Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

Abstract

جعلت القوة الوراثية والتقنية الفقاريات الزرد نموذج كائن أساسي في أي عواقب التلاعب الجيني يمكن أن تعزى في الجسم الحي خلال الفترة الإنمائية السريعة. عمليات متعددة يمكن دراستها بما في ذلك تكاثر الخلايا، التعبير الجيني، هجرة الخلايا والتشكل. والأهم من ذلك الجيل من الوهم من خلال زرع يمكن أداؤها بسهولة، مما يتيح وضع العلامات الفسيفساء وتتبع الخلايا الفردية تحت تأثير البيئة المضيفة. على سبيل المثال، من خلال الجمع بين التلاعب وظيفية جينات الجنين المضيف (على سبيل المثال، من خلال حقن مكروي morpholino) والتصوير الحي، وآثار خارجي، إشارات الخلية nonautonomous (التي تقدمها البيئة المعدلة وراثيا) على الخلايا المانحة زرع الفردية يمكن تقييمها. نحن هنا لشرح كيفية استخدام هذا النهج لمقارنة بداية من التعبير التحوير الفلورسنت كوكيل لتوقيت determin مصير الخليةأوجه في مختلف البيئات المضيف الجيني.

في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكول للmicroinjecting الأجنة الزرد بمناسبة الخلايا المانحة، ويسبب ضربة قاضية الجينات في الأجنة المضيفة، وصفا للتقنية زرع استخدامها لتوليد أجنة خيالية، وبروتوكول لإعداد وتشغيل في الجسم الحي متحد البؤر الوقت الفاصل تصوير الأجنة المتعددة. على وجه الخصوص، وأداء التصوير العديد من المواقع من الأهمية بمكان عند المقارنة بين توقيت الأحداث مثل ظهور التعبير الجيني. وهذا يتطلب جمع البيانات من السيطرة متعددة والأجنة التجريبية معالجتها في وقت واحد. يمكن بسهولة أن يمتد هذا النهج للدراسات التأثيرات خارجي في أي عضو أو نسيج من خيار للوصول للعيش التصوير، شريطة أن زرع يمكن استهداف بسهولة وفقا لخرائط مصير الجنينية المعمول بها.

Introduction

وقد ساهم القدرة على تصور العمليات التنموية الهامة في الفقاريات في الجسم الحي لجعل الزرد نموذجا أساسيا لدراسة الظروف العادية والمرض (إعادة النظر في 1 و 2). على وجه الخصوص، الشبكية العصبية هي جزء لا يمكن الوصول إليها من الجهاز العصبي المركزي. شبكية العين يفسح المجال لسهولة إجراء دراسات من الخلايا العصبية بسبب، بعد بنية بسيطة نسبيا درجة عالية من التنظيم لها، وأنواع الخلايا العصبية الحفظ جدا في جميع أنحاء نوعا من الفقاريات 3. يمكن اتباعها ديناميات السلوكيات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، خروج دورة الخلية، انقسام الخلايا غير المتماثلة، مواصفات مصير، والتمايز، وتشكيل الدوائر العصبية في جميع أنحاء العملية برمتها من retinogenesis، التي أنجزت في الشبكية المركزية للالزرد بنسبة 3 د postfertilization ( DPF) 4، 5،المرجع "> 6 و 7.

وعلاوة على ذلك، فإن المتطلبات الوظيفية من الجينات المختلفة في كل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه يمكن تقييم متزامنة في شبكية العين الزرد، وتوفير ميزة على نماذج الفقاريات الأخرى التي الظواهر الناتجة عن تطبيق تقنيات خروج المغلوب الجينات يمكن تقييمها إلا بعد تشريح الجثة الثابتة الأنسجة. على وجه الخصوص، واستخدام خطوط المعدلة وراثيا التي يمكننا تصور ورصد التعبير من البروتينات الفلورية كما الجينات المحورة مراسل في شبكية العين، ويسمح لنا للحصول على قرار الزمني في التعبير الجيني الذي يكمن وراء نشأة معين نوع من الخلايا العصبية. نظرا للتطور السريع في الزرد، ويمكن تصور هذه الأحداث خلال الفترة التنموية برمتها، وبالتالي توفير رؤية أعمق في أهمية الزمانية في التعبير الجيني فيما يتعلق اكتساب هوية الخلايا العصبية وسلوك الخلية.

وأخيرا، هذه الأساليب يمكن الجمع بين الكفاءة في الزرد مع جيل من الوهم عن طريق زرع، مما أدى إلى نظرة ثاقبة جانبين رئيسيين من وظيفة الجين. أولا، ودراسة الخلايا المزروعة من جنين المانحة، الذي كان يطرق على جين معين أسفل في حين أنها تتطور في بيئة نوع البرية غير المسماة، ويسمح لنا للحصول على المعلومات ذات الصلة حول وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. وهذا يؤدي إلى معلومات هامة عن وظيفة العوامل مصير المحدد الشبكية داخل الخلايا الاولية يعبر عنها عادة. وهذا ما يتضح من فحص نتائج مصير التنموية من الأسلاف التي لم تعد قادرة على توليد البروتين وظيفية من هذه الجينات 4، 6، 8، 9. باستخدام هذا النهج، ونحن قد أظهرت أن العوامل المحددة العديد من مصير (على سبيل المثال، Vsx1، Atoh7، Ptf1a، Barhl2) تعمل خلية-autonomously لدفع مصير الخلايا العصبية للشبكية محددة؛ عدم التعبير الجيني يؤدي في المقام الأول إلى تبديل القدر، بحيث الخلايا مع الجينات ضربة قاضية لا تزال قابلة للحياة من خلال تبني خلية مصير بديل 4، 6، 7، 10. ثانيا، مثل هذه التجارب خيالية يمكن استخدامها لتقييم مدى البرية تتصرف نوع الأسلاف عندما تعمل على تطوير ضمن بيئات وراثية مختلفة. على سبيل المثال، عن طريق مقارنة تطوير خلايا WT التي عادة ما تعبر عن الجين (والتحوير مراسل) في WT مقابل البيئة المضيفة التلاعب (على سبيل المثال، بالضربة القاضية جين / ضربة قاضية)، والآثار الناجمة على التعبير الجيني ومصير خلية يمكن تقييم . عدم وجود أنواع معينة من الخلايا العصبية في بيئة المضيف، على سبيل المثال، فقد تبين للتأثير على سلوك السلف النوع البري في خلية بطريقة غير المتمتعة بالحكم الذاتي، إلى التحيز لهم نحو التفريق في س ممثلة تمثيلا ناقصاص المفقودين أنواع الخلايا العصبية 4، 7، 11، 12. وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية للشبكية ولدت في ترتيب histogenic يصونها بالتتابع التعبير توقيت الجينات مصير المحدد العصبية محددة (التعبير الجيني مصير) (إعادة النظر في 13)، استخدمنا هذه الطرق لشرح كيفية وتوقيت التعبير مصير الجيني في الأسلاف نوع البرية يتأثر عندما تتطور هذه الأسلاف في البيئات الشبكية المضيفة مع التراكيب الخلوية الشاذة التي يسببها. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه النهج كدليل لكيفية الجمع بين تقنيات قياسية نسبيا، وتستخدم على نطاق واسع يمكن النظر في توقيت التعبير الجيني مصير في تطوير الأسلاف شبكية العين 8 و 9.

