Summary
Undersøkelsen av membranhandel er avgjørende for å forstå nevronfunksjoner. Her presenterer vi en metode for kvantifisering av vesikelmotilitet i nevroner. Dette er en praktisk metode som kan tilpasses kvantifiseringen av membranhandel i nervesystemet.
Abstract
I hjernen spiller membranhandelssystemer viktige roller i regulering av nevrale funksjoner, som nevronmorfologi, synaptisk plastisitet, overlevelse og glialkommunikasjon. Til dato har mange studier rapportert at mangler i disse systemene forårsaker ulike nevrale sykdommer. Dermed kan forståelse av mekanismene som ligger bak vesikkeldynamikken, gi innflytelsesrike ledetråder som kan hjelpe til med behandling av flere nevrale lidelser. Her beskriver vi en metode for kvantifisering av vesikkmotiliteter, for eksempel motilitetsavstand og bevegelseshastighet, ved hjelp av en programvareplugin for ImageJ-plattformen. For å oppnå bilder for kvantifisering merket vi neuronale endosomlysosomstrukturer med EGFP-merkede vesikkelmarkørproteiner og observerte bevegelsen av vesikler ved hjelp av en tidsforskjellmikroskopi. Denne metoden er svært nyttig og forenkler måling av vesikkmotilitet i nevritt, slik som axoner og dendritter, samt i soma til både nevroner og glialceller. FurthermoRe, denne metoden kan brukes på andre cellelinjer, slik som fibroblaster og endotelceller. Denne tilnærmingen kan gi en verdifull fremgang i vår forståelse av membranhandel.
Introduction
Nøyaktig kontroll av endosomlysosomhandel er uunnværlig for regulering av nevronfunksjon. Spesielt er de dynamiske bevegelsene til disse vesiklene en nøkkelfaktor som ligger til grund for reguleringen av nevronmorfologi, utvikling og overlevelse. Feil i dette systemet forårsaker alvorlige nevroniske lidelser 1 , 2 . De molekylære mekanismene som knytter vesikkelhandel til nevonale sykdommer anses som kompliserte, og flere grupper har forsøkt å undersøke denne relevansen. For eksempel er det rapportert at perturbed late endosomotilitet er signifikant forbundet med Niemann-Pick C sykdom 3 , en arvet nevrodegenerativ lidelse forårsaket av lysosomfeil. Et annet eksempel er en mutasjon i en lysosomal Ca 2+ kanal, trpml 1, noe som forringer lysosomal motilitet, noe som resulterer i lysosomale lagringssykdommer 4 , 5 , 6 . Vår gruppe har rapportert at dysregulering av PtdIns (3,5) P 2 omsetning undertrykker endosom og lysosomotilitet i nevroner, noe som fører til økt sårbarhet for stressresponsen 7 , 8 . Metabolsk regulering av PtdIns (3,5) P 2 , som hovedsakelig lokaliserer seg på late endosomer og lysosomer, spiller en viktig rolle i et bredt spekter av cellulære funksjoner, inkludert vesikkelhandel og fusjonsfission prosesser 9 , 10 . Siden nedsatt PtdIns (3,5) P 2- omsetning forårsaker alvorlig nevrodegenerasjon 11 , 12 , kan avvigende regulering av endosomlysosommotilitet være en nøkkelfaktor for å forstå patogenesen av nevrodegenerasjon. En undersøkelse av molekylære mekanismer som ligger til grunn for vesikkmotilitet, kan således gi lovende ledetråder som kan utdype vår undeResten av flere nevroniske lidelser.
