Summary
Utredningen av membranhandel är avgörande för att förstå neuronfunktioner. Här introducerar vi en metod för att kvantifiera vesikelmotilitet i neuroner. Detta är en bekväm metod som kan anpassas till kvantifieringen av membranhandel i nervsystemet.
Abstract
I hjärnan spelar membranhandelssystem viktiga roller för att reglera neuronfunktioner, såsom neuronal morfologi, synaptisk plasticitet, överlevnad och glial kommunikation. Hittills har många studier rapporterat att defekter i dessa system orsakar olika neuronala sjukdomar. Således kan förståelse av mekanismerna som ligger bakom vesikeldynamiken ge inflytelserika ledtrådar som kan hjälpa till vid behandling av flera neuronala störningar. Här beskriver vi en metod för att kvantifiera vesikelmotiliteter, såsom rörelseavstånd och rörelsehastighet, med hjälp av en plug-in för ImageJ-plattformen. För att erhålla bilder för kvantifiering märkte vi neuronala endosomlysosomstrukturer med EGFP-märkta vesikelmarkörproteiner och observerade rörelsen av vesiklar med hjälp av en tidsförlindningsmikroskopi. Denna metod är mycket användbar och förenklar mätning av vesikelmotilitet i neuriter, såsom axoner och dendriter, liksom i soma av både neuroner och glialceller. FurthermoÅterigen kan denna metod appliceras på andra cellinjer, såsom fibroblaster och endotelceller. Detta tillvägagångssätt skulle kunna ge en värdefull framsteg för vår förståelse av membranhandel.
Introduction
Exakt kontroll av endosomlysosomhandel är oumbärlig för att reglera neuronfunktionen. De dynamiska rörelserna hos dessa vesiklar är särskilt en nyckelfaktor som ligger bakom regleringen av neuronal morfologi, utveckling och överlevnad. Defekter i detta system orsakar allvarliga neuronala störningar 1 , 2 . De molekylära mekanismerna som knyter vesikelhandel till neuronala sjukdomar anses vara komplicerade, och flera grupper har försökt undersöka denna relevans. Det har till exempel rapporterats att perturbed late endosomotilitet är signifikant associerad med Niemann-Pick C-sjukdom 3 , en ärftlig neurodegenerativ sjukdom orsakad av lysosomfel. Ett annat exempel är en mutation i en lysosomal Ca2 + -kanal, trpml 1, vilket inverkar på lysosomal motilitet, vilket resulterar i lysosomala lagringssjukdomar 4 , 5 , 6 . Vår grupp har rapporterat att dysregulering av PtdIns (3,5) P 2 omsättning undertrycker endosom och lysosomotilitet i neuroner vilket leder till en ökning av sårbarheten för stressresponsen 7 , 8 . Den metaboliska reglering av PtdIns (3,5) P 2 , som mestadels lokaliserar sig på sena endosomer och lysosomer, spelar en viktig roll i en mängd olika cellulära funktioner, inklusive vesikelhandel och fusionsfissionprocesser 9 , 10 . Eftersom nedsatt PtdIns (3,5) P 2 omsättning orsakar allvarlig neurodegeneration 11 , 12 , kan avvikande reglering av endosomlysosommotilitet vara en nyckelfaktor för att förstå patogenesen för neurodegenerering. En undersökning av de molekylära mekanismerna som ligger till grund för vesikelmotilitet kan således ge lovande ledtrådar som kan fördjupa vår undeRstanding av flera neuronala störningar.
