Summary
膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。
Abstract
脳において、膜輸送システムは、ニューロンの形態、シナプス可塑性、生存およびグリアの通信などのニューロン機能の調節において重要な役割を果たす。今日まで、これらの系の欠陥が様々なニューロン疾患を引き起こすとの多数の研究が報告されている。したがって、ベシクル動態の根底にあるメカニズムを理解することは、いくつかのニューロン障害の治療を助けることができる影響力のある手掛かりを提供し得る。ここでは、ImageJプラットフォームのソフトウェアプラグインを使用して、運動距離や移動速度などの小胞の運動量を定量化する方法について説明します。定量化のための画像を得るために、EGFP標識小胞マーカータンパク質を用いてニューロンエンドソーム - リソソーム構造を標識し、経時顕微鏡法を用いて小胞の動きを観察した。この方法は非常に有用であり、軸索および樹状突起のような神経突起ならびにニューロンおよびグリア細胞の細胞の小胞における小胞の運動性の測定を単純化する。さらにこの方法は、線維芽細胞および内皮細胞のような他の細胞株にも適用することができる。このアプローチは、膜輸送の理解の価値ある進歩を提供することができます。
Introduction
エンドソーム - リソソームの輸送の正確な制御は、神経機能を調節するために不可欠です。特に、これらの小胞の動的な動きは、ニューロンの形態、発達および生存の調節の根底にある重要な因子である。このシステムの欠陥は、重度のニューロン障害を引き起こす1,2 。小胞輸送をニューロン疾患に結びつける分子メカニズムは複雑であると考えられ、いくつかのグループがこの関連性を調べようとしている。例えば、摂動した後期エンドソーム運動が、リソソーム欠損に起因する遺伝的神経変性疾患であるNiemann-Pick C疾患3と有意に関連することが報告されている。もう1つの例は、リソソームCa 2+チャネルの突然変異であり、これはリソソーム運動性を損ない、リソソーム蓄積疾患4,5 、 6 。我々のグループは、PtdIns（3,5）P 2代謝回転の調節不全が、ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの運動性を抑制し、ストレス反応に対する脆弱性を増加させることを報告している7,8 。主に後期エンドソームおよびリソソームに局在するPtdIns（3,5）P 2の代謝調節は、小胞輸送および融合核分裂プロセスを含む広範囲の細胞機能において重要な役割を果たす9,10 。損傷したPtdIns（3,5）P 2代謝回転は重度の神経変性を引き起こすので、エンドソーム - リソソームの運動性の異常調節は、神経変性の病因を理解するための重要な要因となり得る。小胞の運動性の基礎をなす分子メカニズムの研究は、このようにして、我々のundeを深めることができる有望な手掛かりを提供するかもしれないいくつかのニューロン障害を呈する。
本稿では、手動トラッキングと呼ばれるフリーソフトウェアパッケージを使用して、ニューロンの小胞の運動性を定量化する貴重な方法を紹介します。目的は、小胞の運動性を分析するための高速定量法を開発することでした。この定量化は、タイムラプス映画の各フレームの基準点をクリックするという標準的なアプローチによって行われます。 Manual Trackingソフトウェアを使用することで、このアプローチは他のアプリケーションとは異なり、非常に簡単で幅広いユーティリティになります。さらに、このアプローチは、グリア細胞のような他の細胞にも適用可能である。この方法は原始的であるが、細胞運動性および形態学的変化を含む様々な分析に適用することができる。例えば、一連の画像にわたって基準点を定義した後、データ解析および画像処理ソフトを使用して、連続画像から基準点の位置および各位置における時間に関する情報を抽出することができる陶器。まとめると、この方法は単純で強力であり、エンドソーム - リソソーム機能を調べるような膜輸送に基づく研究における効率の改善の開発に寄与する。
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Protocol
すべての動物の手技は、つくば動物管理委員会（IACUC）の承認を得て行われた。
1.解剖
- 胎生13-14日のICRまたはC57BL / 6胎仔を準備するために、妊娠したマウスを頸椎脱臼により安楽死させる。子宮を取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を入れたペトリ皿に入れます。血液をすすぎ洗いしてください。
- 鉗子を使用して、70％エタノールで新しいペトリ皿に子宮を移して滅菌します。
- 子宮をHBSSで新しいペトリ皿に移す。消毒された解剖鉗子と手術はさみを使用して子宮から胎児を除去する。
- 外科用ハサミを使って胎児を断つ。 HBSSで新しいペトリ皿に入れてください。
- 皮膚と頭蓋骨を取り外し、滅菌された解剖鉗子を使用して脳を取り出します。 HBSSでペトリ皿に入れてください。