I dette papiret presenterer vi en verdifull metode for å kvantifisere vesikkmotilitet i nevroner ved hjelp av en gratis programvarepakke kalt manuell sporing. Målet var å utvikle en rask kvantifiseringsmetode for å analysere vesikkmotilitet. Denne kvantifiseringen er rettet gjennom en standard tilnærming til å klikke på et referansepunkt i hver ramme av en time-lapse-film. Bruken av Manual Tracking-programvaren gjør denne tilnærmingen ganske enkel og av bred funksjon, i motsetning til andre applikasjoner. Videre er denne tilnærmingen også anvendelig for andre celler, for eksempel glialceller. Selv om denne metoden er primitiv, kan den brukes på ulike analyser, inkludert cellulær motilitet og morfologisk forandring. Etter å ha definert et referansepunkt over en sekvens av bilder, kan informasjon om posisjonene til referansepunktene og tiden ved hver posisjon trekkes ut fra sekvensielle bilder ved hjelp av dataanalyse og bildebehandlingsmjukware. Samlet sett er denne metoden enkel, men kraftig og bidrar til utviklingen av forbedret effektivitet i studier basert på membranhandel, for eksempel de som undersøker endosomlysosomfunksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført med godkjenning fra Universitetet i Tsukuba dyrepleie og brukskomité (IACUC).
1. Disseksjon
- For å forberede embryonale dag 13-14 ICR- eller C57BL / 6-foster, euthaniser gravide mus ved cervikal dislokasjon. Ta ut livmoren og legg den i en petriskål med Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Skyll det godt for å fjerne blodet.
- Ved hjelp av tapper, overfør livmoren til en ny petriskål med 70% etanol for å sterilisere.
- Overfør livmoren til en ny petriskål med HBSS. Fjern fostrene fra uterus ved hjelp av steriliserte disseksjonspincer og kirurgiske saks.
- Dekapitate fostrene ved hjelp av kirurgiske saks. Legg dem inn i en ny petriskål med HBSS.
- Fjern hud og hodeskall og ta ut hjernen ved hjelp av steriliserte disseksjonspincetter. Sett dem i en petriskål med HBSS.
MERK: Fra dette trinnet er det best å gjennomføre prosedyren på en ren måtebenk. - Fjern meningesene ved hjelp av steriliserte disseksjonspincer under et stereomikroskop. Klipp av basalganglia, hippocampus og cerebellum ved hjelp av pincet. Ved hjelp av buede tipper, overfør kortene til en ny petriskål med HBSS.
- Samle alle kortikene med en engangsdråper eller en 25 ml pipette. Sett dem i en 15 ml rør og fjern deretter HBSS ved pipettering.
- Tilsett 3 ml cerebral kortikal enzymløsning til røret som inneholder kortikene. Sett denne røret i et vannbad og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
MERK: Forbered et cerebralt kortikalt kulturenzym bestående av fosfatbuffert saltvann (PBS) med 0,25% trypsin og 1 mM EDTA. Steriliser med et 0,22 μm filter. - Tilsett ytterligere 3 ml cerebral kortikal enzymoppløsning i røret som inneholder kortiklene og inkuber ved 37 ° C i et vannbad i ytterligere 5 minutter.
- Fjern den cerebrale kortikale enzymløsningen ved å bruke en 5 ml pipette og tilsett 5 ml DulbeCco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Dissociate cortices ved forsiktig pipettering opp og ned ved hjelp av en 5 mL pipette med en steril P1000 tips. Pipette igjen med en 5 ml pipette med en P200-spiss.
- Sett en 40 μm nyloncellesylinder på et 50 ml rør og filtrer suspensjonen for å fjerne ruskene.
- Sentrifuger ved 420 xg i 5 minutter ved RT og fjern deretter DMEM-mediumet.
- Tilsett 5 ml cerebralt kortikalt dyrkningsmedium og resuspender cellepellet forsiktig.
MERK: Forbered et cerebralt kortikalt kulturmedium bestående av nevronbasalt medium supplert med 1x B-27-tilskudd, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin streptomycin. - Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og juster cellekonsentrasjonen (som ønsket) ved hjelp av det cerebrale kortikale kulturmediet.
- Plate 3,0 × 10 6 kortikale nevroner i 2,0 ml pr. Belagt 35 mm glassbunnede retter.
MERK: Før du pletter, belegge35mmm glassbunnede retter med 0,1 mg / ml Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL) eller 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkuber i 3 timer - O / N ved 37 ° C og vask med PBS minst 3x.
2. Imaging Vesicle Motility
- Klargjør plasmidene som vil merke hver type vesikkel. For eksempel, bruk EGFP-Rab5 for tidlige endosomer, EGFP-Rab7 for sen endosomer, LAMP-EGFP for lysosomer og EGFP-LC3 for autofagosomer 8 , 13 .
