Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490

Summary

Live-sporing af individuelle WT retinale stamfædre i distinkte genetiske baggrunde giver mulighed for vurdering af bidraget fra celle non-autonome signalering under neurogenese. Her blev en kombination af gen knockdown, kimære generation via embryo transplantation og in vivo time-lapse konfokal billeddannelse anvendes til dette formål.

Abstract

De genetiske og tekniske styrker har gjort zebrafisk hvirveldyr en central model organisme, hvori konsekvenserne af gen-manipulationer kan spores in vivo hele hurtig udviklingsperiode. Flere processer kan studeres herunder celleproliferation, genekspression, cellemigrering og morfogenese. Vigtigt er det, kan frembringelsen af ​​kimærer gennem transplantationer let udføres, så mosaik mærkning og sporing af individuelle celler under indflydelse af værtsmiljøet. For eksempel kan ved at kombinere funktionelle gen manipulationer af værten embryo (f.eks gennem morpholino mikroinjektion) og levende billedbehandling, virkningerne af ydre, celle nonautonomous signaler (leveret af genetisk modificerede miljø) på individuelle transplanterede donorceller vurderes. Her demonstrerer vi, hvordan denne tilgang anvendes til at sammenligne indtræden af ​​fluorescerende transgen udtryk som en proxy for timingen af ​​cellens skæbne determination i forskellige genetiske værtsmiljøer.

I denne artikel giver vi protokollen for mikroinjektion zebrafisk embryoner til at markere donorceller og forårsage gen knockdown i værts embryoner, en beskrivelse af transplantation teknik, der anvendes til at generere kimære embryoner, og protokollen for at forberede og kører i vivo time-lapse konfokal billeddannelse af flere embryoer. Især udfører Multiposition billeddannelse er afgørende, når man sammenligner timingen af ​​begivenheder som indtræden af ​​genekspression. Dette kræver indsamling af data fra flere kontrol og eksperimentelle embryoner behandles samtidigt. En sådan tilgang kan let udvides til studier af ydre påvirkninger i ethvert organ eller væv af valg tilgængelige til at leve billedbehandling, forudsat at transplantationer kan målrettes let i henhold til etablerede embryonale skæbne kort.

Introduction

Evnen til at visualisere vigtige udviklingsprocesser i en in vivo hvirveldyr har bidraget til at gøre zebrafisk en vigtig model til at studere normale og sygdomstilstande (revideret i 1, 2). Især den neurale nethinde er en tilgængelig del af det centrale nervesystem. Nethinden egner sig til nemt at udføre undersøgelser af neurogenese på grund af sin meget organiseret, men alligevel relativt enkle struktur, og dets højt konserverede neuron typer tværs hvirveldyr 3. Dynamics af cellulære adfærd, såsom spredning, cellecyklus exit, asymmetrisk celledeling, skæbne specifikation, differentiering og neurale kredsløb dannelse kan følges gennem hele processen med retinogenesis, som er afsluttet i den centrale nethinden i zebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Desuden kan de funktionelle krav i forskellige gener i hver af de ovennævnte faser skal samtidig vurderes i zebrafisk nethinden, hvilket giver en fordel frem for andre hvirveldyr modeller, hvor fænotyper som følge af anvendelsen af ​​gen-knockout teknikker kan kun vurderes ved obduktion af fast væv. Navnlig anvendelsen af ​​transgene linjer hvor vi kan visualisere og overvåge ekspressionen af ​​fluorescerende proteiner som reporter transgener i nethinden, giver os mulighed for at opnå tidsmæssige opløsning af genekspression, der ligger til grund for tilblivelsen af ​​en bestemt neuronal celletype. På grund af den hurtige udvikling af zebrafisk, kan disse begivenheder visualiseres under hele udviklingsperiode, hvorved der tilvejebringes dybere indsigt i den tidsmæssige betydning af genekspression i forhold til neuronal erhvervelse celleidentitet og celle adfærd.

Endelig kan disse tilgange kombineres effektivt i zebrafisk med frembringelsen af ​​kimære via transplantationer, hvilket resulterer i indsigter i to centrale aspekter af genfunktion. For det første undersøger celler transplanteret fra en donor embryo, hvor et bestemt gen blev slået ned, mens de udvikler i en umærket vildtype miljø, giver os mulighed for at indhente relevante oplysninger om gen-funktion i en celle-uafhængig måde. Dette fører til vigtige indsigter om funktionen af nethinden skæbne afgørende faktorer inden for stamceller de normalt udtrykkes i. Dette eksemplificeres ved undersøgelsen af udviklingsmæssige skæbne resultatet af stamfædre, der ikke længere kan generere funktionelt protein fra disse gener 4, 6, 8, 9. Ved hjælp denne tilgang, har vi vist, at mange skæbne afgørende faktorer (f.eks Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handle celle-autonomously at køre specifikke retinale neuronale skæbner; manglen på genekspression fører primært til en skæbne switch, således at cellerne med gen knockdown forbliver levedygtige ved at vedtage en alternativ celleskæbnen 4, 6, 7, 10. For det andet kan sådanne kimære eksperimenter bruges til at vurdere, hvordan vildtype stamfædre opfører sig, når de udvikler inden for forskellige genetiske miljøer. For eksempel ved at sammenligne udviklingen af WT-celler, der normalt udtrykker et gen af interesse (og reporter transgen) i et WT versus manipuleret vært miljø (f.eks gen knockout / knockdown), de resulterende virkninger på genekspression og celleskæbne kan vurderes . Manglen på visse neuron typer i værtsmiljøet, for eksempel har vist sig at påvirke vildtype progenitor adfærd i en celle non-autonomt at forspænde dem til at differentiere til det underrepræsenterede or mangler neuron typer 4, 7, 11, 12. I betragtning af at retinale neuroner er født i en bevaret histogenic ordre ved tidsstyret sekventiel ekspression af specifikke neuronale skæbne determinant gener (skæbne genekspression) (revideret i 13), brugte vi disse metoder til at vise, hvordan timingen af skæbnen genekspression i vildtype stamfædre påvirkes, når disse stamfædre udvikle sig i retinale vært miljøer med inducerede afvigende cellulære kompositioner. Her vil vi skitsere disse tilgange som bevis for, hvordan kombinationen af relativt standard og udbredte teknikker muliggør undersøgelse af timingen af skæbnen genekspression i udviklingen retinale stamfædre 8, 9.

Denne protokol beskriver en eksperimenterende tilgang, der kombinerer time-lapse imaging med lethed af prdanner transplantation i ex vivo udvikle zebrafisk embryo at følge individuelle mosaically mærkede celler i hele perioden af udviklingsmæssige retinogenesis. Ved at udføre funktionelle gen manipulationer enten i værten embryo, donor embryo, begge eller ingen af ​​delene, kan man vurdere celle autonomi genfunktion. Denne fremgangsmåde kan tilpasses bredt til lignende forskningsspørgsmål i et andet system, for hvilken de enkelte komponenter, der er skitseret her, er egnede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med bestemmelserne i den australske National Health og Medical Research Council regelsæt for pasning og anvendelse af dyr, og blev godkendt af de institutionelle etiske råd.

1. Udarbejdelse af Zebrafisk

  1. Voksen fisk parring
    1. Opsæt voksne fisk som par (eller to par) i passende størrelse ynglende tanke aftenen før anvendelse.
    2. For at holde den kvindelige adskilt fra mandlige, bruge en deler, således at fisk at se, men ikke røre hinanden.
    3. Om morgenen, efter tilkobling af lys, fjerne skillevægge og lade fisk at parre uforstyrret.
    4. Efter en vellykket parring sætte voksne fisk tilbage i deres oprindelige tanke.
      BEMÆRK: Host og donorstammer kan være ens, fx eventuelle vildtype (WT) stammer. Til denne undersøgelse donor embryoner stammer fra de transgene linjer Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) ellerTg (vsx1: GFP), hvori ekspressionen af skæbnen afgørende faktorer kørsel tidligt eller sent neural skæbne kan visualiseres, henholdsvis 14, 15, 16. For at sammenligne virkningerne af forskellige genetiske miljøer, kan værten embryoer være specifikke mutanter eller morphants som beskrevet nedenfor.
  2. embryonindsamlingsteam
    1. Brug en te si for at indsamle æg fra avl kassen. Kontroller for æg hver 15 min til at bestemme tidspunktet for fødslen og sikre encellede embryoer er indsamlet til efterfølgende trin.
    2. Skyl fostre med E3-medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCI, 0,4 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2 og 2% methylenblåt i destilleret vand) og placere dem i petriskåle indeholdende ~ 40 ml E3 17 ved en maksimal tæthed på 50 æg pr 90 mm diameter petriskål.
    3. Mærk petriskåle med stammen navn, dato og tidspunkt forfødsel. Brug en Pasteur overførsel pipette til at fjerne eventuelle rester, mens visning af embryoner under dissektionsmikroskop.
    4. Hold embryoner ved 28,5 ° C, indtil ~ 3 timer postfertilization (HPF) til transplantation, eller fortsætte med mikroinjektioner.
      BEMÆRK: For transplantationer, mål for donor og vært embryoner på samme alder. Derfor udnytter forskellige produktionssystemer temperaturer mellem 25 - 32 ° C ifølge Kimmel et al. 18 at bremse eller fremskynde en kobling af embryoner til at matche den anden.
    5. Hold ~ 20 af de transgene donor embryoner ikke-injicerede ved 32 ° C fra tidspunktet for indsamlingen indtil time-lapse imaging (24 - 28 h senere).
      BEMÆRK: Disse vil udvikle hurtigere end den eksperimentelle kohorte og vil udtrykke fluorescerende markører tidligere. De kan således anvendes til at opsætte parametre (laser magt, gain) til billeddannelse. I dette særlige eksempel billeddannelse af den eksperimentelle kohorte begynder før transgenekspression (at vurderedet nøjagtige tidspunkt for denne begivenhed).

2. Forberedelse til Mikroinjektion

  1. forberedelse mikroinjektion nål
    1. Brug en nål aftrækker til at trække nåle fra hver borosilikatglas kapillarrør (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lang glaskapillar) i midten for at opnå to nåle af samme længde. Målet for nåle, der taper med lange aksler.
      BEMÆRK: Eksempler på indstillinger for nålen aftrækker bruges her leveres i Materialer List.
    2. Opbevar løftes nåle i en petriskål og sikres ved at presse dem ind i en strimmel af formbar kit eller tape.
    3. Før injektionen bringe spidsen af ​​nålen i fokus under et dissektionsmikroskop og bruge pincet til at bryde åben nålen ved spidsen. Målet for en skarp tilspidset spids med en lille åbning (figur 1C).
  2. <li> Morpholino forberedelse til værten embryoner
    1. Bestil morpholino oligonukleotider specielt designet til genet af interesse samt en standard kontrol morpholino eller et passende 5 basepar-mismatch at kontrollere for proceduremæssige og håndtering effekter.
      BEMÆRK: Her en oversættelse blokering Ptf1a morpholino med sekvensen 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 ', der hæmmer udviklingen af ​​de mellemliggende født horisontale og amacrine celler, og en standard kontrol zebrafisk morpholino målretning human beta-globin intron mutation (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA 3 ') 7, 19 blev anvendt.
    2. Forbered en 1 mM morpholino stamopløsning (~ 8-8,5 ng / nL) og opbevares ved stuetemperatur.
    3. På dagen for injektion, opvarme en alikvot (10 pi) af morpholino ved 65 ° C i 10 minutter, spinde kortvarigt og anbring på is for at køle ned fra 65 ° C (hvorefter den kan opbevares ved stuetemperatur under brug). ther vil vende enhver potentielt aggregering i morpholino løsning, som kan nedsætte effektiviteten af ​​knockdown.
      1. For Ptf1a morpholino og tilsvarende standard kontrol morpholino, forberede en arbejdsgruppe opløsning af 6 ng / nL ved at fortynde morpholino stamopløsningen med destilleret vand. Hold ved RT.
        BEMÆRK: Brug 2 nL af morpholino pr embryo som Ptf1a morpholino kræver en relativ høj arbejdsmiljø koncentration på 12 ng pr embryo som tidligere 7 bestemmes. For de fleste morpholinoer 2 - 5 ng pr embryo er effektiv, så fortynde lager til 2 - 5 ng / nL og injicere en nL i hver foster.
  3. Forberedelse fluorescerende histon fusion reporter konstruerer for donor mærkning embryoner
    BEMÆRK: For at skelne / visualisere donorceller inden værten embryoner, der er forskellige tilgange til at mærke donor embryo, herunder mikroinjektion af H2A-GFP (hvis du bruger transgene donorer medrøde fluorescerende reportere) eller H2B-RFP (hvis du bruger transgene donorer med grønne fluorescerende reportere) mRNA i blommen af ​​en enkelt celle stadie donor embryo.
    1. Linearisere mindst 1 ug plasmid indeholdende reporter-DNA.
      BEMÆRK: Her pCS2 + plasmid (genereret og venligst stillet til rådighed af Prof. David Turner fra University of Michigan og Prof. Ralph Rupp fra Biomedical Center Munich), der indeholder H2A-GFP eller H2B-RFP (genereret af Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, University of London) blev lineariseret med NotI restriktionsenzymfordøjelse.
    2. Oprensning af DNA under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits ifølge producentens anvisninger.
    3. Transskribere mRNA under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits med passende polymerase ifølge producentens anvisninger. For pCS2 + plasmidet, brug en SP6 polymerase kit.
    4. Rens mRNA under anvendelse af kommercielle kits eller phenol-chloroformekstraktion efterfulgt af isopropanol udfældning som pr fabrikantens anvisningers. Fortynd mRNA i ultrarent vand (20 - 30 uL), måle koncentrationen med et spektrofotometer og opbevares ved -80 ° C.
    5. På dagen for injektion fremstilles en arbejdsopløsning af mRNA i sterilt vand med en slutkoncentration på 100 ng / pl og holde på is. Retur ubrugt mRNA lager tilbage til -80 ° C.