注：この手順を実行すると、手順はクリーンな状態で実行することをお勧めしますベンチ。 - ステレオ顕微鏡下で滅菌された解剖鉗子を使用して髄膜を除去する。鉗子を用いて基底核、海馬、および小脳を切断する。曲がった先端の鉗子を使用して、HBSSで新しいペトリ皿に皮質を移す。
- 使い捨てのドロッパーまたは25mLのピペットを使用してすべての皮質を収集する。 15 mLのチューブに入れ、ピペットでHBSSを除去する。
- 皮質を含むチューブに3mLの大脳皮質酵素溶液を加える。このチューブを水浴に入れ、37℃で5分間インキュベートする。
注：0.25％トリプシンおよび1mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）からなる大脳皮質培養酵素を調製する。 0.22μmフィルターで滅菌する。 - 脳皮質酵素溶液3mLを皮質を含むチューブに加え、水浴中37℃でさらに5分間インキュベートする。
- 5mLのピペットを用いて大脳皮質の酵素溶液を除去し、5mLのDulbe10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するccoの修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。
- 滅菌P1000チップを備えた5mLピペットを使用して上下に穏やかにピペットで皮質を解離させる。 P200先端を有する5mLピペットを用いて再度ピペットをかける。
- 40μmナイロンセルストレーナーを50mLチューブに入れ、懸濁液を濾過して残渣を除去する。
- 室温で5分間420xgで遠心分離し、次いでDMEM培地を除去する。
- 大脳皮質培養培地5mLを添加し、穏やかに細胞ペレットを再懸濁する。
注：1×B - 27サプリメント、2mM L - グルタミン、100U / mLペニシリンストレプトマイシンを補充したニューロン基底培地からなる大脳皮質培養培地を調製する。 - 血球計数器を用いて細胞を計数し、大脳皮質培養培地を用いて細胞濃度を（必要に応じて）調整する。
- プレート3.0×10 6皮質ニューロンをコーティングされた35mmのガラス底のディッシュあたり2.0mLに入れた。
注：めっきする前に、0.1mg / mLのポリ-D-リシン臭化水素酸塩（PDL）または0.01％ポリ-L-オルニチン（PLO）を含む35mmのガラス底の皿。 37℃で3時間インキュベートし、少なくとも3回PBSで洗浄する。
イメージングベシクルの運動性
- それぞれのタイプの小胞を標識するプラスミドを準備する。例えば、早期エンドソームにはEGFP-Rab5、後期エンドソームにはEGFP-Rab7、リソソームにはLAMP-EGFP、オートファゴソームにはEGFP-LC3を使用します8,13。
注：これらのプラスミドは、tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jpから要求に応じて入手できます。典型的には、トランスフェクション試薬を用いて3〜5日間のインビトロ （DIV）ニューロンをこれらのプラスミドでトランスフェクトすることができる。 - 4.0μgのプラスミドを200μLの無血清培地とピペットで混合する。別のチューブで、200μLの無血清培地に8μLのトランスフェクション試薬（ 表の表を参照 ）を希釈する。 RTで5分間インキュベートする。
- ステップ2.2のプラスミド溶液とトランスフェクション試薬溶液をピペットで混合する。 RTで20分間インキュベートする。
- ステップ2.3からの無血清培地および400μLのプラスミド溶液を各コートガラス底ディッシュに添加する。ニューロンを37℃、5％CO 2インキュベーターで30分間インキュベートする。 2mLの大脳皮質培養培地で培地を交換する。 1~2日間5％CO 2インキュベーターで37℃でニューロンをインキュベートする。
- トランスフェクションの1〜2日後、画像取得のためにトランスフェクションされた細胞を選択する。
注：7 DIV未満の時期尚早なニューロンは、動的小胞運動性を示す傾向がある。高度に発現するニューロンが選択された場合、鮮明な画像が得られないため、蛍光プローブを適度に発現するニューロンを選択する。また、軸索および樹状突起の同定を容易にするために、長い軸索および複雑な樹状突起を有するピラミッドニューロンなどの典型的なニューロン形状を選択する（ 図1A）。 - タイムラプス画像システムを用いた画像取得：
イメージングには、40X Plan Apo 0.95NAまたは100X Plan Apo VC NA1.4対物レンズを備えた電荷結合素子（CCD）カメラを備えた蛍光顕微鏡を使用します。インキュベーションシステムを使用して37℃で温度を制御する。画像取得ソフトウェアによって制御される100秒の期間にわたって、1フレーム/ 5秒でニューロン画像を取得する。あるいは、300秒間に1秒間に1フレームなど、より短い間隔で、より長い時間間隔で画像を取得することもできます。
