Summary
Undersøgelsen af membranhandel er afgørende for forståelsen af neuronale funktioner. Her introducerer vi en metode til kvantificering af vesikelmotilitet i neuroner. Dette er en bekvem metode, som kan tilpasses kvantificering af membranhandel i nervesystemet.
Abstract
I hjernen spiller membranhandelssystemer vigtige roller i regulering af neuronale funktioner, såsom neuronal morfologi, synaptisk plasticitet, overlevelse og glial kommunikation. Til dato har mange undersøgelser rapporteret, at defekter i disse systemer forårsager forskellige neuronale sygdomme. Således kan forståelse af mekanismerne bagved vesikeldynamikken tilvejebringe indflydelsesrige spor, som kunne hjælpe til behandling af flere neuronale lidelser. Her beskriver vi en metode til kvantificering af vesikelmotiliteter, såsom bevægelsesafstand og bevægelseshastighed, ved hjælp af en software plug-in til ImageJ-platformen. For at opnå billeder til kvantificering mærket vi neuronale endosomlysosomstrukturer med EGFP-mærket vesikelmarkørproteiner og observerede bevægelsen af vesikler ved anvendelse af en tidsforskydningsmikroskopi. Denne metode er yderst nyttig og forenkler måling af vesikelmotilitet i neuritter, såsom axoner og dendritter, såvel som i soma af både neuroner og glialceller. FurthermoIgen, denne metode kan anvendes på andre cellelinjer, såsom fibroblaster og endotelceller. Denne tilgang kunne give en værdifuld fremgang i vores forståelse af membranhandel.
Introduction
Præcis kontrol med endosomlysosomhandel er uundværlig for regulering af neuronfunktionen. Navnlig er de dynamiske bevægelser af disse vesikler en nøglefaktor, der ligger til grund for reguleringen af neuronal morfologi, udvikling og overlevelse. Fejl i dette system forårsager alvorlige neuronale lidelser 1 , 2 . De molekylære mekanismer, der forbinder vesikelhandel med neuronale sygdomme, betragtes som komplicerede, og flere grupper har forsøgt at undersøge denne relevans. For eksempel er det blevet rapporteret, at perturbed late endosomotilitet er signifikant forbundet med Niemann-Pick C-sygdom 3 , en arvelig neurodegenerativ lidelse forårsaget af lysosom defekter. Et andet eksempel er en mutation i en lysosomal Ca 2+ kanal, trpml 1, hvilket nedsætter lysosomalmotilitet, hvilket resulterer i lysosomale lagringssygdomme 4 , 5 , 6 . Vores gruppe har rapporteret, at dysregulering af PtdIns (3,5) P 2 omsætning undertrykker endosom og lysosommotilitet i neuroner, hvilket fører til en øget sårbarhed over for stressrespons 7 , 8 . Den metaboliske regulering af PtdIns (3,5) P 2 , som hovedsagelig lokaliseres på late endosomer og lysosomer, spiller en vigtig rolle i en bred vifte af cellulære funktioner, herunder vesikelhandel og fusionsfissionprocesser 9 , 10 . Da nedsat PtdIns (3,5) P 2 omsætning forårsager alvorlig neurodegeneration 11 , 12 , kan den afvigende regulering af endosomlysosommotilitet være en nøglefaktor for at forstå patogenesen af neurodegenerering. En undersøgelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for vesikelmotilitet, kan således give lovende spor, der kan uddybe vores undeResning af flere neuronale lidelser.
I dette papir introducerer vi en værdifuld metode til at kvantificere vesikelmotilitet i neuroner ved hjælp af en gratis softwarepakke kaldet Manuel Tracking. Målet var at udvikle en hurtig kvantificeringsmetode til analyse af vesikelmotilitet. Denne kvantificering er rettet gennem en standard tilgang til at klikke på et referencepunkt i hver ramme af en time-lapse film. Brugen af Manual Tracking-softwaren gør denne fremgangsmåde ret simpel og af bred nytte, i modsætning til andre applikationer. Endvidere er denne fremgangsmåde også anvendelig for andre celler, såsom glialceller. Selv om denne metode er primitiv, kan den anvendes på forskellige analyser, herunder cellulær motilitet og morfologisk forandring. Efter at have defineret et referencepunkt på tværs af en sekvens af billeder, kan information om positionerne af referencepunkterne og tiden i hver position ekstraheres fra sekventielle billeder ved hjælp af dataanalyse og billedbehandlingsmjukware. Tværtimod er denne metode enkel, men kraftig og bidrager til udviklingen af forbedret effektivitet i undersøgelser baseret på membranhandel, såsom dem, der undersøger endosomlysosomfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprocedurer blev udført med godkendelse fra University of Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissektion
- For at forberede embryonale dag 13-14 ICR eller C57BL / 6 fostre, euthaner gravide mus ved cervikal dislokation. Fjern livmoderen og læg den i en petriskål med Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Skyl det godt for at fjerne blodet.
- Overfør livmoderen med en pincet til en ny petriskål med 70% ethanol for at sterilisere.
- Overfør livmoderen til en ny petriskål med HBSS. Fjern fostrene fra livmoderen ved hjælp af steriliserede dissecting tang og kirurgiske saks.
- Dekapiter fostrene ved hjælp af kirurgiske saks. Placer dem i en ny petriskål med HBSS.
- Fjern hud og kraniet og tag hjernerne ud ved hjælp af steriliserede dissekeringspincer. Sæt dem i en petriskål med HBSS.
BEMÆRK: Fra dette trin er det bedst at udføre proceduren på en renbænk. - Fjern meninges ved hjælp af steriliserede dissecting pincet under et stereomikroskop. Afskær den basale ganglia, hippocampus og cerebellum ved hjælp af pincet. Ved hjælp af buede tip tænger, overfør corticesne til en ny petriskål med HBSS.
- Saml alle cortices med en engangsdråber eller en 25 ml pipette. Sæt dem i en 15 ml rør og fjern derefter HBSS ved pipettering.
- Tilsæt 3 ml cerebral kortikal enzymopløsning til røret indeholdende cortices. Sæt dette rør i et vandbad og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
BEMÆRK: Forbered et cerebralt kortikalt kulturenzym bestående af phosphatbufferet saltvand (PBS) med 0,25% trypsin og 1 mM EDTA. Steriliseres med et 0,22 μm filter. - Tilsæt yderligere 3 ml cerebral kortikal enzymopløsning i røret indeholdende cortices og inkuber ved 37 ° C i et vandbad i yderligere 5 minutter.
- Fjern den cerebrale kortikale enzymopløsning ved hjælp af en 5 ml pipette og tilsæt 5 ml DulbeCco's Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Dissociate cortices ved forsigtigt pipettering op og ned ved hjælp af en 5 mL pipette med en steril P1000 tip. Pipette igen med en 5 ml pipette med et P200 tip.
- Sæt en 40 μm nyloncellefilm på et 50 ml rør og filtrer suspensionen for at fjerne snavs.
- Centrifuge ved 420 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og fjern derefter DMEM-mediumet.
- Tilsæt 5 ml cerebralt kortikalt dyrkningsmedium og forsigtigt resuspender cellepellet.
BEMÆRK: Forbered et cerebralt kortikalt dyrkningsmedium bestående af neuron basalt medium suppleret med 1x B-27 kosttilskud, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin streptomycin. - Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og juster cellekoncentrationen (som ønsket) under anvendelse af det cerebrale kortikale dyrkningsmedium.
- Plade 3,0 × 10 6 kortikale neuroner i 2,0 ml pr. Coatede 35 mm glasbundede tallerkener.
BEMÆRK: Før plettering, belæg den35mmm glasbundede fade med 0,1 mg / ml Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL) eller 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubér i 3 timer - O / N ved 37 ° C og vask med PBS mindst 3x.
2. Imaging Vesicle Motility
- Forbered de plasmider, der vil mærke hver type vesikel. For eksempel, brug EGFP-Rab5 til tidlige endosomer, EGFP-Rab7 til late endosomer, LAMP-EGFP for lysosomer og EGFP-LC3 til autophagosomer 8 , 13 .
BEMÆRK: Disse plasmider er tilgængelige på forespørgsel fra tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Typisk kan 3 -5 dage in vitro (DIV) neuroner transficeres med disse plasmider under anvendelse af transfektionsreagenser. - Bland 4,0 μg plasmider med 200 μl serumfrit medium ved pipettering. I et separat rør fortyndes 8 μl transfektionsreagens (se tabel over materialer ) i 200 μl serumfrit medium. Inkubér i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Bland plasmidopløsningen og transfektionsregentopløsningen i trin 2.2 ved pipettering. Inkubér i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt serumfrit medium og 400 μl af plasmidopløsningen fra trin 2.3 til hver overtrukket glasbunds skål. Inkuber neuronerne ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 30 minutter. Udskift mediet med 2 ml cerebralt kortikalt dyrkningsmedium. Inkuber neuronerne ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 1-2 dage.
- Efter 1 - 2 d transfektion skal du markere de transfekterede celler til billedkøb.
BEMÆRK: Tidligere neuroner mindre end 7 DIV har en tendens til at udvise dynamisk vesikelmotilitet. Vælg neuroner, der moderat udtrykker fluorescens sonden, fordi klare billeder ikke kan opnås, når en stærkt udtrykkende neuron er valgt. Vælg også en typisk neuronform, såsom pyramidale neuroner, som har lange axoner og intrikate dendritter, for at lette identifikationen af axonen og dendritterne (se figur 1A). - Billedoptagelse ved hjælp af et tidsforløb billeddannelsessystem:
Til billedbehandling, brug et fluorescensmikroskop udstyret med et CCD-kamera (CCD) med 40X Plan Apo 0.95NA eller 100X Plan Apo VC NA1.4 objektivlinser. Kontroller temperaturen ved 37 ° C ved hjælp af et inkubationssystem. Acquire neuron billeder på en ramme / 5 s over en 100 s periode styret af billedet opkøb software. Alternativt kan du erhverve billeder med kortere intervaller og længere perioder, f.eks. Ved en ramme pr. 2 s over en 300-s periode.
BEMÆRK: En række applikationer er tilgængelige for at tage sekventielle billeder, hvoraf mange vil være egnede til denne metode. Derfor anbefales ingen særlig anvendelse; I stedet skal hver forsker bruge det, der er tilgængeligt.
3. Billedanalyse
- Åbn alle sekventielle billeder i ImageJ-software med Manuel Tracking 14 .
BEMÆRK: Til dato har manuel sporing været wiDely anvendes til sporing af forsøg 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Manuel Tracking blev udviklet af Dr. Fabrice Cordelières. Detaljerede skriftlige instruktioner er tilgængelige online 20 . Til analysen forbedres billedkvalitetsdata med et tilstrækkeligt antal billeder. Det anbefales at bruge mere end 20 billeder. - For at kombinere de sekventielle billeder skal du vælge <Image> → <Stacks> → <Images to Stack>. Klik på <OK>.
- Vælg <Plugins> → <Manual Tracking>; Et sporingsvindue dukker op.
- Klik på afkrydsningsfeltet for <Vis parametre?> Og definer sporingsparametrene i parametreafsnittet.
BEMÆRK: Flere parametre kan indstilles, inklusiv tidsinterval, x / y-kalibrering, z-kalibrering, søgefeltstørrelse til centerIng, punktstørrelse, linjebredde og skriftstørrelse. I denne forenklede analyse blev både tidsinterval og x / y-kalibrering defineret. Under andre eksperimentelle omstændigheder kan det være nødvendigt at definere andre parametre også. De parametre, der anvendes her, er som følger: <Tidsintervall> er 5 s, og <x / y-kalibrering> er enten 0,26642 μm for en 40X Plan Apo 0.95NA objektivlins eller 0,10657 μm til en 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv linse. - Når parametrene er defineret, skal du klikke på <Tilføj spor> for at starte et nyt spor.
- Efter at have bestemt vesiklerne af interesse ( f.eks. De vesikler, der er angivet med blå og røde pilehoveder i figur 1A (højre panel)), klikker du på midten af signalerne i de sekventielle billeder for at optage xy-koordinaterne. Resultaterne af de registrerede xy-koordinater, afstand og hastighed dukker op i et nyt vindue.
BEMÆRK: I tilfælde af lysosomer kan store lyse fluorescerende signaler ( fx figUre 1A (højre panel), orange pilehoved) observeres ofte i neuroner. Da disse signaler lejlighedsvis udviser enten akkumulerede vesikler eller patologiske varicositeter, bør disse signaler undgås for at kvantificere bevægelighed. - Gentag trin 3.6 for at indsamle xy-koordinaterne for vesikler fra alle sekventielle billeder; Hvert billede fremføres automatisk til det efterfølgende billede, efter at referencepunktet er valgt.
- Eksporter disse data til en ny tabel ( fx et regneark). Brug en passende software til at oprette en passende graf (se Materialebeskrivelse ).
BEMÆRK: For at analysere dataene skal du vælge kolonnen <Afstand>, opsummere alle værdier af denne kolonne og vise en bevægelsesafstand som et stregdiagram, som i figur 1B . Herudover gentages dette trin, beregner gennemsnittet af den totale bevægelsesafstand og viser som et stregdiagram som i figur 1C . Softwaren til oprettelse af en stregdiagram og bølgeformdata vises iMaterialebordet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette assay blev designet til at måle vesikeldynamik i in vitro- kultur. Dette assay blev anvendt til at bestemme vesikelmotiliteten forbundet med neuronal morfologi og overlevelse. Figur 1A og B viser repræsentative data, der viser lysosommotilitet i neuroner. Cortiske neuroner blev transficeret med lysosommarkøren, LAMP-EGFP og observeret under anvendelse af et standard fluorescensmikroskop. Det er tidligere blevet rapporteret, at specifikke endosomlysosomvesikler er meget mobile, selv i hvilende neuroner 8 . Faktisk demonstrerer disse resultater både hvile og bevægelse af vesikler i samme dendrit ( Figur 1A og B ). Normalt udviser hvilende vesikler vibratorisk bevægelse, som Brownian motion, i neuronale dendritter. I modsætning hertil udviser bevægelige vesikler uregelmæssig motilitet. Vi spekulerer på, at hver vesikel har en andenSammensætningsfunktion, som ligger til grund for bestemmelsen af funktionen, selv i lysosomvesikler 8 . Således kan klassificeringen af vesikler ved anvendelse af denne fremgangsmåde tilvejebringe nyttig information. Ved hjælp af dette system er det let at kvantificere gennemsnitsmotiliteten af disse vesikler ( figur 1C ) og at analysere vesikelegenskaberne ved hjælp af dette system på en tidseffektiv måde.
Figur 1: Lysosommotilitet i neuronale dendritter. ( A ) Mus-kortikale neuroner (4 DIV) blev transficeret med LAMP-EGFP-plasmid i 2 dage. Dette billede viser bevægeligheden af LAMP-EGFP-holdige vesikler i dendritterne. Indsætet viser tidsforløbsbilledet af LAMP-EGFP-positive vesikler. Den røde pilehoved angiver en bevægelig vesikel, og den blå pilehoved angiver en hvilevesikel. De orange pilehoveder angiver større fluorescerende signaler som omtaltTil ovenfor. Skalbjælke = 20 μm. ( B ) Den tidsafhængige x-akse position af LAMP-EGFP-positive vesikler fra figur A. Vesiklen i den røde cirkel mærket (b) bevæger sig, og vesiklen i den blå cirkel mærket (a) hviler. Skalestang: 5 μm (til venstre). Stanggrafen angiver den totale afstand af LAMP-EGFP-bevægelsen (højre). ( C ) Stanggrafen angiver gennemsnitsmotilitetsafstanden af LAMP-EGFP-holdige vesikler. (N = 5, middelværdi ± standardfejl af middelværdien [SEM], ** p <0,01 ved Studentens t- test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol introducerer fremgangsmåden til kvantificering af vesikelmotilitet. I primære neuroner har endosomer og lysosomer tendens til at vise høj bevægelighed i yngre neuroner (4-6 DIV). Da neuroner skal levere nogle komponenter til de forreste kanter for at forlænge neurale processer, bør membranhandel foregå dynamisk i løbet af dette stadium. Det er således vigtigt at bruge yngre neuroner til at observere dynamisk motilitet i neuronale dendritter. Derudover har større vesikler ikke tendens til at udvise høj bevægelighed, selv i yngre neuroner. Reguleringen af vesikelstørrelsen er sandsynligvis involveret i hyppigheden af fusionsfissionstrin. Det kan være muligt, at bestemte vesikler, der ikke bevæger sig dynamisk, nemt accepterer andre vesikler og afslutter deres bevægelser. Selektion af vesikler er således en vigtig proces til denne analyse.
Der findes flere gratis plug-in-softwarepakker til sporing af objekter 21 . For eksempel SporetMate pakke kan spore objekter 22 og kan modificeres ved hjælp af numerisk software, der giver en række matematiske oplysninger. På den anden side er det lidt kompliceret at bruge til den relativt enkle billedanalyse i denne protokol. Mtrack2 er en anden plug-in og er baseret på MultiTracker plug-in 23 . Mtrack2 er også nyttig, fordi det kan identificere mål og derefter bestemme hvilke mål i følgende rammer, der er tættest. Denne tilgang er nyttig til kvantificering af enorme datamængder; Men manuel sporing kan være mere pålidelig for mindre mængder billeddata. Derfor anbefaler vi Manuel Tracking til at kvantificere mindre sæt data og erkende, at det kan være bedre at bruge anden software til at overvåge større volumener.
Der skal tages flere forholdsregler i denne tilgang. For det første bør prøveudtagningen være høj for at opnå strenge data. Dette skyldes, at nogle vesikler udviser hurtig bevægelse ogAbrupte ændringer, såsom fusionsfission og forekomst-forsvindingshændelser ses lejlighedsvis, hvilket indikerer, at hyppig billeddannelse er afgørende for at undgå at savne tegn på ændringer. Et andet punkt er, at brugen af high-end-mikroskoper, såsom scanning-disk-konfokale mikroskoper og samlede interne refleksionsfluorescensmikroskoper, kan være nøglen til at opnå højopløsningsinteressante data. Det anbefales at tage billeder med kortere intervaller ved hjælp af et high-end-mikroskop, selv om billeder her blev taget hver 5. s på grund af udstyrsbegrænsninger.
Væsentlige undersøgelser har foreslået et biologisk link mellem membranhandel og neuronale lidelser 2 . For eksempel er det blevet påvist, at lysosomale defekter er involveret i svære neuronale lidelser, såsom Niemann-Pick-sygdom og Gaucher-sygdom 24 . Interessant har flere undersøgelser rapporteret om, at lysosomal bevægelse og lokalisering er involveret iUdbrud af lysosomal lagringsforstyrrelse 6 . Det er muligt, at vesikelmotilitet kan anvendes som biomarkør for disse lidelser. En interessant tilgang kan skyldes tilgængeligheden af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Undersøgelse af vesikelmotilitet ved hjælp af iPSCs-afledte neuroner kan afsløre en biomarkør for lysosomale opbevaringsforstyrrelser. Denne tilgang giver nogle spor til de processer, der ligger til grund for sygdomsrisikoen.
Da dette assay er simpelt, er det nemt at opnå motilitetsdata. Den er også anvendelig til analyse af andre cellulære begivenheder, herunder migration og morfologiske ændringer. Det er vigtigt at bemærke, at denne tilgang har flere begrænsninger på grund af sin enkelhed. Som sådan er det nødvendigt at anvende andre tilgange, herunder elektrofysiologi, biokemi og elektronmikroskopanalyse, for at forstå den nøjagtige fysiologiske relevans af neuronalt menneskehandel. Ikke desto mindre er denne tilgang en værdifuld methoD, der er velegnet til forskere, der ønsker at analysere handel på en retfærdig og tidseffektiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, nuværende tilknytning: Novartis Institutes for Biomedical Research) for at hjælpe med at udvikle denne analyse og Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara og Dongsook Kim for deres kritiske læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
- ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