MERK: Disse plasmidene er tilgjengelig på forespørsel fra tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Vanligvis kan 3 -5 dager in vitro (DIV) neuroner transfekteres med disse plasmidene ved hjelp av transfeksjonsreagenser. - Bland 4,0 μg plasmider med 200 μl serumfritt medium ved pipettering. I et separat rør fortynnes 8 μl transfeksjonsreagens (se tabell over materialer ) i 200 μl serumfritt medium. Inkuber i 5 minutter ved RT.
- Bland plasmidoppløsningen og transfeksjonsregentløsningen i trinn 2.2 ved pipettering. Inkuber i 20 minutter ved RT.
- Tilsett serumfritt medium og 400 μl av plasmidoppløsningen fra trinn 2.3 til hver belagt glassbunnsrett. Inkubér nevronene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 30 minutter. Erstatt mediet med 2 ml cerebralt kortikalt kulturmedium. Inkubér nevronene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 1-2 dager.
- Etter 1 - 2 d transfeksjon, velg de transfekterte cellene for bildeoppkjøp.
MERK: Tidlige neuroner mindre enn 7 DIV har en tendens til å utvise dynamisk vesikkmotilitet. Velg neuroner som moderat uttrykker fluorescens-proben fordi klare bilder ikke kan oppnås når en svært uttrykkelig nevron er valgt. Også velg en typisk nevronform, for eksempel pyramidale nevroner, som har lange axoner og intrikate dendriter, for enkel identifisering av axon og dendriter (se figur 1A). - Bildeoppkjøp ved hjelp av et time-lapse-bildebehandlingssystem:
For bildebehandling, bruk et fluorescensmikroskop utstyrt med et CCD-kamera (CCD) med 40X Plan Apo 0.95NA eller 100X Plan Apo VC NA1.4 objektivlinser. Kontroller temperaturen ved 37 ° C ved hjelp av et inkubasjonssystem. Oppnå nevronbilder i en ramme / 5 s over en 100 s periode styrt av bildeoppkjøpsprogramvaren. Alternativt kan du skaffe bilder med kortere intervaller og lengre tidsperioder, for eksempel ved en ramme per 2 s over en 300-s periode.
MERK: En rekke applikasjoner er tilgjengelige for å ta sekventielle bilder, hvorav mange vil være egnet for denne metoden. Derfor anbefales ingen spesiell applikasjon; Heller, hver forsker bør bruke hva som helst søknad er tilgjengelig.
3. Bildeanalyse
- Åpne alle sekvensielle bilder i ImageJ-programvare med manuell sporing 14 .
MERK: Manuell sporing har hittil vært wiDely brukes i sporing eksperimentene 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Manuell sporing ble utviklet av Dr. Fabrice Cordelières. Detaljert skriftlig instruksjon er tilgjengelig online 20 . For analysen blir kvaliteten på bildedata forbedret med et tilstrekkelig antall bilder. Det anbefales å bruke mer enn 20 bilder. - For å kombinere sekvensielle bilder, velg <Bilde> → <Stabler> → <Bilder til Stack>. Klikk på <OK>.
- Velg <Plugins> → <Manual Tracking>; Et sporingsvindu vil dukke opp.
- Klikk på avkrysningsruten for <Vis parametere?> Og definer sporingsparametrene i parameteren.
MERK: Flere parametere kan stilles inn, inkludert tidsintervall, x / y-kalibrering, z-kalibrering, søkfirkantstørrelse for senterIng, punktstørrelse, linjebredde og skriftstørrelse. I denne forenklede analysen ble både tidsintervall og x / y-kalibrering definert. Under andre eksperimentelle omstendigheter kan det være nødvendig å definere andre parametre også. Parametrene som brukes her er som følger: <Tidsintervall> er 5 s, og <x / y-kalibrering> er enten 0,26642 μm for en 40X Plan Apo 0.95NA objektivlins eller 0,10657 μm for en 100X Plan Apo VC NA1.4 objektiv linse. - Etter at parametrene er definert, klikker du på <legg til spor> for å starte et nytt spor.