I det här dokumentet introducerar vi en värdefull metod för att kvantifiera vesikelmotilitet i neuroner med ett gratis mjukvarupaket som heter Manual Tracking. Syftet var att utveckla en snabb kvantifieringsmetod för analys av vesikelmotilitet. Denna kvantifiering riktas genom en standardinriktning för att klicka på en referenspunkt i varje ram av en time-lapse-film. Användningen av Manual Tracking-mjukvaran gör att detta synsätt är ganska enkelt och brett, till skillnad från andra tillämpningar. Vidare är detta tillvägagångssätt även användbart för andra celler, såsom glialceller. Även om denna metod är primitiv kan den tillämpas på olika analyser, inklusive cellmotilitet och morfologisk förändring. Efter att ha definierat en referenspunkt över en sekvens av bilder kan information om positionerna för referenspunkterna och tiden vid varje position extraheras från sekventiella bilder med hjälp av dataanalys och bildbehandlingsmjukgods. Sammantaget är denna metod enkel men kraftfull och bidrar till utvecklingen av förbättrad effektivitet i studier baserade på membranhandel, såsom de som undersöker endosomlysosomfunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer utfördes med godkännande av University of Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissektion
- För att förbereda embryonal dag 13-14 ICR- eller C57BL / 6-foster, avliva gravida möss genom cervikal dislokation. Ta bort livmodern och sätt den i en petriskål med Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Skölj det bra för att ta bort blodet.
- Överför livmodern till en ny petriskål med 70% etanol för att sterilisera.
- Överför livmodern till en ny petriskål med HBSS. Ta bort fostren från livmodern med hjälp av steriliserade dissekeringspincetter och kirurgiska saxar.
- Avsluta fostren med kirurgiska saxar. Placera dem i en ny petriskål med HBSS.
- Ta bort hud och skalle och ta bort hjärnorna med hjälp av steriliserade dissekeringspincett. Lägg dem i en petriskål med HBSS.
OBS! Från det här steget är det bäst att genomföra proceduren på en renbänk. - Ta bort meningesna med hjälp av steriliserade dissekeringspincett under ett stereomikroskop. Klipp av basala ganglier, hippocampus och cerebellum med hjälp av pincett. Med hjälp av böjda tångtångar, överför corticesna till en ny petriskål med HBSS.
- Samla alla kortikor med en engångsdropp eller en 25 ml pipett. Sätt dem i ett 15 ml rör och ta sedan bort HBSS genom pipettering.
- Tillsätt 3 ml cerebral kortikal enzymlösning till röret som innehåller kortikalerna. Sätt röret i ett vattenbad och inkubera vid 37 ° C i 5 minuter.
OBS: Förbered ett cerebralt kortikalt odlingsenzym bestående av fosfatbuffert saltlösning (PBS) med 0,25% trypsin och 1 mM EDTA. Sterilisera med ett 0,22 μm filter. - Tillsätt ytterligare 3 ml cerebral kortikal enzymlösning i röret som innehåller kortikalerna och inkubera vid 37 ° C i ett vattenbad under ytterligare 5 min.
- Ta bort den cerebrala kortikala enzymlösningen med en 5 ml pipett och tillsätt 5 ml DulbeCcos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Dissociate corticesna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 5 ml pipett med en steril P1000-spets. Pipettera igen med en 5 ml pipett med en P200-spets.
- Sätt en 40 μm nyloncellsilter på ett 50 ml rör och filtrera suspensionen för att avlägsna skräpet.
- Centrifugera vid 420 xg i 5 minuter vid RT och avlägsna sedan DMEM-mediumet.
- Tillsätt 5 ml cerebralt kortikalt odlingsmedium och försiktigt resuspendera cellpelleten.
OBS: Förbered ett cerebralt kortikalt odlingsmedium bestående av neuronbasalt medium kompletterat med 1x B-27-kompletteringar, 2 mM L-glutamin och 100 U / ml penicillin streptomycin. - Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och justera cellkoncentrationen (enligt önskemål) med hjälp av det cerebrala kortikala odlingsmediet.
- Plattor 3,0 × 10 6 kortikala nervceller i 2,0 ml per belagd 35 mm glasbaserad disk.
OBS! Innan du pläterar, belägga35mmm glasbaserade rätter med 0,1 mg / ml Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL) eller 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubera i 3 h - O / N vid 37 ° C och tvätta med PBS minst 3x.
2. Imaging Vesicle Motility
- Förbered plasmiderna som kommer att märka varje typ av vesikel. Använd till exempel EGFP-Rab5 för tidiga endosomer, EGFP-Rab7 för sena endosomer, LAMP-EGFP för lysosomer och EGFP-LC3 för autofagosomer 8 , 13 .
OBS: Dessa plasmider är tillgängliga på begäran från tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Typiskt kan 3 -5 dagar in vitro (DIV) neuroner transfekteras med dessa plasmider med användning av transfektionsreagens. - Blanda 4,0 μg plasmider med 200 μl serumfritt medium genom pipettering. I ett separat rör späd 8 μl transfektionsreagens (se tabell över material ) i 200 μl serumfritt medium. Inkubera i 5 min vid RT.
- Blanda plasmidlösningen och transfektionsregentlösningen i steg 2.2 genom pipettering. Inkubera i 20 min vid RT.
- Tillsätt serumfritt medium och 400 μl av plasmidlösningen från steg 2.3 till varje belagd glasbaserad maträtt. Inkubera neuronerna vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator under 30 minuter. Byt mediet med 2 ml cerebralt kortikalt odlingsmedium. Inkubera neuronerna vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 1-2 dagar.
- Efter 1 - 2 d transfektion, välj de transfekterade cellerna för bildförvärv.
OBS! Tidig neuroner mindre än 7 DIV har en tendens att uppvisa dynamisk vesikelmotilitet. Välj neuroner som måttligt uttrycker fluorescensproben, eftersom klara bilder inte kan erhållas när en högt uttryckande neuron väljs. Välj också en typisk neuronform, såsom pyramidala neuroner, som har långa axoner och invecklade dendriter, för att enkelt identifiera axonen och dendriterna (se figur 1A). - Bildförvärv med hjälp av ett tidsfördröjningsavbildningssystem:
För bildbehandling, använd ett fluorescensmikroskop utrustat med en laddningsenhet (CCD) -kamera med 40X Plan Apo 0.95NA eller 100X Plan Apo VC NA1.4 objektivlinser. Kontrollera temperaturen vid 37 ° C med hjälp av ett inkubationssystem. Skaffa neuronbilder i en ram / 5 s över en 100 s period styrd av bildupptagningssoftware. Alternativt kan du skaffa bilder med kortare intervaller och längre tidsperioder, till exempel vid en ram per 2 s över en 300-talperiod.
OBS! En rad olika applikationer är tillgängliga för att ta sekventiella bilder, varav många skulle vara lämpliga för denna metod. Därför rekommenderas ingen särskild tillämpning. I stället borde varje forskare använda vilken applikation som helst.
3. Bildanalys
- Öppna alla sekventiella bilder i ImageJ-programvaran med manuell spårning 14 .
OBS! Hittills har manuell spårning varit wiAnvändes i spårningsförsök 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Manuell spårning utvecklades av Dr. Fabrice Cordelières. Detaljerade skriftliga instruktioner finns tillgängliga online 20 . För analysen förbättras bilddataens kvalitet med ett tillräckligt antal bilder. Det rekommenderas att använda mer än 20 bilder. - Om du vill kombinera sekventiella bilder väljer du <Image> → <Stacks> → <Images to Stack>. Klicka på <OK>.
- Välj <Plugins> → <Manual Tracking>; Ett spårningsfönster kommer dyka upp.
- Klicka på kryssrutan för <Visa parametrar?> Och definiera spårningsparametrarna i parametrarna.
OBS: Flera parametrar kan ställas in, inklusive tidsintervall, x / y-kalibrering, z-kalibrering, sökkorgstorlek för centrumIng, punktstorlek, linjebredd och teckenstorlek. I denna förenklade analys definierades både tidsintervall och x / y-kalibrering. Under andra experimentella omständigheter kan det vara nödvändigt att definiera andra parametrar. Parametrarna som används här är följande: <Tidsintervall> är 5 s och <x / y-kalibreringen> är antingen 0,26642 μm för en 40X Plan Apo 0.95NA objektivlins eller 0,10657 μm för en 100X Plan Apo VC NA1.4 objektivlins. - När parametrarna är definierade klickar du på <lägg till spår> för att starta ett nytt spår.
- Efter att ha bestämt blåsorna av intresse ( t.ex. blåsorna indikerade med blå och röda pilhuvud i Figur 1A (höger panel)), klicka på mitten av signalerna i sekventiella bilder för att spela in xy-koordinaterna. Resultaten av de inspelade xy-koordinaterna, avståndet och hastigheten visas i ett nytt fönster.
OBS! Vid lysosomer är stora ljusa fluorescerande signaler ( t.ex. FigUre 1A (höger panel), orange pilhuvud) observeras ofta i neuroner. Eftersom dessa signaler ibland uppvisar antingen ackumulerade vesiklar eller patologiska varicositeter, bör dessa signaler undvikas för att kvantifiera motilitet. - Upprepa steg 3.6 för att samla blåsorna xy-koordinater från alla sekventiella bilder; Varje bild går automatiskt fram till den efterföljande bilden efter att referenspunkten har valts.
- Exportera dessa data till ett nytt bord ( t.ex. ett kalkylblad). Använd en lämplig programvara för att skapa ett lämpligt diagram (se Materialbiblioteket ).
OBS! För att analysera data, välj kolumnen <Distance>, summera alla värden i denna kolumn och visa ett motilitetsavstånd som ett stapeldiagram, som i Figur 1B . Upprepa dessutom detta steg, beräkna medelvärdet av det totala motilitetsavståndet och visa som ett stapeldiagram, som i Figur 1C . Programvaran för att skapa en stapeldiagram och vågformdata visas iMaterialet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna analys var avsedd att mäta vesikeldynamik i in vitro- odling. Denna analys användes för bestämning av vesikelmotiliteten associerad med neuronal morfologi och överlevnad. Figur 1A och B visar representativa data som visar lysosommotilitet i neuroner. Cortikala neuroner transfekterades med lysosommarkören, LAMP-EGFP och observerades med användning av ett standardfluorescensmikroskop. Det har tidigare rapporterats att specifika endosomlysosomvesiklar är mycket mobila, även i vilande neuroner 8 . Faktum är att dessa resultat demonstrerar både vilande och rörliga blåsor i samma dendrit ( Figur 1A och B ). Normalt uppvisar vilande vesiklar vibrerande rörelse, som brunisk rörelse, i neuronaldenditer. I motsats härtill uppvisar rörliga blåsor oregelbunden motilitet. Vi spekulerar på att varje vesikel har en annanKompositionsegenskap som ligger till grund för bestämningen av funktion, även i lysosomvesiklar 8 . Således kan klassificeringen av vesiklar med användning av denna metod ge användbar information. Med hjälp av detta system är det enkelt att kvantifiera den genomsnittliga motiliteten hos dessa vesiklar ( Figur 1C ) och att analysera vesikelegenskaperna med detta system på ett tidseffektivt sätt.
Figur 1: Lysosommotilitet i neuronal dendriter. ( A ) Muscortikala neuroner (4 DIV) transfekterades med LAMP-EGFP-plasmid i 2 dagar. Denna bild visar motiliteten hos LAMP-EGFP-innehållande vesiklar i dendriterna. Inlägget visar tidsfördröjningsbilden av LAMP-EGFP-positiva blåsorna. Det röda pilhuvudet indikerar en rörlig vesikel, och det blå pilhuvudet indikerar en vilande vesikel. De orange pilhuvudena indikerar större fluorescerande signaler, enligt vad som avsesTill ovan. Skala bar = 20 μm. ( B ) Den tidsberoende x-axelpositionen för LAMP-EGFP-positiva vesiklarna från Figur A. Vesikeln i den röda cirkeln märkt (b) rör sig och vesikeln i den blå cirkeln märkt (a) vilar. Skalbalk: 5 μm (vänster). Stångdiagrammet anger det totala avståndet mellan LAMP-EGFP-rörelsen (höger). ( C ) Stångdiagrammet indikerar det genomsnittliga motilitetsavståndet för LAMP-EGFP-innehållande vesiklar. (N = 5, medelvärde ± standardfel av medelvärdet [SEM], ** p <0,01 av Studentens t- test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll introducerar förfarandet för kvantifiering av vesikelmotilitet. I primära neuroner tenderar endosomer och lysosomer att visa hög motilitet hos yngre neuroner (4-6 DIV). Eftersom neuroner måste leverera vissa komponenter till de främre kanterna för att förlänga neurala processer, bör membranhandel ske dynamiskt under detta stadium. Således är det viktigt att använda yngre neuroner för att observera dynamisk motilitet i neuronaldenditer. Dessutom tenderar större vesiklar inte att uppvisa hög rörlighet, även i yngre neuroner. Reglering av vesikelstorlek är sannolikt inblandad i frekvensen av fusionsfissionsteg. Det kan vara möjligt att specifika vesiklar som inte rör sig dynamiskt lätt enkelt accepterar andra vesiklar och avslutar deras rörelser. Således väljer vesiklar en viktig process för denna analys.
Flera gratis plug-in programvarupaket är tillgängliga för att spåra objekt 21 . Till exempel spåretMate-paketet kan spåra objekt 22 och kan modifieras av numerisk programvara, vilket ger ett utbud av matematisk information. Å andra sidan är det lite komplicerat att använda för den relativt enkla bildanalysen i detta protokoll. Mtrack2 är en annan plugin och bygger på MultiTracker plugin 23 . Mtrack2 är också användbart eftersom det kan identifiera mål och sedan bestämma vilka mål i följande ramar som är närmast. Denna metod är användbar för att kvantifiera enorma datamängder. Manuell spårning kan dock vara mer tillförlitlig för mindre volymer av bilddata. Därför rekommenderar vi Manuell spårning för att kvantifiera mindre datamängder och bekräfta att det kanske är bättre att använda annan programvara för att övervaka större volymer.
Flera försiktighetsåtgärder bör vidtas i detta tillvägagångssätt. För det första bör samplingsfrekvensen vara hög för att få strikta uppgifter. Detta beror på att vissa vesiklar uppvisar snabb rörelse ochAbrupta förändringar, såsom fusionsfission och händelseförsvinnande händelser observeras ibland, vilket indikerar att frekvent bildbehandling är avgörande för att undvika att missa tecknet på några förändringar. En annan punkt är att användningen av avancerade mikroskop, såsom skannings-konfokala mikroskop och totala interna reflektionsfluorescensmikroskop, kan vara nyckeln till att erhålla högupplösta, intressanta data. Det rekommenderas att ta bilder med kortare mellanrum med hjälp av ett avancerat mikroskop, även om bilderna togs var 5: e sekund på grund av utrustningens begränsningar.
Väsentliga studier har föreslagit en biologisk koppling mellan membranhandel och neuronala sjukdomar 2 . Det har till exempel visat sig att lysosomala defekter är involverade i svåra neuronala störningar, såsom Niemann-Pick-sjukdomen och Gaucher-sjukdomen 24 . Intressant har flera studier rapporterat att lysosomal rörelse och lokalisering är inblandade iUppkomsten av lysosomal lagringsstörning 6 . Det är möjligt att vesikelmotilitet kan användas som biomarkör för dessa störningar. Ett intressant tillvägagångssätt kan bero på tillgängligheten av humant inducerade plöripotenta stamceller (iPSCs). Undersökande av vesikelmotilitet med hjälp av iPSCs-härledda neuroner kan avslöja en biomarkör för lysosomala lagringsstörningar. Detta tillvägagångssätt ger några ledtrådar till de processer som ligger till grund för risken för sjukdom.
Eftersom denna analys är enkel är det lätt att erhålla motilitetsdata. Det är också tillämpligt på analys av andra cellhändelser, inklusive migration och morfologiska förändringar. Det är viktigt att notera att detta tillvägagångssätt har flera begränsningar på grund av dess enkelhet. Som sådan är det nödvändigt att använda andra metoder, inklusive elektrofysiologi, biokemi och elektronmikroskopanalys, för att förstå den exakta fysiologiska relevansen av neuronhandeln. Ändå är detta tillvägagångssätt en värdefull metodD som är lämplig för forskare som vill analysera handel på ett enkelt och tidseffektivt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, nuvarande anknytning: Novartis Institute for Biomedical Research) för att hjälpa till att utveckla denna analys och Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara och Dongsook Kim för deras kritiska läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
- ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
