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Developmental Biology

在嵌合斑马鱼胚胎的个别视网膜祖细胞转基因表达的体内成像来研究细胞非自治的影响

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

在不同的遗传背景的个体WT视网膜祖细胞的现场跟踪允许细胞非自主性的信令神经过程中贡献进行评估。这里，通过胚胎移植和体内的时间推移共焦成像的基因敲除，嵌合体的产生的组合物用于此目的。

Abstract

遗传和技术优势作出了斑马鱼脊椎动物一个关键的模式生物，其中基因操作的后果可在体内在整个快速发育期间进行跟踪。多个进程可以研究包括细胞增殖，基因表达，细胞迁移和形态发生。重要的是，嵌合体通过移植的产生可以容易地执行，允许主机环境的影响下镶嵌标签和单个细胞的跟踪。例如，通过结合宿主胚的个体移植供体细胞中有功能的基因操作（ 例如，通过显微注射吗啉）和实时成像，外在的影响，细胞非自治信号（由经遗传修饰的环境提供）进行评估。在这里，我们证明这种方法是如何使用荧光的转基因表达的开始比较作为细胞命运determin的定时的代理在通货膨胀不同的遗传主机环境。

在本文中，我们提供的协议为显微注射斑马鱼胚胎标记供体细胞，并引起在宿主胚胎的基因敲除，用于产生嵌合胚胎移植技术的说明，以及用于制备和体内的时间推移共焦运行协议多个胚胎成像。特别是，在执行多位置成像比较事件定时例如基因表达的开始时是至关重要的。这需要从多个控制和同时处理的胚胎实验数据收集。这种方法可以很容易地扩展为在任何器官或访问的实时成像选择的组织外在影响的研究，其前提是移植可根据已建立的胚胎命运地图容易定位。

Introduction

可视化在体内脊椎动物重要的发育过程的能力已经到使斑马鱼的关键模型为研究正常和疾病条件作出了贡献（在1综述，2）。具体地，神经视网膜是中枢神经系统的访问的一部分。视网膜适合于容易地进行神经发生的研究，由于其高度的组织，但结构较简单，并在脊椎动物物种3其高度保守的神经类型。细胞行为，如增殖，细胞周期出口，非对称的细胞分裂，命运规范，分化和神经电路形成的动力学可以遵循整个retinogenesis的整个过程中，这是在斑马鱼的中心视网膜由3天受精后完成（ dpf）的4，5，REF“> 6，7。

另外，在每个上述的阶段的不同基因的功能要求，可伴随地评估在斑马鱼视网膜，用其他脊椎动物模型中，表型从基因敲除技术的应用导致提供的优点只能在验尸检查评估固定的组织。特别是，使用的转基因品系中，我们可以可视化和监控荧光蛋白如在视网膜报告基因的表达，使我们能够获得underlies一个特定的神经元细胞类型的起源的基因表达的时间分辨率。由于斑马鱼的迅速发展，这些事件可以在整个发育期间被可视化，从而提供更深入了解的基因表达相对于神经元细胞身份采集和细胞行为的时间的重要性。

最后，这些方法可有效地在通过移植的产生嵌合体的斑马鱼相结合，导致分析上市基因功能的两个关键方面。首先，检查从捐赠者的胚胎，其中一个特定基因被撞倒，而他们在未标记的野生型环境中开发移植的细胞，使我们能够获得有关基因功能的细胞自主的方式相关的信息。这导致了关于它们在此。正常表达是由祖细胞，可以不再从这些基因4,6产生功能性蛋白质的发育命运结果的检查例举的祖细胞内视网膜命运决定因素的功能是重要的见解， 8,9。利用这种方法，我们已经表明，很多命运的决定性因素（ 例如，VSX1，Atoh7，Ptf1a，Barhl2）细胞的作用-autonomously推动特定视网膜神经命运;缺乏的基因表达的主要导致命运开关，使得与基因拦截的细胞保持通过采用一个备用细胞命运4，6，7，10是可行的。其次，这种嵌合的实验可用于评估时不同遗传环境中开发类型的祖细胞如何野生表现。例如，通过比较野生型细胞的发展通常表达在一WT兴趣（和报告基因）与操纵宿主环境（ 例如，基因敲除/击倒）的基因，对基因表达和细胞命运所得效果可以评估。缺乏在主机环境中的某些神经类型的，例如，已被证明在细胞非自主的方式来影响野生型祖行为，以偏压它们朝向分化成的代表性不足Ò④短缺的神经类型4，7，11，12。鉴于视网膜神经元出生在通过特定的神经元的命运决定簇的基因的顺序定时表达式（命运的基因表达）（以13中综述）保守histogenic顺序，我们使用这些方法，以说明如何命运的基因表达在野生型祖细胞的定时当这种祖细胞在诱发异常细胞组合物视网膜主机环境发展会受到影响。这里，我们概述这些方法作为证据的相对标准和广泛使用的技术的组合如何能够命运的基因表达的时机在显影视网膜祖8,9的检查。

这个协议描述了一种实验方法组合延时成像用的放心的每形成在离体显影斑马鱼胚胎移植到跟随个别mosaically标记细胞整个发育retinogenesis的整个期间。通过执行功能基因操作或在宿主胚胎，供体胚胎，两者或两者都不是，人们可以评估基因功能的细胞自主性。这种方法可广泛适用于在任何其它系统的量这里概述的各个部件都是合适的类似研究问题。

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Protocol

所有程序均按照照顾和使用动物的做法澳大利亚国家卫生和医学研究理事会的代码的规定进行，由机构伦理委员会的批准。

1.斑马鱼的制备

  1. 成鱼配对
    1. 设置成鱼如在适当大小的育种罐对（或两对），晚上在使用之前。
    2. 为了保持与男性分开的女性，使用分频器，使鱼看看，但不互相接触。
    3. 当天上午，在光转换后，取出分频器和让鱼交配不受干扰。
    4. 成功后交配摆成鱼回原来的坦克。
      注：主机和供体菌株可以是相同的， 例如 ，任何野生型（WT）的菌株。 （：gapRFP atoh7）的Tg（atoh7：gapGFP）或本研究的供体胚胎从转基因系的Tg衍生的Tg（VSX1：GFP），其中的命运决定因子的表达早驱动或晚期神经命运可以分别为14，15，16可视化。为了比较不同遗传环境的影响，宿主胚胎可以是如下所述的特定的突变体或morphants。
  2. 胚胎收集
    1. 用滤茶器，从繁殖箱收集鸡蛋。检查蛋每15分钟，以确定出生的时间，并确保单细胞阶段的胚胎被收集用于后续步骤。
    2. 冲洗E3介质（5 mM氯化钠，0.2mM的氯化钾，0.4mM的氯化钙 ，0.9毫米氯化镁在蒸馏水2和2％的亚甲基蓝）胚胎，并放置在含有〜40毫升的E3 17的培养皿在50最大密度每个直径90mm的培养皿鸡蛋。
    3. 标签的培养皿菌株名称，日期和时间的诞生。用巴斯德移液管，以除去任何碎片，而在解剖显微镜下观察胚胎。
    4. 保持胚胎在28.5°C，直到〜3小时受精后（HPF）用于移植，或者继续使用微量注射。
      注：对于移植，目的是为在相似的年龄捐助者和东道国的胚胎。根据基梅尔等 32°C -因此，利用25之间是不同的饲养温度。 18减速或加速胚胎的一个离合器以匹配另一个。
    5. 保持20〜32℃，从收集时未注射，直到时间推移成像转基因供体胚胎（24 - 28小时后）。
      注意：这些将开发比实验队列更快，更早将表达荧光标记。它们因此可用于设置参数（激光功率，增益）用于成像。在此特定实例中，实验队列的成像之前的转基因表达开始（评估该事件的确切时间）。

2.准备显微注射

  1. 显微注射针制剂
    1. 用针拔出器，以在中心从各个硼硅玻璃毛细管（1.0 mm外径/0.78毫米ID / 100毫米长的玻璃毛细管）拉针以获得相等长度的两个针。瞄准与长轴锥针。
      注：这里使用的针头拔示例设置在供给材料清单。
    2. 存储拉动针在培养皿中并通过将它们压入可模压油灰或胶带的条带固定。
    3. 前的注射使针的尖端在聚焦在解剖显微镜下，并使用钳子在尖端破开针头。瞄准一个尖锐的锥形尖端具有小开口（ 图1C）。
    2. <LI>主机胚胎吗啉制剂
    1. 为了啉寡专门为感兴趣的基因，以及一个标准控制啉或适当的5个碱基对的错配来控制程序和处理的效果而设计的。
      注意：在此，翻译与抑制所述中间生的水平和无长突细胞的发展序列5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3'阻断Ptf1a吗啉代，和一个标准的控制斑马鱼啉靶向人β-珠蛋白内含子突变（5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA 3'）7，使用19。
    2. 准备一个1毫米吗啉原液（〜8 - 8.5纳克/ NL）和储存在室温。
    3. 关于注射的当天，在65℃下加热啉的等分试样（10微升）处理10分钟，简要地和地方旋在冰上从65℃（之后，它可以在室温下在使用期间保持）冷却下来。钍是将扭转吗啉的解决方案，它可以降低击倒效果的任何潜在的聚集。
      1. 对于Ptf1a吗啉和同等标准控制啉，通过稀释吗啉原液用蒸馏水准备6纳克/ NL的工作解决方案。保持在室温。
        注意：使用每个胚胎的吗啉作为Ptf1a吗啉的2 NL需要每个胚胎12纳克的相对高的工作浓度如前面7来确定。对于大多数吗啉，2 - 每个胚胎5纳克是有效的，所以淡化股票2 - 5毫微克/ NL，注入1 NL到每个胚胎。
  2. 准备荧光蛋白融合报道构建贴标捐赠胚胎
    注：为了使主机胚胎中区分/可视化的供体细胞，也有标注捐赠者的胚胎不同的方法，包括H2A-GFP的显微注射（如果使用转基因捐助者红色荧光报告）或H2B-RFP（如果使用与绿色荧光报告转基因供体）的mRNA成单细胞阶段的供体胚胎的蛋黄。
    1. 线性化含有报告DNA至少1微克质粒。
      注：此处PCS2 +质粒（生成并恳请大卫·特纳教授从生物医学中心提供的慕尼黑密歇根和拉尔夫·鲁普教授的大学）含H2A-GFP或H2B-RFP（克里斯托弗·威尔金森博士，皇家霍洛威产生，伦敦大学）用NotI酶切线性化。
    2. 使用市售试剂盒按照制造商的说明纯化DNA。
    3. 使用市售的试剂盒适当聚合酶按照生产商的说明转录的mRNA。对于PCS2 +质粒，用SP6聚合酶套件。
    4. 纯化使用按照制造商的指示作为商用试剂盒或苯酚 - 氯仿提取接着异丙醇沉淀的mRNA秒。稀释mRNA的超纯水（20 - 30μL），测量与在-80℃的分光光度计和商店的浓度。
    5. 关于注射的当天，制备mRNA在无菌水中的工作液用100ng /μL的终浓度，并保持在冰上。将不使用的mRNA的股票回到-80℃。