يصف هذا البروتوكول نهج تجريبي يجمع الوقت الفاصل بين التصوير مع سهولة فيتشكيل زرع في الجسم الحي السابقين تطوير الجنين الزرد لمتابعة mosaically الفردية الخلايا المسمى طوال فترة من retinogenesis التنموية. عن طريق أداء التلاعب الجيني وظيفية سواء في الجنين المضيف، الجنين المانحة، على حد سواء أو لا، يمكن للمرء أن تقييم الحكم الذاتي خلية من وظيفة الجين. ويمكن تكييف هذا النهج على نطاق واسع على أسئلة بحوث مماثلة في أي نظام آخر والتي المكونات الفردية المذكورة هنا هي مناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لأحكام مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ورمز الاسترالية لممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية.

1. إعداد الزرد

  1. الاقتران الأسماك الكبار
    1. إعداد الأسماك البالغة كما أزواج (أو اثنين من أزواج) في خزانات تربية بحجم مناسب المساء قبل استخدامها.
    2. للحفاظ على الأنثى فصلها عن الذكور، واستخدام مقسم إلى تمكين السمك لنرى، ولكن لا تلمس بعضها البعض.
    3. في الصباح، وبعد تبديل على ضوء ذلك، إزالة فواصل والسماح الأسماك للتزاوج دون عائق.
    4. بعد وضع التزاوج الناجح الأسماك البالغة بالعودة الى دباباتهم الأصلية.
      ملاحظة: المضيفة والمانحة سلالات قد تكون هي نفسها، على سبيل المثال، أي نوع البرية (WT) السلالات. لهذه الدراسة الأجنة المانحة المستمدة من خطوط المعدلة وراثيا تيراغرام (atoh7: gapRFP)، تيراغرام (atoh7: gapGFP) أوTG (vsx1: GFP) التي التعبير عن العوامل مصير المحدد القيادة في وقت مبكر أو يمكن تصور مصير العصبي في وقت متأخر، على التوالي 14 و 15 و 16. من أجل مقارنة آثار اختلاف البيئات الوراثية، يمكن أن الأجنة المضيفة يكون المسوخ أو morphants محددة كما هو موضح أدناه.
  2. جمع الأجنة
    1. استخدام مصفاة الشاي لجمع البيض من مربع تربية. تحقق من البيض كل 15 دقيقة لتحديد وقت ولادة وضمان أن يتم جمع الأجنة مرحلة وحيدة الخلية لخطوات لاحقة.
    2. شطف الأجنة مع E3 المتوسطة (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.2 ملي بوكل، 0.4 ملي CaCl 2، 0.9 ملي MgCl 2 و 2٪ الميثيلين الأزرق في الماء المقطر) ووضعها في أطباق بتري تحتوي على ~ 40 مل E3 17 في مناطق ذات كثافة أقصاها 50 البيض في 90 مم طبق بيتري.
    3. تسمية أطباق بتري مع اسم السلالة، وتاريخ ووقتولادة. استخدام ماصة نقل باستور لإزالة أي حطام في حين عرض الأجنة تحت المجهر تشريح.
    4. الحفاظ على الأجنة في 28.5 درجة مئوية حتى ~ 3 ساعات postfertilization (HPF) لزرع، أو الاستمرار بواسطة إبر دقيقة جدا.
      ملاحظة: للزرع، وتهدف لالمانحة والمضيفة الأجنة في سن مماثلة. لذلك، والاستفادة من درجات الحرارة تربية مختلفة بين 25 - 32 درجة مئوية وفقا لكيميل وآخرون. 18 لإبطاء أو تسريع مخلب واحد من الأجنة لتتناسب مع الآخر.
    5. إبقاء ~ 20 من الأجنة المانحة المعدلة وراثيا uninjected في 32 درجة مئوية من الوقت لجمع حتى الوقت الفاصل بين التصوير (24 - بعد 28 ساعة).
      ملاحظة: هذه تطوير أسرع من الفوج التجريبية وسوف يعبرون عن علامات الفلورسنت في وقت سابق. أنها بالتالي يمكن استخدامها لإعداد المعلمات (قوة الليزر، ربح) للتصوير. في هذا المثال بالذات، والتصوير من الفوج التجريبية يبدأ قبل التعبير التحوير (لتقييمالتوقيت الدقيق لهذا الحدث).

2. إعداد ل microinjection

  1. إعداد حقن مكروي إبرة
    1. استخدام مجتذب إبرة لسحب الإبر من كل الأنابيب الشعرية البورسليكات الزجاج (1.0 مم OD / 0.78 ملم ID / 100 ملم الزجاج الشعرية الطويلة) في مركز للحصول على اثنين من الإبر متساوية في الطول. تهدف لالإبر التي تفتق مع اعمدة طويلة.
      يتم توفير إعدادات مثال لمجتذب الإبرة المستخدمة هنا في ملاحظة: قائمة المواد.
    2. تخزين الإبر سحبت في طبق بتري وتأمين طريق الضغط عليها في شريط من المعجون قابل للتشكيل أو شريط لاصق.
    3. قبل حقن جلب رأس الإبرة في التركيز تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط لكسر مفتوحة الإبرة في طرف. تهدف لطرف مدبب حاد مع فتحة صغيرة (الشكل 1C).
    2. <لى> إعداد Morpholino للالأجنة المضيفة
    1. [أليغنوكليوتيد أجل morpholino مصممة خصيصا لهذا الجين من الفائدة فضلا عن morpholino السيطرة القياسية أو عدم تطابق 5 قاعدة الزوج المناسب للسيطرة على الآثار الإجرائية والمناولة.
      ملاحظة: هنا، ترجمة منع Ptf1a morpholino مع تسلسل 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 "الذي يمنع تطور الخلايا الأفقية وعديم الاستطالات لدت وسيطة، ومعيار morpholino السيطرة الزرد استهداف غلوبين بيتا الإنسان إنترون طفرة (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7، واستخدمت 19.
    2. إعداد 1 ملم حل سهم morpholino (~ 8-8،5 نانوغرام / NL) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. في يوم من الحقن، وتسخين قسامة (10 ميكرولتر) من morpholino عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وتدور لفترة وجيزة ومكان على الجليد ليبرد من 65 درجة مئوية (وبعد ذلك يمكن أن تبقى في درجة حرارة الغرفة خلال الاستخدام). عشرهو سوف عكس أي يحتمل التجميع ضمن حل morpholino، والتي يمكن أن تقلل من فعالية ضربة قاضية.
      1. لPtf1a morpholino ويعادل morpholino السيطرة القياسية، وإعداد حل العاملة من 6 نانوغرام / NL بواسطة تمييع morpholino حل الأسهم مع الماء المقطر. الحفاظ على RT.
        ملاحظة: استخدام 2 NL من morpholino في الجنين مثل Ptf1a morpholino يتطلب تركيز العمل عالية نسبيا من 12 نانوغرام في الجنين كما سبق تحديدها 7. بالنسبة لمعظم morpholinos، 2-5 نانوغرام في جنين فعال، لذلك يخفف من الأسهم إلى 2-5 نانوغرام / NL وحقن 1 NL إلى كل جنين.
  2. إعداد الفلورسنت مراسل هيستون الانصهار يبني لأجنة وضع العلامات المانحة
    ملاحظة: من أجل التمييز / تصور الخلايا المانحة في الأجنة المضيفة، وهناك أساليب مختلفة لتسمية الجنين المانحة، بما في ذلك Microinjection من H2A-GFP (في حال استخدام الجهات المانحة المعدلة وراثيا معللصحفيين أحمر فلوري) أو H2B-طلب تقديم العروض (اذا كنت تستخدم الجهات المانحة المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت الأخضر) مرنا في صفار البيض للخلية واحدة الجنين مرحلة المانحة.
    1. خطي 1 ميكروغرام على الأقل تحتوي على البلازميد الحمض النووي المراسل.
      ملاحظة: هنا pCS2 + البلازميد (ولدت وتفضلت التي تقدمها البروفيسور ديفيد تيرنر من جامعة ميشيغان والبروفيسور رالف روب من الطبية مركز ميونيخ) التي تحتوي على H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض (الناتجة عن الدكتور كريستوفر ويلكنسون، رويال هولواي، وقد خطي جامعة لندن) على الهضم نوتي تقييد الانزيم.
    2. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. نسخ الرنا المرسال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا مع البلمرة المناسب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالبلازميد pCS2 +، استخدم مجموعة SP6 البلمرة.
    4. تنقية مرنا باستخدام مجموعات تجارية أو استخراج الفينول كلوروفورم تليها هطول الأمطار الأيسوبروبانول حسب تعليمات الشركة الصانعةالصورة. تمييع مرنا في الماء عالى النقاء (20 - 30 ميكرولتر)، وقياس تركيز مع معمل ومخزن في -80 درجة مئوية.
    5. في يوم من الحقن، وإعداد محلول العمل مرنا في الماء المعقم مع تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر والحفاظ على الجليد. العودة الأسهم مرنا غير المستخدمة إلى -80 درجة مئوية.