- Etter å ha bestemt vesiklene av interesse ( f.eks. Vesiklene angitt med blå og røde pilehoder i figur 1A (høyre panel)), klikker du på midten av signalene i sekvensielle bilder for å registrere xy-koordinatene. Resultatene av de registrerte xy-koordinatene, avstanden og hastigheten dukker opp i et nytt vindu.
MERK: Ved lysosomer kan store lyse fluorescerende signaler ( f.eks. FigUre 1A (høyre panel), oransje pilespiss) observeres ofte i nevroner. Ettersom disse signalene av og til viser enten akkumulerte vesikler eller patologiske varicositeter, bør disse signalene unngås for å kvantifisere motilitet. - Gjenta trinn 3.6 for å samle xy-koordinatene til vesikler fra alle sekvensielle bilder; Hvert bilde går automatisk videre til det etterfølgende bildet etter at referansepunktet er valgt.
- Eksporter disse dataene til et nytt bord (for eksempel et regneark). Bruk en passende programvare for å lage en passende graf (se Materialetabell ).
MERK: For å analysere dataene, velg kolonnen <Distanse>, oppsumm alle verdier i denne kolonnen, og vis en motilitetsavstand som et linjediagram, som i figur 1B . I tillegg gjenta dette trinnet, beregne gjennomsnittet av totalmotilitetsavstanden, og vis som et strekkdiagram, som i figur 1C . Programvaren for å lage en strekediagram og bølgeformdata vises iMaterialebordet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne analysen ble utformet for å måle vesikkeldynamikk i in vitro- kultur. Denne analysen ble benyttet for å bestemme vesikelmotiliteten assosiert med neuronal morfologi og overlevelse. Figur 1A og B viser representative data som viser lysosommotilitet i nevroner. Kortikale nevroner ble transfektert med lysosommarkøren, LAMP-EGFP, og observert ved bruk av et standard fluorescensmikroskop. Det har tidligere vært rapportert at spesifikke endosomlysosomvesikler er svært mobile, selv i hvilende nevroner 8 . Faktisk demonstrerer disse resultatene både hvile og bevegelige vesikler i samme dendrit ( Figur 1A og B ). Normalt viser hvilende vesikler vibrasjonsbevegelse, som brunisk bevegelse, i nevroniske dendriter. I kontrast utviser bevegelige vesikler uregelmessig motilitet. Vi spekulerer på at hver vesikkel har en annenSammensetningsfunksjon som ligger til grunn for bestemmelse av funksjon, selv i lysosomvesikler 8 . Således kan klassifiseringen av vesikler ved hjelp av denne tilnærmingen gi nyttig informasjon. Ved hjelp av dette systemet er det enkelt å kvantifisere den gjennomsnittlige motiliteten til disse vesiklene ( figur 1C ) og å analysere vesikkets egenskaper ved hjelp av dette systemet på en tidsbesparende måte.
Figur 1: Lysosommotilitet i neuronale dendriter. ( A ) Muskortiske nevroner (4 DIV) ble transfektert med LAMP-EGFP-plasmid i 2 dager. Dette bildet viser motiliteten av LAMP-EGFP-holdige vesikler i dendriter. Innlegget viser tidsforløpet av LAMP-EGFP-positive vesikler. Den røde pilen angir en bevegelig vesikkel, og den blå pilen peker på en hvilevesikkel. De oransje pilehoder indikerer større fluorescerende signaler, som referert tilTil over. Skalbjelke = 20 μm. ( B ) Den tidsavhengige x-akseposisjonen til LAMP-EGFP-positive vesikler fra figur A. Vesikelen i den røde sirkel merket (b) beveger seg, og vesikken i den blå sirkel merket (a) hviler. Skalbjelke: 5 μm (venstre). Stanggrafen indikerer total avstand for LAMP-EGFP-bevegelse (høyre). ( C ) Stanggrafen indikerer gjennomsnittlig motilitetsavstand for LAMP-EGFP-holdige vesikler. (N = 5, gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet [SEM], ** p <0,01 ved Studentens t- test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen introduserer prosedyren for kvantifisering av vesikelmotilitet. I primære nevroner har endosomer og lysosomer en tendens til å vise høy motilitet hos yngre nevroner (4-6 DIV). Gitt at nevroner må levere noen komponenter til ledende kanter for å forlenge nevrale prosesser, bør membranhandel foregå dynamisk i dette stadiet. Dermed er det viktig å bruke yngre nevroner til å observere dynamisk motilitet i nevendon dendriter. I tillegg har større vesikler ikke en tendens til å oppvise høy motilitet, selv i yngre nevroner. Reguleringen av vesikkelstørrelsen er sannsynligvis involvert i frekvensen av fusjons-fisjonstrinn. Det kan være mulig at bestemte vesikler som ikke beveger seg dynamisk, enkelt aksepterer andre vesikler og avslutter bevegelsene sine. Derfor er valg av vesikler en viktig prosess for denne analysen.
