Summary
서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.
Abstract
유전 적 및 기술적 장점은 제브라 척추 유전자 조작의 결과가 급속한 발달 기간 동안 생체 내에서 추적 될 수있는 키 모델 생물 만들었다. 다중 처리는 세포 증식, 유전자 발현, 세포 이동 및 형태 형성을 포함하여 연구 될 수있다. 중요한 것은, 이식을 통해 키메라의 생성을 용이하게 호스트 환경의 영향하에 모자이크 표시와 개별 세포의 추적을 가능하게 수행 될 수있다. 예를 들어, 개별 이식 공여자 세포 (모르 폴리 마이크로 인젝션을 통해 예를 들어) 호스트 배아 기능 유전자 조작 및 라이브 영상, 외부의 영향 (유 전적으로 변형 환경에 의해 제공되는) 셀 비 자립적 신호를 조합하여 평가 될 수있다. 여기서 우리는이 방식 세포 운명 determin의 타이밍에 대한 프록시로서 형광 유전자 발현의 개시를 비교하기 위해 사용되는 방법을 보여다른 유전 호스트 환경에서 ATION.
이 글에서 공여 세포를 표시 유전자 호스트 배아 최저 키메라 배아를 생성하는 데 사용되는 이식 기술을 설명하고, 제조 및 생체 저속 촛점에서 실행을위한 프로토콜을 일으킬 제브라 피쉬 배아 마이크로 인젝션을위한 프로토콜을 제공 여러 개의 배아의 영상. 이러한 유전자 발현의 개시에 따라 이벤트의 타이밍을 비교하면 특히 다단 촬상을 행하는 것은 매우 중요하다. 이것은 다수의 제어와 동시에 처리 실험 배아에서 데이터 수집이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 쉽게 장기 나 영상을 살 액세스 선택의 조직에서 외부의 영향에 대한 연구를 위해 확장 될 수있다, 이식이 이루어 배아 운명의지도에 따라 쉽게 대상이 될 수 있음을 제공했다.
Introduction
생체 내 척추 동물의 중요한 발달 과정을 시각화하는 능력은 정상과 질병 조건을 공부 제브라 피쉬에게 키 모델을 만들기에 기여하고있다 (1 검토, 2). 특히, 신경 망막은 중추 신경계의 접근 가능한 부분이다. 망막 인해 고도로 조직 아직 비교적 간단한 구조 및 척추 동물 종 3에서 고도로 보존 된 신경 세포 유형에 쉽게 신경의 연구를 수행하기 위해 빌려 준다. 이러한 증식, 세포주기 출구, 비대칭 세포 분열, 운명 사양, 차별화 및 신경 회로의 형성과 같은 세포 행동의 역학은 3 일의 postfertilization에 의해 제브라 피쉬의 중심 망막에 완료 retinogenesis의 전체 과정에 걸쳐 올 수 있습니다 ( DPF) 4, 5,REF "> (6, 7).
또한, 전술 한 각 단계에서 상이한 유전자의 기능적 요구 병용 단 후 부검시에 평가 될 수있는 유전자 녹아웃 기술의 적용으로 인한 표현형 다른 척추 동물 모델에 비해 이점을 제공 제브라 망막 평가할 수있다 의 조직을 고정. 특히, 시각화 및 망막 리포터 유전자 형광 단백질의 발현을 모니터 할 수있는 트랜스 제닉 라인의 사용은 우리가 특정 신경 세포 유형 기원의 기초의 유전자 발현의 시간 해상도를 얻을 수있다. 인해 지브라 피쉬의 급속한 발전으로, 이러한 이벤트는 따라서 신경 세포 식별 획득 및 셀의 동작과 관련하여 유전자 발현의 시간 중요도에 깊은 통찰력을 제공하여 전체 개발 기간을 시각화 할 수있다.
마지막으로,이 방법은 유전자 기능의 두 가지 주요 형태로 통계 결과 이식을 통해 키메라의 생성과 제브라 효율적으로 결합 될 수있다. 우선, 그들이 비 표지 야생형 환경에서 개발하면서 특정 유전자를 넉다운시킨 도너 배아에서 이식 세포 검사, 세포 자율 방식으로 유전자 기능에 대한 관련 정보를 얻을 수있게 해준다. 따라서, 그들은 일반적으로 더 이상 유전자 -4,6-에서 기능성 단백질을 생성 할 수 없다 전구 세포의 발달 운명 결과의 시험을들 수있다.이 표현되는 전구 세포 내 망막 운명 결정 인자의 기능에 관한 중요한 통계 리드 8,9. 이 방법을 활용하여, 우리는 많은 운명의 결정 요인 (예를 들어, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2가) 세포의 역할을하는 것으로 나타났습니다-autonomously 특정 망막 신경 세포의 운명을 구동하는 단계; 유전자 발현의 부족은 주로 유전자 녹다운 세포가 다른 세포 운명 4, 6, 7, 10을 채용하여 생존 유지되도록 운명 스위치로 이끈다. 둘째, 이러한 키메라 실험은 서로 다른 유전 적 환경에서 개발할 때 형 선조 동작 방식 야생 평가하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 일반적으로 조작 된 호스트 환경 (예를 들어, 유전자 녹아웃 / 최저) 대 WT 관심 (리포터 유전자)의 유전자를 발현 WT 세포의 발달을 비교하여, 유전자 발현 및 세포 운명 얻어진 효과를 평가할 수있다 . 호스트 환경의 특정 신경 세포 유형의 부재가 예를 들어, 소수 O로 분화 향해 바이어스 그들 셀 비 자율 방식으로 야생형 전구 동작에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다신경 세포 타입 4, 7, 11, 12을 r에 누락. 망막 신경 세포가 (13에서 검토) 특정 신경 세포 운명 결정하는 유전자의 순차적 초과 식 (운명의 유전자 발현)에 의해 보존 histogenic 위해 태어난 것을 감안할 때, 우리는 입증하기 위해 이러한 방법을 사용하는 방법 야생형 전구 세포의 운명 유전자 발현의 타이밍 이러한 전구 세포가 유도 된 비정상적인 세포 조성 망막 호스트 환경에서 개발할 때 영향을받습니다. 비교적 널리 사용되는 표준 및 기술의 조합은 망막 전구 세포를 8, 9 개발 운명 유전자 발현의 타이밍의 시험을 가능하게하는 방법을 여기에서는 증거 이러한 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 당의 용이성으로 시간 경과 영상을 결합하는 실험 방법을 설명합니다전 생체 개발 제브라 피쉬 배아에 이식을 형성하는 개별 mosaically에게 발달 retinogenesis의 전체 기간 동안 표지 세포를 수행합니다. 기능 유전자 조작을 수행함으로써 어느 호스트 배아 도너 배아, 또는 둘 모두에서 하나의 유전자 기능의 셀 자율성을 평가할 수있다. 이 방법은 여기에 설명 된 개별 구성 요소가 적합있는 다른 시스템에서 유사한 연구 질문에 널리 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 동물의 관리 및 사용에 대한 실천의 호주 국립 보건 의료 연구 협의회 코드의 규정에 따라 수행하고, 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다.
Zebrafish의 1. 준비
- 성인 물고기 페어링
- 저녁은 사용하기 전에 적절한 크기 사육 탱크 쌍 (또는 2 쌍)으로 성인 물고기를 설정합니다.
- 남성에서 분리 된 여성을 유지하기 위해 볼 수있는 물고기를 사용하지만, 서로 접촉하지 않도록 칸막이를 사용합니다.
- 아침에 불을 전환 한 후, 칸막이를 제거하고 물고기가 방해받지 않고 짝짓기를 할 수 있습니다.
- 성공적인 짝짓기는 원래 탱크로 다시 성인 물고기를 넣어 후.
참고 : 호스트 및 기증자 균주 어떤 야생형 (WT) 균주, 예를 들어, 동일 할 수있다. (: gapRFP atoh7)의 Tg (atoh7 : gapGFP) 또는 본 연구를 위해 기증자의 배아는 유전자 변형 라인의 Tg에서 파생 된TG (vsx1 : GFP)가되는 운명 결정 인자의 발현 일찍 또는 늦게 구동 신경 거동은 각각 14, 15, 16, 가시화 될 수있다. 후술하는 바와 같이 유전 적 환경에 상이한 효과를 비교하기 위해, 호스트 배아 특정 돌연변이 또는 morphants 수있다.
- 배아 컬렉션
- 사육 상자에서 계란을 수집하기 위해 차 여과기를 사용합니다. 계란에 대한 출생의 시간을 결정 및 단일 세포 단계의 배아는 다음 단계를 수집하도록 최선 15 분을 확인합니다.
- E3 매체 (5 mM의 염화나트륨, 0.2 밀리미터의 KCl, 0.4 mM의 염화칼슘 2, 0.9 밀리미터의 MgCl 증류수 2, 2 % 메틸렌 블루)와 배아를 씻어 (50)의 최대 밀도 ~ 40 mL의 E3 (17)를 포함하는 배양 접시에 배치 90mm 직경 페트리 접시 당 계란입니다.
- 변형 이름, 날짜 및 시간으로 배양 접시 레이블출생. 해부 현미경으로 배아를 보는 동안 이물질을 제거하기 위해 파스퇴르 전송 피펫을 사용합니다.
- 이식 ~ 3 시간 postfertilization (HPF)까지 28.5 ° C에서 배아를 유지, 또는 microinjections를 계속합니다.
참고 : 이식의 경우, 비슷한 연령대에서 기증자와 호스트 배아을 목표로. 킴멜 등에 따라 32 °의 C - 따라서, (25) 사이에 다른 사육 온도를 사용한다. 도 18은 느려지거나 다른 일치 배아 한 클러치를 가속화한다. - (- 28 시간 후에 24) 시간 경과 영상까지 수집시에서 32 ° C에서 uninjected 형질 전환 기증자의 배아 ~ 20을 유지합니다.
참고 :이 실험 집단보다 빠르게 개발하고 이전 형광 마커를 표현하는 것입니다. 이들은 따라서 촬상에 대한 파라미터 (레이저 파워 게인)를 설정하는데 사용될 수있다. 이 특정 예에서, 실험 집단의 촬상 유전자 발현 이전에 시작 (평가하기이 이벤트의 정확한 타이밍).
미세 주입 2. 준비
- 마이크로 인젝션 니들 준비
- 같은 길이의 두 바늘을 얻기 위해 중앙에 각 붕규산 유리 모세관 튜브 (1.0 mm OD / 0.78 mm의 ID / 100 mm 긴 유리 모세관)에서 바늘을 뽑아 바늘 풀러를 사용합니다. 긴 샤프트와 테이퍼 바늘을 목표로.
참고 : 여기에 사용되는 바늘 풀러의 예 설정이 공급된다 재료 목록. - 페트리 접시에서 뽑아 바늘을 저장하고 성형 퍼티 또는 접착 테이프의 스트립으로 그들을 눌러 고정합니다.
- 이전에 주입 해부 현미경 초점 바늘의 끝을 가져오고 끝에 열린 바늘을 깰 집게를 사용합니다. 작은 구멍 (그림 1C)와 날카로운 테이퍼 팁을 목표로.
<리> 호스트 배아에 대한 모르 폴리 노의 준비 - 같은 길이의 두 바늘을 얻기 위해 중앙에 각 붕규산 유리 모세관 튜브 (1.0 mm OD / 0.78 mm의 ID / 100 mm 긴 유리 모세관)에서 바늘을 뽑아 바늘 풀러를 사용합니다. 긴 샤프트와 테이퍼 바늘을 목표로.
- 주문 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드는 특히 관심의 유전자뿐만 아니라 표준 제어 모르거나 절차 및 처리 효과를 제어하기 위해 적합한 5 염기쌍 불일치 설계된.
주 : 여기에서, 인간 베타 - 글로빈 인트론 변이를 타겟팅 중간 태어난 수평 무 축삭 세포의 발달을 억제하는 서열 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 '과 모르 Ptf1a 차단 번역 및 표준 제어 지브라 피쉬의 모르 폴리 노 (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA ) (7 ') -3, (19)을 사용 하였다. - 실온에서 저장 - 1㎜의 폴리 노 스톡 용액 (8.5 NG / 거리 nL ~ 8)을 준비한다.
- 주사 당일, 10 분 동안 65 ° C에서 모르의 분액 (10 μL)을 가열 65 ° C (이후는 사용 동안 실온에서 유지 될 수있다)에서 냉각 얼음 간단히 제자리 스핀. 일잠재적 녹다운의 효과를 감소시킬 수있는 모르 폴리 용액 내에서 응집 거꾸로 것이다.
- Ptf1a의 모르 폴리 노 및 등가의 표준 제어 모르 들어 증류수 모르 원액을 희석하여 6 NG / 거리 nL의 작업 용액을 제조 하였다. 실온에서 보관하십시오.
참고 : 이전에 (7)의 결정에 따라 사용 Ptf1a 모르 폴리 노 등의 배아 당 모르 폴리 노의 2시 NL 배아 당 12 ng의 상대적으로 높은 작업 농도를 필요로한다. 대부분의 morpholinos를 들어, 2 - 배아 당 5 ng의 효과가있다, 그래서 2로 주식을 희석 - 5 NG / 거리 nL 각각의 배아에 1 거리 nL를 주입.
- Ptf1a의 모르 폴리 노 및 등가의 표준 제어 모르 들어 증류수 모르 원액을 희석하여 6 NG / 거리 nL의 작업 용액을 제조 하였다. 실온에서 보관하십시오.
- 형광 히스톤 융합 기자를 준비 라벨 기증자의 배아에 대한 구축
주 : 호스트 배아 내의 도너 세포 / 구별 시각화하기 위하여, H2A-GFP의 마이크로 인젝션을 포함하는 도너 배아 라벨을 다른 접근법이있다 (유전자와 도너를 사용하면적색 형광 기자) 또는 단일 셀 단계 기증자 배아의 노른자로 H2B-RFP (녹색 형광 기자들과 형질 전환 기증자를 사용하는 경우)의 mRNA.- 리포터 DNA를 함유하는 적어도 1 μg의 플라스미드를 선형화.
참고 : 여기에 PCS2 + 플라스미드 (생성 친절 바이오 메디컬 센터 뮌헨에서 미시간과 교수 랄프 렆의 대학에서 교수 데이비드 터너에 의해 제공) H2A-GFP 또는 박사 크리스토퍼 윌킨슨, 로얄 홀로 웨이에 의해 생성 된 H2B-RFP를 (포함, 런던 대학)를 NotI 제한 효소 절단으로 선형화 하였다. - 제조업체의 지침에 따라 시판 키트를 사용하여 DNA를 정화.
- 제조업체의 지침에 따라 적절한 중합 효소와 시판 키트를 사용하여 mRNA의를 전사. PCS2 + 플라스미드를 들어, SP6 중합 효소 키트를 사용합니다.
- mRNA를 같은 제조업체의 지시에 따라 이소프로판올 침전 다음에 상용 키트 또는 페놀 - 클로로포름 추출을 사용하여 정화에스. 초순수의 mRNA를 희석 (20 - 30 μL), -80 ° C에서 분광 광도계 저장소와 농도를 측정한다.
- 주사 당일, 100 NG / μL의 최종 농도로 멸균에서의 mRNA의 작업 용액을 제조하고 얼음에 보관. 다시 -80 ° C에 사용되지 않은 mRNA의 주식을 돌려줍니다.
- 리포터 DNA를 함유하는 적어도 1 μg의 플라스미드를 선형화.
단일 세포 단계 배아에 Morpholinos 및 / 또는 mRNA의 3. 미세 주입
참고 : Microinjections 모든 공여 세포를 표시하고 다른 호스트 환경 (제어 및 유전자 최저)를 준비하고 mRNA의 또는 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (20), (21)의 주사를 포함하는 데 사용됩니다.
- 로딩 및 주사 바늘을 교정
- microloader 피펫 팁을 사용하여 3 모르 폴리 노의 μL 및 / 또는 히스톤 형광 융합 mRNA의 용액을 주사 바늘을 Backload.
- 오디오 솔루션을 흔들어잔여 기포가 없어 질 때까지 주사 바늘 끝을 향해 이온. 이 솔루션은 주로 모세관 작용에 의해 팁에 그려집니다 있도록 삽입 내부 유리와 주사 바늘을 사용합니다.
- 미세 조작기 (3D 수동 미세 조작기)에 장착 된 홀더에 주사 바늘을 연결하고 관 하우징 내에서 꽉 밀봉을 보장합니다.
- 압력 조절 마이크로 인젝터에 전원과 가스 공급 장치의 전원을 켭니다.
- (A 계수 선 접안 렌즈를 사용하는 경우) 접시에 미네랄 오일 한 방울의 바늘 끝을 담가하거나 드롭 볼륨을 교정하기 위해 마이크로 미터 슬라이드를 통해 직접 바늘 끝을 맴 돕니 다. 풋 페달을 눌러 주입 부피를 측정하고, 주입량 1 거리 nL (125 μm의 직경)에 상응 할 때까지 가스 압력 및 / 또는 지속 시간을 조절한다.
주 : 마이크로 슬라이드의 장점은 측정 접안 계수의 기능을 사용하여 단, 현미경에서 사용 된 배율 무관하다는 것이다tead 사출 드롭 스케일 동시에 초점이 될 수있다.
- 배아 미세 주입
- 페트리 접시에서 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드 가장자리를 따라 단일 세포 단계의 배아를 입금 전송 피펫을 사용합니다. 잘라 얇은 팁의 절반으로 microloader 피펫 팁을 사용하여 하나의 컬럼에 맞 춥니 다. 주사 (그림 1A) 동안 움직임을 방지하기 위해 미세 전송 피펫으로 많은 액체를 가능한 한 제거합니다.
- 각 배아를 향해 바늘을 낮 춥니하고, 융모막을 관통 한 번의 부드러운 스트로크 (그림 1B)에 노른자.
- 바늘 끝은 풋 페달을 눌러 노른자 microinject 중심으로지면. 단일 셀 단계 기증자 배아 (유전자 변형)의 노른자로 H2A-GFP의 1 거리 nL을 주입 또는 H2B-RFP의 mRNA. 배 풋 페달을 가압하여 단일 세포 단계 야생형 호스트 배아 노른자로 표준 또는 MO Ptf1a MO 2 거리 nL 주입한다. 성공적인 주사가에 작은 시각화 할 수 있습니다 노른자에 리터 공간 변형.
- (- 60 배아 50) 위치에 다음 배아를 가져오고 배아의 전체 열이 주입 될 때까지 주입 계속 배아를 포함하는 요리를 이동, 주사 바늘을 제거합니다.
- 모든 배아를 주입 한 후, 30 접시를 올려 - 45 °의 각도와 새로운 깨끗한 페트리 접시에 주입 된 배아를 전송하는 E3 매체 (스퀴즈 병)의 부드러운 스트림을 사용합니다.
- 인큐베이터에서 배아 접시를 놓고 (중 28.5 ° C 또는 다른 온도에서 기증자와 호스트 배아은 동일 연령대에 있는지 확인합니다).
- 250 호스트 배아 - ~ 100 기증자의 배아 나 ~ 200를 얻기 위해 3.2.6 필요 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.
- 1 - 2 HPF, 해부 현미경으로 배아를 확인하고 파스퇴르 전송 피펫으로 2 또는 4 셀 단계에 진출하지 않은 미 수정 난자를 제거합니다.
이식 4. 준비
ontent "> 주 : 이식 상이한 유전 호스트 환경의 영향을 허용 키메라 배아를 생성하는 데 사용되는 것은 등가 WT 공여체 선조 9, 22, 23에서 평가한다.- 기증자 배아 선택
- 3 HPF에서 2에서 기증자의 배아를 확인 - 라벨 신호의 5 배의 배율을 형광 현미경. 580 nm의 여기, 610 nm의 - GFP의 플러스 필터 (460-500 nm의 여기, 510 nm의 긴 패스 방출) 또는 텍사스 레드 필터 ((540)를 사용하여 강한 형광 신호와 배아 잘 발달 (균일 크기의 세포 대칭 세포 질량을)를 선택 장거리 패스로 방출) (그림 1D). 형질 전환 기자는 아직 표현되지 않습니다.
- 아가로 오스 주입 플레이트와 페트리 접시 준비
- 90 mm 직경의 페트리 접시에 E3 매체에 희석 용융 2 % 아가로 오스를 붓고 접시 안전 때까지 냉각하자만지지. 핫 아가 그렇지 않으면 몰드를 변형 할 수있다.
- 아가로 오스 (그림 2D, E)에 쐐기 모양의 돌출부 (6 × 25 / 금형)와 플라스틱 금형을 플로트. 아가로 오스 상에 몰드의 한쪽면을 배치하고, 다른면을 아래로하여 서서히 낮은 기포를 피한다. 금형 이식 바늘에 충분한 여유 공간을 확보하기 위해 접시 또는 쐐기 모양의 돌출부의 가장 깊은 지점의쪽으로 중심으로되어 있는지 확인합니다.
- 아가로 오스가 완전히 RT에서 고화 할 수 있습니다.
- 30 분 동안 4 ° C에서 아가로 오스 접시를 놓고 부드럽게 (집게로, 예를 들어) 한 구석에서 들어 올려 금형을 제거합니다. 건조되는 것을 방지하기 위해 E3 매체와 파라핀 필름 실의 작은 볼륨으로 4 ° C에서 하루 전에 실험 및 저장에 아가로 오스 주입 플레이트를 준비합니다.
- 이전 이식에, E3 매체와 아가로 오스 주입 플레이트를 작성하여 적어도 30 분 동안 28.5 ° C 배양기에 배치합니다. <리> dechorionated 배아, 중 사용 유리 접시 또는 코트 E3에서 2 % 아가로 오스의 얇은 층으로 배양 접시 (90mm 직경)의 내부 플라스틱에 충실하기 때문에. dechorionated 호스트 배아에 대한 한 접시, dechorionated 기증자의 배아에 대해 하나의 요리마다 40 이식 배아에 대해 하나의 요리를 준비합니다. 분사 판 (4.2.4)에 대한 설명으로 저장합니다.
- 미세 유리 팁 파스퇴르 피펫 뽑아 긴 형태의 끝을 잘라 (2 ㎖ 볼륨, 230mm 길이 100 mm 길이 팁) 팁 떨어질 때까지 회전하는 동안 다이아몬드 칼로 긁하여 편안한 기동 (선택 사항)을 허용하는 길이 오프 (그림 1 층).
- 절단은 직선 있는지 확인합니다. 화재 폴란드어 dechorionated 배아 (도 1F)을 손상하지 않도록 부드러운 단부를 생성 분젠 버너의 절단면을 회전시켜 유리 전송 피펫.
참고 : w 너무 오래 화염에 피펫 팁을 유지오프닝에서 아픈 결과는 밀봉 또는 배아 너무 작은되고된다.
- Dechorionate 배아 수동으로 배아를 만지고, 또는 효소 배아 (9)의 많은 수의 동시 빠른 dechorionation을 허용하는 단백질 분해 효소를 사용하지 않고 각 융모막를 오픈 찢어하여이 미세 집게로.
- 50 ㎎ / ㎖의 단백질 분해 효소 혼합물의 100 배 원액을 준비 100 μL 씩을하고 -20 ° C에 저장합니다.
- 10 mL의 E3 매체 (0.5 ㎎ / ㎖ 프로테아제의 최종 농도)에 주식 프로테아제의 100 μL를 추가합니다.
- 두 개의 작은 삼각 유리 비커 (10 mL)을 잘 개발 된 호스트 및 기증자의 배아를 놓고 가능한 한 많은 액체를 제거합니다.
- 각 비커에 0.5 ㎎ / ㎖ 프로테아제 액 5 mL를 넣어 부드럽게 해부 현미경으로 그들을보고하는 동안 배아를 소용돌이. 융모막의 변형 된 부분이 없는지 살펴보십시오.
- 소용돌이를 유지합니다. 즉시 최초의 배아는 융모막 (그림 1D, 별표)에서와 같이, 대부분의 액체를 부어 부드럽게 측면을 따라 E3에 부어 플라스크를 보충하여 단백질 분해 효소 용액을 제거 E3 매체와 세 개의 빠른 헹굼을 수행합니다. 그들이 파열되므로 dechorionated 배아 이식 (섹션 5)이 끝날 때까지 후속 단계 중의 공기와 접촉하는 것을 허용하지 않습니다. 린스 사이의 플라스크에 적절한 솔루션을 둡니다.
- 화재 광택 유리 전송 피펫, 유리 페트리 접시 또는 아가로 오스 (E3 매체의 2 %) 코팅 된 플라스틱 접시에 삼각 비커에서 배아를 전송합니다. 부드럽게 남아 약화 융모막을 제거하기 위해 전송하는 동안 피펫.
- 각 보로 실리케이트 얇은 벽 유리 튜브 (1.0 mm OD에서 두 바늘을 당겨 바늘 풀러를 사용하여/ 마이크로 인젝션 피펫과 같은 설정으로 0.78 mm의 ID / 100 mm 길이).
참고 : 여기에 사용되는 바늘 풀러 예제 설정은 재료 목록에 공급된다. 이 손상 세포 바늘로 빨려 이식 바늘 유리 삽입물이 없다. - 페트리 접시에 미리 저장을 바늘을 당겨 성형 퍼티 또는 접착 테이프의 스트립으로 눌러 고정합니다.
- 이전에 이식을 해부 현미경 초점 바늘의 끝을 가져오고 끝에 열린 바늘을 깰 집게를 사용합니다. 플루트 모양 (그림 2G)을 목표로, 또는 팁 모양 (23)을 생성하는 기술 대체 방법을 사용하는 바늘의 모양을 조정하는 미세 집게를 사용합니다.
포배 이식을 통해 5 키메라 생성
- 이식 설정
주 : 여기에서, 자기 조립 이식 장치가 사용되었다 (도 2A - 위의 미세 주입에 사용 된 것과 같은 바늘 홀더에 이식 바늘을 장착합니다 (그림 2A) (미세 조작기, 단계 3.1.3에 장착).
- microinjections에 사용되는 압력 조절 마이크로 인젝터에 마이크로 피펫 홀더의 끝을 연결하는 주입 튜브를 분리합니다. 이식 장비를 나타내는 1 ML의 주사기 (그림 2A, B)에 연결되어 주입 튜브를 연결합니다.
- 모든 연결이 단단히 파라핀 필름 또는 성형 퍼티를 사용하여 밀봉되어 있는지 확인합니다. 이식 바늘 자체에 약간의 E3 매체가 항상 존재하도록하여 공기와의 접촉에서 배아를 방지합니다. 로와 이식 바늘에서 셀 / 액체를 빨아 수동으로 주사기를 운영하고 있습니다.
- 아가로 오스 금형의 첫 번째 열에에 유리 피펫 기증자의 배아를 전송합니다. 열에 호스트 배아를 전송 2아가로 오스 금형 (그림 2 층)의 6. 할구면이 위를 향하도록 피펫으로 배아를 놓습니다.
- 조심스럽게 기증자 배아의 할구 세포에 이식 바늘을 휴식 천천히 약 20 빨아 - 이식 바늘 (그림 2H)으로 50 세포를. 노른자를 흡입하지 마십시오.
- 미세 조작기를 이용하여 기증자의 배아에서 이식 바늘을 들어 올립니다. 왼쪽에있는 아가로 오스 금형 접시를 이동하고 첫 번째 호스트 배아의 동물 극에 세포 질량의 측면을 통해 이식 바늘 끝을 삽입합니다. 보증금 5 -이 지역은 전뇌 / 눈 필드 (24) (그림 2I)을 발생시킨다 보여주는 운명 매핑에 따라 표면 근처 10 세포. 전체 과정에 걸쳐 E3 매체에 침지 바늘 끝을 유지합니다.
- 기증자의 배아 a를 제거28.5 ° C에서 2 시간 - ND 1 아가 몰드 호스트 배아를 떠난다. 이 영상을 방해하므로 색소 형성을 방지하는 0.003 % N-페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 포함 E3 매체 유리 또는 (2 % 아가로 오스 코팅), 플라스틱 배양 접시를 입력합니다. 화재 광택 유리 피펫 이러한 요리에 호스트 배아를 전송하고 28.5 ° CO / N에 품어.
주의 : PTU를 처리 할 때 장갑을 착용 할 것.
6. 라이브 영상 설치
참고 : 작은 크기와 급속한 발전과 함께 제브라 피쉬의 광학 투명도는 다른 세포와 장기의 생체 내 이미징을위한 핵심 척추 동물 모델이 될 수있다. 영상은 설정 및 매개 변수 다를 것 현미경의 다양한 수행 할 수 있습니다. 다음은 망막 개발 5, 8의 이미지에 적합한 공 초점 영상 설정을 설명합니다.
- 키메라 배아선택
- 24시 - 26 HPF, 형광 해부 범위에서 이식 된 배아가 개발 눈 primordium에서 (라벨 H2A-GFP 또는 H2B-RFP) 이식 기증자 세포를 보여 건강 잘 개발 된 배아를 선택하는 화면.
- 새 접시에 피펫으로 장착 40 배아까지 따로 설정하고 배아를 마취 0.4 ㎎ / ㎖의 tricaine의 methanesulfate (MS222)를 추가합니다.
주의 : MS222 취급시 장갑을 착용 할 것.
- 장착 배아
참고 : 영상이 8 역 또는 직립 현미경 (여기에 설명)을 수행할지 여부에 따라 적절한 장착 접시를 사용합니다.- E3 매체에서 0.4 ㎎ / ㎖ MS222 1 % 낮은 용융 아가로 오스 1 ㎖를 포함하는 1.5 몇 ML의 플라스틱 튜브를 준비하고 40 ° C의 물을 욕조에 용융 유지.
- 플라스틱 전송 피펫으로 5 배아를 빨아과 배아가 중력에 의해 팁에 축적 할 수 있습니다. 전송 피펫을 터치1 % 저 용융 아가 로즈 0.4 ㎎을 함유하는 제조 된 플라스틱 튜브들 중 하나의 표면 상 / ㎖ MS222는 배아 E3 전송의 양을 제한하는 동안 튜브에 들뜸.
- 직립 현미경 및 도립 현미경 이미징을위한 유리 바닥 페트리 접시 (모든 크기)의 이미징을위한 90 mm 직경의 페트리 접시에 마운트 배아. 시각적 이미지 (하나 측) WT 호스트에서 기증자 또는 동일한 실험에서 morphant 호스트 (다른쪽에) 두 반으로 요리를 나눌 영구 마커를 사용합니다.
- 1 ML의 아가 - 0.5 페트리 접시 하나에 아가로 오스 플라스틱 튜브에서 다섯 개의 배아를 전송합니다. 남아 - 단지 작은 방울 (300 μL ~ 200)하도록 전송 피펫을 초과 아가로 오스를 제거합니다. 직립 현미경으로 촬영하는 경우, 페트리 접시 둘레 1cm 내에서 배아를 배치하지 마십시오. 영상에 사용되는 침수 침지 렌즈로 인해 페트리 접시 벽에 그 지역에서 중심을하지 못할 수 있습니다 (그림 3A </ STRONG>).
- 아가로 오스 응고 될 때까지 옆으로 배아를 정렬 (깨진 끝)와 마이크로 로딩 피펫을 사용합니다. 머리의 양쪽에있는 두 개의 눈 (그림 3B) 완전히 중첩 (XY 차원으로 정렬 된) 경우 요리 두 가지 유형의 경우, 태아가 제대로 측면 각도한다. 도립 현미경을 사용을 위해, 커버 슬립 근처 눈 가능한 초점 레벨의 제한 내에서, Z 차원을 통해 촬상 있도록 가능한 한 커버 슬립에 가까운 가압되어야한다.
- 개별 아가로 오스 방울에 한 번에 다섯 배아를 장착 계속합니다. 아가로 오스가 서로 화상 (도 3a) 중에 빠지 및 측면 운동을 방지하기 위해 접시의 측면 상품 가입보다 1 % 저 용융 아가 로스를 사용한다.
- 일단 완전히 응고, E3 매체와 접시 커버 (포함 0.003 % PTU를 0.4 ㎎ / ㎖ MS222)는 28.5 ℃로 데워진.
- 단계 6.2.2에서 설명 된 것과 동일한 방법을 사용하여- 6.2.8 ~ 별도의 접시에 32 ° C (단계 1.2.5)에서 제기 20 유전자 변형 배아를 탑재합니다.
- 영상 매개 변수
참고 : 이미지가 높은 공간 세포 내 해상도를 필요로하지 않는 형광 형질 전환 유전자의 발현을 분석합니다. 그것은 1.5 줌에 W 계획 - 고차 색지움 20X / 1.0 DIC M27 70 mm의 목적을 수행 할 수 있습니다.- (단계 6.2.8 즉, 32 ° C에서 발생) 가속 개발과 함께 ~ 20 유전자 변형 배아에 대한 유전자 강도에 따라 레이저 파워와 노출 시간을 설정합니다.
주 : 유전자 발현의 발현 연구를 위해, 실험 배아가 경과 따라서 설정되어시 형광 없어야 이러한 가속 배아 촬상의 파라미터를 결정하는 중요하다. - 실험 접시를 들어, 배아의 수준을 각각의 배아를 시각화하고 위치를 저장하고 초점을 맞 춥니 다.
- 측면 s의 올바른 장착 각도가 배아 (즉, 선택가능한 한 수평으로 눈)과 강한 심장 박동 (건강의 지표)의 IDE. 주로 (유전자 발현의 물결이 시작) 개발 망막 (그림 3C)의 전방 복부 사분면 (H2A-GFP 또는 H2B-RFP 라벨로 식별) 몇 이식 공여 세포와 배아를 선택합니다.
참고 : - 25분 180 비트 / 제브라 피쉬 배아에서 평균 심장 박동는 120입니다. 120 비트 / 분 - 마취 배아 건강한 하트 비트 (60)의 범위에있을 수있다. 느린 심박동 감소 가능성을 나타낼 수 있고 이들 배아는 연구에서 제외한다.
- 측면 s의 올바른 장착 각도가 배아 (즉, 선택가능한 한 수평으로 눈)과 강한 심장 박동 (건강의 지표)의 IDE. 주로 (유전자 발현의 물결이 시작) 개발 망막 (그림 3C)의 전방 복부 사분면 (H2A-GFP 또는 H2B-RFP 라벨로 식별) 몇 이식 공여 세포와 배아를 선택합니다.
- 최대 15 태아의 망막을 통해 2 μm의 간격으로 광학 부분의 Z-스택을 설정합니다.
참고 : 개별 매개 변수 (노출 시간 및 z 스택의 크기)에 따라 달라집니다 주어진 실험에서 영상화 할 수 배아의 총 수입니다. 선택된 배아의 모든 이미지 1 시간 지점에 걸리는 시간을 쉬해야합니다시점들 사이의 간격보다의 orter. 어떤 깊이 해상도를 희생하여 더 배아 시간 간격 내에서 이미지화 될 수있다. 는 z 스택의 제한은 장착 배아 눈의 외측과 내측 극단적으로 선정되어 30 μm의는 z 방향이 설정 변화 등의 개발 배아의 눈으로, 직립 현미경 설정의 측면에 추가 배아 밤새 성장. 170 μm의 두께 (50 - - 85 이미지 / 눈)이 스택에 100을 발생합니다. - 형질 전환 유전자에 레이저 / 채널 적절한 사용 (0.5 HPF 간격에 해당) 32 ° C에서 이미지마다 24 분 가져 가라.
주 : 배아는 전체 현미경을 포괄 가열 챔버 내에서 전체 시간 경과에 걸쳐 무대에 남아 있습니다. 24 시간 시간 경과 기간 - 실험은 28 ° C에서 수행 할 수 있지만, 따뜻한 온도는 개발 속도와 실험의 관련 시간 포인트가 16에서 이미지화되어 있는지 확인하는 데 사용됩니다. - 영상순차 주사를 사용하여 (GFP : RFP 또는 Vsx1 Atoh7) 및 유전자 - 기증자 라벨 (옵션 H2A-GFP 또는 H2B-RFP)를 나타내는 채널. 분석을 위해, 기술 된 바와 같이 적절한 배아를 선택 만 도너 라벨을 이용한다 (촬상의 처음에 하나의 Z 스택을) 후 유전자 발현을 캡처 전용 채널에서 시간 경과를 수행한다.
주 : 대안 적으로, 적절한 배아를 선택하기 만 도너 라벨을 사용하여 (예를 확인 이식 전방 복부 사분면 셀 것) 및 이미지 만 트랜스 채널 대략 촬상 시간을 절반으로 거의 묘화하고별로 분석 할 수 배아의 개수를 두배 실험 (그림 4).
- (단계 6.2.8 즉, 32 ° C에서 발생) 가속 개발과 함께 ~ 20 유전자 변형 배아에 대한 유전자 강도에 따라 레이저 파워와 노출 시간을 설정합니다.
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Representative Results
이 작품은 야생형 망막 전구 세포가 morphant 호스트 배아 내에서 개발할 때 유전자 발현 타이밍의 변화를 평가하기 위해 실험 프로토콜을 제시한다. 실험 호스트 배아 망막 7, 26의 중간 태어난 수평 및 무 축삭의 interneurons 부족 Ptf1a의 morphants이다. 이러한 표준 제어 모르 주사 하였다 호스트 배아를 제어하기 위해 비교 하였다.
(망막 포함), 중추 신경계의 뉴런에 걸쳐 다양한 형태의 신경 세포가 발생하기 때문에 고도로 보존 후의 운명의 진행은 세포 비 자율 피드백에 의존 순서 27, 28, 29, 30, 31 histogenic이전에 태어난 신경 세포 유형을 축적에서. 이 가설은 중간 태어난 뉴런 유형의 부재 현상 이식 전구 세포 뒷부분 태어난 신경 유형의 발생의 타이밍을 평가하여 시험 하였다. 대조군으로서, 출생 초기 셀의 타이밍이 독립적으로 중간 세포가 생성되는지의 여부에 영향을받지되어야하는 정량 하였다. 선 후반의 발병을 분석하는데 사용 하였다이를 위해, Tg는 (atoh7 : RFP) 또는 (TG atoh7 : gapGFP)의 Tg는 (GFP vsx1)이 동안 라인은 제 태어난 신경절 세포의 신경의 개시를 시각화하는데 사용되었다 태어난 바이폴라 인구. 추가적으로 리포터 유전자를 발현하는 이외에, 이들 배아에서 공여 세포 유전자 WT이다.
3에서 HPF 의해 형광 리포터 단백질을 발현 단세포 단계 배아 결과 노른자위로 (라벨 공여체 세포) 한 거리 nL mRNA를 마이크로 인젝션무대 밝은 기증자 (그림 1)을 선택한다. 배아는 2 HPF (그림 2) 주위에있을 때 이식 설치를 준비합니다. 24 HPF에서 관련 망막 위치에 이식 공여 세포와 배아가 선택되고 오 (그림 3) 그룹을 1 % 낮은 용융 아가로 오스에 장착. 24 시간 - Z 축 스택 및 시간 매개 변수를 설정 배아 위치를 저장 한 후, 타임 랩스 영상 16 행한다. 첫 번째 태어난 신경절 세포의 타이밍은 Atoh7의 발병으로 표시됩니다 RFP 또는 Atoh7 : GFP 유전자도 뚜렷하게 낮은 밝기로 표현된다 gapGFP 형질 전환 유전자 마지막 태어 바이폴라 세대의 타이밍은 Vsx1의 강한 상향 조절에 의해 표시된다 개발 조상의 수준. 이러한 Atoh7으로 첫 번째 유전자 발현의 타이밍 : gapGFP은 영상의 각 평가시기 (흰색 화살촉, 그림 4)에서 각각의 세포에서 발견된다. Atoh7 : gapGFP 및 신경절 세포 분화 occu관계없이 호스트 배아 WT 또는 Ptf1a morphant 부족한 중간 (즉 신경절 세포 생후) 수평 및 무 축삭 세포인지 등가 시점 RS.
제시된 데이터는이 실험 방법은 정상적인 발달 과정을 이해뿐만 아니라 정상 및 질병 상태의 세포 재 프로그래밍 전략의 미래 응용 프로그램뿐만 아니라 관련 의미로, 유전자 발현의시기에 특히 망막 환경의 역할을 평가하는 강력한 도구를 제공하고 있음을 입증 .
그림 1 : 단일 세포 단계 배아의 노른자에 미세 주입은 기증자의 세포를 레이블하고 다른 호스트 환경을 생성하는 데 사용됩니다. A) 배아는 주위의 액체 다시의 대부분 유리 슬라이드의 가장자리에 정렬움직이는. B) 바늘이 노른자와 H2A-GFP 또는 H2B-RFP의 mRNA 중 하나 (기증자) 또는 호스트에 대한 모르 폴리 노 (표준 MO 또는 Ptf1a MO)의 중심에 삽입이 주입된다. C) 주사 바늘은 각각의 모세관의 두 개의 대칭적인 바늘을 발생시키는 바늘 풀러를 사용하여 생성된다. 각 뽑아 바늘은 이후에 쉽게 배아에 삽입 할 수 있습니다 (무디게하지 않음) 날카로운 각도 팁을 제공하는 동안 바늘을 열고 집게와 깨진 팁을 가질 필요가있다. 단일 세포 단계에서 H2B RFP-mRNA를 주입 D) 기증자 배아 가장 밝고 균일 표지 배아 선택할 수있는 스테이지 2.5 HPF 의해 형광 리포터 단백질을 발현 시작한다. E) 약 2.5-3 HPF, 기증자와 호스트 배아는 효소 단백질 분해 효소를 사용하여 dechorionated 있습니다. 삼각 플라스크의 소용돌이가 열려 약화 chorions을 파괴하는 데 필요한 기계적인 힘을 제공하고 dechorionated 배아를 제공합니다중앙에의. 자마자 처음 (별표) 또는 몇 dechorionated 배아으로 관찰 급속하지만 부드러운 세정은 프로테아제 용액이 제거되는 것을 보장한다. dechorionated 배아의 전송을 위해 F)은, 유리 전송 피펫이 사용된다. 이러한 초기 편안하게 끼워 질 때까지 오프 다이아몬드 나이프와 적절한 위치에서 유리 스크래칭함으로써, 사용자에 의해 임의의 길이 였는데 (옵션)을 단축 할 수있다. 이 화재 연마 세포를 손상시킬 수있는 거친 가장자리를 부드럽게하기가 전송 중에 피펫으로 빨려 할 필요가 날카로운 절단 팁을 초래한다. 스케일 바 A, B, D, E = 1 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 이식 설정.
그림 3 : 시간 경과 이미징을위한 설치 배아. A)를 함유하는 다섯 배아 여러 저 용융 아가 방울을 나타낸 페트리 접시 (90mm) 아가로 연결된 각각 분리 개별 방울을 방지하기 위해 기업 네트워크를 형성한다. B) 24 HPF의 배아 옆으로 정렬 응고 아가로 오스에 내장의 높은 전력보기. 최적의 각도는 두 눈은 (Z 축 치수)에서 서로의 상단에 위치한다. 관심있는 유전자에 의존하는 것은 중요한 타이밍 직전까지 연기한다 실장 (예를 들면, 신경절 세포 분화 26 HPF 또는 쌍극 세포 분화의 개시 35 HPF). C) 브라이트과 빨간색 채널의 오버레이를 보여주는 하나의 광학 Z-섹션의 공 초점 이미지 (사용 "선형 닷지 (추가)"를의 레이어 메뉴에서 옵션다르게 표지 된 호스트 환경 내의 몇몇 표지 공여 세포 (적색) 현상과 눈의 래스터 그래픽 에디터). 스케일 바 B = 1mm, 스케일 바 C = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 신경 발생의 타이밍이 다른 호스트 환경으로 이식 형질 전환 기증자의 세포를 시각화 할 수 있습니다. 레이블이없는 WT 호스트에 이식 유전자 변형 배아 : Tg는 (gapGFP atoh7)에서 개발 WT 기증자 세포의 시간 경과 이미지에서 현미경 사진. 형질 전환 유전자 발현 발병 흰색 화살촉에 의해 몇 셀에 표시됩니다. 스케일 바는 10 μm의 =. 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.
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Discussion
효율적 특정 포스트 - 유사 분열 세포 유형 또는 패터닝 된 조직으로 분화하는 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 지시하는 것을 목표로 할 때 넓이가있는 이웃하는 셀은 중요한 세포의 운명 결정 인자의 발현의 타이밍에 영향을 이해하는 것이 필수적이다. 또한, 살아있는 동물의 개발 세포에서 이러한 분자 이벤트를 검사하면 추가로 관련 동적 생체 내에서 이러한 이벤트와 관련된 특정 세포 컨텍스트에 (공간적) 정보를 제공합니다. 이러한 연구는 쉽게 모든 척추 동물 모델에서 달성 될 수 없다.
제시된 프로토콜에서, 의무 제브라 피쉬 배아는 척추 동물의 망막의 아직 매우 조직, 비교적 간단한 3 차원 패턴 화 된 조직으로, 생체 내에서 이러한 문제를 해결하기 위해 척추 동물 모델로 이용된다. 이것은 특히 망막 세포 고갈 가설을 테스트하여 예시유형 유전자 발현시기 망막 전구 세포의 발달 운명에 영향을 준다. 우리는 추가로 예를 들어, 다시 평가 시간에 특정 셀을 추적하는 도너 세포 마커를 이용할 수있다하는 postmitotic 셀이 마지막 분할을 시행하거나,이 셀의 일반적인 동작을 평가하는 시간 형질 전환 유전자의 발현 이전에 (예를 들어, 이동) 다른 환경에서 도입 유전자의 발현 이전에 여러 단계에서. 이러한 연구의 경우, 상대적으로 쉬운의 조합, 이식 및 라이브 영상을 허물고 모르 폴리 노 - 매개 유전자를 포함하는 기술이 제시 수행 할 수 있습니다. 이식 방법의 경우, 프로토콜은 소설, 상대적으로 쉽고 저렴 이식 장비를 소개하고이 운영 설치의 용이성을 보여줍니다.
이 프로토콜은 망막에 한정되지 않는다. 또한 셀의 자율 developm disentangling 필요할 다른 동적 세포 과정의 수를 연구하기 위해 적용될 수있다셀이 아닌 자율적 인 환경의 영향에서 ental 프로그램. 약간의 문제 해결이 필요한 상태 그러나 중요한 단계의 수는 사전 실험을 시작으로 고려되어야한다. 기술의 성공적인 응용 프로그램에 대한 하나의 중요한 전제 조건은 선택의 장기 나 조직이 쉽게 운명의지도를 이용하여 초기 배아에서 대상으로해야한다는 것입니다. 조직 타겟팅의 효율이 이전에 테스트 한 경우,이 제 최적화 표준화되어야한다. 마이크로 인젝션 및 이식 된 배아의 개수는 증가 공여 세포와 배아 충분히 정확하게 통합 및 관련 조직 내에 위치를 얻는 촬상 전에 라이브 스크리닝 될 수있다. 또한,이 프로토콜은 쉽게 두 가지 이유로 더 어려워지고 성장 유충으로 초기 단계 배아 제브라 피쉬, 나중 단계까지 응용 프로그램에 적용 할 수있다. 우선, morpholinos 입수 가능한 넉다운 유전자의 효율이 시간이지나면서 감소 (DE각각의 모르 폴리 노에 보류는) 일반적으로 3 DPF 전에 가장 효율적입니다. 이 문제를 무시하기 위해, 이식 공여자 배아 유전 적 변이체의 사용이 바람직하다. 제브라 피쉬의 성장에 따라 둘째, 유충의 더 깊은 부분은 특히 현미경 목적의 작동 거리가 제한되어 높은 배율 (높은 전력 목표)에서, 공 초점 현미경 이미징 덜 접근하게된다. 따라서, 해당 나이에 관심있는 각각의 조직은 제 1 이미징에의 복종 할 의무를 평가해야합니다.
시간 경과 영상은 반전 또는 수직으로 공 초점 현미경 중 하나를 수행 할 수 있습니다.
직립 현미경의 장점은, 가능한 경우가있다. 필요한 온도에서 사용되는 침지 물질의 증착 (예를 들면, 물 굴절률 물 또는 침지 오일) 역 현미경은 완전 건조 아웃을 초래할 수있다. 이것은 지속적인 모니터링이 필요하며결국 초점이 샘플을 배치하는 위험, 보충. 이것은 부분적으로, 대물 정해진 거리를 낮추기 위해 자동화를 사용하여 침지 물질을 첨가하고 경험하지만, 다시 대물 상승을 피할 수 있고, 재 집속 종종 정지 영상의 다음 시점의 시작 전에 발생해야하는 필요 . 둘째, 우리가 공급 최대 규모의 커버 슬립 바닥 요리는 여전히 직립 현미경을 위해 사용되는 표준 90mm 직경 배양 접시보다 (직경 50mm) 훨씬 작다. 이 반전 된 현미경을 사용하면 장착 될 수 배아의 개수 및 추가 배아 매체 볼륨이 더 제한되어 있다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 시간 경과 파라미터는 일반적으로 묘화 따라서 접시의 크기는 여전히 적합 할 수 배아의 개수의 주요 제한 요소를 구성한다. 매우 높은 배율의 대물 렌즈를 사용하는 경우, 역 현미경 눈과 같은 Z 축 치수에서 큰 깊이를 허용 할 수 있고목적은 얇은 커버 슬립에 의해 분리된다. 직립 현미경 매우 높은 배율을 조합 한 경우, 배아를 덮는 아가 강하는 최대한 얇게 유지되어야한다. 전반적으로 직립 또는 도립 현미경을 사용하여 얻어진 데이터는 이와 동등하다.
고품질 데이터의 생성을 위해 고려되어야 할 추가적인 중요한 단계가있다. 우선, 밝게 표시된 도너의 선택은 시간 경과 영화 시작에서의 눈에 이식 된 세포의 적절한 수의 이식 배아를 수득하기위한 중요한 (수 있지만, 너무 많은)이다. 프로테아제 효소는 프로테아제 dechorionation에서 중요한 단계 배양 빠른이어서 최소로 유지되어야하지만,이 완만 한 배아의 연속 상태에 영향을주지하는 린스. 기증자와 호스트 배아의 나이 매칭은 운명의지도에와 세포의 효율적인 통합에 따라 대상으로 정확한 조직 수 있습니다. 잘 모양의 이식 북동edle은 끝이 이식되는 세포에 기계적 손상을 일으킬하지 작고 많은 피해를 유발하지 않고 호스트 배아에 삽입 할 정도로 날카로운, 그러나 내부 직경이 충분히 큰 것을 보장해야합니다. 장치가 완전히 (특히 접속점에서) 밀봉되지 않은 경우 이식하는 동안, 수동으로 및 이식 바늘에서 E3 매체 세포의 이동을 제어하는 것은 매우 어렵다. 수동 주사기 볼륨을 변경하지 않고 내부 또는 이식 바늘 중 하나가 흐를 때 가장 명백하다. 이 경우 모든 관절을 다시 확인하고 재 밀봉해야합니다. 이것은 실험에 앞서 테스트해야합니다.
마지막으로, 이식 및 시간 경과 설정 사이의 경과 시간 동안, 이식 된 배아는 꼼꼼하게 어떤 건강에 해로운 배아를 청소하는 동안 낮은 밀도로 개발을 허용하는 것이 중요합니다. 이것은 특히 중요 할 때 개발 또는 겐의 타이밍E 발현을 조사하고있다. 임의의 프로세스 (예를 들어, 유전자 발현)의 타이밍을 평가할 때, 제어는 모르 기술 비특이적 부작용을 배제하기 위해 사용되어야한다. 우리의 연구에서, 우리는 모르 폴리 타겟팅하는 특정 유전자의 영향을받지 무관 조직 (예컨대, 근육)의 유전자 발현의 타이밍을 사용한다.
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Acknowledgments
이 작품은 (PO 1440 / 1-1) LP하는 PRJ에 ARC DECRA (DE120101311)에 의해과 독일 연구 협회 (DFG)의 연구 보조금에 의해 지원되었다. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아 주 정부와 호주 연방 정부의 자금 지원됩니다. 우리는 케이 등의 알에 게시 여기에 기술 된 실험을 실시 박사 제레미 잉 치 케이를 인정합니다. 2016 년 우리는 교수 Higashijima에서 형질 전환 어류의 규정에 대한 감사 및 PROFS 감사합니다. H2B-RFP 및 H2A-GFP 구조를 생성하기위한 PCS2 + 플라스미드 박사 윌킨슨의 제공을위한 터너와 렆. 우리는 우리의 동물을 돌보는에 대한 FishCore 시설 직원 (모나 쉬 대학) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted). |
| borosillicate glass capillary tube w/o filament | SDR Scientfic | 30-0035 | alternatives with similar diameter can be used |
| borosillicate glass capillary tube with filament | SDR Scientfic | 30-0038 | alternatives with similar diameter can be used |
| glass petri dishes (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | any glass alternative of any size |
| Injection tube (2 m) | Eppendorf | 524616004 | This connects the needle holder to the syringe during transplantation |
| Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatives with similar shape can be use |
| microneedle holder | Narishige | M-152 | any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used |
| microinjector | Narishige or Eppendorf Femtojet | Pneumatic injector using gas pressure | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | similar alternatives can be used |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904-500ML | |
| needle puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension |
| Parafilm | Interpath | PM996 | any paraffin film |
| Pasteur pipette plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipette glass | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-phenyl thiourea | Sigma | P7629-25G | PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use. |
| Qiaquick gel extraction | Qiagen | 28704 | any alternatives to purify DNA can be used |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | any alternatives to purify RNA can be used |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | any alternatives to transcribe DNA using SP6 |
References
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