3.显微注射吗啉代和/或mRNA的成单细胞期胚胎

注：显微注射用来标记所有的供体细胞，并准备不同的主机环境（控制和基因敲除），涉及mRNA或吗啉代反义寡核苷酸20，21的注射。

  1. 装载和校准注射针
    1. 后送注射针头吗啉的3μL和/或组蛋白荧光融合基因的解决方案使用微加载枪头。
    2. 摇动SOLUT离子朝向注射针尖端直到有剩余的无气泡。使用注射针，其内部的玻璃插入使得溶液将主要吸引到通过毛细作用的前端。
    3. 注射针连接到安装在显微（3D手工显微操作）的保持器，并确保在管外壳内的密封。
    4. 打开电源和供气压力调节微量。
    5. 浸泡在矿物油在培养皿一滴针尖（如果使用刻度目镜）或针尖直接悬停在一个千分尺滑校准液滴体积。通过按下脚踏测量注射量和调整气体压力和/或持续时间，直到在注入量为相当于1 NL（直径125微米）。
      注：千分尺滑的优点是，测量独立于在显微镜中使用的倍率，但是通过使用目镜刻度插件TEAD，注射下降和规模可以同时成为市场焦点。
  2. 胚胎显微注射
    1. 放置在培养皿显微镜载玻片，并使用移液管，以沿着滑动边缘沉积的单细胞阶段的胚胎。对准成使用微加载枪头与薄尖切断的一半的单个列。用细移液管除去尽可能多的液体尽可能地防止运动注射（ 图1A）中。
    2. 降低向每个胚的针，并穿透绒毛膜并且在一个光滑行程（ 图1B）蛋黄。
    3. 一旦针尖通过按下脚踏在蛋黄，microinject居中。注入H2A-GFP的1 NL或H2B-RFP的mRNA成单细胞阶段供体胚胎（转基因）的蛋黄。注入标准的MO或Ptf1a MO 2 NL成单细胞阶段的野生型宿主胚胎的蛋黄按下脚踏板的两倍。成功的注射剂可以通过SMAL可视化在蛋黄升空间变形。
    4. 取出注射针，将含有胚胎的菜带来下一个胚胎到位并继续注射，直到胚胎的整列注射（50 - 60胚胎）。
    5. 所有注射胚胎后，拿起菜上来以30 - 45°角，并使用E3媒体（挤压瓶）吹干到注射胚胎转移到一个新的清洁的培养皿。
    6. 放置在培养箱中胚盘（无论是在28.5℃或其他温度，以确保供体和宿主胚胎在等效的年龄）。
    7. 重复步骤3.2.1 - 3.2.6在必要时获得100〜囊胚或〜200 - 250主机胚胎。
    8. 在1 - 2 HPF，检查胚胎解剖显微镜下，并删除那些没有晋级到2或4芯阶段用巴斯德移液管的未受精的卵子。