Flere gratis plug-in programvarepakker er tilgjengelige for å spore objekter 21 . For eksempel sporetMate pakken kan spore objekter 22 og kan endres med numerisk programvare, og gir et utvalg av matematisk informasjon. På den annen side er det litt komplisert å bruke for den relativt enkle bildeanalysen i denne protokollen. Mtrack2 er en annen plugin og er basert på MultiTracker-plugin-modulen 23 . Mtrack2 er også nyttig fordi det kan identifisere mål og deretter bestemme hvilke mål i følgende rammer som er nærmest. Denne tilnærmingen er nyttig for å kvantifisere enorme datamengder; Manuell sporing kan imidlertid være mer pålitelig for mindre mengder bildedata. Derfor anbefaler vi Manuell sporing for å kvantifisere mindre sett med data og bekrefte at det kan være bedre å bruke annen programvare for å overvåke større volumer.
Det må tas flere forholdsregler i denne tilnærmingen. For det første bør samplingsfrekvensen være høy for å oppnå strenge data. Dette skyldes at noen vesikler utviser hurtig bevegelse ogAbrupte endringer, for eksempel fusjonsfisjon, og utseende-forsvunnelse hendelser observeres av og til, noe som indikerer at hyppig bildebehandling er avgjørende for å unngå å savne tegn på eventuelle endringer. Et annet poeng er at bruken av high-end mikroskoper, for eksempel skanne-disk-konfokale mikroskoper og totale interne reflekterende fluorescensmikroskoper, kan være nøkkelen til å oppnå høyoppløselige, interessante data. Det anbefales å ta bilder med kortere intervaller ved hjelp av et high-end-mikroskop, men her ble bilder tatt hver 5. s på grunn av begrensninger i utstyret.
Vesentlige studier har antydet en biologisk sammenheng mellom membranhandel og nevrologiske sykdommer 2 . For eksempel har det vist seg at lysosomale defekter er involvert i alvorlige nevroniske lidelser, slik som Niemann-Pick-sykdom og Gaucher-sykdom 24 . Opplagt har flere studier rapportert at lysosomal bevegelse og lokalisering er involvert iUtbrudd av lysosomal lagringsforstyrrelse 6 . Det er mulig at vesikelmotilitet kan brukes som biomarkør for disse forstyrrelsene. En interessant tilnærming kan oppstå ved tilgjengeligheten av humant induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Undersøkelse av vesikelmotilitet ved hjelp av iPSCs-avledede nevroner kan avsløre en biomarkør for lysosomale lagringsforstyrrelser. Denne tilnærmingen gir noen ledetråder til prosessene som ligger til grunn for sykdomsrisikoen.
Siden denne analysen er enkel, er det enkelt å oppnå motilitetsdata. Det er også aktuelt for analysen av andre cellulære hendelser, inkludert migrasjon og morfologiske endringer. Det er viktig å merke seg at denne tilnærmingen har flere begrensninger på grunn av sin enkelhet. Som sådan er det nødvendig å benytte andre tilnærminger, inkludert elektrofysiologi, biokjemi og elektronmikroskopanalyse, for å forstå den nøyaktige fysiologiske relevansen av neuronalhandel. Likevel er denne tilnærmingen en verdifull metodeD som passer for forskere som ønsker å analysere menneskehandel på en enkel og tidseffektiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, tilstede tilknytning: Novartis Institutes for Biomedical Research) for å bidra til å utvikle denne analysen og Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara og Dongsook Kim for deres kritiske lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" (PEI) | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
- ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
