Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

Живая отслеживание отдельных WT клеток-предшественников сетчатки в различных генетических фонов позволяет для оценки вклада клеток неавтономных сигнализации во время нейрогенеза. Здесь, сочетание гена нокдаун, химеры поколения с помощью трансплантации эмбрионов и в естественных условиях покадровой конфокальной микроскопии был использован для этой цели.

Abstract

Генетические и технические достоинства сделали данио позвоночное ключевой модель организма , в котором последствия генных манипуляций можно проследить в естественных условиях в течение всего периода быстрого развития. Несколько процессов могут быть изучены в том числе пролиферацию клеток, экспрессию генов, миграции клеток и морфогенеза. Важно отметить, что образование химер с помощью трансплантаций могут быть легко выполнены, что позволяет маркировки мозаики и отслеживание отдельных клеток под воздействием принимающей среды. Например, путем комбинирования функциональных генов манипуляциями хозяина эмбриона (например, посредством морфолино микроинъекции) и живого изображения, эффекты примесной, клеточные сигналы неавтономные (предоставляемые генетически модифицированной среды) , на отдельных пересаженных донорских клеток могут быть оценены. Здесь показано, как этот подход используется для сравнения начало флуоресцентного трансгенной экспрессии как прокси-сервер для синхронизации клеточных судеб determinвания в различных средах генетический хост.

В этой статье мы предлагаем протокол для microinjecting эмбрионов данио , чтобы отметить донорских клеток и вызывать ген нокдаун в принимающих эмбрионов, описание методики трансплантации , используемой для получения химерных эмбрионов, а также протокол для подготовки и проведения в естественных условиях покадровой конфокальной визуализация нескольких эмбрионов. В частности, выполняя функции многопозиционного визуализации имеет решающее значение при сравнении времени событий, таких как начало экспрессии генов. Это требует сбора данных из нескольких контрольных и экспериментальных эмбрионов, обработанных одновременно. Такой подход может быть легко расширена для изучения внешних воздействий в любом органе или ткани выбора доступной для живого изображения, при условии, что трансплантация может быть легко направлены в соответствии с установленными эмбриональных карт судьбы.

Introduction

Способность визуализировать важные процессы развития в в естественных условиях позвоночных животных способствовало делает данио ключевую модель для изучения нормальных и болезненных условий (обзор в 1, 2). В частности, нейронная сетчатка является доступной частью центральной нервной системы. Сетчатка поддается легко выполнять исследования нейрогенеза в связи с его высокоорганизованной, все же относительно простую структуру, и его высоко консервативных типов нейронов через 3 видов позвоночных. Динамика клеточных поведения, таких как пролиферация, выхода из клеточного цикла, асимметричного деления клеток, спецификации судьбы, дифференциации и формирования нейронной электрической схемы можно проследить на протяжении всего процесса ретиногенеза, который завершается в центральной сетчатки данио на 3 г после оплодотворения ( DPF) 4, 5,исх "> 6, 7.

Кроме того, функциональные требования различных генов в каждом из указанных выше этапов могут быть одновременно оценены в данио сетчатки, обеспечивая преимущество по сравнению с другими позвоночными моделями, в которых фенотипы в результате применения методов нокаут гена может быть оценена только после аутопсии фиксированных тканей. В частности, использование трансгенных линий, в которых мы можем визуализировать и контролировать экспрессию флуоресцентных белков как репортер трансгенов в сетчатке, позволяет получить временное разрешение экспрессии гена, лежащего в основе генезиса определенного нейронного типа клеток. В связи с быстрым развитием данио, эти события могут быть визуализированы в течение всего периода развития, тем самым обеспечивая более глубокое понимание важности временной экспрессии генов в связи с приобретением нейрональной идентичности клеток и поведения клеток.

И, наконец, эти подходы могут быть объединены эффективно в данио рерио, при генерации химер через трансплантаций, в результате проникновения в суть двух ключевых аспектов функции гена. Во-первых, исследуя клетки, пересаженные от донора эмбриона, в котором конкретный ген был нокдаун в то время как они развиваются в среде немеченного дикого типа, позволяет получить необходимую информацию о функции гена в клетке-автономным способом. Это приводит к важным более глубокое представление о функции сетчатки глаза факторов судьбы определителем внутри клеток - предшественников , они , как правило , выражается в. Это можно проиллюстрировать на примере рассмотрения развития исхода судьбы клеток - предшественников , которые больше не могут генерировать функциональный белок из этих генов 4, 6, 8, 9. Используя этот подход, мы показали , что многие судьбы определяющих факторов (например, vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) действуют ячейки-autonomously водить специфические нейронные сетчатку судьбы; отсутствие экспрессии генов в первую очередь , приводит к судьбы переключателя, таким образом, что клетки с геном нокдауна сохраняют жизнеспособность путем принятия альтернативной клеточной судьбы 4, 6, 7, 10. Во-вторых, такие химерные эксперименты могут быть использованы для оценки того, как дикого типа клетки-предшественники ведут себя, когда они развиваются в различных генетических средах. Например, путем сравнения развития клеток WT , которые обычно выражают представляющий интерес ген (и репортер трансгена) в WT в сравнении манипуляций среде хоста (например, ген Нокаут / бросовой), которые воздействуют на экспрессию генов и судьбу клетки могут быть оценены , Отсутствие определенных типов нейронов в принимающей среде, например, было показано, что влияние на поведение клеток-предшественников дикого типа в клетке неавтономных образом, чтобы смещать их к дифференцировке в недопредставленного Oг отсутствуют типы нейронные 4, 7, 11, 12. Учитывая , что нейроны сетчатки рождаются в консервативном histogenic порядке по последовательно приуроченной экспрессии специфических нейрональных генов судьбы определитель (экспрессии генов судьбы) (обзор в 13), мы использовали эти методы , чтобы продемонстрировать , как выбор времени экспрессии генов судьба в предшественниках дикого типа влияет, когда такие клетки-предшественники развиваются в сетчатку средах хозяев с индуцированными аберрантных клеточных композиций. Здесь мы опишем эти подходы в качестве доказательства для того, как сочетание относительно стандартных и широко используемых методов позволяет изучение сроков экспрессии генов судьбы в развитии клеток - предшественников ретинальных 8, 9.

Этот протокол описывает экспериментальный подход, включающий покадровой обработки изображений с легкостью вформирование трансплантации в естественных условиях экс развивающегося эмбриона данио следовать отдельному мозаично меченых клеток на протяжении всего периода ретиногенеза развития. Выполняя функциональные манипуляции генов либо в принимающем зародыша, донора эмбриона, оба или ни, можно оценить автономию клеток функции гена. Такой подход может быть широко адаптировано для аналогичных исследовательских вопросов в любой другой системе, для которых отдельные компоненты, описанные здесь, являются подходящими.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с положениями Австралийского Национального исследовательского совета по здравоохранению и медицинским кодекс практики по уходу и использованию животных и были одобрены институциональными комитетами по этике.

1. Приготовление данио рерио

  1. Взрослые рыбы спаривание
    1. Установить взрослую рыбу в виде пар (или две пары) в селекционных надлежащего размера резервуаров вечером перед использованием.
    2. Для того, чтобы держать женщину, отделенную от самца, использовать делитель для того, чтобы рыбу, чтобы увидеть, но не касаются друг друга.
    3. Утром, после включения света, снимите разделители и дайте рыбе спариваться спокойно.
    4. После успешного спаривания поместить взрослую рыбу обратно в свои оригинальные танки.
      Примечание: Узлы сети и донорные штаммы могут быть одинаковыми, например, любые дикого типа (WT) штаммами. Для этого исследования эмбрионов - доноров полученные из трансгенных линий Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) илиТд (vsx1: GFP) , в котором выражение факторов судьба определителем вождения рано или поздно нейронная судьбы могут быть визуализированы, соответственно 14, 15, 16. Для того чтобы сравнить эффекты различной генетической среды, принимающих эмбрионы могут быть конкретные мутанты или морфанты, как описано ниже.
  2. коллекция Эмбрион
    1. Используйте ситечко, чтобы собрать яйца из коробки разведения. Проверить яйца каждые 15 минут, чтобы определить время рождения и обеспечить эмбрионов стадии одноклеточные собираются для последующих шагов.
    2. Промыть эмбрионы с средой E3 (5 мМ NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,4 мМ CaCl 2, 0,9 мМ MgCl 2 и 2% метиленового синего в дистиллированной воде) и поместить их в чашки Петри , содержащие ~ 40 мл E3 17 при максимальной плотности 50 яиц на 90 мм диаметр чашки Петри.
    3. Этикетка чашки Петри с именем штамма, дату и времярождение. С помощью пипетки Пастера передачи для удаления мусора при просмотре эмбрионов под рассекает микроскопом.
    4. Держите эмбрионов на 28,5 ° С до ~ 3 ч (ФВЧ после оплодотворения) для трансплантации, или продолжить микроинъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансплантаций, стремиться к доноров и принимающих эмбрионов на сходных возрастов. Таким образом, используют различные температуры выращивания между 25 - 32 ° C в соответствии с Kimmel и соавт. 18 , чтобы замедлить или ускорить одно сцепление эмбрионов , чтобы соответствовать другим.
    5. Держите ~ 20 из трансгенных эмбрионов-доноров не неинъецированных при 32 ° С с момента сбора до покадровой съемки (24 - 28 ч позже).
      Примечание: Они будут развиваться быстрее, чем экспериментальная когорты и выразит флуоресцентные маркеры ранее. Таким образом, они могут быть использованы для настройки параметров (мощность лазера, усиление) для формирования изображения. В этом конкретном примере, визуализация экспериментальной когорты начинается до трансгенной экспрессии (для оценкиточные сроки этого события).

2. Подготовка к микроинъекции

  1. подготовка Микроинъекция иглы
    1. С помощью иглы съемника, чтобы вытащить иглы из каждого из боросиликатного стекла капиллярной трубки (1,0 мм OD / 0,78 мм ID / 100 мм длиной стеклянного капилляра) в центре, чтобы получить две иглы одинаковой длины. Цель для игл, которые сужаются с длинными валами.
      Примечание: Пример настройки для иглы съемник используется здесь поставляются в Список материалов.
    2. Хранить растянутой иглы в чашке Петри и зафиксировать, нажав их в полосу формовочную замазки или клейкой ленты.
    3. Перед инъекцией довести кончик иглы в фокусе под микроскопом рассекает и использовать пинцет, чтобы взломать иглу на конце. Цель для острого конического наконечника с небольшим отверстием (рис 1C).
    2. <li> подготовка Morpholino для принимающих эмбрионов
    1. Заказать морфолино олигонуклеотиды, специально предназначенные для представляющего интерес гена, а также стандартного управления морфолино или соответствующего рассогласования 5 пар оснований для контроля за процедурных и обработки эффектами.
      Примечание: В данном случае перевод блокирующий Ptf1a морфолино с последовательностью 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 ', что тормозит развитие промежуточных рожденных горизонтальных и амакринных клеток, и стандартный контроль данио морфолино нацеливание бета-глобина мутации интрон человека (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 были использованы.
    2. Подготовьте 1 мМ морфолино исходного раствора (~ 8 - 8,5 нг / нл) и хранить при комнатной температуре.
    3. В день инъекции, нагревать аликвоту (10 мкл) морфолино при 65 ° С в течение 10 мин, на короткое время и место спина на льду, чтобы остыть от 65 ° C (после чего его можно хранить при комнатной температуре во время использования). Thэто будет возмещена любой потенциально агрегации в растворе морфолино, который может снизить эффективность нокдауна.
      1. Для Ptf1a морфолино и эквивалентной стандартной контрольной морфолино, готовят рабочий раствор 6 нг / нл путем разбавления морфолино маточного раствора с дистиллированной водой. Хранить при комнатной температуре.
        Примечание: Используйте 2 нл морфолино на эмбрион в качестве Ptf1a морфолино требует относительно высокой рабочей концентрации 12 нг на эмбрион , как определено ранее 7. Для большинства Morpholinos, 2 - 5 нг на эмбриона является эффективным, поэтому разбавлять запас до 2 - 5 нг / НЛ и вводят 1 Н.Л. в каждого эмбриона.
  2. Подготовка флуоресцентный гистонов фьюжн репортеру конструкции для эмбрионов-доноров маркировки
    Примечание: Для того, чтобы различать / визуализировать донорских клеток в принимающих эмбрионов, существуют разные подходы к этикетке донора эмбриона, в том числе микроинъекции H2A-GFP (при использовании трансгенных доноров скрасные флуоресцентные репортеры) или Н2В-RFP (при использовании трансгенных доноров с зелеными репортерами флуоресцентных) мРНК в желток одноклеточного эмбриона донора стадии.
    1. Линеаризацию по меньшей мере, 1 мкг плазмиды, содержащей ДНК-репортер.
      Примечание: Здесь шт.2 + плазмида (сгенерирован и любезно предоставленный профессором Дэвидом Тернером из Университета Мичигана и профессор Ральф Рапп из биомедицинской центр Мюнхена), содержащий H2A-GFP или H2B-RFP (созданный доктором Кристофером Уилкинсон, Royal Holloway, Лондонский университет) линеаризовали NotI ферментами рестрикции.
    2. Очищают ДНК с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Расшифруйте мРНК с использованием коммерчески доступных наборов с соответствующими полимеразой в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения плазмиды шт.2 +, используют набор SP6 полимеразы.
    4. Очищают мРНК с использованием коммерческих наборов или экстракции фенолом-хлороформом с последующим осаждением изопропанолом в соответствии с инструкцией производителяs. Растворите мРНК в сверхчистой воде (20 - 30 мкл), измеряют концентрацию с помощью спектрофотометра и хранят при -80 ° С.
    5. В день инъекции, готовят рабочий раствор мРНК в стерильной воде с конечной концентрацией 100 нг / мкл, и держать на льду. Убирайте неиспользованную мРНК запас обратно до -80 ° C.

3. Микроинъекция Morpholinos и / или мРНК в одноклеточные стадии Эмбрионы

Примечание: Микроинъекции используются для обозначения всех донорских клеток и для подготовки различных сред - хозяев (контроль и ген нокдаун) и включают инъекции мРНК или морфолино антисмысловых олигонуклеотидов 20, 21.

  1. Загрузка и калибровки инъекционной иглой
    1. Backload инъекционной иглой с 3 мкл морфолино и / или гистона-флуоресцентный раствора мРНК слитого с использованием microloader пипеток.
    2. Встряхнуть Solutиона к кончику инъекционной иглы, пока не осталось пузырьков. Используйте иглы для инъекций с внутренней стеклянной вставкой, что решение будет в первую очередь обращается к кончику под действием капиллярных сил.
    3. Прикрепите инъекционной иглы к держателю, установленный в микроманипулятора (3D ручной микроманипулятора) и обеспечивают герметичное уплотнение внутри корпуса трубки.
    4. Включите питание и газоснабжение давления регулируется microinjector.
    5. Погрузить кончик иглы в каплю минерального масла в чашке (при использовании координатной сетки окуляра) или зависать кончик иглы непосредственно над стрелочным горкой для калибровки объема капли. Измерьте объем впрыска, нажав на педаль и регулировки давления газа и / или продолжительность времени, пока объем впрыска не эквивалентен 1 нл (диаметр 125 мкм).
      Примечание: Преимущество микрометра слайда является то, что измерения не зависят от увеличения используемого в микроскопе, однако при использовании окуляр картографической сетки иновTEAD, падение впрыска и масштаб может быть в фокусе одновременно.
  2. Эмбрион микроинъекции
    1. Поместите предметное стекло в чашку Петри и использовать пипетки передачи на хранение эмбрионов стадии одноклеточных вдоль края слайда. Совместите в одну колонку, используя наконечник пипетки microloader с половиной тонкий кончик отрезанной. Удалите так много жидкости , как это возможно с помощью тонкой пипетки передачи для предотвращения движения во время инъекции (рис 1А).
    2. Опустите иглу в направлении каждого эмбриона, а также проникают через хориона и желток одним плавным ходом (рис 1B).
    3. После того, как кончик иглы находится в центре желтка, microinject нажатием на педаль. Вводят 1 нл H2A-GFP или мРНК Н2В-RFP в желток одноклеточного эмбриона донора стадии (трансгенного). Вводят 2 Н.Л. стандартного МО или Ptf1a МО в желток сценического одноклеточного дикого типа эмбриона хозяина, нажав на педаль дважды. Успешные инъекции могут быть визуализированы с помощью Smal л пространственная деформация в желтке.
    4. Снимите инъекционную иглу, переместить блюдо, содержащее эмбрионов, чтобы принести следующий эмбриона в исходное положение и продолжать инъекции, пока весь столбец эмбрионов не вводили (50 - 60 эмбрионов).
    5. После введения всех эмбрионов, поднимите тарелку вверх на 30 - 45 ° углом и использовать мягкий поток E3 среды (сжимающей бутылки) для переноса эмбрионов, инъецированные в новую чистую чашку Петри.
    6. Поместите эмбрион блюдо в инкубаторе (либо при 28,5 ° C или другой температуре, чтобы гарантировать, что доноров и принимающих эмбрионы в эквивалентных возрастов).
    7. Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.6 по мере необходимости, чтобы получить ~ 100 эмбрионов донора или 200 ~ - 250 принимающих эмбрионов.
    8. На 1 - 2 часов после оплодотворения, проверьте эмбрионов под микроскопом рассекает и удалите неоплодотворенные яйца, которые еще не вышли в 2- или 4-клеточных стадий с передачей пипетки Пастера.

4. Подготовка к трансплантаций

ontent "> Примечание: Трансплантации используются для создания химерных эмбрионов , допускающие воздействия различных средах генетический принимающих быть оценены в пределах эквивалентных клеток - предшественников доноров WT 9, 22, 23.