4.准备移植

内容】“>注意：移植被用于产生嵌合体胚胎允许不同遗传主机环境的影响也可以等效WT供体祖细胞9，22，23内的评估。

  1. 捐赠胚胎选择
    1. 在3 HPF，检查供体胚胎2 - 放大5倍进行标记信号在荧光显微镜下。选择发达（有大小均匀的细胞对称细胞团）具有较强的荧光信号胚胎使用GFP加过滤器（460-500 nm激发，510 nm的长传排放），或德州红过滤器（540 - 580 nm激发，610纳米长传排放）（ 图1D）。转基因记者尚未表达。
  2. 琼脂糖注入板块和培养皿准备
    1. 倒入熔化的2％琼脂糖在E3中稀释成90毫米直径的培养皿中，让它冷却下来，直到菜是安全的触摸。热琼脂糖可以以其他方式变形的模具。
    2. 漂浮的塑料模具上琼脂糖（ 图2D，E）的楔形凸起（6×25 /模具）。由模具的一侧放置到琼脂糖和向下的另一侧慢慢降低避免气泡。确保模具在盘或朝向楔形凸部的最深点的一侧为中心，以允许移植针足够的间隙空间。
    3. 允许琼脂糖完全在室温下固化。
    4. 放置在4℃下30分钟的琼脂糖盘并通过从一个角轻轻提起（ 例如，用钳子）除去模具。在4℃下制备试验和储存前一天琼脂糖喷射板与E3介质和石蜡膜密封件的小体积，以防止它们干燥。
    5. 之前的移植，填充琼脂糖喷射板与E3介质和放置到28.5℃培养箱至少30分钟。
      6. <利>由于dechorionated胚胎粘到塑料，无论是使用玻璃培养皿或涂层的皮氏培养皿（直径为90毫米），在E3的2％琼脂糖的薄层的内部。准备dechorionated主机胚胎一菜，一盘为dechorionated捐助胚胎和每40胚胎移植一盘。作为注入板（4.2.4）中描述的存储。
  3. 移液管的制备
    1. 切断的长形式微细拉玻璃尖端巴斯德吸管的尖端（2毫升体积230毫米的长度100毫米长尖端）到一个长度，允许舒适机动（可选）通过用钻石刀划伤而转动，直到前端瀑布关闭（ 图1F）。
    2. 确保晋级是直的。火抛光通过在本生灯切割表面旋转，以产生平滑的端部，以便不损坏dechorionated胚胎（ 图1F）的玻璃移液管。
      注意：保持枪头火焰太久W¯¯生病结果在开场被查封，成为胚胎太小。
  4. Dechorionating囊胚期捐助者和东道国的胚胎
    1. Dechorionate胚胎手动与由撕开各绒毛膜而不触及胚胎，或酶用蛋白酶，以允许大量的胚胎9的同时快速dechorionation两位漂亮镊子。
      1. 制备50毫克/毫升的蛋白酶混合物的100倍原液，使100微升的等分试样，并将其存储在-20℃。
      2. 添加100μL的股票蛋白酶至10毫升的E3培养基（0.5毫克/毫升的蛋白酶终浓度）。
      3. 将发达东道国和捐助国胚胎在两个独立的小三角玻璃烧杯（10毫升），并删除尽可能多的液体越好。
      4. 添加0.5毫克/毫升的蛋白酶溶液，以每个烧杯的5毫升，并轻轻摇动胚胎而在解剖显微镜下观察它们。留意绒毛膜变形的迹象。
      5. 保持旋转。只要第一胚胎是出绒毛膜（ 图1D，星号）的，执行三个快速冲洗与E3的介质通过倾倒掉大部分的液体和由在E3沿侧轻轻倒出再填充该烧瓶以除去蛋白酶溶液。不允许dechorionated胚胎进来以任何的后续步骤中的空气接触，直到移植（部分5）的端部，因为它们会爆裂。留在冲洗之间的烧瓶合适的解决方案。
      6. 用中火抛光的玻璃移液管，从锥形烧杯中成玻璃培养皿或涂琼脂糖（E3中的介质2％），塑料菜胚胎转移。传输过程中轻轻吸取以除去任何剩余减弱绒毛膜。
  5. 移植针制剂
    1. 用针拉马从每个硼硅薄壁玻璃管（1.0 mm外径拉两针/0.78毫米ID / 100mm长），用相同的设置显微注射移液器。
      注：这里使用的针头拔示例设置在材料清单提供的。移植针不具有玻璃嵌入，因为这会损坏细胞吸入到针。
    2. 预先在培养皿拉针头，存储和通过压入可模压油灰或胶带的条带固定。
    3. 移植前使针的尖端在聚焦在解剖显微镜下，并使用钳子在尖端破开针头。使用细镊子来调整针的形状瞄准一个笛形（ 图2G），或者使用所述生成的尖端形状23的替代方法。

5.通过囊胚移植嵌合体生成

  1. 移植设置
    注意：在此，使用自组装移植装置（ 图2A
  2. 安装在用于上面显微注射同一针支架移植针（安装在显微，步骤3.1.3）（ 图2A）。
  3. 断开注入管道链接微量持有者用于显微注射的压力调节微量的结束。附加链接到一个1毫升的注射器（ 图2A，B），其表示移植钻机注射管。
    1. 确保所有连接都用石蜡膜或成型的腻子密封。从通过确保总是有在移植针本身的一些E3介质与空气接触来防止胚胎。手动操作注射器吸细胞/液体流入和流出移植针。
  • 胚胎对齐
    1. 转移供体胚胎玻璃吸管入琼脂糖模具的第一列中。传输主机胚胎成2列到琼脂糖模具（ 图2F）6。使得卵裂球面朝上的胚胎用吸管定位。
  • 移植
    1. 轻轻地休息移植针到捐赠者的胚胎卵裂球细胞和大约20慢慢地吸起来- 50细胞进入移植针（ 图2H）。避免吸了蛋黄。
    2. 提起从使用显微捐赠者的胚胎移植针。移动至琼脂糖模具盘到左侧，并插入通过细胞块侧的移植针尖到第一宿主胚胎的动物极。存5 -根据表示此区域引起的前脑/眼字段24（ 图2I）命运映射的表面附近10个细胞。保持针尖浸渍在E3介质在整个过程。
  • 胚胎移植护理
    1. 取出胚胎捐赠一在28.5℃，2小时 - 次留在琼脂糖模具主机胚胎1。填补玻璃或塑料（涂以2％琼脂糖）培养皿含0.003％N-苯基硫氧嘧啶（PTU），以防止色素形成，因为这将干扰成像E3网上平台。传输主机胚胎到这些菜用中火抛光的玻璃吸管，并在28.5°CO / N培养。
      注意：处理PTU时戴上手套。

    • 6.实时成像设置

    注意：小尺寸和斑马鱼与快速发展相结合的光学透明性已使它成为不同的细胞和器官的体内成像的关键脊椎动物模型。成像可以在各种显微镜的，这将在设置和参数不同来执行。以下描述了用于视网膜发育5,8的成像的合适的共焦成像设置。

    1. 嵌合胚胎选择
      1. 在24 - 26 HPF，屏幕下方荧光解剖范围移植胚胎选择健康发育良好的胚胎，显示在发展中国家眼原基移植的供体细胞（H2A-GFP或H2B-RFP标记）。
      2. 预留多达40个胚胎，吹打安装到一个新菜，并添加0.4毫克/毫升三卡因methanesulfate（MS222）麻醉胚胎。
        注意：处理MS222时戴上手套。
    2. 安装胚胎
      注意：使用适当的安装盘，这取决于是否成像将在一个倒置的8或直立显微镜（详见这里）来执行。
      1. 在0.4毫克/毫升MS222在E3的介质制备含有1毫升1％低熔点琼脂糖的几个1.5mL的塑料管，并在40℃水浴中保持熔融状态。
      2. 吸了5胚胎成塑料移液管，让在重力作用下胚胎在尖端累积。触摸移液管到含有1％低熔点琼脂糖和0.4毫克制备的塑料管中的一个的表面/毫升MS222允许胚胎沉入管同时限制E3转移量。
      3. 胚胎山采用90毫米直径的培养皿中堂堂正正的显微镜和玻璃底培养皿（任何尺寸）在倒置显微镜成像成像。使用永久标记，以目视分任菜成两半在WT主机图像体（在一侧上），或在同一个实验morphant主机（另一侧）。
      4. 传送从琼脂糖塑料管的五个胚胎要么培养皿0.5 - 1毫升琼脂糖。用移液管中取出多余的琼脂糖，因此只有一小滴（约200 - 300μL）依然存在。如果直立显微成像，避免1厘米的培养皿圆周内放置胚胎。用于成像的水浸泡浸渍透镜可能无法在该领域为中心，由于在培养皿壁（ 图3A </ STRONG>）。
      5. 使用微负载吸管（用刀尖折断），横向排列的胚胎，直到琼脂糖凝固。对于这两种类型的盘，将胚正确横向成角度，如果两只眼睛在头部的任一侧完全重叠（在XY尺寸对齐）（ 图3B）。对于倒置显微镜使用中，盖玻片靠近眼睛必须推尽可能靠近盖玻片越好，以使通过可能焦点层次的约束内的z维度成像。
      6. 继续在个人琼脂糖滴一次安装5胚胎。使用更多的1％低熔点琼脂糖加入琼脂糖下降到彼此和盘，以防止成像（ 图3A）中的任何松脱和横向移动的一侧。
      7. 一旦完全凝固，覆盖E3中菜（含0.003％机动部队，0.4毫克/毫升MS222）预热至28.5℃。
      8. 使用步骤6.2.2所述的相同方法- 6.2.8，安装〜在一个单独的菜在32℃（步骤1.2.5）提出20转基因胚胎。
    3. 成像参数
      注：成像分析荧光的转基因的发病并不需要高的空间内的分辨率。它可以以W计划复消色差透镜20X / 1.0 DIC M27 70毫米的目标在1.5变焦进行。
      1. 建立了基于与加速发展〜20转基因胚胎转基因强度激光功率和曝光时间（ 即在32℃下凸起;步骤6.2.8）。
        注：对于转基因表达的发病研究，实验胚胎显示在时间推移被设置，因此，时间没有荧光，这些加速胚胎是用于确定所述成像参数是至关重要的。
      2. 对于实验的菜，可视化每个胚胎和保存位置和重点胚胎的水平。
        1. 选择正确的安装角度的胚胎（ 即横向小号眼睛尽可能的水平）和强大的心跳（健康的一个指标）的IDE。选择与几个移植供体细胞（H2A-GFP或H2B-RFP标记识别）主要在显影视网膜（其中基因表达的波开始）（ 图3C）的前腹侧象限胚胎。
          注：在斑马鱼胚胎，平均心率为120 - 180次/分钟25。在麻醉的胚胎，一个健康的心跳可以在60的范围内 - 120次/分钟。较慢的心跳可以指示减少活力的和那些胚胎应从研究中排除。
      3. 在2微米的间隔通过最多15个胚胎的视网膜设置光学切片的z轴堆叠。
        注意：可以在任何给定的实验进行成像，将取决于个体参数（曝光时间和z堆栈大小）胚胎的总数。拍摄图像1时间点为所有所选胚胎的时间必须SH比时间点之间的间隔orter。通过牺牲一定深度的分辨率，更胚的时间间隔内进行成像。的z叠层的限制被选择为所安装的胚胎眼的外侧和内侧极端和30微米加到在直立显微镜设置的侧面，作为显影胚胎中在z方向上这种设置移视眼胚胎生长过夜。这会导致栈100 - 170微米的厚度（50 - 85图像/眼）。
      4. 使用激光/信道适合于转基因拍摄图像，每24分钟，在32℃（相当于0.5 HPF的间隔）。
        注：胚胎留在舞台上的整个时间推移加热室涵盖整个显微镜内。而实验可在28℃下进行，较高的温度是用来加速发展，并确保在实验有关的时间点是在16之内成像的 - 24小时的时间推移周期。
      5. 图片使用顺序扫描（GFP：RFP或VSX1 Atoh7）和转基因 - 代表捐助标签（可选H2A-GFP或H2B-RFP）通道。为了分析，只利用施主标签所描述的选择合适的胚胎（采取一Z堆叠在成像的开始），然后只在信道执行时间推移捕获转基因表达。
        注：另外，使用捐赠标签只有选择合适的胚胎（ 即那些与前腹象限证实移植细胞）和图像只转基因通道，大致减半成像时间几乎翻了一番可以成像，每个分析胚胎数实验（ 图4）。

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    Representative Results

    这项工作提出了一个实验性协议时，野生型视网膜祖细胞morphant胚胎主机内发展，以评估基因表达变化的时序。实验宿主胚胎Ptf1a morphants，缺乏视网膜7，26的中间生的水平和无长突的interneurons。这些已相比，控制宿主胚胎，其中注射了一个标准的控制啉。

    因为在整个中枢神经系统的不同类型的神经元（包括视网膜）的神经发生出现在一个高度保守histogenic顺序27，28，29，30，31随后命运的进展可能取决于细胞非自主反馈从早期的积累出生神经类型。这种假设通过在移植祖细胞在不存在中间生神经类型的显影评估后出生的神经类型的产生的定时检测。作为对照，早生细胞的定时也被定量，这应该是不受影响独立是否生成中间细胞或没有。为此目的，所述的Tg（atoh7：RFP）或Tg的（atoh7：gapGFP）系用于可视化第一生节细胞神经发生的发作，而Tg为（VSX1：GFP）线用于分析晚期发作出生人口两极。除此外表达报告基因，从这些胚胎的供体细胞的基因WT。

    1 NL mRNA的显微注射（标注供体细胞）成荧光记者表达单细胞期胚胎结果蛋黄3 HPF，在这舞台最亮的捐赠者被选中（ 图1）。准备移植时设置胚胎约2 HPF（ 图2）。在24 HPF，胚胎在相关视网膜部位移植的供体细胞被选择并安装在五个（ 图3）组1％低熔点琼脂糖。 24小时 - 保存胚胎位置，设定的z堆和时间参数后，延时成像为16执行。第一生神经节细胞的定时由Atoh7发病指示：RFP或Atoh7：GFP转基因，其也以明显较低的亮度表示为：gapGFP转基因和最后生双极产生定时由VSX1的强烈上调指示在显影祖细胞的水平。第一转基因表达，如Atoh7的定时：gapGFP在各个细胞在成像的每个时间点（白色箭头， 图4）识别。 Atoh7：gapGFP和神经节细胞分化通讯中断在等效时间RS不管主机胚胎是否是WT或一个Ptf1a morphant缺乏中间（ 即神经节细胞在出生后）的水平和无长突细胞。

    呈现的数据表明，该实验的方法提供了一个有力的工具，以评估对基因表达的定时特定视网膜环境的作用，与相关的影响，不仅对理解正常发育过程，而且在正常和疾病状况的细胞重编程的策略未来的应用。

    图1
    图1：微量注射单细胞期胚胎中的卵黄用来标注供体细胞，并产生不同的主机环境。 A）的胚与大多数周围液体再对载玻片的边缘对齐移动。 B）的针插入蛋黄和任H2A-GFP或H2B-RFP的mRNA（供体）或吗啉代（标准的MO或Ptf1a MO主机）的中心注入。 C）的注射针是使用产生从每个毛细管两个对称的针的针拔出器产生的。每个拉针随后需要具有尖端与钳破碎以打开针，同时提供一个尖锐角度的尖端（未钝），可容易地插入到胚胎。在单细胞阶段，H2B-RFP的mRNA注射D）供体胚胎开始2.5 HPF，在此阶段最聪明和最均匀标记胚胎可以选择表达荧光报告蛋白。 E）约为2.5 - 3 HPF，捐助者和东道国的胚胎是使用蛋白酶酶解dechorionated。锥形瓶中的袅袅提供了必要的机械力破开减弱绒毛膜，带来dechorionated胚胎s转换的中心。只要第一个（星号），或几个dechorionated胚胎中观察到，快速但温和漂洗确保蛋白酶溶液被去除。 F）对于dechorionated胚胎转移，玻璃移液管被利用。这些可以初步缩短（可选），是由舒适的操纵用户，通过使用钻石刀合适的位置划伤玻璃，直至其卡掉任何长度。这将导致一个尖锐切割尖端，这需要是火抛光以平滑任何粗糙的边缘，可能会破坏细胞被吸进传送期间吸管。比例尺A，B，D，E = 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图2
    图2：移植设置。 B）中所示的移植管指示如何在关节潜在泄漏都仅仅使用可模制的油灰和石蜡膜防止。 C）的注射管和任何合适的管道之间的连接的更高放大倍数图，以连接到注射器。虽然可以使用任何管道，这里所使用的管的直径紧密配合一个10μL的枪头。用石蜡膜以保证密封。 D）的模具具有150（6×25）楔形，以产生在琼脂糖注入板三角草皮。 E）每一个楔形的近似尺寸显示。该公司测量是专有的。 F）与楔形凹槽制备琼脂糖喷射板用于与加入到第一塔供体胚胎和列2 - 6填充有主机胚胎。移植是在该行中，从而在每一行中，从一个供体收集的细胞可被移植到5宿主胚胎进行。在每个模具，从多达25个供体细胞可被移植到高达125主机胚胎。注模具与楔接近培养皿边缘的较深端不对称放置。这允许从右侧的移植针没有击中培养皿边缘。 G）的移植针被拉用相同的参数注射针以导致这里示出的长锥形尖端。针必须打破以生成可以占用细胞而不变形它们较大的内径。较高功率插图显示了移植针的尖端应该有角度的，最好有一个“笛”形状，如图在这个例子。 高 ）高功率视图显示在顶部细胞宿主胚胎的方向。移植针被插入到囊胚阶段宿主胚的细胞团横向（白星号）和如下所示被推入未来眼。供体细胞可以在移植针（箭头），因此移植可以控制细胞的粗数可以看到。 Ⅰ）的两个例子（左和右），这表明移植后立即，胚胎在正确的位置顺利移植细胞可以立即使用施主标签（ 例如，H2B-RFP）整理出来。荧光通道采用“线性减淡（添加）”中的光栅图形编辑图层菜单下的选项加入到明。比例尺（为H，I）= 500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。


    图3：胚胎的安装时间推移成像。 A）的培养皿（90 MM）表示包含五个胚胎多种低熔点琼脂糖滴每通过琼脂糖连接以形成一个牢固的网络，以防止个别液滴从分离。 B）的24 HPF胚胎横向排列并嵌入凝固的琼脂糖的高等权力观。对于理想的角度，这两个眼睛应该被定位在彼此的顶部（在z维度）。取决于感兴趣的基因，安装件应被延迟，直到刚刚之前的相关定时（ 例如，26 HPF对神经节细胞的分化或35高倍视野为双极细胞分化的开始）。 C）显示明和红色通道的叠加单光Z-部分的共聚焦图像（采用“线性减淡（添加）”，在图层菜单下选择显影眼的光栅图形编辑器）与一个否则未标记的主机环境中的几个标记的供体细胞（红色）。刻度条B = 1毫米，比例尺c = 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图4
    图4：神经发生的时间可以移植到不同的主机环境的转基因供体细胞可视化。移植到未标记的野生型宿主转基因胚胎：来自的Tg（gapGFP atoh7）显影WT供体细胞的隔时图像的显微照片。转基因表达发生的适应症为白色箭头的几个细胞。比例尺= 10微米。 请点击此处查看大版本OF该数字。

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    Discussion

    理解的程度，邻近细胞影响的关键的细胞命运决定因子的表达的定时旨在有效地指示胚胎或诱导的多能干细胞分化成特定的有丝分裂后的细胞类型或甚至图案化的组织时是必不可少的。此外，检查在活的动物的显影细胞中的这些分子事件还提供相关的动态上与体内这些事件相关的特定蜂窝上下文（时间和空间）的信息。这种研究不能在所有脊椎动物模型可以轻松实现。

    在所提出的协议中，适合斑马鱼胚胎被利用作为脊椎动物模型来解决在体内这些问题，在脊椎动物视网膜的相对简单的，但高度组织的三维图案化的组织。这通过检测该消耗一特定的视网膜细胞的假说例举类型会影响基因的表达时间和视网膜祖细胞发育命运。我们还可以利用供体细胞标记跟踪特定的细胞重新进行评估的时候，例如，有丝分裂后的细胞如何转基因的表达不久进行的最后分裂，或评估这种细胞的一般行为（ 例如，迁移）在之前的在不同环境中的转基因表达的不同阶段。在这些研究中，比较容易的组合来进行技术展示，包括介导的基因吗啉击倒，移植和实时成像。对于移植的方法，协议引入了一个新的，比较容易和便宜移植钻机并演示了这种简便的操作设置的。

    这个协议并不局限于视网膜。它也可以用于研究多种不同的动态细胞过程，需要细胞自主developm的解开从细胞非自主的环境影响ental方案。然而，虽然几乎不需要排除故障，需要在开始实验之前，必须进行考虑到若干关键的步骤。该技术的成功应用的一个重要前提是，所选择的器官或组织必须使用命运映射胚胎早期很容易的目标。如果组织靶向效率先前尚未测试过，这首先需要优化和标准化。显微注射和移植的胚胎的数量可以增加和事先筛选实时成像，以获得足够的胚胎供体细胞正确地整合和定位有关的组织内。另外，虽然该协议可以很容易地应用到早期胚胎斑马鱼的阶段，应用到以后阶段，例如在生长的幼虫变得更加困难，原因有二。首先，基因敲除获得吗啉代的效率随时间下降（DE每个啉之前，它通常是前3 DPF最有效）。要覆盖这一问题，使用遗传突变体为供体胚胎移植是可取的。其次，作为斑马鱼生长，幼虫的深部成为共聚焦显微镜，影像，特别是在较高的放大倍数（高功率的目标），其中显微镜物镜的工作距离较为有限不易进入。因此，首先需要评估其顺从成像在适龄感兴趣的各组织。

    时间推移成像可以在一个倒置或直立共聚焦显微镜进行任。

    有，如果可用的若干直立显微镜的优点。在所需的温度，所用的浸渍物质的蒸发（ 例如，水或浸油与水的折射率）的倒置显微镜可导致完全干燥的。这需要持续监控和最终再填充，以将样品置于聚焦的风险。这可以通过使用自动化来降低目标的一个限定的距离，增加的浸渍物质，并在我们的经验再次提高的目的，虽然可以部分避免，再聚焦往往仍然需要，该成像的下一时间点的开始之前应该发生。其次，我们源最大盖玻片底菜仍然比为直立显微镜中使用的标准的90毫米直径的培养皿中小得多（50毫米直径）。这意味着，使用倒置显微镜时的胚胎可安装加入胚胎培养基体积的数量，并且更有限。然而，时间推移参数通常构成为可以被成像，因此盘的大小仍然适合胚胎数的主要限制因素。当使用非常高的放大的目标，倒置显微镜可以允许在z维度眼睛中的更大的深度和目的仅由薄盖玻片分离。当结合直立显微镜非常高倍率，琼脂糖滴覆盖胚胎必须保持尽可能的薄。总体而言，使用垂直或倒置显微镜获得的数据是等效的质量。

    为了产生高质量的数据，有需要考虑额外的关键步骤。首先，亮标记的供体的选择是用于获得与在眼在时间推移电影的开始移植细胞的适当数量的移植胚胎的关键（几，但没有太多）。蛋白酶酶促dechorionation是在蛋白酶的关键步骤和温育应保持在最低限度随后很快，但温和冲洗到不影​​响胚胎的后续健康。供体和宿主胚胎的年龄匹配允许准确组织根据命运地图和用于细胞的高效集成定位。一个井字形移植NEedle是重要的，以确保针尖小和足够锋利以插入到宿主的胚胎，而不会造成太大的损坏，但在内部直径足够大，以不引起对被移植的细胞的机械损坏。移植过程中，如果设备没有完全密封的（特别是在连接点），这是非常困难的手动控制E3培养基和细胞的移动进出移植针。这是最明显时，有流动或者进入或离开移植针，而无需手动改变注射器容量。在这种情况下，所有的接头都必须重新检查和重新密封。这应事先实验进行测试。

    最后，在移植和延时设置之间经过的时间，这是至关重要的，移植的胚胎被允许以低密度培养而精心清理任何不健康的胚胎。这是特别重要的，当发展或发电机的定时Ë表达正在调查中。在评估的任何方法（ 例如，基因表达）的定时，控制必须被用来排除啉技术的非特异性的副作用。在我们的工作中，我们使用的转基因表达的时间在由吗啉靶向特定基因的影响无关的组织（ 例如，肌肉）。

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    Acknowledgments

    这项工作是由ARC DECRA到PRJ（DE120101311）和德意志研究联合会（DFG）的研究经费以LP（PO 1440 / 1-1）的支持。澳大利亚再生医学研究所是由维多利亚州政府和澳大利亚联邦政府的资金支持。我们承认杰里米·伍枝记医生，谁进行公布在箕等人在这里描述的实验。 ，2016年我们是从Higashijima教授转基因鱼的规定，感激和感谢PROFS。特纳和鲁普为提供PCS2 +质粒和威尔金森博士生成H2B-RFP和H2A-GFP构造。我们感谢FishCore设施的工作人员（莫纳什大学）采取了动物的照顾。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    发育生物学，121期，斑马鱼，移植，嵌合体，实时成像，细胞非自主性，视网膜，基因的表达时机，神经
    <em>在</em>嵌合斑马鱼胚胎的个别视网膜祖细胞转基因表达的<em>体内</em>成像来研究细胞非自治的影响
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    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

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