注記：シーケンシャル画像の撮影にはさまざまなアプリケーションがあり、その多くはこの方法に適しています。したがって、特定のアプリケーションは推奨されません。むしろ、各研究者は利用可能なアプリケーションを使用する必要があります。
3.画像解析
- Manual Tracking 14を使用してImageJソフトウェアですべての連続画像を開きます。
注：これまでのところ、手動トラッキングはwi追跡実験15,16,17,18,19に使用されている。マニュアルトラッキングは、Dr. FabriceCordelièresによって開発されました。詳細な説明書はオンラインで入手できます20 。分析のために、十分な数の画像を用いて画像データの品質が改善される。 20枚以上の画像を使用することをお勧めします。 - 連続イメージを結合するには、<イメージ>→<スタック>→<イメージをスタック>を選択します。 <OK>をクリックします。
- <プラグイン>→<手動トラッキング>を選択します。トラッキングウィンドウがポップアップ表示されます。
- <Show Parameters？>のチェックボックスをクリックし、パラメータセクションでトラッキングパラメータを定義します。
注：時間間隔、x / y校正、z校正、中心のスクエアサイズの検索を含むいくつかのパラメータを設定することができますドットサイズ、線幅、およびフォントサイズを指定します。この単純化されたアッセイでは、時間間隔およびx / y較正の両方が定義された。他の実験環境下では、他のパラメータも定義する必要があるかもしれない。ここで使用されるパラメータは以下のとおりです：40X Plan Apo 0.95NA対物レンズでは<Time interval>が5秒、<x / y calibration>は0.26642μm、100X Plan Apo VC NA1.4では0.10657μmです対物レンズ。 - パラメータが定義されたら、<add track>をクリックして新しいトラックを開始します。
- 関心のある小胞（ 例えば、 図1A （右パネル）の青と赤の矢印で示される小胞）を決定した後、連続画像のシグナルの中心をクリックしてxy座標を記録する。記録されたxy座標、距離、速度の結果が新しいウィンドウに表示されます。
注：リソソームの場合、大きな明るい蛍光シグナル（ 例えば、 Fig。ure 1A（右のパネル）、オレンジの矢頭）がしばしばニューロンで観察される。これらの信号は時折、蓄積された小胞または病的な静脈瘤のいずれかを示すので、これらの信号は運動性を定量化するために避けるべきである。 - ステップ3.6を繰り返して、すべての連続画像からベシクルのxy座標を収集する。各画像は、基準点が選択された後、自動的に連続画像に進む。
- これらのデータを新しい表（スプレッドシートなど）にエクスポートします。適切なソフトウェアを使用して適切なグラフを作成します（材料表を参照 ）。
注：データを分析するには、<距離>列を選択し、この列のすべての値を合計し、 図1Bに示すように運動性距離を棒グラフとして表示します。さらに、このステップを繰り返し、全運動距離の平均を計算し、 図1Cのように棒グラフとして表示します。バーグラフと波形データを作成するソフトウェアは、材料のテーブル。
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Representative Results
このアッセイは、インビトロ培養における小胞の動態を測定するために設計された。このアッセイを利用して、ニューロンの形態および生存に関連する小胞の運動性を決定した。 図1AおよびBは、ニューロンにおけるリソソームの運動性を示す代表的なデータを示す。皮質ニューロンにリソソームマーカーLAMP-EGFPをトランスフェクションし、標準蛍光顕微鏡を用いて観察した。特定のエンドソーム - リソソーム小胞は、休止ニューロンにおいてさえ、高度に可動性であることが以前に報告されている8 。実際に、これらの結果は、同じデンドライト（ 図1AおよびB ）中の休止小胞および移動小胞の両方を示す 。通常、静止小胞は、ニューロンの樹状突起におけるブラウン運動のような振動運動を示す。対照的に、動く小胞は不規則な運動性を示す。我々は、各小胞が異なるリソソームの小胞においてさえ、機能の決定の根底にある組成的特徴8 。したがって、このアプローチを用いた小胞の分類は、有用な情報を提供し得る。このシステムを使用すると、これらの小胞の平均運動性を定量化し（ 図1C ）、このシステムを用いて小胞特性を時間効果的に分析することが容易である。
