Summary
막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.
Abstract
뇌에서 멤브레인 트래 피킹 시스템은 연결 형태, 시냅스 가소성, 생존 및 신경 교종과 같은 신경 기능을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 지금까지 수많은 연구에서 이러한 시스템의 결함이 다양한 신경 질환을 일으킨다 고보고했습니다. 따라서, 소포 역학의 기저를 이해하는 메커니즘은 여러 가지 신경 질환의 치료에 도움이 될 수있는 영향력있는 단서를 제공 할 수 있습니다. 여기에서는 ImageJ 플랫폼 용 소프트웨어 플러그인을 사용하여 운동 거리 및 이동 속도와 같은 소포 운동을 정량화하는 방법을 설명합니다. 정량화를위한 이미지를 얻기 위해, 우리는 EGFP - 태그 소낭 마커 단백질과 연결 endosome - 리소좀 구조를 표시하고 시간 경과 현미경을 사용하여 소포의 움직임을 관찰했다. 이 방법은 매우 유용하고 축삭 및 수상 돌기와 같은 신경 돌기뿐만 아니라 뉴런 및 신경아 교세포의 소마에서 소포 운동성 측정을 단순화합니다. 추가이 방법은 섬유 아세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포주에도 적용될 수있다. 이 접근법은 막 밀매에 대한 우리의 이해를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
Endosome-lysosome trafficking의 정확한 조절은 신경 기능 조절에 필수 불가결합니다. 주목할 만하게,이 vesicles의 동적 인 운동은 신경질 형태학, 발달 및 생존의 규칙의 기초가되는 중요한 요인이다. 이 시스템의 결함은 심한 신경 장애를 유발합니다 1 , 2 . 소포 인신 매매를 신경 질환과 연결시키는 분자 메커니즘은 복잡하다고 여겨지며, 몇몇 그룹에서는이 관련성을 조사하려고 시도해 왔습니다. 예를 들어, 늦은 엔도 솜 운동성을 교란 시키면 리소좀 결함으로 인해 유전되는 신경 퇴행성 질환 인 Niemann-Pick C 질병 3 과 유의 한 연관성이있는 것으로보고되었습니다. 다른 예는 리소좀 운동성을 손상시키는 리소좀 성 Ca 2+ 채널 trpml 1의 돌연변이로 리소좀 성 저장 질환 4 , 5 , 6 . 우리 그룹은 PtdIns (3,5) P 2 turnover의 조절 장애가 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 운동성을 억제하여 스트레스 반응에 대한 취약성이 증가한다고보고했다. PtdIns (3,5) P 2의 대사 조절은 후기 엔도 좀과 리소좀에 주로 국한되며, 소포 수송과 융합 분열 과정을 포함한 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 손상된 PtdIns (3,5) P 2 turnover가 심한 신경 퇴화를 유발하기 때문에 11,12 endosome-lysosome 운동성의 비정상적인 조절은 신경 퇴행의 발병 기전을 이해하는 중요한 요소가 될 수 있습니다. 소포 운동성의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 연구는 우리의 unde를 깊게 할 수있는 유망한 단서를 제공 할 수 있습니다몇 가지 신경 장애의 견해.
이 논문에서는 수동 추적이라는 무료 소프트웨어 패키지를 사용하여 뉴런의 소포 운동성을 정량화하는 유용한 방법을 소개합니다. 목표는 소포 운동성을 분석하는 빠른 정량화 방법을 개발하는 것이 었습니다. 이 양화는 저속 영화의 각 프레임에서 기준점을 클릭하는 표준 방식을 통해 이루어집니다. 수동 추적 소프트웨어를 사용하면이 방법을 다른 응용 프로그램과 달리 매우 간단하고 폭넓게 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 접근법은 신경 교세포와 같은 다른 세포에도 적용 가능하다. 이 방법은 원시적이지만 세포 운동성 및 형태 학적 변화를 비롯한 다양한 분석에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 일련의 이미지에서 참조 점을 정의한 후 데이터 분석 및 이미지 처리 소프트를 사용하여 순차 이미지에서 참조 지점의 위치 및 각 위치에서의 시간에 대한 정보를 추출 할 수 있습니다제품. 이 방법은 간단하면서도 강력하며, 엔도 좀 - 리소좀 기능을 검사하는 것과 같은 멤브레인 트래 피킹을 기반으로 한 연구의 효율성 향상에 기여합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 쓰쿠바 대학 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 해부
- 배아 일 13-14 ICR 또는 C57BL / 6 태아를 준비하기 위해, 자궁 경부 탈구로 임신 생쥐를 안락사. 자궁을 제거하고 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페트리 접시에 넣어. 혈액을 제거하기 위해 잘 헹구십시오.
- 겸자를 사용하여 70 % 에탄올로 자궁을 새로운 페트리 접시에 옮겨 멸균하십시오.
- 자궁을 HBSS로 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 살균 해부 포셉 및 수술 가위를 사용하여 자궁에서 태아를 제거하십시오.
- 외과 용 가위로 태아를 처치하십시오. HBSS와 함께 새로운 페트리 접시에 그들을 놓으십시오.
- 피부와 두개골을 제거하고 살균 해부 포 셉를 사용하여 두뇌를 꺼내. 그들을 HBSS와 페트리 접시에 넣어.
참고 :이 단계부터 깨끗한 상태에서 절차를 수행하는 것이 가장 좋습니다벤치. - 입체 현미경으로 멸균 해부 포셉을 사용하여 meninges를 제거합니다. 겸자를 사용하여 기저핵, 해마 및 소뇌를 차단하십시오. 곡선 팁 포셉을 사용하여 HBSS와 함께 새로운 페트리 접시에 cortices를 전송하십시오.
- 일회용 dropper 또는 25mL 피펫을 사용하여 모든 cortices를 수집합니다. 그들을 15 ML 튜브에 넣어 다음 pipetting하여 HBSS를 제거하십시오.
- cortices를 포함하는 튜브에 대뇌 피질 효소 솔루션 3 ML을 추가합니다. 이 튜브를 수조에 넣고 5 분 동안 37 ° C에서 배양하십시오.
참고 : 0.25 % 트립신과 1mM EDTA와 인산염 완충 식염수 (PBS)로 구성된 대뇌 피질 문화 효소를 준비합니다. 0.22 μm 필터로 소독하십시오. - cortices를 포함하는 튜브에 대뇌 피질 효소 솔루션의 추가 3 ML을 추가하고 추가 5 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 품어.
- 5 ML 피펫을 사용하여 대뇌 피질 효소 솔루션을 제거하고 Dulbe 5 ML을 추가10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 함유 된 cco 's Modified Eagle Medium (DMEM).
- 멸균 P1000 팁 5 ML 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 pipetting하여 cortices을 떼어. P200 팁 5 ML 피펫을 사용하여 다시 피펫.
- 40 μm 나일론 셀 스트레이너를 50 mL 튜브에 넣고 현탁액을 여과하여 잔해물을 제거합니다.
- RT에서 5 분 동안 420 XG에서 원심 분리기를 만든 다음 DMEM 배지를 제거합니다.
- 대뇌 피질 배지 5 ML을 추가하고 부드럽게 세포 펠렛을 resuspend.
참고 : 1x B - 27 보충제, 2mM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충 뉴런 기본 미디어로 구성된 대뇌 피질의 문화 매체를 준비합니다. - hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 대뇌 피질 문화 매체를 사용하여 세포 농도를 (원하는대로) 조정합니다.
- 코팅 된 35mm 유리 바닥 접시 당 2.0mL의 플레이트 3.0 × 10 6 피질 뉴런.
참고 : 도금하기 전에Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) 또는 0.01 % Poly-L-Ornithine (PLO)을 함유 한 35mmm 유리 바닥 접시. 37 ° C에서 3 시간 동안 배양하고 적어도 3x PBS로 세척하십시오.
2. 이미징 베 시클 운동성
- 각 유형의 소포를 라벨링 할 플라스미드를 준비하십시오. 예를 들어 초기 엔도 솜에는 EGFP-Rab5를, 후기 엔도 솜에는 EGFP-Rab7을, 리소좀에는 LAMP-EGFP를,자가 염색체에는 EGFP-LC3을 사용합니다 8 , 13 .
참고 :이 플라스미드는 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp에서 요청할 수 있습니다. 전형적으로, 3-5 일 의 시험 관내 (DIV) 뉴런은 형질 전환 시약을 사용하여 이들 플라스미드로 트랜 스펙 션 될 수있다. - 피펫 팅으로 혈청이없는 배지 200 μL와 4.0 μg의 플라스미드를 섞는다. 별도의 튜브에 혈청이없는 배지 200 μL에 8 μL의 형질 전환 시약 ( 재료 표 참조)을 희석하십시오. RT에서 5 분 동안 품어 둡니다.
- 단계 2.2에서 pipetting하여 플라스미드 솔루션과 transfection 섭정 솔루션을 섞는다. RT에서 20 분 동안 품어 낸다.
- 무 혈청 배지와 단계 2.3에서 얻은 플라스미드 용액 400 μL를 각 코팅 된 유리 바닥 접시에 첨가한다. 37 ° C에서 뉴런을 품어 5 % CO 2 배양기에서 30 분간 항온 처리한다. 대뇌 피질 문화 매체 2 ML로 매체를 대체하십시오. 1-2 일 동안 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 뉴런을 품어.
- transfection 1 ~ 2 일 후, 이미지 수집을 위해 transfected 세포를 선택합니다.
참고 : 7 DIV 미만의 조기 뉴런은 동적 소포 운동성을 나타내는 경향이 있습니다. 고도로 표현하는 뉴런을 선택하면 명확한 이미지를 얻을 수 없기 때문에 형광 프로브를 적당히 표현하는 뉴런을 선택하십시오. 또한 축색 돌기 및 수상 돌기의 확인을 용이하게하기 위해 긴 축삭 및 복잡한 수상 돌기가있는 피라미드 뉴런과 같은 전형적인 연결 형태를 선택하십시오 ( 그림 1A 참조)). - 저속 영상 시스템을 이용한 영상 획득 :
이미징의 경우 40X Plan Apo 0.95NA 또는 100X Plan Apo VC NA1.4 대물 렌즈가 장착 된 CCD (Charge Coupled Device) 카메라가 장착 된 형광 현미경을 사용하십시오. 부화 시스템을 사용하여 37 ° C에서 온도를 제어하십시오. 이미지 수집 소프트웨어가 제어하는 100 초 동안 한 프레임 / 5 초에서 뉴런 이미지를 수집합니다. 또는 300 초 동안 2 초당 1 프레임과 같이 더 짧은 시간 간격과 더 긴 시간 간격으로 이미지를 수집 할 수 있습니다.
참고 : 순차적 이미지 촬영에는 다양한 응용 프로그램을 사용할 수 있으며 그 중 많은 이미지가이 방법에 적합합니다. 따라서 특정 응용 프로그램을 권장하지 않습니다. 오히려 각 연구원은 사용 가능한 응용 프로그램을 사용해야합니다.
3. 이미지 분석
- Manual Tracking 14 로 ImageJ 소프트웨어의 모든 순차 이미지를 엽니 다.
참고 : 현재까지 수동 추적은추적 실험 15 , 16 , 17 , 18 , 19에서 사용 되었습니다. 수동 추적은 Dr. Fabrice Cordelières가 개발했습니다. 자세한 서면 지침은 온라인에서 확인할 수 있습니다 20 . 분석을 위해, 이미징 데이터의 품질은 충분한 수의 이미지로 개선됩니다. 20 장 이상의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다. - 연속 이미지를 결합하려면 <이미지> → <스택> → <스택 할 이미지>를 선택하십시오. <확인>을 클릭하십시오.
- <Plugins> → <Manual Tracking>을 선택하십시오. 추적 창이 열립니다.
- <Show Parameters?> 체크 박스를 클릭하고 매개 변수 섹션에서 추적 매개 변수를 정의하십시오.
참고 : 시간 간격, x / y 보정, z 보정, 중심에 대한 정사각형 크기 검색 등 여러 매개 변수를 설정할 수 있습니다도트 크기, 선 너비 및 글꼴 크기가 포함됩니다. 이 단순화 된 분석에서, 시간 간격 및 x / y 보정 모두가 정의되었다. 다른 실험 환경에서는 다른 매개 변수도 정의해야 할 수 있습니다. 여기에 사용 된 매개 변수는 다음과 같습니다 : 40X Plan Apo 0.95NA 대물 렌즈의 경우 <Time interval>이 5 초이고 <x / y calibration>이 0.26642 μm이거나 100X Plan Apo VC NA1.4의 경우 0.10657 μm입니다. 대물 렌즈. - 매개 변수가 정의 된 후 <트랙 추가>를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오.
- 관심있는 소낭 ( 예 : 그림 1A (오른쪽 패널)의 파란색과 빨간색 화살촉으로 표시된 소낭)을 결정한 후 순차 이미지에서 신호의 중심을 클릭하여 xy 좌표를 기록합니다. 기록 된 xy 좌표, 거리 및 속도의 결과가 새 창에 표시됩니다.
참고 : 리소좀의 경우, 큰 밝은 형광 신호 ( 예 : Figure 1A (오른쪽 패널), 주황색 화살촉)은 종종 뉴런에서 관찰됩니다. 이 신호들은 때때로 누적 된 소낭이나 병적 정맥류를 나타 내기 때문에 운동성을 정량화하기 위해 이러한 신호를 피해야합니다. - 모든 순차 이미지에서 vesicles의 xy 좌표를 수집하려면 3.6 단계를 반복하십시오. 각 이미지는 참조 점이 선택된 후 자동으로 연속 이미지로 진행됩니다.
- 이 데이터를 새 테이블 ( 예 : 스프레드 시트)로 내 보냅니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 적절한 그래프를 만듭니다 ( 재료 표 참조).
참고 : 데이터를 분석하려면 <거리> 열을 선택하고이 열의 모든 값을 합한 다음 그림 1B 와 같이 운동 거리를 막대 그래프로 표시합니다. 또한이 단계를 반복하고 전체 운동 거리의 평균을 계산하고 막대 그래프로 표시합니다 ( 그림 1C) . 막대 그래프와 파형 데이터를 생성하는 소프트웨어는자료 표.
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Representative Results
이 분석은 체외 배양 에서 소포 역학을 측정하기 위해 고안되었습니다. 이 분석은의 연결 형태 및 생존과 관련된 소포 운동성을 결정하는 데 활용되었습니다. 그림 1A 및 B 는 뉴런의 리소좀 운동성을 보여주는 대표적인 데이터를 표시합니다. 피질 뉴런은 리소좀 마커, LAMP-EGFP로 형질 감염되었고, 표준 형광 현미경을 사용하여 관찰되었다. 이전에는 특정 엔도 좀 - 리소좀 소포가 쉬고있는 뉴런 에서조차도 매우 이동성이 있다고보고되었습니다. 사실, 이러한 결과는 같은 수상 돌기 ( 그림 1A 와 B )에 휴식과 움직이는 소포 둘 다 보여줍니다. 일반적으로 쉬고있는 소포는 갈색의 움직임과 같은 진동 운동을 뉴런 수상 돌기에서 나타낸다. 대조적으로, 움직이는 소포는 불규칙한 운동성을 나타낸다. 우리는 각각의 소포가 다른lysosome vesicles에서도 기능의 결정을 내리는 구성적인 특성 8 . 따라서, 이러한 접근법을 사용하는 소포의 분류는 유용한 정보를 제공 할 수있다. 이 시스템을 사용하면 이러한 소포의 평균 운동성을 정량화하고 ( 그림 1C )이 시스템을 사용하여 소포 성질을 시간에 따라 효과적으로 분석 할 수 있습니다.
그림 1 : 신경원 수상 돌기에서의 라이 소솜 운동성. ( A ) 마우스 대뇌 피질 뉴런 (4 DIV)은 LAMP-EGFP 플라스미드로 2 일 동안 형질 감염시켰다. 이 이미지는 수상 돌기에서 LAMP-EGFP- 함유 소포의 운동성을 보여줍니다. 삽화는 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 경과 이미지를 보여줍니다. 빨간색 화살촉은 움직이는 소포를 나타내며 파란색 화살촉은 휴식 소포를 나타냅니다. 주황색 화살촉은 더 큰 형광 신호를 나타냅니다.에 위. 스케일 바 = 20 μm. ( B )는 그림 A의 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 의존적 인 x 축 위치입니다. (b)로 표시된 빨간 동그라미의 소포는 움직이며, (a)로 표시된 파란색 동그라미의 소포는 쉬고 있습니다. 스케일 바 : 5 μm (왼쪽). 막대 그래프는 LAMP-EGFP 이동의 총 거리를 나타냅니다 (오른쪽). ( C ) 막대 그래프는 LAMP - EGFP - 함유 vesicles의 평균 운동 거리를 나타냅니다. (n = 5, 평균 ± SEM의 표준 오차, Student t- 검정 에 의한 ** p <0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 소포 운동성을 정량화하는 절차를 소개합니다. 일차 뉴런에서 엔도 좀과 리소좀은 젊은 뉴런에서 높은 운동성을 나타내는 경향이 있습니다 (4-6 DIV). 뉴런은 신경 프로세스를 길게하기 위해 리딩 에지에 몇 가지 구성 요소를 제공해야한다는 것을 감안할 때 멤브레인 트래 피킹은이 단계에서 동적으로 발생해야합니다. 따라서, 신경 dendrites의 동적 운동을 관찰하기 위해 젊은 뉴런을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 큰 베 시클은 젊은 뉴런에서도 높은 운동성을 나타내는 경향이 없습니다. 소포 크기의 조절은 융합 - 핵분열 단계의 빈도와 관련이있다. 역동적으로 움직이지 않는 특정 소포는 다른 소포를 쉽게 받아들이고 운동을 종결시킬 수 있습니다. 따라서 소포를 선택하는 것은이 분석을위한 중요한 과정입니다.
객체를 추적하기 위해 몇 가지 무료 플러그인 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 21 . 예를 들어, 트랙메이트 패키지는 객체 22 를 추적 할 수 있으며 다양한 수학 정보를 제공하는 수치 소프트웨어로 수정할 수 있습니다. 반면에,이 프로토콜에서 상대적으로 간단한 이미지 분석에 사용하는 것은 약간 복잡합니다. Mtrack2는 또 다른 플러그인이며 MultiTracker 플러그인 23을 기반으로합니다. Mtrack2는 대상을 식별하고 다음 프레임에서 가장 가까운 대상을 결정할 수 있기 때문에 유용합니다. 이 접근법은 엄청난 양의 데이터를 정량화하는 데 유용합니다. 그러나 수동 추적은 더 적은 양의 이미지 데이터에 대해 더 신뢰할 수 있습니다. 따라서 더 작은 데이터 세트를 수량화하고 다른 소프트웨어를 사용하여 더 큰 볼륨을 모니터링하는 것이 더 나을 수 있음을 인정하기 위해 수동 추적을 권장합니다.
이 접근법에서는 몇 가지주의 사항을 취해야합니다. 첫째, 엄격한 데이터를 얻으려면 샘플링 속도가 높아야합니다. 일부 소포는 빠른 움직임을 보이고융합 분열 (fusion-fission)과 같은 급격한 변화와 외견 상 실종 (appearance-disappearance) 현상이 때때로 관찰되어, 빈번한 이미징 (imaging)이 변화의 징조를 놓치지 않기 위해 중요하다는 것을 나타낸다. 또 다른 요점은 스캐닝 디스크 공 촛점 현미경과 내부 반사 형광 현미경과 같은 하이 엔드 현미경을 사용하면 고해상도 흥미로운 데이터를 얻는 데 핵심이 될 수 있다는 것입니다. 하이 엔드 현미경을 사용하여 더 짧은 간격으로 이미지를 찍는 것이 좋습니다. 이미지는 장비 제한으로 인해 매 5 초마다 찍었습니다.
상당한 연구 결과 막 매매와 신경 장애 사이의 생물학적 연관성이 제기되었다 2 . 예를 들어, 리소좀 결함이 Niemann-Pick 병 및 Gaucher 질환과 같은 심한 신경 장애에 관여한다는 것이 입증되었습니다. 흥미롭게도, 여러 연구에 의하면 리소좀 운동과 지방화가lysosomal 저장 장애의 개시 6 . 소포 운동성이 이러한 장애에 대한 바이오 마커로 사용될 수 있습니다. 하나의 흥미로운 접근법은 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 이용 가능성에서 발생할 수 있습니다. iPSCs 유래 뉴런을 사용하여 소포 운동성을 조사하면 리소좀 성 저장 장애에 대한 바이오 마커가 밝혀 질 수 있습니다. 이 접근법은 질병의 위험에 처한 프로세스에 대한 단서를 제공합니다.
이 분석은 간단하기 때문에 운동성 데이터를 얻는 것이 쉽습니다. 또한 이동 및 형태 학적 변화를 포함한 다른 세포 사건의 분석에도 적용 가능합니다. 이 접근법은 단순성으로 인해 여러 가지 한계가 있음을 알아 두는 것이 중요합니다. 따라서, 전기 생리학, 생화학 및 전자 현미경 분석을 포함한 다른 접근법을 사용하여 신경 인신 매매의 정확한 생리적 관련성을 이해할 필요가 있습니다. 그럼에도 불구하고이 접근법은 가치있는인신 매매를 직접적이고 시간 효율적으로 분석하고자하는 연구자에게 적합합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이번 분석을 돕기 위해 Ricardo Dolmetsch 박사 (Stanford University of Medicine, 현재 : Novartis Institute for Biomedical Research)와 Matthew Wood 박사, Aihara Takum, Dongsook Kim에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
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