3. Microinjection من Morpholinos و / أو مرنا في خلية واحدة المرحلة الأجنة

وتستخدم إبر دقيقة جدا للاحتفال كل الخلايا المانحة وإعداد بيئات المضيف مختلفة (السيطرة وضربة قاضية الجينات) وتشمل حقن مرنا أو morpholino أليغنوكليوتيد] العقاقير 20، 21: ملاحظة.

  1. تحميل ومعايرة إبرة الحقن
    1. Backload إبرة الحقن مع 3 ميكرولتر من morpholino و / أو هيستون الفلورسنت حل الانصهار مرنا باستخدام نصائح microloader ماصة.
    2. يهز solutايون نحو الطرف حقن الإبرة حتى عدم وجود فقاعات المتبقية. استخدام إبر الحقن مع الزجاج الداخلي إدراج مثل هذا الحل وسيتم اختيار في المقام الأول إلى الطرف بفعل الخاصية الشعرية.
    3. نعلق إبرة الحقن لصاحب المركبة في micromanipulator (3D اليدوي micromanipulator) وضمان وجود ختم ضيق في السكن أنبوب.
    4. بدوره على امدادات الكهرباء والغاز إلى microinjector الضغط تنظيمها.
    5. تزج طرف الإبرة في قطرة من الزيوت المعدنية في طبق (في حالة استخدام العدسة graticule) أو تحوم طرف الإبرة مباشرة على شريحة ميكرون لمعايرة حجم الهبوط. قياس حجم الحقن عن طريق الضغط على دواسة القدم، وضبط ضغط الغاز و / أو المدة الزمنية حتى حجم الحقن ما يعادل 1 NL (125 ميكرون قطر).
      ملاحظة: الاستفادة من شريحة ميكرون هي أن قياسات مستقلة من التكبير المستخدمة في المجهر، ومع ذلك باستخدام خصوصيات العدسة graticuletead، وانخفاض حقن وحجم يمكن أن يكون في التركيز في نفس الوقت.
  2. الجنين حقن مكروي
    1. ضع شريحة المجهر في طبق بتري واستخدام ماصة نقل لإيداع الأجنة مرحلة وحيدة الخلية على طول حافة الشريحة. محاذاة إلى عمود واحد باستخدام طرف microloader ماصة مع نصف من طرف رقيقة قطع. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن مع ماصة نقل غرامة لمنع الحركات أثناء الحقن (الشكل 1A).
    2. انخفاض الإبرة نحو كل جنين، وتخترق المشيمه وصفار في السكتة الدماغية على نحو سلس واحد (الشكل 1B).
    3. مرة واحدة يتم توسيط طرف إبرة في صفار البيض، microinject عن طريق الضغط على دواسة القدم. حقن 1 NL من H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض مرنا في صفار البيض لوحيدة الخلية الجنين مرحلة المانحة (وراثيا). حقن 2 NL من MO القياسية أو Ptf1a MO في صفار البيض من مرحلة وحيدة الخلية النوع البري الجنين المضيف عن طريق الضغط على دواسة القدم مرتين. حقن ناجحة يمكن تصور من قبل األصغر ل تشوه المكاني في صفار البيض.
    4. إزالة إبرة الحقن، ونقل الطبق الذي يحتوي على أجنة لجعل الجنين القادم في الموقف ومواصلة ضخ حتى يتم حقن العمود بأكمله من الأجنة (50 - 60 الأجنة).
    5. بعد حقن جميع الأجنة، ورفع الطبق يصل في 30 - زاوية درجة 45 واستخدام تيار لطيف من E3 المتوسطة (زجاجة ضغط) لنقل الأجنة حقنه في طبق بيتري نظيفة جديدة.
    6. وضع طبق الجنين في حاضنة (إما في 28.5 درجة مئوية أو درجة حرارة أخرى للتأكد من أن الجهات المانحة والمضيفة الأجنة في سن ما يعادلها).
    7. كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.6 عند الضرورة للحصول على ~ 100 الأجنة المانحة أو ~ 200-250 الأجنة المضيفة.
    8. في 1-2 HPF، والتحقق من الأجنة تحت المجهر تشريح وإزالة أي بويضة غير مخصبة التي لم تقدم لل2- أو 4 خلايا مراحل مع نقل ماصة باستور.

4. التحضير لزراعة الأعضاء

ontent "> ملاحظة: يتم استخدام الزرع لتوليد أجنة خيالية السماح للآثار مختلفة البيئات المضيف وراثي ليتم تقييمها ضمن معادلة الأسلاف المانحة WT 9، 22، 23.

  1. الجهات المانحة اختيار الجنين
    1. في 3 HPF، والتحقق من الأجنة المانحة في 2 - 5X التكبير لوصفها إشارة تحت المجهر مضان. اختر متطورة (كتلة الخلية متماثل مع خلايا الحجم بالتساوي) الأجنة مع إشارة الفلورسنت قوية باستخدام GFP بالإضافة إلى فلتر (460-500 نانومتر الإثارة، 510 نانومتر الانبعاثات تمريرة طويلة) أو مرشح تكساس الأحمر (540-580 نانومتر الإثارة، 610 نانومتر الانبعاثات تمريرة طويلة) (1D الشكل). لا يتم التعبير عن صحفيين المعدلة وراثيا حتى الان.
  2. لوحة حقن الأغاروس وبيتري إعداد الطبق
    1. صب المنصهر 2٪ الاغاروز مخففة في E3 المتوسطة إلى 90 مم طبق بيتري وندعه يبرد حتى طبق آمنللمس. الاغاروز الساخن يمكن أن تشوه خلاف ذلك القالب.
    2. تطفو على قالب من البلاستيك مع نتوءات على شكل وتد (6 × 25 / العفن) على الاغاروز (الشكل 2D، E). تجنب فقاعات الهواء عن طريق وضع جانب واحد من العفن على الاغاروز وأقل ببطء أسفل الجانب الآخر. تأكد يتركز القالب في طبق أو نحو الجانب من أعمق نقطة من نتوءات على شكل وتد للسماح الفضاء إزالة ما يكفي لإبرة الزرع.
    3. السماح للالاغاروز ليصلب تماما في RT.
    4. ضع صحن الاغاروز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة القوالب من خلال رفع بلطف من زاوية واحدة (على سبيل المثال، مع ملقط). إعداد لوحات حقن الأغاروس اليوم قبل التجربة وتخزينها في 4 درجة مئوية مع كمية صغيرة من E3 ختم المتوسطة والبارافين فيلم لمنعهم من الجفاف.
    5. قبل زرع، وملء لوحة حقن الأغاروس مع E3 المتوسطة والمكان الى 28.5 درجة مئوية الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      6. <لى> منذ الأجنة dechorionated التمسك البلاستيك، إما استخدام الأطباق الزجاجية أو معطف داخل أطباق بتري (90 مم) مع طبقة رقيقة من 2٪ الاغاروز في E3. إعداد طبق واحد عن الأجنة المضيفة dechorionated، طبق واحد للأجنة المانحة dechorionated وطبق واحد عن كل 40 الأجنة المزروعة. تخزين كما هو موضح في لوحة حقن (4.2.4).
  3. إعداد نقل ماصة
    1. قطع رأس من شكل طويل سحبت بدقة الزجاج طرف ماصة باستير (2 حجم مل، 230 ملم طول 100 ملم طرف الطويل) على طول تسمح للمناورة مريحة (اختياري) عن طريق خدش بسكين الماس في حين الدورية حتى السقوط طرف إيقاف (الشكل 1F).
    2. تأكد من أن قطع مستقيم. البولندية النار الزجاج ماصة نقل عن طريق تناوب على سطح قطع في موقد بنسن لتوليد نهايات ناعمة حتى لا تضر الأجنة dechorionated (الشكل 1F).
      ملاحظة: حفظ غيض ماصة في الشعلة لفترة طويلة جدا ثنتيجة سوء في افتتاح يجري مختومة أعلى أو أصبحت صغيرة جدا بالنسبة للأجنة.
  4. Dechorionating الأريمة مرحلة المانحة والمضيفة الأجنة
    1. الأجنة Dechorionate إما يدويا مع اثنين من ملقط غرامة بشق كل المشيمه دون لمس الجنين، أو إنزيمي باستخدام البروتيني للسماح dechorionation السريع المتزامن لعدد كبير من الأجنة 9.
      1. يعد حل الأسهم 100X من 50 ملغ / مل البروتيني الخليط، وجعل 100 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      2. إضافة 100 ميكرولتر من البروتيني الأسهم إلى 10 مل E3 المتوسطة (تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل البروتيني).
      3. وضع متطورة المضيفة والمانحة الأجنة في اثنين فنجان صغير مخروطي الزجاج منفصلة (10 مل) وإزالة أكبر قدر من السائل ممكن.
      4. إضافة 5 مل من 0.5 ملغ / مل من محلول بروتيني إلى كل كوب ودوامة بلطف الأجنة في حين ينظر إليها تحت المجهر تشريح. مراقبة أي علامات تشوه المشيمه.
      5. الحفاظ دوامات. بمجرد أن الجنين الأول من المشيمه (1D الشكل، النجمة)، نفذ ثلاثة يشطف سريعة مع E3 المتوسطة لإزالة حل البروتيني التي تتدفق معظم السائل وإعادة تعبئة القارورة بصب بلطف في E3 على طول الجانب. لا تسمح الأجنة dechorionated تأتي في اتصال مع الهواء في أي من الخطوات التالية حتى نهاية (القسم 5) لزراعة الأعضاء، لأنها سوف تنفجر. ترك حل مناسب في قارورة بين يشطف.
      6. مع الحريق مصقول نقل ماصة الزجاج، ونقل الأجنة من دورق مخروطي في أطباق بتري الزجاج أو الاغاروز (2٪ في E3 المتوسطة) المغلفة أطباق بلاستيكية. ماصة بلطف أثناء نقل لإزالة أي المتبقية المشيمه ضعف.
  5. إعداد زرع الإبر
    1. استخدام مجتذب إبرة لسحب اثنين من الإبر من كل أنبوب رفيع الجدار الزجاجي البورسليكات (1.0 مم OD/ 0.78 ملم ID / 100 ملم طول) مع نفس الإعدادات كما ماصات حقن مكروي.
      يتم توفير إعدادات مثال لمجتذب الإبرة المستخدمة هنا في قائمة المواد: ملاحظة. الإبر زرع لم يكن لديك إدراج الزجاج، كما امتص هذا يضر الخلايا في الإبرة.
    2. سحب الإبر مسبقا وتخزينها في طبق بيتري وتأمين طريق الضغط على شريط من المعجون قابل للتشكيل أو شريط لاصق.
    3. قبل الزرع جلب رأس الإبرة في التركيز تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط لكسر مفتوحة الإبرة في طرف. استخدام ملقط غرامة لضبط شكل إبرة لهدف لالفلوت الشكل (الشكل 2G)، أو استخدام الطرق البديلة وصفه لتوليد شكل قمة 23.

5. الوهم الجيل عبر الأريمة زراعة

  1. الإعداد زرع
    ملاحظة: هنا، تم استخدام جهاز زرع الذاتي تجميعها (الشكل 2A
  2. جبل الإبرة زرع في حامل إبرة نفسه الذي استخدم ل microinjection فوق (التي شنت على micromanipulator، خطوة 3.1.3) (الشكل 2A).
  3. قطع أنابيب ضخ الذي يربط نهاية حامل micropipette إلى microinjector الضغط ينظم استخدامها لإبر دقيقة جدا. إرفاق أنابيب حقن مرتبط إلى 1 مل حقنة (الشكل 2A، B)، الذي يمثل منصة الزرع.
    1. تأكد من أن كافة الاتصالات مغلقة بإحكام باستخدام فيلم البارافين أو المعجون قابل للتشكيل. منع الأجنة من ملامسة الهواء عن طريق ضمان أن هناك دائما بعض المتوسطة E3 في الإبرة زرع نفسها. تعمل حقنة يدويا لامتصاص خلايا / السائل داخل وخارج إبرة الزرع.
  • محاذاة الجنين
    1. نقل الأجنة المانحة مع ماصة الزجاج في العمود الأول من قالب الاغاروز. نقل الأجنة المضيفة في أعمدة 2إلى 6 من العفن الاغاروز (الشكل 2F). وضع الأجنة مع ماصة بحيث يواجه الجانب قسيم أرومي تصل.
  • ازدراع
    1. راحة بلطف الإبرة زرع على خلية قسيم أرومي من جنين المانحة وتمتص ببطء حوالي 20 - 50 خلية في إبرة الزرع (الشكل 2H). تجنب امتصاص الصفار.
    2. رفع إبرة زرع من الجنين المانحة باستخدام micromanipulator. نقل طبق قالب الاغاروز إلى اليسار وإدراج غيض زرع إبرة من خلال الجانب من الكتلة الخلوية في القطب الحيواني من الجنين المضيف الأول. إيداع 5-10 خلايا بالقرب من السطح وفقا لرسم الخرائط مصير تبين أن هذا المجال يثير مجال الدماغ الأمامي / العين 24 (الشكل 2I). الحفاظ على طرف إبرة منغمسين في المتوسط ​​E3 في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
  • رعاية الأجنة المزروعة
    1. إزالة المانحة الأجنة لالثانية ترك الأجنة المضيفة في قالب الاغاروز ل1 - 2 ساعة في 28.5 درجة مئوية. ملء الزجاج أو البلاستيك (المغلفة مع 2٪ الاغاروز) أطباق بتري مع المتوسط ​​E3 تحتوي على 0.003٪ N-الفنيل (PTU) لمنع تشكيل الصباغ لأن هذا سوف تتداخل مع التصوير. نقل الأجنة المضيفة إلى هذه الأطباق مع النار مصقول ماصة الزجاج واحتضان عند 28.5 درجة CO / N.
      تنبيه: ارتداء القفازات عند التعامل مع PTU.