  1. Выбор эмбрионов донора
    1. В 3-х часов после оплодотворения, проверьте эмбрионов доноров на 2 - 5x увеличением для сигнала маркировки под флуоресцентным микроскопом. Выберите хорошо развитую (симметричную клеточную массу с одинакового размера клеток) эмбрионов с сильным флуоресцентного сигнала с использованием GFP плюс фильтр (460-500 нм возбуждения, 510 нм эмиссия длинный пас) или Texas Red фильтра (540 - 580 нм возбуждения, 610 нм эмиссия длинный пас) (рис 1D). Трансгенные журналисты еще не выражены.
  2. Агарозном пластина инъекции и подготовка чашку Петри
    1. Залить расплавленным 2% агарозы, разбавленного в E3 среды в чашки Петри диаметром 90 мм и дайте ему остыть, пока блюдо не является безопаснымтрогать. Горячий агарозы в противном случае могут деформировать форму.
    2. Поплавок пластиковую форму с клиновидными выступами (6 х 25 / гниль) на агарозы (рис 2D, Е). Избегайте пузырьков воздуха путем размещения на одной стороне литейной формы на агарозе и медленно опустить вниз с другой стороны. Убедитесь, что пресс-форма находится в центре блюдо или в сторону самой глубокой точки клинообразных выступов, чтобы обеспечить достаточное пространство зазора для трансплантации иглы.
    3. Разрешить агарозном полностью затвердеть при комнатной температуре.
    4. Поместите агарозном блюдо при 4 ° С в течение 30 мин и удалить пресс - формы, осторожно поднимая из одного угла (например, пинцетом). Подготовка агарозном инъекций пластин день до эксперимента и хранить при температуре 4 ° С с небольшим объемом E3 уплотнения средней и парафиновой пленки, чтобы предотвратить их от высыхания.
    5. До трансплантации, заполнить агарозном инъекции пластину с E3 среды и поместить в 28,5 ° C инкубаторе в течение не менее 30 мин.
      6. <li> Так как dechorionated эмбрионов придерживаться пластика, либо использовать стеклянные тарелки или пальто внутри чашки Петри (диаметром 90 мм) с тонким слоем 2% агарозы в Е3. Подготовьте одно блюдо для dechorionated эмбрионов хозяев, одно блюдо для dechorionated эмбрионов-доноров и одно блюдо на каждые 40 пересаженных эмбрионов. Хранить, как описано для инъекционного пластины (4.2.4).
  3. Подготовка пипетки передачи
    1. Обрежьте кончик длинной формы мелко вытащил стеклянный наконечник пипетки Пастера (2 мл объема, мм длина 230, длиной 100 мм наконечник) в длину, что позволяет для комфортного маневрирования (по желанию), царапая с алмазным ножом, пока не вращая до кончика падений выкл (рис 1F).
    2. Убедитесь в том, что разрез прямой. Огонь польский стекло пипетки передачи, вращая поверхность среза в горелку для создания гладких концов так, чтобы не повредить dechorionated эмбрионов (рис 1F).
      Примечание: Удерживая наконечник пипетки в пламени слишком долго шзаболел результат в открытии герметизировать вверх или становится слишком маленьким для эмбрионов.
  4. Dechorionating бластула стадии доноров и принимающих эмбрионов
    1. Dechorionate эмбрионы либо вручную , с двумя тонким пинцетом, оторвав открыть каждый хорион , не касаясь эмбрион, или ферментативно с помощью протеаз , чтобы позволить одновременное быстрое dechorionation большого количества зародышей 9.
      1. Приготовьте 100x исходного раствора 50 мг смеси протеазы / мл, составляют 100 мкл аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С.
      2. Добавьте 100 мкл основного протеазу до 10 мл среды E3 (конечная концентрация 0,5 мг / мл протеазы).
      3. Поместите хорошо развитые хозяина и доноров эмбрионов в двух отдельных небольших Эрленмейера стеклянных стаканах (10 мл) и удалить как можно больше жидкости, как это возможно.
      4. Добавить 5 мл раствора 0,5 мг / мл в протеаз к каждому стакану и слегка встряхните эмбрионов, а глядя на них под микроскопом рассекает, Следите за любые признаки деформации хориона.
      5. Keep завихрение. Как только первый эмбрион из хориона (рис 1D, отмеченные звездочкой), выполнять три быстрых цикла полоскания с E3 среды для удаления раствора протеазы, выливая большую часть жидкости и заправки колбу аккуратно вливать Е3 вдоль стороны. Не позволяйте dechorionated эмбрионы войти в контакт с воздухом в любой из последующих шагов до конца трансплантации (раздел 5), так как они лопнут. Оставьте адекватное решение в колбе между полосканий.
      6. С отожженной переноса стеклянной пипетки, передача эмбрионов из стакана Эрленмейера в стеклянные чашки Петри или агарозы (2% в E3 среде) с покрытием пластиковой посуды. Аккуратно пипеткой во время передачи, чтобы удалить оставшиеся ослабленные хориона.
  5. Подготовка Трансплантация иглы
    1. С помощью иглы съемника, чтобы вытащить две иглы из каждой боросиликатного тонкие стенки стеклянной трубки (1,0 мм OD/ 0,78 мм ID / длина 100 мм) с теми же параметрами, как микроинъекции пипеток.
      Примечание: Пример настройки для иглы съемник используется здесь поставляются в списке материалов. Трансплантаций иглы не имеют стеклянную вставку, так как это повреждает клетки засасывается в иглу.
    2. Вытащите иглы заранее, хранить в чашку Петри и зафиксировать, нажав в полосу формовочной замазкой или клейкой лентой.
    3. До трансплантации довести кончик иглы в фокусе под микроскопом рассекает и использовать пинцет, чтобы взломать иглу на конце. Используйте тонкий пинцет , чтобы скорректировать форму иглы , чтобы стремиться к флейте форме (рисунок 2G), или использовать альтернативные методы , описанные для создания формы 23 наконечника.

5. Химера Поколение через бластулы трансплантологии

  1. настройка Трансплантация
    Примечание: В данном случае был использован самособранные трансплантацию аппарат (рис 2А
  2. Установите трансплантацию иглу в том же самом держателе иглы , используемой для микроинъекции выше (монтируется на микроманипулятора, шаг 3.1.3) (рис 2А).
  3. Отсоедините инъекционного трубку, которая связывает конец держателя микропипетки к microinjector давления регулируется используемой для микроинъекций. Приложить инъекционной трубки , который связан с 1 мл шприц (рис 2А, В), которая представляет собой трансплантацию буровой установки.
    1. Убедитесь, что все соединения плотно герметизированы с использованием парафиновой пленки или формовочной замазку. Предотвратить эмбрионов от контакта с воздухом, гарантируя, что всегда есть E3 среда в самой трансплантации иглы. Используйте шприц вручную, чтобы сосать клеток / жидкость в и из трансплантационной иглы.
  • Эмбрион выравнивание
    1. Перенос эмбрионов донора с стеклянной пипеткой в ​​первую колонку агарозы пресс-формы. Передача хозяев эмбрионов в колонках 2до 6 агарозы формы (рис 2F). Поместите эмбрионы с пипеткой так, чтобы сторона бластомеров была обращена вверх.
  • трансплантация
    1. Осторожно отдохнуть трансплантации иглу на бластомеров в клетки донора эмбриона и медленно высосать около 20 - 50 клеток в трансплантационной иглы (рис 2H). Избегайте сосать желток.
    2. Поднимите трансплантацию иглу из эмбриона донора с использованием микроманипулятора. Перемещение агарозном формы блюдо влево и вставьте кончик иглы Пересадка через боковую сторону клеточной массы в животное полюс первого эмбриона хозяина. Депозит 5 - 10 клеток вблизи поверхности в зависимости от судьбы отображения , показывая , что эта область приводит к области переднего мозга / глаз 24 (Рисунок 2i). Держите кончик иглы, погруженного в среде E3 на протяжении всей процедуры.
  • Уход за пересаженных эмбрионов
    1. Удалите доноров эмбрионов Aе покидают хозяина эмбрионов в агарозном форме в течение 1 - 2 ч при 28,5 ° С. Заполните стеклянные или пластиковые (покрытые 2% агарозы) чашки Петри со средой E3, содержащей 0,003% N-фенилтиомочевину (PTU), чтобы предотвратить образование пигмента, так как это будет мешать визуализации. Передача хозяев эмбрионов в эти блюда с огнем полированного стекла пипеткой и инкубировать при температуре 28,5 ° CO / N.
      ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с PTU.

    • 6. Установка Живая съемка

    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой размер и оптическая прозрачность данио в сочетании с быстрым развитием позволили ей стать ключевым модель позвоночное для визуализации в естественных условиях различных клеток и органов. Такая операция может выполняться по различным микроскопов, которые будут отличаться по настройке и параметрам. Ниже описаны подходящие настройки конфокальной микроскопии для визуализации развития сетчатки 5, 8.

    1. химерных эмбрионоввыбор
      1. Через 24 - 26 часов после оплодотворения, экран пересаженные эмбрионы под флуоресцентным объем рассекает, чтобы выбрать здоровые хорошо развитые эмбрионы, которые показывают пересаженных донорских клеток (H2A-GFP или H2B-RFP меченых) в развивающемся зачатке глаза.
      2. Отложенный до 40 эмбрионов для монтажа пипеткой в ​​новую чашку и добавляют 0,4 мг / мл Tricaine methanesulfate (MS222) анестезировать эмбрионов.
        ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с MS222.
    2. Монтаж эмбрионов
      Примечание: Используйте соответствующие монтажные блюдо, в зависимости от того, будет ли выполняться визуализация на перевернутом 8 или вертикального микроскопа (описано здесь).
      1. Приготовьте несколько 1,5 мл пластиковые пробирки, содержащие 1 мл 1% агарозном низкой расплава в 0,4 мг / мл MS222 в E3 среды и поддерживать расплавленный на водяной бане 40 ° C.
      2. Сосать до 5 эмбрионов в пипетки для переноса пластиковой и пусть эмбрионы накапливаются в наконечнике под действием силы тяжести. Нажмите пипетки передачина поверхности одного из подготовленных пластиковые пробирки, содержащие 1% агарозы с низкой текучести расплава и 0,4 мг / мл MS222 позволяет эмбрионы тонуть в трубку во время ограничивая объем передачи E3.
      3. Маунт-эмбрионы в 90 мм диаметром чашки Петри для работы с изображениями в вертикальном микроскопом и со стеклянным дном чашки Петри (любого размера) для работы с изображениями в инвертированным микроскопом. Используйте постоянный маркер, чтобы визуально разделить либо блюдо на две половины доноров изображения в составе хозяев WT (на одной стороне) или morphant хостов (с другой стороны) в том же самом эксперименте.
      4. Перенесите пять эмбрионов из пластиковой трубки агарозном либо чашку Петри с 0,5 - 1 мл агарозы. Удалите излишки агарозы с пипетки передачи таким образом, что только небольшое падение (~ 200 - 300 мкл) остается. Если изображения с вертикальной микроскопии, избегать размещения эмбрионов в 1 см от окружности чашки Петри. Погружением в воду окунать объектив , используемый для формирования изображения не может быть в состоянии быть сосредоточены в этой области из - за тарелки стенки Петри (Фигура 3А </ Сильный>).
      5. Используйте microloading пипетку (с наконечником разорвавшейся), чтобы выровнять эмбрионы в боковом направлении, пока агарозном затвердевает. Для обоих типов блюд, эмбрионы в боковом направлении под углом правильно , если оба глаза по обе стороны от головы полностью перекрываются (выровнен в размерности XY) (фигура 3В). Для перевернутой использования микроскопии, глаз вблизи покровного должен быть выдвинут как можно ближе к покровным, насколько это возможно, чтобы включить визуализацию через Z-измерения в пределах ограничений возможных уровней фокусировки.
      6. Продолжить монтаж пять эмбрионов в то время, в отдельных агарозном капель. Использование более 1% агарозы с низкой расплава , чтобы присоединиться к агарозы капли друг к другу и в сторону тарелки , чтобы предотвратить любое оплывание и боковое перемещение во время формирования изображения (фиг.3А).
      7. После того, как полностью затвердевший, накройте блюдо с E3 среда (содержит 0,003% PTU, 0,4 мг / мл MS222), предварительно нагретую до 28,5 ° С.
      8. Используя тот же подход, описанный в пунктах 6.2.2- 6.2.8, крепление ~ 20 трансгенные эмбрионы, поднятые при 32 ° C (этап 1.2.5) в отдельном блюде.
    3. параметры изображения
      Примечание: Визуализация анализировать возникновение флуоресцентного трансгенов не требует высокого пространственного разрешения внутриклеточный. Она может быть выполнена с целью W План-Apochromat 20X / 1,0 ДИК M27 70 мм при 1,5 трансфокации.
      1. Настройка времени мощности лазера и экспозиции на основе интенсивности трансгенов для ~ 20 трансгенных эмбрионов с ускоренным развитием (т.е. поднятых при 32 ° C, шаг 6.2.8).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения начала экспрессии трансгенов, экспериментальные эмбрионы не проявляют флуоресценции в то время, когда в заданный промежуток времени устанавливается и, таким образом, эти ускоренные эмбрионы имеют решающее значение для определения параметров изображения.
      2. Для экспериментального блюда, визуализировать каждый эмбрион и сохранить позицию и сосредоточиться уровни эмбрионов.
        1. Выберите эмбрионы , которые имеют правильный угол монтажа (т.е. с боковой сязь глаза как по горизонтали, как это возможно) и сильное сердцебиение (показатель здоровья). Выберите эмбрионов с нескольких клеток пересаживали доноров (определенных H2A-GFP или маркировки Н2В-RFP) , в основном в передней брюшной квадранте развивающейся сетчатки (где начинается волна экспрессии генов) (рис 3C).
          Примечание: В эмбрионов данио, средняя HeartRate составляет 120 - 180 ударов / мин 25. В наркозом эмбрионов, здоровый сердцебиение может быть в пределах от 60 - 120 ударов / мин. Более медленное сердцебиение может свидетельствовать о пониженной жизнеспособности и эти эмбрионы должны быть исключены из исследования.
      3. Установите Z-стеки оптических срезов с интервалом 2 мкм через сетчатку до 15 эмбрионов.
        Примечание: Общее количество эмбрионов, которые могут быть отображенных в любом данном эксперименте, будет зависеть от индивидуальных параметров (времени экспозиции и размера Z-стека). Время, затраченное на изображение 1 временной точке для всех выбранных эмбрионов должны быть шorter чем интервал между моментами времени. Жертвуя некоторое разрешение по глубине, больше эмбрионов могут быть отображены в пределах временных интервалов. Пределы Z-стека выбраны в качестве латеральной и медиальной крайностями смонтированном эмбрионов глаза и 30 мкм добавляется к боковой стороне в вертикальном установке микроскопии, как глаза развивающихся эмбрионов в этой настройке сдвига в направлении г, как эмбрионы растут в течение ночи. Это приводит к стеками 100 - 170 мкм толщиной (50 - 85 изображений / глаз).
      4. Делать снимки каждые 24 мин при 32 ° С (эквивалент 0,5 HPF интервалов) с использованием соответствующего лазера / канала к трансгенов.
        Примечание: Эмбрионы остаются на сцене в течение всего времени перерыва в нагретой камере, охватывающей весь микроскоп. Хотя эксперимент может проводиться при температуре 28 ° С, более теплые температуры используются для ускорения разработки и обеспечить, чтобы соответствующие моменты времени в эксперименте изображаются в пределах 16 - 24-часового периода времени покадровой.
      5. Образканалы, представляющие метку донора (H2A-GFP или H2B-ЗП - по желанию) и трансген (Atoh7: ЗП или vsx1: GFP) с использованием последовательного сканирования. Для анализа используют метку донора только выбрать соответствующие зародыши, как описано (один по выбору Z-стек в начале формирования изображения), а затем выполнять времени покадровой только на канале, чтобы захватить экспрессию трансгена.
        Примечание: В качестве альтернативы, используйте ярлык донора только для выбора соответствующих эмбрионов (то есть те , с подтвержденными трансплантированных клеток в передней брюшной квадранте) и изображения только канала трансгенов, примерно сокращение вдвое времени формирования изображений и почти в два раза количество эмбрионов , которые могут быть изображаемых и проанализированы в эксперимент (рисунок 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Эта работа представляет собой экспериментальный протокол для оценки изменений в сроках экспрессии генов, когда клетки-предшественники сетчатки дикого типа развиваются в morphant эмбриона хозяина. Экспериментальные эмбрионы хозяева Ptf1a морфанты, которые испытывают недостаток в промежуточных рожденных горизонтальных и амакринных интернейронов сетчатки 7, 26. Они были по сравнению с контрольными хозяев эмбрионов, которые были введены со стандартным контролем морфолино.

    Поскольку нейрогенез различных типов нейронов по всей центральной нервной системы ( в том числе сетчатки) происходит в высоко консервативны histogenic порядка 27, 28, 29, 30, 31 прогрессирование дальнейшей судьбы может зависеть от клеточных неавтономных обратных связейот накопления ранее рожденных типов нейронов. Эта гипотеза была проверена путем оценки сроков генерации позже рожденных нейронных типов в трансплантированных клеток-предшественников, развивающихся в отсутствие рожденных промежуточных типов нейронов. В качестве контроля, выбор времени раннего рожденных клеток также количественно, которые должны быть неизменными, независимо от того, генерируются промежуточные клетки или нет. С этой целью Tg (atoh7: RFP) или Tg (atoh7: gapGFP) линии были использованы для визуализации начала первого рожденного ганглиозных клеток нейрогенеза в то время как Tg (vsx1: GFP) линия была использована для анализа начало конца родился биполярное населения. Кроме дополнительно экспрессировать репортерные трансгены, донорские клетки из этих эмбрионов являются генетически WT.

    Микроинъекция 1 мРНК Н.Л. (для донорских клеток этикетки) в желтке одноклеточных зародышей стадии приводит к флуоресцентного экспрессии белка репортер на 3 часов после оплодотворения, при которомэтапе яркие доноры выбирают (Рисунок 1). Подготовка установки трансплантации , когда эмбрионы около 2 часов после оплодотворения (Рисунок 2). В 24 часов после оплодотворения, эмбрионы с трансплантированных донорских клеток в соответствующих местах сетчатки глаза выбраны и смонтированы в 1% агарозном низкой расплава в группы из пяти (рисунок 3). После сохранения положения эмбриона, устанавливая Z-стек и временные параметры изображения в заданный промежуток времени проводят в течение 16 - 24 ч. Сроки первых родившихся ганглиозных клеток обозначается началом Atoh7: ЗП или Atoh7: gapGFP трансгенов и времени последнего рожденного биполярного поколения обозначается сильным механизмом усиления экспрессии vsx1: GFP трансгена, который также выражается в отчетливо более низкой яркости уровни в развивающихся клеток-предшественников. Время первого трансгенной экспрессии, такие как Atoh7: gapGFP идентифицируется в отдельных клетках в каждой временной точке из изображений (белые наконечники стрел, рисунок 4). Atoh7: gapGFP и ганглий дифференцировки клеток occuRS в эквивалентных время , независимо от того , хост эмбрион WT или Ptf1a morphant , не имеющие промежуточного продукта (т.е. после рождения ганглиозных клеток) горизонтальных и амакринные клетки.

    Представленные данные показывают, что этот экспериментальный подход представляет собой мощный инструмент для оценки роли конкретных сред сетчатки глаза на экспрессию генов времени, с соответствующими последствиями, а не только для понимания процессов нормального развития, но и для будущих применений стратегий перепрограммирования клеток в нормальных и болезненных состояниях ,

    Рисунок 1
    Рисунок 1: микроинъекции в желтке одноклеточных Stage Эмбрионы используется для обозначения Донорские клетки и для создания различных хост - сред. А) Эмбрионы выровнены по отношению к краю предметного стекла с большей частью жидкости , окружающей репереехал. В) Иглу вводят в центр желтка и либо H2A-GFP , или мРНК , Н2В-ОПП (для донора) или морфолино (MO стандартный или Ptf1a MO для хоста) инъецируют. С) инъекционной иглы генерируется с использованием иглы съемника , который генерирует две симметричные иглы от каждого капилляра. Каждый вытащил иглу впоследствии должен иметь наконечник выломанного щипцов, чтобы открыть иглу, одновременно обеспечивая острый угловой наконечник (не тупой), который может быть легко вставлен в эмбрионах. D) Донорские эмбрионы , инъецированные мРНК Н2В-RFP на стадии одной клетки начинают выражать флуоресцентные белки репортер 2,5 HPF, на каком этапе наиболее яркие и наиболее равномерно меченые эмбрионы могут быть выбраны. E) Около 2,5 - 3 HPF, доноров и принимающих эмбрионы ферментативно dechorionated с помощью протеаз. Вихревой колбы Эрленмейера обеспечивает механическую силу, необходимую для взламывать ослабленные хорионов и приносит dechorionated эмбрионаs в центр. Как только первый (звездочка) или нескольких dechorionated эмбрионов наблюдаются, быстрый, но нежный полоскание гарантирует, что раствор протеазы удаляют. F) Для передачи dechorionated эмбрионов используются пипетки переноса стекла. Они могут быть изначально укороченный (приобретается отдельно) для любой длины, который удобно маневрировал пользователем, царапая стекло в нужном положении с помощью алмазного ножа, пока он не встанет прочь. Это приводит к острым наконечником разреза, который должен быть огневой полировкой, чтобы сгладить любые неровности, которые могут повредить клетки всасывается в пипетку во время передачи. Масштабные бары A, B, D, E = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: Настройка Трансплантация. B) Трубка трансплантация показано , как показывает потенциальные утечки в суставах просто предотвращено с помощью формовочной замазку и парафиновую пленку. C) при большем увеличении соединения между инъекционной трубки и любой подходящей трубки для подключения к шприцу. В то время как любая трубка может быть использована трубка используется здесь, имеет диаметр, который плотно прилегает к 10 мкл кончиком пипетки. Используйте парафиновую пленку для обеспечения герметичности. D) Форма имеет 150 (6 х 25) клинья для генерации треугольные дерн в агарозном инъекции пластины. Е) Примерные размеры каждой формы клина показаны. Измерения компании являются собственностью компании. F)Подготовленные агарозы инжекционные пластины с клиновидными углублений используются с эмбрионами-доноров, добавленных к первому столбцу и столбцы 2 - 6, заполненных принимающих эмбрионов. Трансплантации выполняются через ряд, в результате чего клетки, собранные от одного донора в каждой строке может быть пересажен в 5 эмбрионов хозяина. Внутри каждой формы, клетки до 25 доноров могут быть пересажены в до 125 принимающих эмбрионов. Обратите внимание, форму помещают асимметрично с более глубоким концом клина ближе к краю блюда Петри. Это позволяет Трансплантация иглы с правой стороны, не задев блюдо края Петри. G) Трансплантация игла втягивается с теми же параметрами, что и инъекционной иглой , чтобы привести в длинном коническим наконечником , показанного здесь. Игла должна быть сломана, чтобы генерировать больший внутренний диаметр, который может поглощать клетки, не деформируя их. Чем выше мощность врезке показывает, что кончик иглы трансплантации должны быть расположены под углом, и в идеале иметь форму "флейта", как показанов этом примере. H) Выше вид мощности показывает ориентацию принимающих эмбрионов с клетками в верхней части. Трансплантация игла вводится в клеточную массу бластулы стадии эмбриона хозяина с боков (белые звездочки) и толкнул в будущее глаза, как показано здесь. Донорские клетки можно увидеть в трансплантационной иглы (стрелки) и, таким образом, шероховатой числа клеток, трансплантированных можно контролировать. I) Два примера (левый и правый) , показывая , что сразу после пересадки, эмбрионы с успешно трансплантированных клеток в нужном месте может быть немедленно разобраться с использованием метки донора (например, Н2В-RFP). Флуоресцентный канал был добавлен в использовании "светлого линейного Доджа (добавить)" опцию в меню слоя в растровом графическом редакторе. Шкала бар (для H, I) = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


    Рисунок 3: Эмбрион Крепление для Интерв Imaging. A) Чашка Петри (90 мм) , показывая несколько капель агарозном низкой расплава , содержащего пять эмбрионов каждая из которых соединена с агарозы с образованием твердой сети , чтобы предотвратить отдельные капли отсоединение. Б) Высшая точка зрения мощность 24 HPF эмбрионов выровненных в поперечном направлении и заложенным в затвердевшей агарозы. Для идеального угла, два глаза должны быть расположены на верхней части друг с другом (в Z-измерении). В зависимости от интересующего гена, не монтаж должен быть отложен до только до соответствующего времени (например, 26 HPF для дифференцировки ганглиозных клеток или 35 HPF для начала дифференцировки биполярной клетки). С) конфокальной изображение одного оптического г сечении , показывающий наложение и красного светлого каналов ( с помощью "линейного додж (добавить)" вариант в меню слоя вредактор растровой графики) развивающегося глаза с несколькими меченых клеток-доноров (красный цвет) в пределах иначе немеченого среды хоста. Шкала бар B = 1 мм, масштаб бар C = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: Сроки нейрогенеза могут быть визуализированы в Трансгенные Донорские клетки пересаживают в другой хост Среды. Микрофотографии от покадровой изображения развивающихся донорских клеток WT от Tg (atoh7: gapGFP) трансгенных эмбрионов , пересаженных в немаркированной хозяина WT. Трансгенные выражение начала указывается для нескольких ячеек с помощью белых наконечниками. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию Oе эта цифра.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Понимание того, в какой степени влияют на соседние клетки времени экспрессии решающим клеточных судеб определяющих факторов имеет важное значение при прицеливании эффективно инструктировать эмбриональные или индуцированные мультипотентны стволовых клеток дифференцироваться в определенный тип постмитотическими клеток или даже узорной ткани. Кроме того, изучение этих молекулярных событий в развивающихся клетках живого животного дополнительно обеспечивает соответствующую динамику (временную и пространственную) информацию о конкретных клеточных контекстах , связанных с этими событиями в естественных условиях. Такие исследования не могут быть легко достигнуты во всех позвоночных животных моделях.

    В представленном протоколе, поддающийся данио эмбрионов эксплуатируется в качестве модели позвоночных животных для решения этих вопросов в естественных условиях, в относительно простой, но высоко организованной трехмерной узорной ткани сетчатки позвоночных. Примером этого может служить проверкой гипотезы, что разрушающих конкретной клетки сетчатки глазатип влияет на выбор времени экспрессии генов и судьбу процесс развития клеток-предшественников сетчатки. Мы можем дополнительно использовать маркер донорских клеток для отслеживания конкретных клеток назад во времени , чтобы оценить, например, как задолго до экспрессии трансгена постмитотическими клетка претерпела свое последнее деление, или оценить общее поведение этой клетки (например, миграция) на различных этапах, предшествующих трансгенной экспрессии в различных средах. Для этих исследований, сочетание относительно легко выполнить методы представлены, которые включают в себя морфолино-опосредованную ген нокдаун, трансплантации и живого изображения. Для метода трансплантации, протокол вводит новый, сравнительно легкий и недорогой трансплантация буровой установки и демонстрирует легкость этой операционной настройки.

    Этот протокол не ограничивается сетчатке. Он также может быть применен для изучения ряда различных динамических клеточных процессов, которые требуют распутывания клеточно-автономными РазработСИХИЧЕСКОЕ программы из клеточных неавтономных воздействий окружающей среды. Тем не менее, в то время как требуется немного устранение неисправностей, ряд важных шагов, необходимо принять во внимание перед началом эксперимента. Одной из важных предпосылок для успешного применения метода является то, что орган или ткань выбора должны быть легко направлены в раннем эмбрионе, используя карту судьбы. Если эффективность нацеливания ткани не был ранее протестирован, это должно быть сначала оптимизированы и стандартизированы. Число микроинъекции и пересаженных эмбрионов может быть увеличена и просеивают до живого изображения для получения достаточных эмбрионов с клетками донора правильно интегрированы и расположенные в пределах соответствующей ткани. Кроме того, в то время как этот протокол может быть легко применен к ранних эмбриональных стадий данио, нанесение на более поздних этапах, таких как растущей личинки становятся все более трудным по двум причинам. Во-первых, эффективность гена нокдаун получаемый с Morpholinos уменьшается с течением времени (дев ожидании на каждом морфолино, это, как правило, наиболее эффективны до того 3 DPF). Чтобы изменить эту проблему, использование генетических мутантов в качестве эмбрионов-доноров для трансплантации является предпочтительным. Во-вторых, как данио растет, более глубокие части личинок становятся менее доступными для визуализации с помощью конфокальной микроскопии, особенно при более высоких увеличениях (цели высокой мощности), где рабочее расстояние объектива микроскопа является более ограниченным. Таким образом, каждая ткань интерес в соответствующем возрасте должен быть сначала оценивали по его аменабельности к визуализации.

    Изображений в заданный промежуток времени может быть выполнена либо на перевернутом или вертикальном конфокальной микроскопии.

    Есть целый ряд преимуществ вертикального микроскопа, если таковые имеются. При требуемой температуре, испарение иммерсионной вещества , используемого (например, вода или иммерсионное масло с индексом преломления воды) на инвертированный микроскоп может привести к полному высыхании. Это требует постоянного мониторинга ив конце концов, заправку, с риском размещения образца вне фокуса. Этого можно частично избежать, используя автоматизацию, чтобы снизить объективную определенное расстояние, добавляя иммерсионный вещество и снова поднимая цель, хотя в нашем опыте, рефокусировка часто по-прежнему требуется, что должно произойти до начала следующего момента времени визуализации , Во-вторых, самые большие покровное нижние тарелки мы найденные по-прежнему значительно меньше (50 мм в диаметре), чем стандартного диаметра чашки Петри диаметром 90 мм, используемых для вертикальной микроскопии. Это означает, что количество эмбрионов, которые могут быть установлены и эмбрион объем среды добавлены более ограничены при использовании инвертированных микроскопов. Тем не менее, покадровой параметры, как правило, являются основным ограничивающим фактором для количества эмбрионов, которые могут быть отображены и, следовательно, размер блюдо по-прежнему подходит. При использовании очень высоких целей увеличения изображения, перевернутый микроскопия может позволить большую глубину в Z-измерении, как глаза иЦель разделены лишь тонким покровным. При комбинировании очень высокое увеличение с помощью вертикальной микроскопии, агарозном падение покрытия эмбрион должен быть как можно более тонкими. В целом, данные, полученные с использованием в вертикальном или перевернутом микроскопии аналогичного качества.

    Для генерации высококачественных данных, существуют дополнительные важные шаги, которые необходимо учитывать. Во-первых, выбор ярко меченых доноров имеет решающее значение для получения пересаженных эмбрионов с соответствующим количеством пересаженных клеток в глазу в начале покадровой фильмов (некоторые из них, но не слишком много). Протеаза ферментативный dechorionation является важным шагом и инкубирование в протеазы должны быть сведены к минимуму с последующим быстрым, но осторожном ополаскиватели, чтобы не влиять на последующее здоровье эмбрионов. Возраст соответствие доноров и принимающих эмбрионов позволяет точно ткани ориентации в соответствии с картой судьбы и для эффективной интеграции клеток. Стройную трансплантация пеEdle важно, гарантируя, что наконечник мал и достаточно острым, чтобы вставить в принимающих эмбрионов, не причиняя много вреда, но достаточно большой, во внутреннем диаметре, чтобы не вызвать механическое повреждение клеток пересаживают. Во время трансплантации, если оборудование не полностью герметичны (особенно в местах соединения), то очень трудно вручную управлять движением средой, и клетки E3 в и из трансплантационной иглы. Это наиболее очевидно, когда есть течь либо в или из пересадки иглы без ручного изменения объема шприца. В этом случае все швы должны быть повторно проверены и закупорить. Это должно быть проверено до начала эксперимента.

    И, наконец, в течение времени, прошедшего между трансплантацией и установки в заданный промежуток времени, очень важно, чтобы пересаженные эмбрионы позволили разработать при низкой плотности в то время как тщательно вычищать нездоровые эмбрионы. Это особенно важно, когда время развития или гене выражение расследуется. При оценке сроков любого процесса (например, экспрессии генов), контроль должен быть использован , чтобы исключить неспецифические побочные эффекты технологии морфолино. В нашей работе мы используем времени экспрессии трансгена в несвязанной ткани (например, мышцы) , не зависящей от конкретного гена мишенью морфолино.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Эта работа была поддержана ARC Decra к Prj (DE120101311) и исследовательский грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в LP (PO 1440 / 1-1). Австралийский регенеративной медицины Институт финансируется за счет средств от правительства штата Виктория и австралийского федерального правительства. Мы признаем , Доктор Джереми Ng Chi Kei, который проводил эксперименты , описанные здесь, опубликованной в Kei и др. 2016 г. Мы благодарны за положения трансгенной рыбы от профессора Higashijima и благодарят Profs. Тернер и Рапп для предоставления шт.2 + плазмиды и доктора Уилкинсона для генерации Н2В-RFP и H2A-GFP конструкции. Мы благодарим сотрудников объекта FishCore (Monash University) за заботу о наших животных.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    Биология развития выпуск 121 данио трансплантация химера живая визуализация клеточная неавтономная сетчатка экспрессия гена синхронизации нейрогенез
    <em>В</em> визуализации <em>in vivo</em> трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter