Summary
膜运输的调查对于了解神经元功能至关重要。在这里，我们介绍一种量化神经元囊泡运动性的方法。这是一种方便的方法，可以适应于神经系统膜运输的量化。
Abstract
在大脑中，膜运输系统在调节神经元功能，如神经元形态，突触可塑性，存活和胶质细胞通讯中发挥重要作用。迄今为止，许多研究报道，这些系统中的缺陷引起各种神经元疾病。因此，了解囊泡动力学的机制可能会提供有助于治疗几种神经元疾病的有影响力的线索。在这里，我们使用ImageJ平台的软件插件描述了一种量化囊泡运动的方法，例如运动距离和运动速度。为了获得定量图像，我们用EGFP标记的囊泡标记蛋白标记神经元内体 - 溶酶体结构，并使用延时显微镜观察囊泡的运动。该方法非常有用，简化了神经突，如轴突和树突，以及神经元和神经胶质细胞的神经元测量囊泡运动。 Furthermo这种方法可以应用于其他细胞系，如成纤维细胞和内皮细胞。这种方法可以为我们对膜运输的理解提供有价值的推动。
Introduction
内源 - 溶酶体运输的精确控制对于调节神经元功能是必不可少的。值得注意的是，这些囊泡的动态运动是神经元形态，发育和生存调节的关键因素。该系统的缺陷引起严重的神经元疾病1,2 。将囊泡运输与神经元疾病相关联的分子机制被认为是复杂的，并且有几个组织试图检查这种相关性。例如，已经报道，扰动的晚期内体运动性与尼曼 - 皮克C病3 （由溶酶体缺陷引起的遗传性神经变性疾病）显着相关。另一个例子是溶酶体Ca 2+通道的突变， trpml1 ，其损害溶酶体运动，导致溶酶体贮积病4,5 ， 6 。我们的研究小组报道，PtdIns（3,5）P 2转换的失调抑制了神经元中的内体和溶酶体运动，导致应激反应脆弱性增加7,8 。 PtdIns（3,5）P 2的代谢调节，其主要定位于晚期内体和溶酶体上，在多种细胞功能中起重要作用，包括囊泡运输和融合裂变过程9,10 。由于受损的PtdIns（3,5）P 2周转导致严重的神经变性11,12 ，内体 - 溶酶体运动的异常调节可能是了解神经变性发病机理的关键因素。对囊泡运动基础的分子机制的调查可能因此提供有希望的线索，可以加深我们的不便了解几种神经元疾病。
在本文中，我们引入了一种有价值的方法来量化神经元中的囊泡运动，使用自由软件包称为手动跟踪。目的是开发一种快速量化方法来分析囊泡运动。该定量是通过点击延时电影的每个帧中的参考点的标准方法进行的。与其他应用程序不同，使用手动跟踪软件使此方法非常简单，具有广泛的实用性。此外，该方法也适用于其他细胞，例如胶质细胞。虽然这种方法是原始的，但它可以应用于各种分析，包括细胞运动和形态变化。例如，在跨越图像序列定义参考点之后，可以使用数据分析和图像处理软件从连续图像中提取关于参考点的位置和每个位置处的时间的信息洁具。综合起来，这种方法简单而有力，有助于提高基于膜运输的研究的效率的发展，例如检查内体 - 溶酶体功能的研究。
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Protocol
所有动物手术均经筑波大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准进行。
解剖
- 为了准备胚胎13-14日ICR或C57BL / 6胎儿，通过颈椎脱位安乐死怀孕的小鼠。取出子宫，并用汉克平衡盐溶液（HBSS）将其放入培养皿中。冲洗干净，以清除血液。
- 使用镊子，将子宫转移到具有70％乙醇的新培养皿中以消毒。
- 将子宫转移到带有HBSS的新培养皿中。使用消毒的解剖镊子和手术剪刀从子宫去除胎儿。
- 使用外科剪刀切断胎儿。将它们放入带有HBSS的新培养皿中。
- 取出皮肤和头骨，取出大脑使用灭菌解剖钳。将它们放入带有HBSS的培养皿中。
注意：从这一步开始，最好在干净的情况下进行该程序替补。 - 在立体显微镜下使用灭菌解剖镊子取出脑膜。使用镊子切除基底神经节，海马和小脑。使用弯尖钳，将皮质转移到带有HBSS的新培养皿中。
- 使用一次性滴管或25 mL移液管收集所有皮质。将其放入15 mL管中，然后用移液器取出HBSS。
- 将3mL脑皮质酶溶液加入到含有皮质的管中。将该管放入水浴中，37℃下孵育5分钟。
注意：用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA制备由磷酸盐缓冲盐水（PBS）组成的脑皮质培养物。用0.22μm过滤器灭菌。 - 在含有皮质的管中再加入3 mL脑皮质酶溶液，并在37°C的水浴中孵育另外5 min。
- 使用5 mL移液管取出脑皮质酶溶液，加入5 mL Dulbe含有10％胎牛血清（FBS）的cco's Modified Eagle Medium（DMEM）。
- 通过使用无菌P1000提示的5 mL移液管轻轻上下移动皮质分离皮质。再次使用带有P200尖端的5 mL移液管移液。
- 将40μm尼龙细胞过滤器放在50mL管上，过滤悬浮液以除去碎屑。
- 在室温下以420×g离心5分钟，然后除去DMEM培养基。
- 加入5 mL脑皮层培养液，轻轻重悬细胞沉淀。
注意：准备一个脑皮层培养基，由补充有1×B-27补充剂，2mM L-谷氨酰胺和100U / mL青霉素链霉素的神经元基础培养基组成。 - 使用血细胞计数器计数细胞，并使用脑皮层培养基调节细胞浓度（根据需要）。
- 平板3.0×10 6皮质神经元，每个涂覆的35毫米玻璃底盘2.0毫升。
注意：电镀前，涂上具有0.1mg / mL聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）或0.01％聚-L-鸟氨酸（PLO）的35mmm玻璃底盘。在37℃下孵育3小时-O / N，并用PBS洗涤至少3次。
成像囊泡运动
- 准备标记每种类型囊泡的质粒。例如，使用EGFP-Rab5用于早期内体，EGFP-Rab7用于晚期内含体，LAMP-EGFP用于溶酶体，EGFP-LC3用于自噬体8,13。
注意：这些质粒可根据tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp的要求提供。通常使用转染试剂可以用这些质粒转染3〜5天体外 （DIV）神经元。 - 通过移液将200μg无血清培养基混合4.0μg质粒。在单独的管中，在200μL无血清培养基中稀释8μL转染试剂（参见表格 ）。在室温下孵育5分钟。
- 通过移液将步骤2.2中的质粒溶液和转染剂溶液混合。在室温下孵育20分钟。
- 将无血清培养基和400μL来自步骤2.3的质粒溶液加入到每个涂覆的玻璃底盘中。在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育30分钟。用2 mL大脑皮质培养基代替培养基。在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育神经元1-2天。
- 转染1 - 2 d后，选择转染的细胞进行图像采集。
注意：小于7 DIV的早产神经元具有呈现动态囊泡运动的趋势。选择适度表达荧光探针的神经元，因为当选择高度表达的神经元时，无法获得清晰的图像。此外，选择具有长轴突和复杂树突的典型神经元形状，例如锥体神经元，以便于鉴定轴突和树突（参见图1A）。 - 使用延时成像系统进行图像采集：
对于成像，请使用配备有40X Plan Apo 0.95NA或100X Plan Apo VC NA1.4物镜的电荷耦合器件（CCD）相机的荧光显微镜。使用孵育系统控制温度在37°C。在图像采集软件控制的100s周期内以1帧/ 5s获取神经元图像。或者，以更短的间隔和更长的时间段采集图像，例如在300s的时间段内每2秒一帧。
注意：各种应用程序可用于拍摄顺序图像，其中许多应用将适用于此方法。因此，没有特别的应用推荐;相反，每个研究者都应该使用任何可用的应用程序。
图像分析
- 使用手动跟踪14在ImageJ软件中打开所有顺序图像。
注意：到目前为止，手动跟踪一直是wi用于跟踪实验15,16,17,18,19。手动跟踪由FabriceCordelières博士研发。详细的书面说明可在线20 。为了分析，利用足够数量的图像来提高成像数据的质量。建议使用20张以上的图像。 - 要组合顺序图像，请选择<图像>→<堆叠>→<图像到堆叠>。单击<确定>。
- 选择<插件>→<手动跟踪>;将弹出跟踪窗口。
- 单击<显示参数？>复选框，并在参数部分中定义跟踪参数。
注意：可以设置几个参数，包括时间间隔，x / y校准，z校准，搜索中心的正方形尺寸点数，点大小，行宽和字体大小。在这个简化的测定中，定义了时间间隔和x / y校准。在其他实验情况下，也可能需要定义其他参数。这里使用的参数如下：<时间间隔>为5秒，对于40X Plan Apo 0.95NA物镜，<x / y校准>为0.26642μm，对于100X Plan Apo VC NA1.4为0.10657μm物镜。 - 定义参数后，单击<添加轨迹>开始新的轨道。
- 在确定感兴趣的囊泡（ 例如， 图1A中的蓝色和红色箭头所示的囊泡（右图））后，点击顺序图像中信号的中心记录xy坐标。记录的xy坐标，距离和速度的结果显示在新窗口中。
注意：在溶酶体的情况下，大的明亮的荧光信号（ 例如，ure 1A（右图），橙色箭头）经常在神经元中观察到。由于这些信号偶尔表现出积聚的囊泡或病理性静脉曲张，因此应避免这些信号以量化运动性。 - 重复步骤3.6从所有顺序图像收集囊泡的xy坐标;在选择参考点后，每个图像自动前进到连续图像。
- 将这些数据导出到新表（ 例如电子表格）。使用适当的软件创建一个合适的图表（参见表格材料 ）。
注意：要分析数据，选择<距离>列，总结该列的所有值，并将运动距离显示为条形图， 如图1B所示 。此外，重复此步骤，计算总运动距离的平均值，并显示为条形图， 如图1C所示 。创建条形图和波形数据的软件如图所示材料表。
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Representative Results
该测定设计用于测量体外培养中的囊泡动力学。该测定用于确定与神经元形态和存活相关的囊泡运动性。 图1A和B显示了显示神经元溶酶体运动性的代表性数据。皮质神经元用溶酶体标记LAMP-EGFP转染，并使用标准荧光显微镜观察。以前曾报道，即使在静息神经元中，特异性内体溶酶体囊泡也是高度移动的。实际上，这些结果表明在相同的枝晶中静止和移动的囊泡（ 图1A和B ）。通常，静息囊泡在神经元树突中表现出振动运动，如布朗运动。相反，移动的囊泡表现出不规则的运动。我们推测每个囊泡都有所不同组成特征是功能测定的基础，即使在溶酶体囊泡8中 。因此，使用这种方法分类囊泡可能提供有用的信息。使用该系统，可以容易地量化这些囊泡的平均动力（ 图1C ）并且以时间有效的方式分析使用该系统的囊泡性质。
图1：神经元树突状体中的溶酶体运动。 （ A ）用LAMP-EGFP质粒转染小鼠皮质神经元（4DIV）2天。该图像显示在树突中含有LAMP-EGFP的囊泡的运动性。插图显示LAMP-EGFP阳性囊泡的延时图像。红色箭头表示移动囊泡，蓝色箭头指示静止的囊泡。橙色箭头表示较大的荧光信号，参考到上面刻度棒=20μm。 （ B ）来自图A的LAMP-EGFP阳性小泡的时间依赖性x轴位置。标记为（b）的红色圆圈中的囊泡移动，标有（a）的蓝色圆圈中的囊泡静止。刻度棒：5μm（左）。条形图表示LAMP-EGFP移动的总距离（右）。 （ C ）条形图表示含有LAMP-EGFP的囊泡的平均运动距离。 （n = 5，平均值±标准误差[SEM]，** p <0.01，由学生t检验）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议介绍了囊泡运动量的定量程序。在原代神经元中，内含体和溶酶体往往在年轻神经元（4-6 DIV）中表现出较高的运动能力。鉴于神经元必须将一些成分递送到前端以延长神经过程，因此膜运输应在此阶段动态发生。因此，使用年轻神经元观察神经元树突中的动态运动是重要的。此外，即使在年轻的神经元中，较大的囊泡也不会表现出较高的运动性。囊泡大小的调节可能涉及融合裂变步骤的频率。不能动态移动的特定囊泡可能容易容易地接受其他囊泡并终止其运动。因此，选择囊泡是此分析的重要过程。
几个免费的插件软件包可用于跟踪对象21 。例如，Track伴侣包可以跟踪对象22 ，并且可以通过数字软件修改，提供一系列数学信息。另一方面，在本协议中使用相对简单的图像分析稍微复杂一点。 Mtrack2是另一个插件，基于MultiTracker插件23 。 Mtrack2也很有用，因为它可以识别目标，然后确定后续帧中的哪个目标是最接近的。这种方法对于量化大量数据很有用;然而，对于较小体积的图像数据，手动跟踪可能更可靠。因此，我们建议您使用手动跟踪来量化较小的数据集，并确认使用其他软件监控更大的卷可能会更好。
这种方法应该采取几点预防措施。首先，为了获得严格的数据，采样率应该很高。这是因为一些囊泡表现出快速运动偶尔观察到诸如融合裂变和外观消失事件之类的突然变化，表明频繁成像对于避免错过任何变化的迹象至关重要。另一点是使用高端显微镜，如扫描盘共焦显微镜和全内反射荧光显微镜，可能是获得高分辨率，有趣数据的关键。建议使用高端显微镜以更短的间隔拍摄图像，但是由于设备限制，这里每5秒拍摄一次图像。
大量研究表明膜运输与神经元疾病之间存在生物关系2 。例如，已经证明溶酶体缺陷涉及严重的神经元疾病，例如尼曼 - 皮克病和戈谢病24 。有趣的是，有几项研究报道，溶酶体运动和定位涉及到溶酶体储存障碍的发病6 。可以将囊泡运动性用作这些疾病的生物标志物。人类诱导的多能干细胞（iPSCs）的可用性可能产生一种有趣的方法。使用iPSCs衍生的神经元调查囊泡运动可能会揭示溶酶体储存障碍的生物标志物。这种方法为基于疾病风险的过程提供了一些线索。
由于该测定很简单，所以容易获得动力学数据。此外，它适用于其他细胞事件的分析，包括迁移和形态学变化。重要的是要注意，由于其简单性，这种方法有几个限制。因此，有必要采用其他方法，包括电生理学，生物化学和电子显微镜分析，以了解神经元运输的精确生理相关性。然而，这种方法是一种有价值的方法d适合于那些想以直接和时间有效的方式分析贩运的研究人员。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
感谢Ricardo Dolmetsch博士（斯坦福大学医学院;现任隶属机构：诺华生物医学研究所），协助开展此项分析，马修·伍德博士，宝马爱原，以及董秀金博士对手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
- ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