    • 6. إعداد تصوير لايف

    ملاحظة: حجم صغير والشفافية البصرية من الزرد جنبا إلى جنب مع التطور السريع قد أتاحت لها أن تصبح نموذجا الفقاريات رئيسيا في الجسم الحي التصوير من الخلايا والأعضاء المختلفة. التصوير لا يمكن أن يؤديها على مجموعة متنوعة من المجاهر، والتي سوف تختلف في الإعداد والمعلمات. فيما يلي وصف لإعداد متحد البؤر التصوير مناسبة للتصوير للتنمية الشبكية 5، 8.

    1. الجنين خياليةاختيار
      1. في 24-26 HPF، وشاشة الأجنة المزروعة تحت نطاق الفلورسنت تشريح لتحديد الأجنة صحية متطورة التي تظهر الخلايا التي تم زرعها المانحة (H2A-GFP أو H2B-RFP المسمى) في منشم العين النامية.
      2. توضع جانبا حتى 40 الأجنة للتركيب من قبل pipetting إلى طبق جديد وإضافة 0.4 ملغ / مل تريكين methanesulfate (MS222) لتخدير الأجنة.
        تنبيه: ارتداء القفازات عند التعامل مع MS222.
    2. الأجنة تصاعد
      ملاحظة: استخدم طبق تصاعد المناسب، وهذا يتوقف على ما إذا كان سيتم إجراء التصوير على مجهر مقلوب 8 أو تستقيم (الموصوفة هنا).
      1. إعداد عدد قليل من 1.5 مل أنابيب بلاستيكية تحتوي على 1 مل من 1٪ انخفاض الاغاروز تذوب في 0.4 ملغ / مل MS222 في E3 المتوسطة والحفاظ على المنصهر في 40 ° C حمام الماء.
      2. تمتص 5 الأجنة في ماصة نقل البلاستيك والسماح للأجنة تتراكم في الطرف عن طريق الجاذبية. المس نقل ماصةعلى سطح واحد من الأنابيب البلاستيكية المعدة تحتوي على 1٪ تذوب منخفض الاغاروز و 0.4 ملغ / مل MS222 السماح للأجنة لتغرق في أنبوب بينما الحد من كمية نقل E3.
      3. الأجنة جبل في 90 مم طبق بيتري للتصوير في المجهر تستقيم وأسفل الزجاج طبق بتري (أي حجم) للتصوير في مجهر مقلوب. استخدام علامة دائمة لتقسيم بصريا إما طبق إلى نصفين للمانحين الصورة في المضيفين WT (على جانب واحد) أو المضيفين morphant (الجانب الآخر) في التجربة نفسها.
      4. نقل الأجنة خمسة من أنبوب بلاستيكي الاغاروز إما طبق بيتري مع 0،5-1 مل الاغاروز. إزالة الاغاروز الزائدة مع ماصة نقل بحيث (~ 200-300 ميكرولتر) سوى قطرة صغيرة لا يزال قائما. إذا التصوير مع المجهر تستقيم، وتجنب وضع الأجنة داخل 1 سم من محيط طبق بيتري. عدسة غمس غمر المياه المستخدمة في التصوير قد لا تكون قادرة على أن تركز في هذا المجال بسبب الجدار طبق بيتري (الشكل 3A </ قوي>).
      5. استخدام ماصة microloading (مع طرف قطعت) لمحاذاة الأجنة أفقيا حتى يتصلب الأغاروس. لكلا النوعين من الأطباق، والزاوية الأجنة بشكل صحيح أفقيا إذا كانت العينان اثنين على كل جانب من جانبي الرأس هي متداخلة تماما (محاذاة في XY البعد) (الشكل 3B). للاستخدام المجهر المقلوب، والعين بالقرب من ساترة يجب دفع أقرب إلى ساترة وقت ممكن، لتمكين التصوير من خلال البعد ض ضمن قيود مستويات التركيز الممكنة.
      6. تواصل تصاعد خمسة أجنة في وقت قطرات الأغاروس الفردية. استخدام المزيد من 1٪ منخفضة ذوبان الاغاروز للانضمام إلى الاغاروز قطرات من بعضها البعض وعلى جانب الطبق لمنع أي تهجير والحركة الجانبية أثناء التصوير (الشكل 3A).
      7. مرة واحدة توطد تماما، وتغطي الطبق مع E3 المتوسطة (التي تحتوي على 0.003٪ PTU، 0.4 ملغ / مل MS222) prewarmed إلى 28.5 درجة مئوية.
      8. باستخدام نفس النهج هو موضح في الخطوات 6.2.2- 6.2.8، جبل ~ 20 الأجنة وراثيا التي أثيرت في 32 درجة مئوية (الخطوة 1.2.5) في طبق منفصل.
    3. المعلمات التصوير
      ملاحظة: التصوير لتحليل بداية من الجينات المحورة الفلورسنت لا تتطلب دقة عالية داخل الخلايا المكاني. لا يمكن أن يؤديها مع W خطة-امزيغ 20X / 1.0 DIC M27 الهدف 70 ملم على 1.5 التكبير.
      1. إعداد الوقت قوة الليزر والتعرض على أساس كثافة التحوير ل~ 20 الأجنة وراثيا مع التنمية المتسارعة (رفع أي في 32 درجة مئوية، خطوة 6.2.8).
        ملاحظة: للحصول على دراسات من بداية التعبير التحوير، الأجنة التجريبية تظهر أي مضان في الوقت الذي يتم ضبط الوقت الفاصل بين أعلى وبالتالي، فإن هذه الأجنة تسارع حاسمة لتحديد معالم التصوير.
      2. للطبق التجريبية، تصور كل جنين وإنقاذ الموقف والتركيز مستويات الأجنة.
        1. اختيار الأجنة التي لديها زاوية التركيب الصحيحة (أي مع الصورة الجانبيةبيئة تطوير متكاملة من العين كما الأفقي ممكن) وضربات القلب القوي (وهو مؤشر على الصحة). اختيار الأجنة مع عدد قليل من الخلايا المانحة المزروعة (التي حددها H2A-GFP أو العلامات H2B-RFP) في المقام الأول في الربع البطني الأمامي من شبكية العين النامية (حيث تبدأ موجة من التعبير الجيني) (الشكل 3C).
          ملاحظة: في الأجنة الزرد، ومتوسط سرعة القلب هو 120-180 نبضة / دقيقة 25. في الأجنة تخدير، قد تكون ضربات القلب السليم في نطاق 60-120 نبضة / دقيقة. قد يكون أبطأ ضربات القلب يدل على انخفاض الجدوى ولا ينبغي استبعاد تلك الأجنة من الدراسة.
      3. تعيين مداخن Z من المقاطع البصرية في 2 ميكرون فترات من خلال شبكية العين تصل إلى 15 الأجنة.
        ملاحظة: إجمالي عدد الأجنة التي يمكن تصوير في أي تجربة معينة سوف تعتمد على المعلمات الفردية (زمن التعرض وحجم ض المكدس). الوقت الذي يستغرقه لصورة 1 نقطة في الوقت لجميع الأجنة المختارة يجب أن يكون SHorter من الفاصل الزمني بين نقاط الوقت. من خلال التضحية ببعض قرار العمق، والمزيد من الأجنة يمكن تصوير داخل فترات زمنية. ويتم اختيار حدود ض المكدس كما النقيضين الجانبية وسطي من الأجنة العين محمولة و 30 ميكرون يضاف إلى الجانب الوحشي في الإعداد المجهر تستقيم، وعيون الأجنة النامية في هذا التحول الإعداد في اتجاه z كما الأجنة تنمو بين عشية وضحاها. وهذا يؤدي إلى أكوام 100-170 ميكرون سمك (50-85 الصور / العين).
      4. التقاط صور كل 24 دقيقة في 32 ° C (ما يعادل 0.5 HPF فترات) باستخدام الليزر المناسب / القناة إلى التحوير.
        ملاحظة: تبقى الأجنة على المسرح في جميع أنحاء كامل الوقت الفاصل داخل غرفة ساخنة تشمل المجهر بأكمله. بينما يمكن إجراء التجربة على 28 درجة مئوية، وتستخدم درجات الحرارة لتسريع التنمية وضمان نقاط الزمنية ذات الصلة في التجربة يتم تصوير داخل 16-24 ساعة مدة مرور الزمن.
      5. صورةالقنوات التي تمثل التسمية المانحة (H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض - اختياري) والتحوير (Atoh7: طلب تقديم العروض أو Vsx1: GFP) باستخدام المسح المتتابع. لتحليلها، والاستفادة من التسمية المانحة فقط لاختيار الأجنة المناسبة كما هو موضح (تأخذ واحدة ض المكدس في بداية التصوير) ثم نفذ الوقت الفاصل فقط على قناة لالتقاط التعبير التحوير.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم تسمية المانحة فقط لتحديد الأجنة المناسبة (أي تلك بخلايا أكد المزروع في الأمامي الربع البطني) وصورة فقط القناة التحوير، ما يقرب من خفض وقت التصوير وأي ما يعادل ضعف عدد الأجنة التي يمكن تصويرها وتحليلها في تجربة (الشكل 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يعرض هذا العمل بروتوكول تجريبي لتقييم التغيرات في التعبير الجيني توقيت عندما تتطور النوع البري الأسلاف الشبكية داخل الجنين المضيف morphant. الأجنة المضيفة التجريبية هي morphants Ptf1a، التي تفتقر إلى interneurons المتوسطة ولد الأفقي وعديم الاستطالات الشبكية 7 و 26. وقد تم مقارنة هذه للسيطرة على الأجنة المضيفة، التي حقنت مع morpholino السيطرة القياسية.

    منذ تكوين الخلايا العصبية من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي (بما في شبكية العين) يحدث في الحفظ جدا من أجل 27، 28، 29، 30، 31 تطور المصير اللاحق قد تعتمد على خلية الاصداء غير المتمتعة بالحكم الذاتي histogenicمن تراكم أنواع الخلايا العصبية ولدت في وقت سابق. تم اختبار هذه الفرضية من خلال تقييم توقيت جيل من أنواع العصبية ولدت في وقت لاحق في الخلايا الاولية المزروعة النامية في غياب المتوسطة أنواع الخلايا العصبية ولدت. كعنصر تحكم، كان كميا توقيت خلايا لدت في وقت مبكر أيضا، التي ينبغي أن تكون تتأثر بشكل مستقل عن ما إذا كان يتم إنشاء خلايا وسيطة أو لا. تحقيقا لهذه الغاية، تيراغرام (atoh7: طلب تقديم العروض) أو تيراغرام (atoh7: gapGFP) استخدمت خطوط لتصور بداية تكوين الخلايا العصبية الخلايا العقدية أولا لدت في حين تيراغرام (vsx1: GFP) خط استخدمت لتحليل بداية في وقت متأخر ولد سكان القطبين. البعض من التعبير بالإضافة إلى الجينات المحورة مراسل الخلايا المانحة من هذه الأجنة هي WT وراثيا.

    Microinjection من 1 NL مرنا (للخلايا التسمية المانحين) في صفار البيض من خلية واحدة الأجنة مرحلة النتائج في بروتين تعبير مراسل فلوري بنسبة 3 HPF، الذيويتم اختيار استضافة ألمع الجهات المانحة (الشكل 1). إعداد الإعداد زرع عند الأجنة حوالي 2 HPF (الشكل 2). في 24 HPF، ويتم اختيار الأجنة مع الخلايا المانحة زرعها في المواقع الشبكية ذات الصلة والتي شنت في 1٪ الاغاروز انخفاض ذوبان في مجموعات من خمسة (الشكل 3). بعد إنقاذ الموقف الجنين، وتحديد ض المكدس والمعلمات الوقت، يتم تنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير ل16-24 ساعة. يشار توقيت خلايا العقدة الأولى ولدت قبل بداية Atoh7: يشار gapGFP التحوير وتوقيت آخر جيل ثنائي القطب ولد قبل upregulation القوي للVsx1: طلب تقديم العروض أو Atoh7 التحوير GFP، وهو ما يعبر عنه أيضا في انخفاض واضح سطوع المستويات في الأسلاف النامية. يتم تحديد gapGFP في الخلايا الفردية في كل timepoint من التصوير (السهام البيضاء، الشكل 4): توقيت التعبير التحوير الأول، مثل Atoh7. Atoh7: gapGFP والعقدة تمايز الخلايا occuالتمرير في بعض الأحيان أي ما يعادل بغض النظر عن ما إذا كان الجنين المضيف WT أو Ptf1a morphant تفتقر خلايا المتوسط (أي بعد ولادة الخلايا العقدية) الأفقية وعديم الاستطالات.

    البيانات المقدمة تثبت أن هذا المنهج التجريبي يوفر أداة قوية لتقييم دور خاصة البيئات الشبكية في توقيت التعبير الجيني، مع الآثار ذات الصلة، وليس فقط لفهم العمليات التنموية العادية ولكن أيضا للتطبيقات المستقبلية لاستراتيجيات خلية برمجة في الظروف العادية والمريضة .

    شكل 1
    الشكل 1: microinjection في صفار من خلية واحدة المرحلة الأجنة تستخدم لتسمية الخلايا المانحة ولتوليد البيئات المضيف مختلفة. أ) يتم محاذاة الأجنة على حافة شريحة زجاجية مع أكثر من إعادة السائلة المحيطةانتقل. ب) يتم إدخال الإبرة في وسط صفار البيض وإما H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض مرنا (لالمانحة) أو morpholino (MO القياسية أو Ptf1a MO للمضيف) يتم حقنها. ج) يتم إنشاء إبرة الحقن باستخدام مجتذب إبرة الذي يولد إبرتين متناظرة من كل شعري. يحتاج كل إبرة سحبت في وقت لاحق أن يكون الطرف كسر مع ملقط لفتح إبرة وفي الوقت ذاته توفير رأس الزاوية حادة (لا فظة) التي يمكن إدراجها بسهولة في الأجنة. الأجنة D) المانحة حقن H2B-طلب تقديم العروض مرنا في مرحلة وحيدة الخلية تبدأ معربا عن البروتينات الفلورية مراسل بنسبة 2.5 HPF، في المرحلة التي يمكن اختيار ألمع وأكثر المسمى بالتساوي الأجنة. وdechorionated 3 HPF والجهات المانحة والمضيفة الأجنة إنزيمي باستخدام البروتياز - E) نحو 2.5. دوامات من دورق مخروطي يوفر القوة الميكانيكية اللازمة لكسر فتح chorions ضعف ويجلب الجنين dechorionatedالصورة في الوسط. في أقرب وقت واحد الأول (النجمة) أو عدد قليل من الأجنة dechorionated لوحظ، الشطف السريع ولكن لطيف يضمن أن تتم إزالة الحل البروتيني. F) لنقل الأجنة dechorionated، وتستخدم ماصات نقل الزجاج. هذه يمكن اختصارها في البداية (اختياري) إلى أي طول الذي ناور بشكل مريح من قبل المستخدم، بواسطة خدش الزجاج في المكان المناسب بسكين الماس حتى يستقر خارج. وهذا يؤدي إلى خفض الحافة الحادة، التي يجب أن تكون النار مصقول لتنعيم أي حواف خشنة قد تؤدي إلى إتلاف خلايا انجرار إلى ماصة أثناء النقل. أشرطة النطاق A، B، D، E = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: إعداد زرع. ب) أنابيب زرع أظهرت يشير إلى مدى ببساطة منع التسريبات المحتملة في المفاصل باستخدام المعجون قابل للتشكيل وفيلم البارافين. C) وجهة نظر التكبير العالي للعلاقة بين أنابيب الحقن وأي أنابيب مناسبة للاتصال الحقنة. في حين أن أي أنابيب يمكن استخدامها، وأنبوب المستخدمة هنا التي يبلغ قطرها أن بإحكام يناسب 10 ميكرولتر ماصة. استخدام فيلم البارافين لضمان ختم مشددة. D) القالب ديه 150 (6 × 25) أسافين لتوليد ديفوتس الثلاثي في لوحة حقن الأغاروس. E) الأبعاد التقريبية من كل شكل إسفين ترد. القياسات شركة هي ملكية. F)وتستخدم مستعدة لوحات حقن الأغاروس مع المسافات البادئة على شكل وتد مع أجنة المانحة إضافة إلى العمود الأول والأعمدة 2-6 مليئة الأجنة المضيفة. يتم تنفيذ عمليات زرع في الصف، حيث الخلايا التي تم جمعها من الجهات المانحة واحد في كل صف يمكن زرعها فى 5 الأجنة المضيفة. داخل كل العفن، والخلايا من ما يصل الى 25 المانحين يمكن زرعها إلى ما يصل إلى 125 الأجنة المضيفة. ملاحظة يتم وضع القالب غير متماثلة مع نهاية أعمق من إسفين أقرب إلى طبق بيتري حافة. وهذا يسمح للإبرة زرع من الجهة اليمنى دون ضرب طبق بيتري حافة. يتم سحبها G) الإبرة زرع مع نفس المعلمات مثل إبرة حقن أن يؤدي إلى طرف مدبب طويل هو موضح هنا. ولا بد من كسر الإبرة لتوليد القطر الداخلي الأكبر الذي يمكن أن يستغرق الخلايا دون تشويه لها. يظهر أقحم أعلى سلطة أن رأس الإبرة زرع يجب أن تكون الزاوية ومثالي لديها "الفلوت" الشكل كما هو مبين في هذا المثال. يظهر H) أعلى عرض قوة التوجه للأجنة المضيف مع الخلايا في الجزء العلوي. يتم إدخال الإبرة زرع في كتلة خلية من الجنين الأريمة مرحلة المضيف أفقيا (النجمة البيضاء) ودفعت في العين في المستقبل كما هو موضح هنا. ويمكن رؤية الخلايا المانحة في إبرة زرع (السهم)، وبالتالي عدد تقريبي للخلايا يمكن التحكم المزروعة. I) مثالان (اليسار واليمين) تبين أن مباشرة بعد الزرع والأجنة مع الخلايا التي تم زرعها بنجاح في الموقع الصحيح ويمكن على الفور تسويتها باستخدام التسمية المانحة (على سبيل المثال، H2B-RFP). تم إضافة قناة الفلورسنت إلى brightfield باستخدام "دودج الخطي (إضافة)" الخيار ضمن القائمة طبقة في محرر الرسومات النقطية. شريط النطاق (لH، I) = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
    الشكل (3): الجنين تصاعد التصوير الوقت الفاصل. أ) طبق بيتري (90 ملم) تظهر عدة قطرات الاغاروز انخفاض ذوبان تحتوي على خمسة أجنة كل متصلة بواسطة الاغاروز لتشكيل شبكة حازمة لمنع قطرات الفردية من فصل. ب) ارتفاع عرض قوة 24 HPF الأجنة محاذاة أفقيا وجزءا لا يتجزأ من داخل الاغاروز طدت. لزاوية مثالية، وينبغي وضع عيون اثنين من فوق بعضها البعض (في Z-البعد). اعتمادا على الجينات في المصالح، تصاعد ينبغي أن يتأخر حتى قبيل توقيت ذات الصلة (على سبيل المثال، 26 HPF للتمايز الخلايا العقدية أو 35 HPF لبداية تمايز الخلايا ثنائي القطب). C) صورة متحد البؤر من بصري ض مقطع واحد يظهر تراكب brightfield وقنوات الأحمر (باستخدام "الخطي دودج (إضافة)" الخيار ضمن القائمة طبقة فيمحرر الرسومات النقطية) من العين النامية مع عدد قليل من الخلايا المانحة المسمى (الحمراء) في بيئة المضيف غير المسماة خلاف ذلك. مقياس شريط B = 1 ملم، شريط نطاق C = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الشكل 4: توقيت تكوين الخلايا العصبية يمكن تصور في خلايا المانحة المعدلة وراثيا المزروع في البيئات المضيف مختلفة. الميكروسكوب من الصورة الوقت الفاصل بين الخلايا المانحة WT تطوير من تيراغرام (atoh7: gapGFP) الأجنة وراثيا المزروع في مضيف WT الخالي من الملصقات. يشار إلى بداية التعبير التحوير لبضع خلايا من السهام البيضاء. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر سو هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    فهم إلى أي مدى الخلايا المجاورة تؤثر توقيت التعبير عن العوامل التي تحدد مصير خلية حاسم من الضروري عندما تهدف إلى إرشاد كفاءة الخلايا الجذعية الجنينية متعدد القدرات أو حمله على التمايز إلى نوع خلية معينة في مرحلة ما بعد الإنقسامية أو حتى الأنسجة المزخرفة. وعلاوة على ذلك، ودراسة هذه الأحداث الجزيئية في الخلايا النامية في الحيوانات الحية بالإضافة إلى ذلك يوفر ديناميكية ذات الصلة المعلومات (الزمانية والمكانية) على السياقات الخلوية معينة ترتبط هذه الأحداث في الجسم الحي. مثل هذه الدراسات لا يمكن أن يتحقق بسهولة في جميع النماذج الفقاريات.

    في بروتوكول المعروضة، يتم استغلال الجنين الزرد قابلة نموذجا الفقاريات لمعالجة هذه المسائل في الجسم الحي، في النسيج منقوشة ثلاثية الأبعاد بسيطة نسبيا، ولكن درجة عالية من التنظيم للشبكية الفقاريات. ويتمثل هذا عن طريق اختبار الفرضية القائلة بأن المستنفدة لخلايا شبكية معينةنوع يؤثر توقيت التعبير الجيني ومصير التنموي الخلايا الاصلية في شبكية العين. يمكننا الاستفادة بالإضافة إلى علامة الخلية المانحة لتعقب خلايا معينة في الزمن الى الوراء تقييم، على سبيل المثال، كيف قبل وقت طويل من التعبير عن التحوير خضعت خلية تالية للتفتل التقسيم الأخير، أو تقييم السلوك العام لهذه الخلية (على سبيل المثال، والهجرة) في مراحل مختلفة قبل التعبير التحوير في بيئات مختلفة. لهذه الدراسات، يتم عرض تقنيات مزيج من السهل نسبيا القيام بها، والتي تشمل الجينات morpholino بوساطة نهدم، وزرع والتصوير الحي. للتعرف على طريقة الزرع، وبروتوكول يقدم رواية، نسبيا سهلة وغير مكلفة زرع تلاعب ويدل على سهولة الإعداد التشغيل هذا.

    لا يقتصر هذا البروتوكول لشبكية العين. ويمكن أيضا أن تطبق على دراسة عدد من مختلف العمليات الخلوية الحيوية، والتي تتطلب التفكيك من developm خلايا مستقلةبرامج ental من خلية التأثيرات البيئية غير المتمتعة بالحكم الذاتي. ومع ذلك، في حين أن المطلوب استكشاف الأخطاء وإصلاحها قليلا، ويجب أن تؤخذ بعين الاعتبار قبل البدء في تجربة عدد من الخطوات الحاسمة. أحد أهم الشروط الضرورية لنجاح تطبيق هذه التقنية هو أن عضو أو نسيج من الاختيار يجب أن تستهدف بسهولة في الجنين في وقت مبكر باستخدام خريطة المصير. إذا كفاءة استهداف الأنسجة لم يتم اختباره سابقا، وهذا يحتاج إلى أن يكون الأمثل أولا وموحدة. ويمكن زيادة عدد الأجنة microinjected وزرعها وفحص مسبق للعيش التصوير للحصول على الأجنة كافية مع الخلايا المانحة المتكاملة وضعه داخل الأنسجة ذات الصلة بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها بسهولة في المراحل المبكرة الزرد الجنينية، وتطبيق لمراحل لاحقة مثل اليرقات المتزايد تصبح أكثر صعوبة لسببين. أولا، كفاءة الجينات ضربة قاضية يمكن الحصول عليها مع morpholinos تنخفض مع مرور الوقت (ديمعلقة على كل morpholino، فمن عادة أكثر كفاءة قبل 3 DPF). لتجاوز هذه المشكلة، واستخدام طفرات الوراثية مثل الأجنة المانحة للزرع هو الأفضل. ثانيا، كما ينمو الزرد، أعمق أجزاء من اليرقات تصبح أقل للوصول إلى التصوير مع المجهر متحد البؤر، وخصوصا في أعلى تكبير (أهداف عالية الطاقة) حيث المسافة عمل الهدف المجهر أكثر محدودية. وهكذا، كل الأنسجة من الاهتمام في سن ذات الصلة يجب تقييم أولا لبقدراتها التصوير.

    في الوقت الفاصل بين التصوير لا يمكن أن يؤديها إما على مجهر متحد البؤر مقلوب أو تستقيم.

    وهناك عدد من المزايا للمجهر تستقيم، إذا كانت متوفرة. في درجة الحرارة المطلوبة، تبخر مادة الغمر المستخدمة (على سبيل المثال، الماء أو النفط الغمر مع مؤشر الانكسار المياه) على مجهر مقلوب يمكن أن تؤدي إلى تجفيف الكامل بها. وهذا يتطلب مراقبة مستمرة وإعادة تعبئة في نهاية المطاف، مع خطر وضع عينة من التركيز. ويمكن تجنب ذلك جزئيا باستخدام الأتمتة لخفض موضوعية مسافة محددة، إضافة مادة الغمر ورفع الهدف مرة أخرى، على الرغم من تجربتنا، وغالبا ما تزال هناك حاجة للتركيز، الذي يجب أن يحدث قبل بداية نقطة زمنية القادمة من التصوير . ثانيا، أكبر أطباق ساترة أسفل مصادر نحن لا تزال أقل بكثير (50 مليمتر في القطر) من 90 مم أطباق بتري القياسية المستخدمة للفحص المجهري في وضع مستقيم. وهذا يعني أن عدد الأجنة التي يمكن تركيبها والجنين حجم متوسط ​​وأضاف أكثر محدودية عند استخدام المجاهر المقلوب. ومع ذلك، تشكل المعلمات الوقت الفاصل بين عادة العامل المحدد الرئيسي لعدد الأجنة التي يمكن تصويرها، وبالتالي فإن حجم الطبق لا تزال مناسبة. عند استخدام الأهداف التكبير عالية جدا، المجهر المقلوب قد تسمح عمق أكبر في Z-البعد كما عين والهدف ويفصل بينهما سوى ساترة رقيقة. عند الجمع بين التكبير عالية جدا مع المجهر تستقيم، يجب أن تبقى قطرة الاغاروز تغطي الجنين رقيقة قدر الإمكان. وعموما، فإن البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر تستقيم أو المقلوب هو من نوعية مماثلة.

    لتوليد بيانات ذات جودة عالية، وهناك خطوات حاسمة الإضافية التي تحتاج إلى النظر فيها. أولا، واختيار من الجهات المانحة وصفت الزاهية أمر حاسم للحصول على الأجنة المزروعة مع عدد مناسب من الخلايا التي تم زرعها في العين في بداية الوقت الفاصل بين الأفلام (عدد قليل، ولكن لم يفت الكثير). وdechorionation البروتيني الأنزيمية هو خطوة حاسمة وحضانة في البروتيني يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن تليها سريعة، ولكن لطيف يشطف أن لا تؤثر على صحة اللاحقة من الأجنة. العمر مطابقة المانحة والمضيفة الأجنة يسمح للأنسجة دقيقة تستهدف وفقا لخريطة مصير والتكامل الفعال للخلايا. وشمال شرق زرع جيدا على شكلedle هو المهم، والتأكد من أن رأس صغير وحاد بما فيه الكفاية لإدراجها في الأجنة المضيفة دون أن تسبب الكثير من الضرر، ولكن كبيرة بما يكفي في القطر الداخلي لللا يسبب التلف الميكانيكي للخلايا التي زرعها. خلال زرع، إذا لم يتم مختومة المعدات بالكامل (خصوصا في نقاط الاتصال)، فإنه من الصعب جدا السيطرة على حركة E3 المتوسطة والخلايا يدويا داخل وخارج إبرة الزرع. هذا هو الأكثر وضوحا عندما يكون هناك تدفق إما داخل أو خارج الإبرة زرع دون تغيير حجم حقنة يدويا. في هذه الحالة جميع المفاصل يجب إعادة فحصها وأعادت. وينبغي اختبار هذا في وقت مبكر من التجربة.

    وأخيرا، وخلال الوقت المنقضي بين زرع والإعداد مرور الزمن، فمن الأهمية بمكان أن يتم السماح الأجنة المزروعة لتطوير بكثافة منخفضة في حين تنظيف بدقة من أي أجنة غير صحية. هذا مهم بشكل خاص، عندما توقيت التنمية أو جنرالويجري التحقيق التعبير ه. عند تقييم توقيت أي عملية (على سبيل المثال، التعبير الجيني)، يجب استخدام الضوابط لاستبعاد آثار جانبية غير محددة من التكنولوجيا morpholino. في عملنا، ونحن نستخدم توقيت التعبير التحوير في الأنسجة لا علاقة لها (على سبيل المثال، والعضلات) تتأثر الجينات المحددة التي استهدفها morpholino.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من قبل DECRA ARC إلى PRJ (DE120101311) ومنحة بحثية الألمانية للبحوث (DFG) ليرة لبنانية (أ ف ب 1440 / 1-1). ويدعم معهد الطب التجديدي الاسترالي بأموال من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاتحادية الاسترالية. ونحن نعترف الدكتور جيريمي نغ تشي كى، الذي أجرى تجارب الموصوفة هنا كما نشرت في كى آخرون. ، عام 2016. ونحن ممتنون لأحكام الأسماك المعدلة وراثيا من البروفيسور Higashijima وأشكر الأستاذان. تيرنر وروب لتوفير pCS2 + البلازميد والدكتور ويلكنسون لتوليد H2B-طلب تقديم العروض وH2A-GFP يبني. نشكر موظفي منشأة FishCore (جامعة موناش) لرعاية الحيوانات لدينا.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    علم الأحياء التنموي، العدد 121، الزرد، وزرع، الوهم، التصوير الحي، الخلايا غير مستقلة، شبكية العين، التعبير الجيني توقيت، تكوين الخلايا العصبية
    <em>في فيفو</em> التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter