минесценцию восстанавливаются полностью.
- Администрировать 10 мкМ NOC-7 в физиологическом буфере Ca 2+ в течение 2 мин с использованием системы перфузионного. Донор NO сильно влияет на G-GENOP флуоресценции, которые, как правило, уменьшается на> 20% в ответ на 10 мкМ NOC-7. В клетках EA.hy926 эффект ННК-7 примерно в 3 раза сильнее по сравнению с агонистом индуцированной G-GENOP флуоресценция закалочной.
- Промойте NO • -releasing соединение в течение примерно 10 мин с физиологической Ca 2+ буфера и остановить запись , как только базальной флуоресценции восстанавливается.
Анализ 4. Данные
- Экспорт приобрела средней интенсивности флуоресценции данных отдельных клеток в течение долгого времени, чтобы программное обеспечение для анализа данных.
- Вычитание соответствующих фоновых значений и вычислить отношение 340 нм при 380 нм, соответствующих фура-2 сигналов каждой отдельной ячейки с течением времени.
- Вычтите фоновые значения канала G-GENOP, чтобы получить фактическую флuorescence интенсивности NO зонда (F) в течение долгого времени с помощью программного обеспечения расчета.
- Возьмите исходные значения флуоресценции в качестве F 0 (F 0 флуоресценции зонда NO в течение долгого времени без стимуляции). Смотрите также шаг 4.5 и Рисунок 1C.
- Вычислить функцию с течением времени для эффектов флуоресценции отбеливания , используя следующее уравнение: F 0 = F • Начальное ехр (-К • Время) + F плато. F Начальное: максимальная сигнал флуоресценции когда - визуализации запускается; K: константа скорости обесцвечивания флуоресценции с течением времени; F плато: флуоресценция минимальное достигается при отбеливании с течением времени; Смотрите также шаги 4.3- 4.4 и Рисунок 1C.
Примечание: Для приближения, все значения флуоресценции с течением времени до и после стимуляции клеток могут быть использованы. Более подробная информация указаны Bentley и др. 27. - Для нормализации сигнала G-GENOP с течением времени, вычислить 1-F / F0 (шаги 4.3-4.5). Смотрите рисунок 1C и 1D.
Representative Results
Визуализация одноклеточные NO • Профили в ответ на скоротечно Applied NO Доноры
Мы использовали клон клеток HEK , которая стабильно экспрессирует G-GENOP (рис 1А), для того , чтобы визуализировать НЕТ • сигналы на одноклеточной уровне в ответ на два различных NO-освободив малых химических соединений, NOC-7 и SNP. В NO • доноры последовательно применяются и удаляются из клеток во время формирования изображения с использованием силы тяжести на основе системы перфузии , что обеспечивается непрерывный поток (рис 1B). Все клетки , экспрессирующие G-GENOP с различной интенсивностью показали явное снижение флуоресценции в ответ на NOC-7 и SNP (рис 1C), что указывает на быстрое NO • накопление внутри клеток при добавлении к NO • доноров. Нормированные сигналы флуоресценции (1-F / F 0) показали , что оба NO • доноры вызывали однородную cellulaг NO • возвышений , что полностью выздоровел после вымывания из -releasing соединений NO • (Рисунок 1D). Тем не менее, 10 мкМ SNP индуцируется только 50% от сотовой связи NO • сигнала (9,63 ± 1,05%, N = 3/38), который был достигнут 10 мкМ NOC-7 (18,10 ± 1,20%, п = 3/38, р < 0,0001). Для достижения равных внутриклеточные уровни NO • как с NO • доноров, требовалась концентрация 1 мМ SNP (рис 1C, 1D).
Далее, мы протестировали способность свежеприготовленной по сравнению с истекшим NOC-7, чтобы поднять внутриклеточных NO • Уровни в НЕК клетках. С этой целью мы подготовили четыре экспериментальных буферов, содержащих 5 мкМ NOC-7. НЕТ • донора либо добавлены свежеприготовленные непосредственно перед измерением, или храниться в резервуарах в течение 1 ч, 2 ч и 3 ч при комнатной температуре перед измерением. Различные буферы были последовательно применены и удаляться пПЗУ клетки , экспрессирующие G-GENOP с помощью перфузионной системы (рис 2B). Такой подход обнародовал стабильность водных NOC-7 решений , которые, как и ожидалось, показал снизилась мощности в течение долгого времени , чтобы поднять внутриклеточные уровни NO • (Фигуры 2А, 2С). Интересно отметить , что НЕТ • сигналы значительно быстрее восстанавливается после удаления истекших буферов, по сравнению с внутриклеточным NO • ответ , что была вызвана свежей NOC-7 (рис 2С), возможно , указывающего слипание нетронутым НЕТ • -liberating молекул на клеточных компонентов ,
Одновременная визуализация Са 2+ и NO • Сигналы в одиночных эндотелиальных клеток
Для изучения Са 2+ не -triggered NO • образование в эндотелиальных клетках, обычно используется эндотелиальной увековечены клеток суррогатным, клеточная линия EA.hy926, была тransiently трансфицируют G-GENOP и нагружали фура-2 / ч (см протокол 2.8). Трансфекция дали примерно 10% G-GENOP положительных эндотелиальных клеток (п = 6, рис 3А), что достаточно для записи Ca 2+ не -evoked NO • производство на уровне отдельных эндотелиальных клеток. Тем не менее, мы достигли почти 100% G-GENOP клетки положительным EA.hy926 с использованием вирусного вектора аденоассоциированный (n = 6; см протокол 2.2). До многоканальных измерений, клетки инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в буфере для хранения , состоящий L-нна, мощный необратимый ингибитор NOS-26. Контрольные клетки содержали в том же буфере для хранения без L-NNA (см протокола 1.1) (рис 3б). Лечение контрольных клеток гистамина, мощный инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3) -generating агониста, мгновенно повышен цитозольного Ca 2+ уровня с последующим постепенным увеличением внутриклеточного NO • пока агонист не было удалитьD (рис 3C, 3D). Клетки , предварительно обработанные с NOS-ингибиторов показали аналогичные цитозольных сигналы Са 2+, в то время как внутриклеточный NO • уровень остается практически неизменным в ответ на гистамин (рис 3Е). EA.hy926 клетки , экспрессирующие G-GENOP также обрабатывали 1 мкМ и 100 мкМ IP 3 -generating агонистом АТФ для того , чтобы проверить , является ли или нет geNOps подходят для мониторинга за NO • сигналы в ответ на низких , так физиологические и супра-физиологические концентрации агониста (рис 3F). В эндотелиальных клеток линии 1 мкМ АТФ вызывало ясно цитозольного НЕТ • сигнал, который был приблизительно половина сигнала , полученного с помощью 100 мкМ АТФ (рис 3F).
Рисунок 1: Внутриклеточные профили NO в ответ на различные NO-Liberati нг молекул. (A) Широкое поле изображения клеток НЕК , стабильно экспрессирующих цитозольного G-GENOP. Шкала бар = 20 мкм. (Б) Схематическое изображение , основанного на полуавтоматическом перфузионной системы гравитации для контролируемого применения и снятия NOC-7 и SNP. (С) представитель (из 3 независимых экспериментов) ненормированной интенсивности одноклеточного флуоресценции прослеживает в произвольных единицах в зависимости от времени из клеток НЕК , стабильно экспрессирующих цитозольного G-GENOP в ответ на 10 мкМ NOC-7, 10 мкМ СНП и 1 мМ SNP. Black полужирный кривая представляет среднюю кривую 26 одноклеточных следов (светло-серые кривые). Пунктирные черная кривая представляет F 0, который был использован для нормализации. (D) нормировано и перевернутые одиночные следы (1-F / F 0, светло - серые кривые), и средней кривой (черная смелая кривая) с течением времени в ответ на 10 мкМ NOC-7, 10 мкМ SNP и 1 мМ SNP , извлеченные из панель C.эс / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Тест на стабильность ННК-7 с использованием стабильно G-GENOP , выражающие HEK клеток. (А) представитель NO • Кривая концентрации реакция с течением времени стабильно G-GeNOps , выражающих HEK клеток при применении свежих и старых NOC-7 буферных растворов. Все NOC-7, содержащие буферы были первоначально приготовленным с конечной концентрации 5 мкМ, используя один и тот же исходный раствор (50 мМ). Время истечения соответствующих растворов после приготовления до количеств изображений до 1 ч, 2 ч, 3 ч и, как не указано обратное. (Б) Схематическое изображение на основе полуавтомат системы перфузионного тяжести , чтобы последовательно добавлять и удалять NOC-7 , содержащий решения во время съемки. (C) Временные корреляциисотовой связи NO • сигналы в ответ на свежеприготовленную и старые NOC-7 буферов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Одновременная многоканальная визуализация NO • и Ca 2+ сигналов в одиночных клетках EA.hy926. (A) репрезентативные широким полем флуоресцентного изображения клеток EAhy.926 , экспрессирующих G-GENOP (левая панель), которые загружаются с фура-2 / AM (средней и правой панелей). Шкала бар = 20 мкм. (Б) Схематическое изображение обработки клеток EAhy.926 с 500 мкМ Nω-нитро-L-аргинина (L-ННА) в течение 20 мин в течение шести-луночного планшета перед измерением. (C) представитель Временной ход одновременной записи фура-2 (возбуждение: 340 нм / 380 нм Emissиона: 510 нм) и сигналы G-GENOP (возбуждение: 480 нм; эмиссионные: 520 нм) в ответ на 100 мкМ гистамина. Как указано гистамин удаляли через 3 мин с использованием перфузионной системы. (D) Кривые представляют собой одновременные записи цитозольного Ca 2+ (фура-2 Отношение сигнал, F 340 / F 380 серая сплошная линия) и NO • (нормированные и перевернутый кривая, 1-F / F 0 зеленая сплошная линия) сигналы с течением времени одного фура-2 / я загружен эндотелиальные клетки транзиторно экспрессирующих G-GENOP. Клетки стимулировали 100 мкМ гистамина в течение 3 мин в Са 2+ (2 мМ CaCl 2) , содержащей буфер (n = 8/3). (Е) представитель одновременно записывается Ca 2+ (серая сплошная линия) и NO • сигналы (зеленая сплошная линия) с течением времени из ячейки EA.hy926 , который предварительно обрабатывают с помощью 500 мкМ Nω-Нитро-L-аргинина (L-NNA) до для измерения (п = 12/3). Клетки обрабатывали 100 мкМ гистамина в присутствии 2 мМCa 2+. (F) , усредненные кривые , представляющие цитозольных Нет • сигналы в ответ на 1 мкМ АТФ , за которым следует второй стимуляции клеток с помощью 100 мкМ АТФ. Бары представляют собой средние значения ± SD максимальных сигналов G-GENOP в ответ на 1 мкМ АТФ (белая полоса) и 100 мкМ АТФ (зеленая полоса) из 4-х независимых экспериментов; р <0,001 по сравнению с 1 мкМ АТФ. P-значение было рассчитано с использованием непарный т-тест. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
С момента открытия NO • в качестве важной сигнальной молекулы в биологии 28, конкретное измерение в режиме реального времени радикала в отдельных клетках, тканях и целых животных с высоким разрешением в осуществимый и надежным образом было стремились. Здесь мы сообщаем о применении недавно разработанных генетически кодируемых флуоресцентных NO • зондов (geNOps) , которые позволяют точное жить-ячейки изображения NO • сигналов с использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии 1.
Для того, чтобы обойти сложные и инвазивные процедуры трансфекции клона НЕК клеток, которые стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный G-GENOP был использован для количественного определения экзогенного генерироваться одноклеточных Нет • профили. Как НЕК клетки обычно не производят NO • эндогенно 29, этот тип клеток подходит для генерации GENOP на основе датчика клеточной линии, которая может оказаться полезной для многих других применений в условиях совместного культивированияс NO • производить первичные клетки или даже в живых животных 30. Тем не менее, в данном исследовании мы демонстрируем способность различных НЕТ • -liberating соединений, различных концентраций и стабильностей, пробуждать внутриклеточных NO • сигналы с использованием G-GENOP, выражающую модель НЕК клеток. Наши данные показали, что NO • -donor концентрация, качество и способ применения в конечном итоге определить модели внутриклеточных Нет • профили. Такая информация необходима для на месте Фармакокинетические характеристики различных доноров NO •, которые являются признаком ряда заболеваний. Следует отметить, что geNOps было показано , что стабильно реагировать на несколько повторяющихся применений NO • -donor импульсов в течение очень длительного времени 1. Таким образом, эксперименты с использованием NO • -liberating соединения, представленные в настоящем документе, позволяют Полуколичественные выводы относительно различных амплитуд и кинетики соответствующего клеточного NO226; сигналы (фиг.1 и 2).
Несмотря на то, стабильно экспрессирующих клон НЕК клеток , вероятно , происходит из одной клетки, широкая гетерогенность уровней экспрессии G-geNOps наблюдалось (рисунок 1). Это общая особенность стабильных клеточных клонов , как транскрипция (генома) интегрированный интерес гена находится под контролем многих факторов , таких как различных экологических стрессов 31, влияющих на темпы роста 32 клеток, и статус клеточного цикла 33. Отдельные ФП на основе geNOps не являются логометрических датчиков и, следовательно, NO • индуцированную потерю интенсивности флуоресценции возрастает с выражением уровня GENOP 1. Соответственно, нормализация geNOps сигналов имеет важное значение для количественной оценки клеточных NO • сигналы особенно в случае сравнительного анализа. Как показано в нашем недавнем исследовании, строгая линейная корреляция Ьetween базальная интенсивность флуоресценции geNOps и сила НЕТ • индуцированного тушения флуоресценции в широком диапазоне интенсивностей флуоресценции было обнаружено 1. Это важная особенность geNOps для абсолютного количественного определения клеточных NO • сигналов. Как показано на рисунке 1, нормализация G-geNOps сигналов в ответ на NOC-7 и SNP выявлены однородные NO • сигналы в различных НЕК клеток из одной тарелки, указывая , что НЕК клетки не разнообразны в отношении их способности принимать до и ухудшать NO • радикал, который берет свое начало от NO • донора. В отличие от этого, используя geNOps в клетках HeLa продемонстрировали четкие гетерогенность клеточных сигналов нет • между различными клетками в ответ на NOC-7. Эти различия указывают на NO • метаболизма и разложения скоростей типа специфических клеток, которые могут иметь несколько последствий в клеточной физиологии и патологии, а также могут быть обнаружены с помощью GENOPs технологии.
Тем не менее, две важные особенности geNOps должны быть тщательно продуманы для правильного использования датчиков и интерпретации данных: I) geNOps требуют адекватного железа (II) , чтобы полностью ответить на NO • 1 и II) в зависимости от варианта FP, geNOps может быть рН чувствительной 1. Здесь мы опишем протокол, который был найден, чтобы быть пригодным для нетоксичен железа (II) добавок geNOps, которые выражаются в любом НЕК, HeLa или клетки EA.hy926 (см протокол 2.6). В то время как это было показано , что лечение клеток с железом (II) / витамин С не влияет на морфологию клеток, жизнеспособность клеток и метаболическую активность клеток 1, это может быть необходимо оптимизировать этот важный шаг для других типов клеток и тканей. Тем не менее, в некоторых экспериментальных условиях, требование железа (II) загрузка может ограничить применимость geNOps. Следует отметить, что было показано, что аскорбиновая кислота может уменьшить NO • 35 и аскорбат железа (II) комплексы способны продувать NO • 36, 37. Кроме того, избыток железа (II) и аскорбат могут вызывать воспалительные реакции 39 и расцепить ENOS 41. Такие эффекты необходимо учитывать при использовании технологии geNOps. Было показано , что при определенных условиях эксперимента, внутриклеточный рН влияет значительно 34, который имеет потенциал , чтобы влиять на geNOps флуоресценции 1. Следует отметить, что голубые и зеленые geNOps варианты относительно рН чувствительны демонстрируют снижение флуоресценции при подкислении 1. Следовательно, острые изменения (суб) клеточного рН может имитировать ложные сигналы НЕТ • при использовании рН-чувствительного geNOps. Как было предложено в нашей предыдущей работе, параллельное использование NO • Нечувствительность geNOps (geNOps MUT) в качестве отрицательного ControLs рекомендуется рассекать реальный клеточный NO • сигнал от pH изменяется 1. Кроме того изменения клеточного рН могут быть проверены с использованием зондов , рН , такие как SypHer 34.
Кроме того, мы визуализировали эндогенной ферментативной NO • образование в ответ на физиологический Ca 2+ -mobilizing агониста в эндотелиальной клетке суррогатной EA.hy926. Клеточная линия EA.hy926 является часто используемая модель системы последовательно выражать Енос 38. Использование geNOps транзиторно экспрессируется в клетках EA.hy926, подтвердили , что IP - 3 -опосредованной Ca 2+ сигналы вызывают глубокое образование NO • В этом типе клеток, который был почти полностью перекрыт L-NNA. Для того , чтобы временно коррелируют Ca 2+ с NO • сигналы, G-GENOP-экспрессирующие клетки были загружены с УФ-возбудимый химической Ca 2+ -indicator фура-2 / AM. Спектральное разделение Са 2+ связанных и несвязанных фура-2 флуо ценция из сигнала G-GENOP может быть легко достигнуто с коммерчески доступными наборами фильтров 40. IMAGING оба зонда представила , что Ca 2+ -triggered ферментативная NO • формирование происходит гораздо медленнее по сравнению с цитозольного Ca 2+ рост этого типа клеток эндотелия. Подобные кинетика одноклеточных NO • сигналы в эндотелиальных клетках из бычьей легочной артерии при обработке клеток с IP - 3 -generating агонистом брадикинина, а также напряжения сдвига было зарегистрировано с использованием НОА-1, косвенное высоко НЕТ • датчик 12 , чувствительными , Соответственно, эти данные подчеркивают , что Ca 2+ -evoked Енос происхождения NO • образование требует определенного времени начала до полного ферментативная активность не будет достигнута. Хотя кинетика клеточного NO • формирование, распространение и деградации могут быть извлечены из других данных, например , измерения напряжения на основе из NO • индуцированный релаксации сосудовсс = "Xref"> 26, большая польза от флуоресцентных зондов • NO является то , что они непосредственно конвертировать клеточные NO • колебания в видимые сигналы в режиме реального времени. Следовательно, визуализации сотовой связи NO • сигналы с geNOps обеспечивает высокую пространственное и временное разрешение, а также предлагает уникальные возможности в (ре) исследования (суб) сотовой связи NO • гомеостаза. Например, Енос изображений челночные 42 в сочетании с технологией geNOps в одиночных эндотелиальных клетках может быть приемлемым не коррелировать NO • образование с внутриклеточной локализации и транслокации нет • -продуцирующих фермента или других соответствующих белков , таких как кальмодулин и кавеолином 43.
Здесь мы опишем достижимой применение G-GENOP, выражающую НЕК и EA.hy926 клетки визуализировать экзогенно и эндогенно генерируются клеточные NO • сигналы на уровне одной клетки и в режиме реального времени на обычном широком поле флуоресцентной мicroscope. Наши данные свидетельствуют о том, что geNOps подходят конкретно отслеживать (суб) клеточных динамику NO • при различных экспериментальных условиях, используя все виды интересных типов клеток.
Disclosures
EE, MW, RM и WFG, сотрудники медицинского университета Граца, подали заявку на патент Великобритании (патентная заявка номер WO2015EP74877 20151027, приоритет номер GB20140019073 20141027), которые описывают части исследований в этой рукописи. Лицензии , связанные с этим патентом предоставляются Next Generation флуоресцентной томографии (NGFI) GmbH ( http://www.ngfi.eu/ ), спин-офф компании медицинского университета Граца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
| CaCl2·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
| MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
| KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
| D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free |
| EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
| DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
| DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| MEM Vitamin solution (100x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| MEM Amino acids solution (50x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
| Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
| FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
| PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
| Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
| Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
| Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
| NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
| Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
| 30 mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) |
| Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
| G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
| G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
| G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
| HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
| EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
| TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
| Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
| AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
| alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | 40X objective |
| dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
| ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
| BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
| ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |
References
- Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
- Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
- Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
- D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
- Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
- Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
- Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
- Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
- Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
- Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
- Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
- Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
- Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
- Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
- Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
- Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
- Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
- Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
- Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
- Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
- Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
- Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
- Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
- Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
- Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
- Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
- Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
- Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
- Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
- Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
- Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
- Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).