3. mikroinjektion af morpholinoer og / eller mRNA i Single-celle Stage embryoer

BEMÆRK: Mikroinjektioner bruges til at markere alle donorceller og forberede de forskellige værtsmiljøer (kontrol og gen Knockdown) og involverer injektioner af mRNA eller morpholino antisense-oligonukleotider 20, 21.

  1. Lastning og kalibrering injektionsnålen
    1. Udsætte den kanyle med 3 pi af morpholino og / eller histon-fluorescerende fusion mRNA opløsning under anvendelse microloader pipettespidser.
    2. Ryst solution mod kanylespidsen indtil der ikke er bobler tilbage. Brug injektionsnåle med en intern glas indsætte sådan, at løsningen vil blive primært henledes på spidsen ved kapillarvirkning.
    3. Fastgør injektionsnål til en holder monteret i en mikromanipulator (3D manuel mikromanipulator) og sikre en tæt forsegling i røret huset.
    4. Tænd for strømmen og gasforsyning til trykket reguleres mikroinjektor.
    5. Fordyb nålespidsen i en dråbe af mineralsk olie i en skål (hvis du bruger en gradnet okular), eller svæve nålespidsen direkte over en mikrometer dias for at kalibrere drop volumen. Mål injektionsvolumen ved at trykke på fodpedalen og justere gastrykket og / eller varighed, indtil injektionsvolumen svarer til 1 nL (125 um diameter).
      BEMÆRK: Fordelen ved mikrometer slide er, at målingerne er uafhængige af den forstørrelse, der anvendes ved mikroskopet imidlertid ved hjælp af okular gradnet insTEAD kan injektionen drop og omfang være i fokus samtidigt.
  2. Embryo mikroinjektion
    1. Placer et objektglas i en petriskål og bruge en overførselspipetten at deponere encellede embryoer langs slæden kant. Juster til en enkelt søjle ved anvendelse af en microloader pipettespids med halvdelen af ​​den tynde spids skåret af. Fjern så meget væske som muligt med en fin transfer pipette for at undgå bevægelser under injektioner (figur 1A).
    2. Sænke nålen mod hinanden embryo, og trænge ind i chorion og æggeblomme i en jævn slagtilfælde (figur 1B).
    3. Når nålespidsen er centreret i blommen, microinject ved tryk på fodpedal. Injicer 1 nL af H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA til blommen i en enkelt-celle stadiet donor embryo (transgene). Injicer 2 nL af standard MO eller Ptf1a MO ind blommen i en enkelt-celle stadiet vildtype værtsembryo ved at trykke på fodpedalen to gange. Vellykkede injektioner kan fremkaldes ved smal l rumlige deformation i blommen.
    4. Fjern kanylen, flytte skål indeholdende embryonerne at bringe den næste embryo i position og fortsætter injektion, indtil hele kolonne af embryoner injiceres (50 - 60 embryoner).
    5. Efter injektion alle embryoner, løft fadet op på en 30-45 ° vinkel og bruge en blid strøm af E3 medium (squeeze flaske) til at overføre de injicerede embryoner i en ny ren petriskål.
    6. Placer embryo fadet i en inkubator (enten ved 28,5 ° C eller en anden temperatur til at sikre, at donor og vært embryoner er på tilsvarende aldre).
    7. Gentag trin 3.2.1 - 3.2.6 som nødvendigt for at opnå ~ 100 donor embryoner eller ~ 200 - 250 vært embryoner.
    8. Ved 1 - 2 ud HPF, kontrollere embryoner under et dissektionsmikroskop og fjern eventuelle ubefrugtede æg, der ikke har avanceret til 2- eller 4-celle etaper med en Pasteur overførsel pipette.

4. Forberedelse til transplantationer

Indholdsproduktion "> BEMÆRK: transplantationer anvendes til at generere kimære embryoner giver mulighed for effekten af forskellige genetiske værtsmiljøer skal vurderes inden for tilsvarende WT donor stamfædre 9, 22, 23.

  1. Donor udvælgelse embryo
    1. Ved 3 HPF, kontrollere donor embryoner ved 2 - 5X forstørrelse til mærkning signal under et fluorescensmikroskop. Vælg veludviklet (symmetrisk cellemasse med lige store celler) embryoner med et stærkt fluorescerende signal ved hjælp af GFP plus filter (460-500 nm excitation, 510 nm lang pasning emission) eller Texas Red filter (540-580 nm excitation, 610 nm lang pasning emission) (Figur 1D). De transgene reportere er endnu ikke udtrykkes.
  2. Agarose injektion plade og petriskål forberedelse
    1. Hæld smeltet 2% agarose fortyndet i E3 medium i en 90 mm diameter petriskål og lad den køle ned, indtil fadet er sikkertat røre. Hot agarose ellers kan deformere formen.
    2. Float en plast støber med kileformede fremspring (6 x 25 / mug) på agarose (figur 2D, E). Undgå luftbobler ved at placere den ene side af formen på agarose og langsomt lavere ned på den anden side. Sørg for, at formen er centreret i skålen eller mod den side af det dybeste punkt af de kileformede fremspring at give tilstrækkelig clearance plads til transplantation nål.
    3. Tillad agarose til helt at størkne ved stuetemperatur.
    4. Placer agarose skålen ved 4 ° C i 30 minutter og fjern formene ved forsigtigt at løfte det ene hjørne (f.eks med pincet). Forbered agarose injektion plader dagen før eksperimentet og opbevares ved 4 ° C med et lille volumen E3-medium og paraffin film forsegling for at forhindre dem i at tørre ud.
    5. Forud for transplantation, fylde agarose injektion plade med E3-medium og anbringes i en 28,5 ° C inkubator i mindst 30 min.
    6. <li> Da dechorionated embryoner holde sig til plast, enten bruge glas retter eller pels inde i petriskåle (90 mm diameter) med et tyndt lag af 2% agarose i E3. Forbered en skål for dechorionated vært embryoner, en skål for dechorionated donor embryoner og en skål for hver 40 transplanterede embryoner. Opbevar som beskrevet for injektion pladen (4.2.4).
  3. forberedelse Transfer pipette
    1. Skær spidsen af ​​en lang form, fint trukket glas spids Pasteur pipette (2 ml volumen, 230 mm længde, 100 mm lang spids) til en længde, der giver mulighed for behagelig manøvrering (valgfrit) ved at skrabe med en diamant kniv mens roterende indtil spidsen falder off (figur 1F).
    2. Sørg for, at snittet er lige. Fire polish glasset overførselspipetten ved at rotere snitfladen i en bunsenbrænder til at generere glatte ender, således at ikke beskadige dechorionated embryoner (figur 1F).
      BEMÆRK: Hold pipettespidsen i flammen for længe wsyg resultat i åbningen bliver forseglet eller bliver for lille til fostrene.
  4. Dechorionating blastula fase donor og vært embryoner
    1. Dechorionate embryoner enten manuelt med to fine tænger ved at rive åben hver chorion uden at røre embryonet eller enzymatisk under anvendelse protease at tillade samtidig hurtig dechorionation af et stort antal embryoner 9.
      1. Der fremstilles en 100 x stamopløsning af 50 mg / ml protease blanding, gør 100 pi alikvoter og opbevares ved -20 ° C.
      2. Tilsæt 100 pi af den bestand protease til 10 ml E3-medium (slutkoncentration på 0,5 mg / ml protease).
      3. Placer godt udviklede vært og donor embryoner i to separate lille Erlenmeyer glas bægre (10 ml) og fjerne så meget væske som muligt.
      4. Tilsæt 5 ml af 0,5 mg / ml protease løsning på hvert bæger og forsigtigt swirl embryoner mens man ser på dem under et dissektionsmikroskop. Hold øje med tegn på deformation af chorion.
      5. Hold hvirvlende. Så snart den første embryo er ude af chorion (figur 1D, asterisker), udføre tre hurtige skylninger med E3-medium for at fjerne proteaseopløsning ved at hælde ud meste af væsken og kolben genpåfyldning ved forsigtigt at hælde i E3 langs siden. Lad ikke dechorionated embryoner til at komme i kontakt med luften i nogen af ​​de efterfølgende trin, indtil udgangen af ​​transplantation (afsnit 5), da de vil briste. Efterlad tilstrækkelig løsning i kolben mellem skylninger.
      6. Med ilden poleret glas overførsel pipette embryoner fra Erlenmeyer bæger i glas petriskåle eller agarose (2% i E3 medium) belagt plast retter. pipettere forsigtigt under overførsel for at fjerne enhver resterende svækket chorion.
  5. forberedelse Transplantation nål
    1. Brug en nål aftrækker til at trække to nåle fra hver borsilicat tynde væg glasrør (1,0 mm OD/ 0,78 mm ID / 100 mm længde) med de samme indstillinger som mikroinjektion pipetter.
      BEMÆRK: Eksempler på indstillinger for nålen aftrækker bruges her leveres i List Materials. Transplantationer nåle har ikke en glasindsats, da dette beskadiger cellerne suget ind i nålen.
    2. Træk nåle i forvejen, opbevares i en petriskål og sikker ved at trykke ind i en stribe af formbar kit eller tape.
    3. Før transplantation bringe spidsen af ​​nålen i fokus under et dissektionsmikroskop og bruge pincet til at bryde åben nålen ved spidsen. Brug fine tænger til at justere formen af nålen at tilstræbe en fløjte-form (fig 2G), eller bruge alternative metoder beskrevet til at generere spidsen form 23.

5. Chimera Generation via blastula Transplantation

  1. setup Transplantation
    BEMÆRK: Her blev en selv-samlet transplantation apparat, der anvendes (figur 2A
  2. Monter transplantation nålen i samme nåleholder anvendes til mikroinjektion ovenfor (monteret på mikromanipulator, trin 3.1.3) (figur 2A).
  3. Afbryd indsprøjte rør, der forbinder udgangen af ​​mikropipetten holderen til trykreguleret mikroinjektor anvendes til mikroinjektioner. Fastgør injektion rør, som er knyttet til en 1 ml sprøjte (figur 2A, B), som repræsenterer transplantation riggen.
    1. Sørg for, at alle forbindelser stramt er tætnet ved hjælp af paraffin film eller formbar kit. Undgå embryoner fra at komme i kontakt med luft ved at sikre, at der altid er nogle E3 medium i transplantation nål selv. Betjene sprøjten manuelt at sutte celler / væske ind i og ud af transplantation nål.
  • Embryo tilpasning
    1. Overfør donor embryoner med glas pipette ind i den første kolonne i agarose mug. Overfør værten embryoner i kolonner 2til 6 i agarose formen (figur 2F). Placer embryoner med pipetten, så blastomer side vender opad.
  • Transplantation
    1. Hvile forsigtigt transplantation nål på en blastomer celle i en donor embryo og langsomt suge op omkring 20-50 celler i transplantation nål (Figur 2H). Undgå suger blommen.
    2. Løft transplantation nål fra donor embryo ved hjælp af mikromanipulator. Flyt agarose formen skålen til venstre og indsæt transplantation nålespidsen gennem siden af ​​cellemassen i dyret pol af første værtsembryo. Depositum 5 - 10 celler nær overfladen efter skæbnen kortlægning viser, at dette område giver anledning til forhjernen / øje felt 24 (figur 2I). Hold nålespidsen nedsænket i E3 medium under hele proceduren.
  • Pleje af transplanterede embryoner
    1. Fjern donor embryoner ennd forlader værten embryoner i agarose formen til 1 - 2 timer ved 28,5 ° C. Fyld glas eller plast (overtrukket med 2% agarose) petriskåle med E3-medium indeholdende 0,003% N-phenylthiourinstof (PTU) for at forhindre pigmentdannelse da dette vil forstyrre billeddannelse. Overfør værten embryoner i disse retter med ilden poleret glas pipette og inkuberes ved 28,5 ° CO / N.
      ADVARSEL: Bær handsker ved håndtering af PTU.
  • 6. Levende Imaging Setup

    BEMÆRK: Den lille størrelse og optisk gennemsigtighed i zebrafisk kombineret med hurtig udvikling har gjort det muligt at blive en central hvirveldyr model for in vivo-billeddannelse af forskellige celler og organer. Billeddannelse kan udføres på en række forskellige mikroskoper, der vil adskille sig i opsætning og parametre. I det følgende beskrives en egnet konfokal imaging setup for billeddannelse af retinal udvikling 5, 8.

    1. kimært embryoudvælgelse
      1. Ved 24 - 26 HPF, screene de transplanterede embryoner under en fluorescerende dissekere omfang at vælge sunde veludviklede fostre, der viser de transplanterede donor celler (H2A-GFP eller H2B-RFP mærket) i udviklingslandene øjet primordium.
      2. Braklægning op til 40 embryoner til montering afpipetteres en ny skål og tilsæt 0,4 mg / mL tricaine methansulfat (MS222) at bedøve embryoner.
        ADVARSEL: Bær handsker ved håndtering MS222.
    2. Montering embryoner
      BEMÆRK: Anvend den relevante monterings skålen, afhængigt af om billeddannelse vil blive udført på en inverteret 8 eller opretstående mikroskop (beskrevet her).
      1. Forbered et par 1,5 ml plastrør indeholdende 1 ml 1% lavtsmeltende agarose i 0,4 mg / ml MS222 i E3-medium og holde smeltet i et 40 ° C vandbad.
      2. Suck op 5 embryoer i en plastik overførsel pipette og lad embryoner ophobes i spidsen ved hjælp af tyngdekraften. Tryk overførsel pipettepå overfladen af ​​én af de forberedte plastrør indeholdende 1% lavtsmeltende agarose og 0,4 mg / ml MS222 tillade embryonet at synke ind i røret samtidig begrænse mængden af ​​E3 overførsel.
      3. Mount embryoner i en 90 mm diameter petriskål til billeddannelse i opretstående mikroskop og glasbund petriskål (alle størrelser) til billeddannelse i omvendt mikroskop. Brug en permanent markør til visuelt opdele enten fad i to halvdele til billedet donorer i WT værter (på den ene side) eller morphant værter (anden side) i det samme eksperiment.
      4. Overfør fem embryoer fra agarose plastrør til enten petriskål med 0,5 - 1 ml agarose. Fjern overskydende agarose med en overførsel pipette, således at kun en lille dråbe (-200 - 300 pi) forbliver. Hvis billeddannelse med opretstående mikroskopi, undgå at placere embryoner inden 1 cm petriskålen omkreds. Nedsænkning i vand dypning anvendte objektiv til billeddannelse kan ikke være i stand til at være centreret i dette område på grund af petriskålen væg (figur 3A </ Strong>).
      5. Brug en microloading pipette (med spidsen brækket af) for at justere embryoner sideværts indtil agarose størkner. For begge typer retter, er embryonerne korrekt vinklet lateralt hvis de to øjne på hver side af hovedet er helt overlappende (centreret i XY dimension) (figur 3B). For inverteret mikroskopi anvendelse skal øjet nær dækglasset skubbes så tæt på dækglasset som muligt, for at muliggøre billeddannelse gennem z-dimension inden for begrænsningerne i de mulige fokus niveauer.
      6. Fortsæt montering fem embryoer på et tidspunkt i individuelle agarose dråber. Anvende mere 1% lavtsmeltende agarose til at deltage i agarose falder til hinanden og den side af skålen for at forhindre enhver løsgørelse og lateral bevægelse under billedbehandling (figur 3A).
      7. Når fuldt størknet, dække fadet med E3 medium (indeholdende 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) forvarmet til 28,5 ° C.
      8. Brug samme fremgangsmåde beskrevet i trin 6.2.2- 6.2.8, montere ~ 20 transgene embryoner rejst ved 32 ° C (trin 1.2.5) i en separat skål.
    3. Imaging parametre
      BEMÆRK: Imaging at analysere indtræden af ​​fluorescerende transgener ikke kræver høj rumlig intracellulær opløsning. Det kan udføres med en W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70-mm mål på 1,5 zoom.
      1. Opstil laseren magt og eksponeringstid baseret på transgene intensitet for de ~ 20 transgene embryoner med accelereret udvikling (dvs. rejst ved 32 ° C, trin 6.2.8).
        BEMÆRK: undersøgelser af udbrud af transgen udtryk, de eksperimentelle embryoner viser ingen fluorescens på det tidspunkt, time-lapse er sat op, og dermed er disse accelererede embryoner er afgørende for bestemmelse af parametrene for billeddannelse.
      2. For den eksperimentelle parabol, visualisere hver foster og gemme positionen og fokusere niveauer af embryoner.
        1. Vælg embryoner, der har den korrekte montage vinkel (dvs. med den laterale side af øjet så vandret som muligt) og kraftig hjertebanken (en indikator for sundhed). Vælg embryoner med et par transplanterede donorceller (fastlagt af H2A-GFP eller H2B-RFP mærkning) primært i den forreste ventrale kvadrant af udviklingen nethinden (hvor bølgen af genekspression begynder) (figur 3C).
          BEMÆRK: I zebrafisk embryoner den gennemsnitlige puls er 120 - 180 slag / minut 25. I de bedøvede embryoner, kan en sund hjerteslag være i området fra 60 - 120 slag / minut. Langsommere puls kan være tegn på nedsat levedygtighed og disse embryoner bør udelukkes fra undersøgelsen.
      3. Set z-stakke af optiske sektioner på 2 um intervaller gennem nethinden på op til 15 embryoner.
        BEMÆRK: Det samlede antal embryoner, der kan afbildes i et givet forsøg vil afhænge af individuelle parametre (eksponeringstid og z-stack størrelse). Den tid, det tager at billedet en gang-point for alle de udvalgte embryoner skal være shOrter end intervallet mellem tidspunkter. Ved at ofre en vis dybde opløsning, kan flere fostre afbildes inden for de tidsintervaller. Grænserne for z-stak bliver valgt som laterale og mediale yderpunkter af monterede embryoner øjet og 30 um sættes til den laterale side i oprejst mikroskopi setup, som øjne i udviklingslandene embryoner i denne opsætning skift i z-retningen som embryoner vokse natten. Dette resulterer i stakke 100-170 um tykkelse (50 - 85 billeder / øje).
      4. Tage billeder hver 24 min ved 32 ° C (svarende til 0,5 HPF intervaller) ved hjælp af laser / kanal hensigtsmæssigt at transgenet.
        BEMÆRK: De embryoer forbliver på scenen hele tiden-lapse inden et opvarmet kammer omfatter hele mikroskop. Mens forsøget kan udføres ved 28 ° C, er varmere temperaturer anvendes til at fremskynde udviklingen og sikre, at de relevante tidspunkter i forsøget afbildes i 16 - 24 t time-lapse periode.
      5. Billedekanaler, der repræsenterer donor etiket (H2A-GFP eller H2B-RFP - ekstraudstyr) og transgen (Atoh7: RFP eller Vsx1: GFP) ved hjælp af sekventiel scanning. Til analyse udnytte donormærke kun at vælge passende embryoer som beskrevet (tage en z-stak i begyndelsen af ​​billeddannelse) og derefter udføre time-lapse kun på kanalen for at indfange transgen ekspression.
        BEMÆRK: Du kan også bruge kun donor etiketten for at vælge passende embryoner (dvs. dem med bekræftede transplanterede celler i forreste ventrale kvadrant) og billedet kun transgen kanal, groft halvere billedbehandling tid og næsten en fordobling af antallet af embryoner, der kan afbildes og analyseres pr eksperiment (figur 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Dette arbejde præsenterer en forsøgsprotokol at vurdere ændringer i genekspression timing, når vildtype retinale stamfædre udvikle sig inden en morphant vært foster. De eksperimentelle vært embryoner er Ptf1a morphants, som mangler de mellemliggende født horisontale og amacrine interneuroner i nethinden 7, 26. Disse er blevet sammenlignet med kontrol værten embryoner, som blev injiceret med en standard kontrol morpholino.

    Da neurogenese af forskellige typer af neuroner i hele centralnervesystemet (herunder nethinden) forekommer i en stærkt bevaret histogenic ordre 27, 28, 29, 30, 31 progressionen af den efterfølgende skæbne kan afhænge af celle ikke-selvstændige tilbagekoblingerakkumulere tidligere født neuron typer. Denne hypotese blev testet ved at vurdere, hvornår genereringen af ​​senere født neurale typer i transplanterede stamceller udvikler i fravær af mellemliggende født neuron typer. Som en kontrol blev timingen af ​​tidlig fødte celler kvantificeres også, som bør være upåvirket uafhængigt af, om de mellemliggende celler genereres eller ikke. Til dette formål Tg (atoh7: RFP) eller Tg (atoh7: gapGFP) linjer blev anvendt til visualisering af indtræden af den første fødte gangliecelle neurogenese mens Tg (vsx1: GFP) linje blev anvendt til at analysere indtræden af den sene født bipolar befolkning. Andre end yderligere ekspression af reporter transgener, donorcellerne fra disse embryoner er genetisk WT.

    Mikroinjektion af 1 nL mRNA (til label donorceller) i blommen i enkelt-celle embryoer resulterer i fluorescerende reporter protein ekspression ved 3 HPF, hvoriscenesætte de lyseste donorer udvælges (figur 1). Forbered transplantation setup når embryoner er omkring 2 HPF (figur 2). Ved 24 HPF, er fostre med transplanterede donorceller i de relevante retinale steder udvalgt og monteret i 1% lavtsmeltende agarose i grupper på fem (figur 3). Efter at have gemt embryo position, indstilling af z-stack og tidsparametre, er time-lapse billeddannelse udført i 16 - 24 t. Timingen af ​​første født ganglieceller er angivet ved opståen Atoh7: RFP eller Atoh7: gapGFP transgen og timingen af ​​den sidste født bipolar generation indikeres af den stærke opregulering af Vsx1: GFP transgen, hvilket også kommer til udtryk ved tydeligt lavere lysstyrke niveauer i udviklingslandene stamfædre. Timingen af første transgenekspression, såsom Atoh7: gapGFP er identificeret i individuelle celler ved hvert tidspunkt af imaging (hvide pilespidser, figur 4). Atoh7: gapGFP og ganglion celledifferentiering occurs ved ækvivalente gange Uanset om værtsembryo er WT eller en Ptf1a morphant mangler mellemprodukt (dvs. efter gangliecelle fødsel) horisontale og amacrine celler.

    De viste data viser, at denne eksperimentelle tilgang giver et kraftfuldt værktøj til at vurdere, hvilken rolle bestemte retinale miljøer på genekspression timing, med relevante konsekvenser, ikke kun for at forstå normale udviklingsprocesser, men også for fremtidige anvendelser af celle omprogrammering strategier i normale og syge tilstande .

    figur 1
    Figur 1: mikroinjektion i blommen i Single-celle Stage Embryoner anvendes til mærkning donorceller og til at generere forskellige Host Environments. A) Embryoner er afstemt mod kanten af en glasplade med de fleste af den omgivende væske reflyttet. B) Nålen indsættes i midten af blommen og enten H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA (for donor) eller morpholino (standard MO eller Ptf1a MO for vært) injiceres. C) Injektionskanylen genereres ved hjælp af en nål aftrækker, der genererer to symmetriske nåle fra hvert kapillar. Hver trukket nålen efterfølgende skal have spidsen brudt med pincet for at åbne nålen og samtidig skabe en skarp vinklet spids (ikke stump), der let kan indsættes i embryoer. D) Donor embryoner injiceret med H2B-RFP mRNA ved enkeltcelle-fase begynde at udtrykke de fluorescerende reporter-proteiner med 2,5 HPF, på hvilket stadie de lyseste og mest jævnt mærkede embryoer kan vælges. E) Omkring 2,5-3 HPF, donor og vært embryoner enzymatisk dechorionated hjælp proteaser. Hvirvlende af Erlenmeyerkolbe giver den mekaniske kraft nødvendigt at bryde åbne svækkede chorions og bringer dechorionated embryos ind til centrum. Så snart den første (asterisk) eller nogle få dechorionated embryoer iagttages, hurtig og skånsom skylning sikrer, at proteasen opløsning fjernes. F) Ved overførsel af dechorionated embryoner, er glas overførselspipetter udnyttes. Disse kan indledningsvist afkortes (valgfrit) til en hvilken som helst længde, der er komfortabelt manøvreres af brugeren, ved at ridse glasset på et passende position med en diamant kniv, indtil den klikker off. Dette resulterer i en skarp snit spids, som skal være flammepoleret at udjævne eventuelle skarpe kanter, der kan beskadige celler bliver suget ind i pipetten under overførslen. Scale barer A, B, D, E = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: Transplantation Opsætning. B) Transplantation rør vist angiver, hvor potentielle lækager ved samlinger er simpelthen forebygges med støbelige kit og paraffin film. C) En højere forstørrelse af forbindelsen mellem injektionen slanger og helst egnet slange til at forbinde til sprøjten. Selv om der kan anvendes en hvilken som helst rørledning, udnyttede her rør har en diameter, der tæt passer til en 10 pi pipettespids. Brug paraffin film for at sikre en tæt forsegling. D) Formen har 150 (6 x 25) kiler til at generere de trekantede opslåede i agarose injektion plade. E) omtrentlige mål hver kileform er vist. Virksomheden målinger er proprietære. F)Tilberedte agarose injektion plader med kileformede fordybninger anvendes med donorembryoner tilsat til den første søjle og kolonner 2 - 6 fyldt med værten embryoer. Transplantationer udføres over rækken, hvorved celler indsamlet fra en donor i hver række kan transplanteres i 5 host embryoer. Inden hver form, kan celler fra op til 25 donorer blive transplanteret ind i op til 125 vært embryoner. Bemærk formen placeres asymmetrisk i den dybere ende af kilen tættere på petriskålen kant. Dette tillader transplantation nålen fra højre ind uden at ramme petriskålen kant. G) Transplantation nålen trækkes med de samme parametre som injektionsnålen at resultere i en lang tilspidset spids vist her. Nålen skal brydes for at generere et større indre diameter, som kan tage op celler uden at deformere dem. Det højere effektområde indsatte viser, at spidsen af ​​nålen transplantation bør være vinklet og ideelt have en "fløjte" form som visti dette eksempel. H) Højere magt visning viser orienteringen af værten embryoner med celler i toppen. Transplantationen nål indsættes i cellemassen af ​​blastulaen fase værtsembryo lateralt (hvid asterisker) og skubbet ind i fremtiden øjet som vist her. Donorceller kan ses i transplantation nål (pil) og dermed den ru antal celler transplanteret kan styres. I) To eksempler (venstre og højre) viser, at umiddelbart efter transplantation, fostre med held transplanterede celler i den korrekte placering kan umiddelbart sorteres ud ved hjælp af donormærke (f.eks H2B-RFP). En fluorescerende kanal blev tilføjet til lysfelt ved hjælp af "lineær dodge (tilføje)" under lag menuen i raster grafik editor. Scale bar (for H, I) = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.


    Figur 3: Embryo Montering for Time-lapse Imaging. A) petriskål (90 mm), der viser flere lavtsmeltende agarose dråber indeholdende fem embryoer hver især er forbundet ved hjælp af agarose til dannelse af en fast netværket for at forhindre individuelle dråber løsner. B) Højere magt visning af 24 HPF embryoner aligned sideværts og indlejret i størknet agarose. Efter den ideelle vinkel bør de to øjne placeres oven på hinanden (i z-dimensionen). Afhængigt af genet af interesse, montering bør udsættes indtil umiddelbart inden relevant timing (f.eks 26 HPF for ganglion celledifferentiering eller 35 HPF for starten af den bipolære celledifferentiering). C) Konfokal billede af en enkelt optisk z-sektion viser overlejring af lysfelt og røde kanaler (ved hjælp af "lineær dodge (tilføje)" under lag menu iraster grafik editor) på at udvikle øje med et par mærkede donorceller (rød) inden for en ellers umærket vært miljø. Målestok B = 1 mm, skala bar C = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4: Timing af Neurogenese kan visualiseres i transgene donorceller transplanteret ind forskellige Host Environments. Mikrografer fra time-lapse billede af udviklingslandene WT donor celler fra Tg (atoh7: gapGFP) transgene embryoner transplanteret ind umærket WT vært. Transgenekspression debut er indiceret til et par celler ved hvide pilespidser. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version of denne figur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Forståelse hvilket omfang naboceller påvirke timing af ekspressionen af ​​afgørende celleskæbne afgørende faktorer er afgørende, når der sigtes til effektivt instruere embryonale eller inducerede multipotente stamceller til at differentiere til en specifik post-mitotisk celletype eller endda mønstrede væv. Desuden undersøger disse molekylære begivenheder i udviklingslandene celler i det levende dyr derudover giver relevant dynamik (tidslige og rumlige) oplysninger om de særlige cellulære sammenhænge i forbindelse med disse begivenheder in vivo. Sådanne undersøgelser kan ikke nemt at opnå i alle hvirveldyr modeller.

    I det præsenterede protokol, er den modtagelig zebrafisk embryo udnyttet som en hvirveldyr model til at behandle disse spørgsmål i vivo, i den relativt enkle, men alligevel meget organiseret tredimensionelle mønstrede væv i hvirveldyr nethinden. Dette eksemplificeres ved at teste den hypotese, at nedbrydende en særlig retinal celletypen påvirker genekspression timing og udviklingsmæssige skæbne retinale stamceller. Vi kan derudover udnytte donorcellen markør til at spore specifikke celler tilbage i tid til at vurdere, for eksempel, hvor længe før ekspression af et transgen en postmitotiske celle undergik sin sidste spaltning eller vurdere den generelle opførsel af denne celle (f.eks, migration) på forskellige trin forud for transgen ekspression i forskellige miljøer. Til disse undersøgelser, at en kombination af relativt let at udføre teknikker præsenteres, som omfatter morpholino-medieret gen vælte, transplantation og direkte billedvisning. For transplantation metode, protokollen introducerer en roman, relativt nemt og billigt transplantation rig og demonstrerer lethed af denne drift setup.

    Denne protokol er ikke begrænset til nethinden. Den kan også anvendes til at studere en række forskellige dynamiske cellulære processer, der kræver udredning af celle-autonom developmEntal programmer fra celle ikke-selvstændige miljømæssige påvirkninger. Men mens lidt fejlfinding er påkrævet, har brug for en række kritiske trin, der skal tages i betragtning, før du starter et eksperiment. En vigtig forudsætning for en vellykket anvendelse af teknikken er, at organet eller vævet af valg skal let målrettes i den tidlige embryo hjælp skæbne kort. Hvis effektiviteten af ​​væv målretning ikke tidligere er blevet testet, må dette først optimeres og standardiseres. Antallet af mikroinjicerede og transplanterede embryoner kan øges og screenes, inden at leve billedbehandling at opnå tilstrækkelige embryoner med donorceller korrekt integreret og placeret inden for det relevante væv. Og mens denne protokol kan let anvendes på tidlige embryonale zebrafisk stadier, påføring på senere stadier, såsom den voksende larver blevet vanskeligere af to grunde. For det første effektiviteten af ​​gen knockdown opnås med morpholinos falder med tiden (deverserende på hver morpholino, er det generelt mest effektive inden den 3. dpf). For at tilsidesætte dette problem, anvendelse af genetiske mutanter som donor embryoner til transplantation er at foretrække. For det andet, da zebrafisk vokser, dybere dele af larverne bliver mindre tilgængelige for billeddannelse med en konfokal mikroskop, især ved højere forstørrelse (højeffekt mål), hvor arbejdsmiljøet afstand af mikroskopet mål er mere begrænset. Således skal først vurderes for sin modtagelighed for billeddannelse hver væv af interesse på relevante alder.

    Den time-lapse imaging kan udføres enten på en inverteret eller opret konfokalmikroskop.

    Der er en række fordele ved den opretstående mikroskop, hvis de er tilgængelige. Ved den påkrævede temperatur, fordampning af nedsænkning stof, der anvendes (fx vand eller nedsænkning olie med vand brydningsindeks) på et omvendt mikroskop kan føre til fuldstændig udtørring. Dette kræver konstant overvågning ogvinder genpåfyldning, med risiko for at placere prøven ud af fokus. Dette kan delvis undgås ved at anvende automatisering at sænke målet en defineret afstand, tilsætning af nedsænkning substans og hæve målet igen, selvom i vores erfaring, er fokusering ofte stadig nødvendigt, hvilket bør ske inden begyndelsen af ​​den næste tidspunkt for billeddannelse . For det andet, de største dækglas bund retter vi indkøbte stadig meget mindre (50 mm i diameter) end standard 90 mm diameter petriskåle anvendes til opretstående mikroskopi. Dette betyder, at antallet af embryoner, der kan monteres og embryoet medium volumen tilsat er mere begrænsede, når der anvendes inverterede mikroskoper. Ikke desto mindre time-lapse parametre udgør normalt den vigtigste begrænsende faktor for antallet af embryoner, der kan afbildes, og dermed på størrelsen af ​​skålen er stadig egnet. Ved brug meget høje forstørrelsesobjektiver kan inverteret mikroskopi tillade en større dybde i z-dimensionen som øjet ogMålet er kun adskilt af en tynd dækglas. Når man kombinerer meget stor forstørrelse med opretstående mikroskopi, skal agarose drop dækker embryoet holdes så tynd som muligt. Samlet set opnåede ved hjælp af opretstående eller omvendt mikroskopi data er af tilsvarende kvalitet.

    Til generering af data af høj kvalitet, der er yderligere kritiske trin, der skal overvejes. For det første udvalg af flotte mærkede donorer er afgørende for at opnå transplanterede embryoner med et passende antal transplanterede celler i øjet i starten af ​​time-lapse film (et par stykker, men ikke for mange). Protease enzymatiske dechorionation er et afgørende skridt og inkubation i protease bør holdes på et minimum, efterfulgt af hurtig, men blid skylninger til ikke at påvirke den efterfølgende sundhed af embryonerne. Alder matching af donor- og vært embryoner muliggør nøjagtig vævsmålretning ifølge skæbne kort og til effektiv integration af cellerne. En velformet transplantation neEdle er vigtigt at sikre, at spidsen er lille og skarpt nok til at indsætte i værten embryoer uden at forårsage stor skade, men stor nok i indre diameter til ikke forårsage mekanisk skade på cellerne transplanteres. Under transplantation, hvis udstyret ikke er fuldt forseglet (især ved forbindelsespunkter), er det meget vanskeligt at manuelt styre bevægelsen af ​​E3-medium, og celler ind og ud af transplantation nål. Dette er mest indlysende, når der er flow enten ind i eller ud af transplantation nålen uden manuelt at ændre sprøjtevolumen. I dette tilfælde alle samlinger skal kontrolleres igen og lukkes igen. Dette bør testes forud for eksperimentet.

    Endelig i den forløbne tid mellem transplantation og time-lapse setup, er det afgørende, at de transplanterede embryoner får lov til at udvikle sig på lav densitet, mens omhyggeligt at rense eventuelle usunde embryoner. Dette er især vigtigt, når timingen af ​​udvikling eller gene ekspression er ved at blive undersøgt. Ved vurderingen timingen af enhver proces (f.eks genekspression) skal kontrollen anvendes til at udelukke ikke-specifikke bivirkninger af morpholino teknologi. I vores arbejde bruger vi timingen af transgen ekspression i en uafhængig væv (f.eks musklen) upåvirket af specifikt gen målrettet af morpholino.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af en ARC Decra til PRJ (DE120101311) og ved en Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) forskningsbevilling til LP (PO 1440 / 1-1). Den australske regenerativ medicin Institute er støttet af midler fra delstatsregeringen i Victoria og det australske forbundsregering. Vi anerkender Dr. Jeremy Ng Chi Kei, der udført eksperimenter beskrives her som offentliggjort i Kei et al. , 2016. Vi er taknemmelige for bestemmelser i transgene fisk fra Prof. Higashijima og tak Profs. Turner og Rupp for levering af pCS2 + plasmidet og Dr. Wilkinson til at generere H2B-RFP og H2A-GFP konstruktioner. Vi takker FishCore facilitet personale (Monash University) til at tage sig af vores dyr.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    Developmental Biology zebrafisk transplantation kimære levende billeddannelse celle non-autonome nethinde genekspression timing neurogenese
    <em>In Vivo</em> Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter