Summary
החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.
Abstract
במוח, מערכות סחר ממברנה משחקות תפקידים חשובים בוויסות תפקודים עצביים, כגון מורפולוגיה נוירונים, גמישות סינפטית, הישרדות ותקשורת גלייה. עד כה, מחקרים רבים דיווחו כי פגמים במערכות אלה גורמים למחלות עצביות שונות. לפיכך, הבנה של המנגנונים הבסיסיים של הדינמיקה שלפוחית עשוי לספק רמזים משפיעים שיכולים לסייע בטיפול של הפרעות עצביות מספר. כאן, אנו מתארים שיטה לכמת motities שלפוחית, כגון מרחק התנועה ואת קצב התנועה, באמצעות תוכנה plug-in עבור פלטפורמת ImageJ. כדי להשיג תמונות לכימות, אנו שכותרתו מבנים endosome-lysosome נוירונים עם EGFP- מתויג שלפוחית חלבונים סמן נצפתה התנועה של שלפוחית באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. שיטה זו שימושית מאוד לפשט את תנועת שלפוחיות מדידה neurites, כגון אקסונים ודנדריטים, כמו גם סומה של שני נוירונים ותאי גלייה. מחיר SONYמחדש, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על שורות תאים אחרים, כגון fibroblasts ותאי האנדותל. גישה זו יכולה לספק התקדמות חשובה של ההבנה שלנו של סחר קרום.
Introduction
שליטה מדויקת של סחר endosome-lysosome היא הכרחית לוויסות פונקציה העצבית. יש לציין כי התנועות הדינמיות של שלפוחיות אלה הן גורם מרכזי ביסוד המורפולוגיה הנוירונים, הפיתוח והישרדות. פגמים במערכת זו לגרום להפרעות נוירונים חמורים 1 , 2 . המנגנונים המולקולריים המקשרים בין סרטן שלפוחית למחלות נוירונים נחשבים מסובכים, וכמה קבוצות ביקשו לבחון את הרלוונטיות הזו. לדוגמה, דווח כי תנועה נידחת מאוחר של האינדוזום קשורה באופן משמעותי למחלת נימן-פיק 3 , מחלה תורשתית נוירו-גנטית הנגרמת על ידי פגמים בליזוזום. דוגמה נוספת היא מוטציה של ערוץ Ca 2 + lysosomal , trpml 1, אשר פוגעת בתנועות ליזוזומליות, וכתוצאה מכך למחלות אחסון lysosomal 4 , 5 , 6 . הקבוצה שלנו דיווחה כי dysregulation של PtdIns (3,5) P 2 מחזור מדכאת את תנועתיות אנדוסום ו lysosome בנוירונים, מה שמוביל לעלייה פגיעות לתגובה הלחץ 7 , 8 . תקנה מטבולית של PtdIns (3,5) P 2 , אשר בעיקר localizes על endosomes ו lysosomes מאוחר, ממלאת תפקיד חשוב במגוון רחב של פונקציות הסלולר, כולל סחר שלפוחית תהליכי ביקוע היתוך 9 , 10 . מאז פגומה PtdIns (3,5) P 2 מחזור גורם נוירוגנרטיון חמור 11 , 12 , הרגולציה חריגה של תנועתיות אנדוסום- lysosome יכול להיות גורם מפתח להבנת הפתוגנזה של ניוון מוחי. חקירה של המנגנונים המולקולריים המונחים ביסוד תנועתיות שלפוחית עשויה, אם כן, לספק רמזים מבטיחים שיכולים להעמיק את חוסר היכולת שלנושל כמה הפרעות נוירונים.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה יקר לכמת תנועתיות שלפוחית נוירונים באמצעות חבילת תוכנה חופשית בשם מעקב ידני. המטרה היתה לפתח שיטת כימות מהירה לנתח את תנועתיות שלפוחית. כימות זה מכוונת דרך גישה סטנדרטית של לחיצה על נקודת התייחסות בכל מסגרת של זמן לשגות הסרט. השימוש בתוכנת המעקב הידני הופך את הגישה הזו לפשוטה למדי ולתועלת רחבה, בניגוד ליישומים אחרים. יתר על כן, גישה זו חלה גם על תאים אחרים, כגון תאי גלייה. למרות ששיטה זו היא פרימיטיבית, ניתן ליישם אותה בניתוחים שונים, כולל תנועתיות סלולרית ושינוי מורפולוגי. לדוגמה, לאחר הגדרת נקודת התייחסות על פני רצף של תמונות, מידע על המיקום של נקודות התייחסות ואת הזמן בכל עמדה ניתן לחלץ מתמונות רציף באמצעות ניתוח נתונים ועיבוד תמונה רכהכלי. יחד, שיטה זו היא פשוטה אך רבת עוצמה ותורמת לפיתוח של יעילות משופרת במחקרים המבוססים על סחר בממברנה, כגון אלה בודקים endosome-lysosome פונקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור של אוניברסיטת Tsukuba טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC).
1. דיסקציה
- כדי להכין יום עובריים 13-14 ICR או C57BL / 6 עוברים, להרדים עכברים בהריון על ידי פריקה צוואר הרחם. הסר את הרחם והכניס אותו לתוך צלחת פטרי עם תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). שוטפים אותו היטב כדי להסיר את הדם.
- באמצעות מלקחיים, להעביר את הרחם לצלחת פטרי חדש עם אתנול 70% לעקר.
- מעבירים את הרחם לצלחת פטרי חדשה עם HBSS. הסר את העוברים מן הרחם באמצעות מלקחיים לנתח סטרילי ומספריים כירורגי.
- לערוף את העוברים באמצעות מספריים כירורגיים. מניחים אותם לתוך צלחת פטרי חדש עם HBSS.
- הסר את העור ואת הגולגולת להוציא את המוח באמצעות מלקחיים לנתח סטריליזציה. שים אותם לתוך צלחת פטרי עם HBSS.
הערה: משלב זה על, עדיף לבצע את ההליך על נקיסַפְסָל. - הסר את קרום באמצעות מלקחיים לנתח סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו. לחתוך את הגרעינים הבסיס, היפוקמפוס, המוח הקטן באמצעות מלקחיים. באמצעות מלקחיים קצה מעוקל, להעביר את הקורטקס לצלחת פטרי חדש עם HBSS.
- לאסוף את כל הקורטקס באמצעות טפטפת חד פעמיות או פיפטה 25 מ"ל. שים אותם לתוך צינור 15 מ"ל ולאחר מכן להסיר את HBSS ידי pipetting.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת האנזימים המוח קליפת המוח לצינור המכיל את הקורטקס. שים את הצינור הזה לאמבט מים ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
הערה: הכינו אנזים תרבותי המוח קליפת המוח המורכב מלחץ שנאגרו פוספט (PBS) עם טריפסין 0.25% ו 1 מ"מ EDTA. לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. - הוסף עוד 3 מ"ל של תמיסת האנזימים המוח קליפת המוח לתוך הצינור המכיל את הקורטקס ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 5 דקות נוספות.
- הסר את הפתרון האנזים מוחית האנזים באמצעות פיפטה 5 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של דולבהCco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS).
- לנתק את הקורטקס על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות פיפטה 5 מ"ל עם טיפ סטרילי P1000. פיפטה שוב באמצעות פיפטה 5 מ"ל עם קצה P200.
- שים מסננת 40 מיקרומטר ניילון תא על צינור 50 מ"ל לסנן את ההשעיה כדי להסיר את הפסולת.
- צנטריפוגה ב XG 420 דקות 5 ב RT ולאחר מכן להסיר את המדיום DMEM.
- הוסף 5 מ"ל של המדיום המוח קליפת המוחית בעדינות resuspend תא גלולה.
הערה: הכן בינוני תרבותי קליפת המוח המורכב בינוני בינוני העצבית בתוספת 1x B-27 ספקים, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 100 U / מ"ל פניצילין סטרפטומיצין. - לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את ריכוז התא (לפי הצורך) באמצעות המדיום המוח קליפת המוח.
- צלחת 3.0 × 10 6 נוירונים קליפתיים ב 2.0 מ"ל לכל מצופה 35 מ"מ זכוכית תחתית מנות.
הערה: לפני ציפוי, המעיל35 מ"מ זכוכית עם תחתית מנות עם 0.1 מ"ג / מ"ל פולי-D- לימין hydrobromide (PDL) או 0.01% Poly-L-Ornithine (אש"ף). לדגור על 3 שעות - O / N ב 37 מעלות צלזיוס לשטוף עם PBS לפחות 3x.
2. דימות תנועה שלפוחית
- הכן את הפלסמידים כי תווית כל סוג של שלפוחית. לדוגמה, להשתמש EGFP-Rab5 עבור endosomes מוקדם, EGFP-Rab7 עבור endosomes מאוחר, LAMP-EGFP עבור ליזוזומים, ו EGFP-LC3 עבור autophagosomes 8 , 13 .
הערה: פלסמידים אלה זמינים על פי בקשה מ tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. בדרך כלל, 3 -5 ימים במבחנה (DIV) נוירונים יכולים להיות transfected עם פלסמידים אלה באמצעות ריאגנטים transfection. - מערבבים 4.0 מיקרוגרם של פלסמידים עם 200 μL של המדיום ללא סרום ידי pipetting. בצינור נפרד, לדלל 8 μL של מגיב transfection (ראה טבלה של חומרים ) ב 200 μL של המדיום ללא סרום. דגירה של 5 דקות ב RT.
- מערבבים את הפתרון פלסמיד פתרון transfection יורש עצר בשלב 2.2 על ידי pipetting. דגירה במשך 20 דקות ב RT.
- הוסף בינוני ללא סרום ו 400 μL של הפתרון פלסמיד משלב 2.3 לכל צלחת זכוכית תחתית מצופה. לדגור את הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 באינקובטור במשך 30 דקות. החלף את המדיום עם 2 מ"ל של המדיום המוח קליפת המוח. דגירה הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 באינקובטור במשך 1-2 ימים.
- לאחר 1 - 2 ד של transfection, בחר את התאים transfected לרכישת תמונות.
הערה: נוירונים מוקדמים פחות מ -7 DIV יש נטייה להציג תנועתיות שלפוחית דינמית. בחר נוירונים כי בינוני להביע את הקרינה בדיקה כי תמונות ברורות לא ניתן להשיג כאשר נוירון להביע מאוד נבחרה. כמו כן, בחר צורה עצבית טיפוסי, כגון נוירונים פירמידליים, אשר יש אקסונים ארוכים דנדריטים מורכבים, על מנת להקל על זיהוי של האקסון הדנדריטים (ראה איור 1A). - רכישת תמונה באמצעות זמן הדמיה מערכת הדמיה:
עבור הדמיה, להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת Charge-Device (CCD) מצלמה עם 40X תוכנית אפו 0.95NA או 100X תוכנית Apo VC NA1.4 עדשות אובייקטיביות. בקרת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת הדגירה. לרכוש תמונות נוירון על מסגרת אחת / 5 על פני תקופה של 100 S נשלט על ידי תוכנת רכישת התמונה. לחלופין, לרכוש תמונות במרווחי זמן קצרים יותר עבור תקופות זמן ארוכות יותר, כגון על מסגרת אחת לכל 2 שניות על פני תקופה של 300 שניות.
הערה: מגוון של יישומים זמינים עבור לקיחת תמונות רציף, רבים מהם יהיה מתאים לשיטה זו. לכן, לא מומלץ יישום ספציפי; אלא, כל חוקר צריך להשתמש בכל יישום זמין.
3. ניתוח תמונה
- פתח את כל התמונות ברצף בתוכנת ImageJ באמצעות Manual Manual 14 .
הערה: נכון לעכשיו, מעקב ידני היה wiמשמשים במעקב אחר ניסויים 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . מעקב ידני פותח על ידי ד"ר פבריס קורדלירס. הוראות מפורטות בכתב זמינים באינטרנט 20 . לצורך הניתוח, איכות נתוני ההדמיה משופרת עם מספר מספיק של תמונות. מומלץ להשתמש ביותר מ -20 תמונות. - כדי לשלב את התמונות הרצופות, בחר <תמונה> → <ערימות> → <תמונות לערימה>. לחץ על <אישור>.
- בחר <Plugins> → <מעקב ידני>; יופיע חלון מעקב.
- לחץ על תיבת הסימון של <הצג פרמטרים?> והגדר את פרמטרי המעקב בקטע הפרמטרים.
הערה: ניתן להגדיר מספר פרמטרים, כולל מרווח זמן, כיול x / y, כיול z, גודל ריבוע לחיפוש עבור מרכזIng, גודל נקודה, רוחב קו וגודל גופן. זה assay פשוטה, מרווח הזמן הן כיול x / y הוגדרו. בנסיבות נסיוניות אחרות, ייתכן שיהיה צורך להגדיר גם פרמטרים אחרים. הפרמטרים המשמשים כאן הם כדלקמן: <מרווח זמן <5 s, ואת <x / y כיול> הוא או 0.26642 מיקרומטר עבור 40X תוכנית אפו 0.95NA עדשה אובייקטיבית או 0.10657 מיקרומטר לתוכנית 100X Apo VC NA1.4 עדשה אובייקטיבית. - לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על <הוסף מסלול> כדי להתחיל רצועה חדשה.
- לאחר קביעת שלפוחית של עניין ( למשל, שלפוחיות מסומנות על ידי ראשי חץ כחול ואדום בתרשים 1A (פאנל מימין)), לחץ על מרכז האותות בתמונות רציף כדי להקליט את הקואורדינטות xy. התוצאות של הקואורדינטות xy המוקלטות, המרחק והמהירות מופיעות בחלון חדש.
הערה: במקרה של lysosomes, אותות ניאון גדולים בהירים ( למשל, איורUre 1A (פאנל ימין), ראש חץ כתום) נצפים לעתים קרובות נוירונים. כמו אותות אלה מדי פעם להציג או שלפוחיות מצטברות או varicosities פתולוגי, אלה האותות יש להימנע לכמת התנועה. - חזור על שלב 3.6 כדי לאסוף את xy קואורדינטות של שלפוחית מכל תמונות רציף; כל תמונה מתקדמת אוטומטית לתמונה רציפה לאחר בחירת נקודת ההתייחסות.
- ייצוא נתונים אלה לטבלה חדשה ( לדוגמה, גיליון אלקטרוני). השתמש בתוכנה המתאימה ליצירת גרף מתאים (ראה טבלת חומרים ).
הערה: כדי לנתח את הנתונים, בחר בעמודה <מרחק>, סיכם את כל הערכים בעמודה זו, והצג מרחק תנועה כגרף עמודות, כמו בתרשים 1B . בנוסף, חזור על שלב זה, לחשב את הממוצע של מרחק התנועה הכולל, ולהראות כמו תרשים בר, כמו בתרשים 1C . התוכנה ליצירת תרשים עמודות וגרפים מוצגים בתצוגהלוח החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay זה נועד למדוד את הדינמיקה שלפוחית בתרבות חוץ גופית . Assay זה נוצל כדי לקבוע את תנועתיות שלפוחית הקשורים מורפולוגיה העצבית והישרדות. איור 1A ו- B להציג נתונים נציג מראה תנועתיות lysosome בנוירונים. נוירונים בקליפת המוח היו transfected עם סמן lysosome, LAMP-EGFP, ונצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. זה כבר דווח בעבר כי ספציפי endosome-lysosome שלפוחית הם ניידים מאוד, אפילו נוירונים מנוחה. ואכן, תוצאות אלו מדגימות הן שלוחות נעות ומרגשות באותו דנדריט ( איור 1 א ו- B ). בדרך כלל, שלפוחית מנוחה להציג תנועה רטט, כמו תנועה בראוני, ב דנדריטים עצביים. לעומת זאת, שלפוחית נעה מראה תנועתיות לא סדירה. אנו משערים כי כל שלפוחית יש שונהתכונה התומכת בבסיס קביעת תפקוד, אפילו שלפוחית lysosome 8 . לפיכך, סיווג שלפוחית באמצעות גישה זו עשויה לספק מידע שימושי. באמצעות מערכת זו, זה קל לכמת את התנועה הממוצעת של שלפוחית אלה ( איור 1C ) ולנתח את המאפיינים שלפוחית באמצעות מערכת זו באופן יעיל זמן.
איור 1: תנועה ליזוזום ב דנדריטים עצביים. ( א ) נוירונים קליפת המוח עכבר (4 DIV) היו transfected עם LAMP-EGFP פלסמיד במשך 2 ימים. תמונה זו מראה את תנועתיות של LAMP-EGFP המכיל שלפוחית הדנדריטים. הבלעה מראה את הזמן לשגות התמונה של LAMP-EGFP חיובי שלפוחית. ראש החץ האדום מצביע על שלפוחית נעה, וראש החץ הכחול מצביע על שלפוחית מנוחה. ראשי החץ הכתומים מצביעים על אותות ניאון גדולים יותר, כמפורטלעיל. סולם בר = 20 מיקרומטר. ( ב ) הזמן תלוי ציר x המיקום של LAMP-EGFP חיובי שלפוחית מן איור A. שלפוחית במעגל האדום שכותרתו (ב) נע, ואת שלפוחית במעגל כחול שכותרתו (א) הוא מנוחה. סולם בר: 5 מיקרומטר (משמאל). תרשים הבר מציין את המרחק הכולל של התנועה LAMP-EGFP (מימין). ( C ) תרשים הבר מציין את מרחק התנועה הממוצע של LAMP-EGFP המכילים שלפוחית. (N = 5, ממוצע ± תקן שגיאה של ממוצע [SEM], ** p <0.01 על ידי תלמיד ttest). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג את ההליך לכימות תנועתיות שלפוחית. ב נוירונים ראשוניים, endosomes ו lysosomes נוטים להראות תנועתיות גבוהה אצל נוירונים צעירים יותר (4-6 DIV). בהתחשב בכך נוירונים חייבים לספק כמה רכיבים לקצוות המובילים להאריך תהליכים עצביים, סחר קרום צריכה להתרחש באופן דינמי במהלך שלב זה. לכן, חשוב להשתמש נוירונים צעירים יותר כדי לבחון תנועתיות דינמית ב דנדריטים עצביים. בנוסף, שלפוחית גדולה יותר לא נוטים להציג תנועתיות גבוהה, אפילו אצל נוירונים צעירים יותר. תקנה של גודל שלפוחית סביר מעורב בתדירות של צעדים ביקוע היתוך. ייתכן כי שלפוחיות ספציפיות שאינן נעות באופן דינמי בקלות לקבל שלפוחיות אחרות בקלות לסיים את התנועות שלהם. לכן, בחירת שלפוחית היא תהליך חשוב לניתוח זה.
מספר חבילות תוכנה לחיבור בחינם זמינות לאובייקטים המעקב אחר 21 . לדוגמה, המסלולחבילת Mate יכול לעקוב אחר אובייקטים 22 והוא יכול להיות שונה על ידי תוכנה מספריים, המספקים מגוון של מידע מתמטי. מצד שני, זה קצת מסובך להשתמש עבור ניתוח תמונה פשוטה יחסית בפרוטוקול זה. Mtrack2 הוא עוד תוסף והוא מבוסס על MultiTracker התוספת 23 . Mtrack2 הוא גם שימושי כי זה יכול לזהות מטרות ולאחר מכן לקבוע אילו מטרות במסגרות הבאות הם הקרובים ביותר. גישה זו שימושית לכימות כמויות עצומות של נתונים; עם זאת, מעקב ידני עשוי להיות אמין יותר עבור אמצעי אחסון קטנים יותר של נתוני תמונה. לכן, אנו ממליצים על מעקב ידני לכימות קבוצות נתונים קטנות יותר ולהכיר בכך שעדיף להשתמש בתוכנות אחרות כדי לפקח על אמצעי אחסון גדולים יותר.
יש לנקוט כמה אמצעי זהירות בגישה זו. ראשית, קצב הדגימה צריך להיות גבוה על מנת לקבל נתונים קפדניים. הסיבה לכך היא כי כמה שלפוחית התערוכה תנועה מהירהשינויים פתאומיים, כגון פיוז'ן הביקוע, ואת המראה-היעלמות אירועים נצפים מדי פעם, המציין כי הדמיה תכופים הוא חיוני כדי למנוע לפספס את הסימן של שינויים כלשהם. נקודה נוספת היא כי השימוש במיקרוסקופים מתקדמים, כגון מיקרוסקופים סריקה דיסק confocal ו מיקרוסקופים פלואורסצנטי השתקפות פנימית מלאה, עשוי להיות המפתח להשגת ברזולוציה גבוהה, נתונים מעניינים. מומלץ לקחת תמונות במרווחים קצרים יותר באמצעות מיקרוסקופ high-end, אם כי כאן, תמונות נלקחו כל 5 S עקב מגבלות הציוד.
מחקרים משמעותיים הציעו קשר ביולוגי בין סחר קרום להפרעות נוירונים 2 . לדוגמה, הוכח כי פגמים ליזוזומליים מעורבים בהפרעות נוירונים חמורות, כגון מחלת נימאן-פיק ומחלת גושה 24 . למרבה הפלא, מספר מחקרים דיווחו כי תנועה ליזוזומלית לוקליזציה מעורביםהופעת הפרעת אחסון lysosomal 6 . זה אפשרי כי תנועת שלפוחית יכול לשמש סמן ביולוגי עבור הפרעות אלה. גישה מעניינת אחת עשויה לנבוע מהזמינות של תאים גזעיים Pluripotent המושרה על ידי אדם (iPSCs). חקירת תנועת שלפוחית באמצעות נוירונים הנגזרים iPSCs עשוי לחשוף ביומרקר עבור הפרעות אחסון lysosomal. גישה זו מספקת כמה רמזים לתהליכים המונחים ביסוד הסיכון למחלה.
מאז assay זה פשוט, קל להשיג נתונים התנועה. כמו כן, הוא חל על ניתוח של אירועים סלולריים אחרים, כולל הגירה ושינויים מורפולוגיים. חשוב לציין כי לגישה זו יש מספר מגבלות הנובעות מפשטותה. ככזה, יש צורך להשתמש בגישות אחרות, כולל electrophysiology, ביוכימיה, וניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים, כדי להבין את הרלוונטיות הפיזיולוגית המדויקת של סחר עצבי. עם זאת, גישה זו היא מתו יקרד זה מתאים לחוקרים שרוצים לנתח את הסחר באופן פשוט ויעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ריקרדו דולמטש (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, השתייכות נוכחית: מכוני נוברטיס למחקר ביו-רפואי) על סיוע בפיתוח ניתוח זה וד"ר מתיו ווד, טקומה איהארה ודנגסוק קים לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
- ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