図1：ニューロン樹状突起におけるリソソーム運動性。 （ A ）マウス大脳皮質ニューロン（4DIV）をLAMP-EGFPプラスミドで2日間トランスフェクションした。この画像は、樹状突起におけるLAMP-EGFP含有小胞の運動性を示す。挿入図は、LAMP-EGFP陽性小胞の時間経過像を示す。赤い矢印は移動する小胞を示し、青い矢印は休止小胞を示します。オレンジ色の矢印は、より大きな蛍光シグナルを示している上に。スケールバー=20μm。 （ B ）は、図AのLAMP-EGFP陽性小胞の時間依存性のx軸位置である。（b）の赤丸の小胞は動いており、（a）の青い円の小胞は静止している。スケールバー：5μm（左）。棒グラフは、LAMP-EGFP移動の合計距離を示します（右）。 （ C ）棒グラフは、LAMP-EGFP含有小胞の平均運動距離を示す。 （n = 5、平均±SEMの標準誤差、スチューデントt検定による** p <0.01）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、小胞の運動性を定量化するための手順を導入する。初代ニューロンにおいて、エンドソームおよびリソソームは、より若いニューロン（4-6DIV）において高い運動性を示す傾向がある。ニューロンが神経プロセスを伸長させるためにいくつかの成分を先端縁に送達しなければならないことを考えると、この段階で膜輸送が動的に起こるはずである。したがって、ニューロン樹状突起における動的運動性を観察するためには、より若いニューロンを用いることが重要である。さらに、より大きい小胞は、より若いニューロンにおいてさえ、高い運動性を示す傾向がない。ベシクルサイズの調節は、融合 - 核分裂段階の頻度に関与している可能性が高い。動的に移動しない特定の小胞は、他の小胞を容易に受け入れやすく、それらの動きを終わらせる可能性があります。従って、小胞の選択は、この分析のための重要なプロセスである。
オブジェクト21を追跡するためにいくつかのフリープラグインソフトウェアパッケージが利用可能である。たとえば、トラックメイトパッケージはオブジェクト22を追跡することができ、数学的な情報の範囲を提供する数値ソフトウェアによって修正することができる。一方、このプロトコルでは比較的簡単な画像解析には少し複雑です。 Mtrack2は別のプラグインであり、MultiTrackerプラグイン23に基づいています。 Mtrack2は、ターゲットを識別して、後続フレームのどのターゲットが最も近いかを判断できるため、便利です。このアプローチは膨大な量のデータを定量化するのに役立ちます。手動トラッキングは、より少量の画像データに対してより信頼性が高くなります。したがって、手動トラッキングを使用して、より小さなデータセットを定量化し、他のソフトウェアを使用してより大きなボリュームを監視するほうがよいことを認識することをお勧めします。
このアプローチでは、いくつかの注意が払われるべきである。第1に、厳密なデータを得るためにサンプリングレートを高くする必要があります。これは、いくつかの小胞が急速な動きを示し、融解核分裂や外観消失などの突然の変化が観察されることがあり、変化の兆候を見逃すことを避けるためには頻繁なイメージングが不可欠であることを示しています。もう一つのポイントは、走査型ディスク共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡などのハイエンド顕微鏡を使用することが、高解像度の興味深いデータを得る上で鍵となることです。ハイエンドの顕微鏡を使用して、より短い間隔で画像を撮ることをお勧めします。ここでは、機器の制約のために5秒ごとに画像が撮影されました。
実質的な研究は、膜輸送と神経障害との間の生物学的関連を示唆している2 。例えば、リソソーム欠損は、ニーマン・ピック病およびゴーシェ病などの重度のニューロン障害に関与することが実証されている24 。興味深いことに、いくつかの研究では、リソソームの動きと局在がリソソーム蓄積障害の発症6 。小胞の運動性がこれらの疾患のバイオマーカーとして使用される可能性があります。 1つの興味深いアプローチは、ヒト誘導多能性幹細胞（iPSCs）の利用可能性から生じ得る。 iPSCs由来ニューロンを用いて小胞の運動性を調べると、リソソーム蓄積障害のバイオマーカーが明らかになるかもしれない。このアプローチは、病気のリスクの根底にあるプロセスにいくつかの手掛かりを提供します。
このアッセイは単純であるので、運動性データを得ることは容易である。また、移動および形態学的変化を含む他の細胞事象の分析にも適用可能である。このアプローチには、単純さのためにいくつかの制限があることに注意することが重要です。したがって、神経細胞の人身売買の正確な生理学的関連性を理解するために、電気生理学、生化学、および電子顕微鏡分析を含む他のアプローチを用いることが必要である。それにもかかわらず、このアプローチは貴重なメソ人身売買を直接的かつ時間的に分析したい研究者に適しています。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この分析の開発を手伝ってくださったRicardo Dolmetsch博士（スタンフォード大学医学部、現在のNovartis Institute for Biomedical Research）、Matthew Wood博士、Aihara Takuma、およびDongsook Kimの原稿の批判的読解に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
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