Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

Live spårning av enskilda WT retinala stamceller i olika genetiska bakgrunder gör det möjligt att bedöma bidrag cells non-autonom signalerings under neurogenes. Här, var en kombination av gen knockdown, chimär generation via embryotransplantation och in vivo tidsförlopp konfokal avbildning utnyttjas för detta ändamål.

Abstract

De genetiska och tekniska styrka har gjort zebrafisk ryggradsdjur en viktig modellorganism i vilken konsekvenserna av genen manipulationer kan spåras in vivo under den snabba utvecklingstiden. Flera processer kan studeras inklusive celltillväxt, genuttryck, cellmigration och morfogenes. Viktigt kan generering av chimärer genom transplantationer lätt utföras, så att mosaik märkning och spårning av individuella celler under inverkan av den mottagande miljön. Till exempel, genom att kombinera funktionell gen manipulationer av värd embryot (t.ex., genom morfolino mikroinjektion) och levande avbildning, effekterna av yttre, cell nonautonomous signaler (tillhandahålls av genetiskt modifierade miljön) på enskilda transplanterade donatorceller kan bedömas. Här kan vi visa hur denna metod används för att jämföra uppkomsten av fluorescerande transgen expression som en proxy för tidpunkten för cell öde fastställbaraation i olika genetiska värdmiljöer.

I denna artikel ger vi protokollet för microinjecting zebrafisk embryon för att markera givarceller och orsakar gen knockdown i embryon värd, en beskrivning av transplantationsteknik används för att generera chimära embryon, och protokollet för att förbereda och köra in vivo tidsförlopp konfokala avbildning av multipla embryon. I synnerhet utför multiposition avbildning är avgörande när man jämför tidpunkten för händelser såsom starten av genuttryck. Detta kräver insamling av uppgifter från flera kontroll- och experiment embryon behandlas samtidigt. En sådan strategi kan lätt utvidgas för studier av yttre påverkan i något organ eller vävnad av val tillgängliga för bildåtergivning i realtid, under förutsättning att transplantationer kan riktas lätt enligt fastställda embryonala öde kartor.

Introduction

Förmågan att visualisera viktiga utvecklingsprocesser i ett in vivo ryggradsdjur har bidragit till att göra zebrafisk en viktig modell för att studera normala och sjukdomstillstånd (översikt i ett, två). I synnerhet är neurala näthinnan en tillgänglig del av det centrala nervsystemet. Näthinnan lämpar sig för enkelt utföra studier av neurogenes på grund av dess mycket organiserat, men ändå relativt enkel struktur, och dess starkt konserverade neuron typer över ryggradsdjur 3. Dynamisk av cellulära beteenden såsom proliferation, cellcykel exit, asymmetrisk celldelning, öde specifikation, differentiering och neurala kretsar bildning kan följas genom hela processen av retinogenesis, som är klar i den centrala näthinnan av zebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Dessutom kan de funktionella kraven för olika gener i var och en av de ovan nämnda stegen att samtidigt bedömas i zebrafisk näthinnan, vilket ger en fördel jämfört med andra ryggradsdjur modeller där fenotyper i samband med tillämpningen av genen knockout tekniker kan bara bedömas efter obduktion av fast vävnader. I synnerhet, användningen av transgena linjer i vilka vi kan visualisera och övervaka uttrycket av fluorescerande proteiner som reportertransgener i näthinnan, tillåter oss att erhålla tidsupplösning av genuttryck som ligger bakom uppkomsten av en speciell neuronal celltyp. På grund av den snabba utvecklingen av zebrafisk, kan dessa händelser visualiseras under hela utvecklingsperioden, varigenom djupare insikter i den tidsmässiga betydelsen av genuttryck i förhållande till neuronal cellidentiteten förvärv och cellbeteende.

Slutligen kan dessa metoder kombineras på ett effektivt sätt i zebrafisk med genereringen av chimären via transplantationer, vilket resulterar i en inblick i två viktiga aspekter av geners funktion. För det första att undersöka celler transplanterade från en donator embryo, i vilken en särskild gen slogs ned medan de utvecklas i en omärkt vildtyp miljö, tillåter oss att få relevant information om geners funktion i en cell-självständigt sätt. Detta leder till viktiga insikter om funktionen av retinala öde bestämningsfaktorer inom stamceller som normalt uttrycks i. Detta exemplifieras genom undersökning av utvecklings öde resultatet av stamceller som inte längre kan generera funktionellt protein från dessa gener 4, 6, 8, 9. Med hjälp av denna metod, har vi visat att många öde bestämningsfaktorer (t.ex. Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agera cell-autonomously att köra specifika retinala neuronala öden; bristen på genexpression leder i första hand till ett öde omkopplare, så att cellerna med genen knockdown förbli livskraftig genom att anta en alternativ cellöde 4, 6, 7, 10. För det andra kan sådana chimära experiment kan användas för att bedöma hur vild typ stamceller beter sig när de utvecklar inom olika genetiska miljöer. Till exempel, genom att jämföra utvecklingen av WT-celler som vanligtvis uttrycker en gen av intresse (och reporter transgen) i en WT kontra manipulerad värdmiljön (t.ex. gen knockout / knockdown), de resulterande effekterna på genuttryck och cell öde kan bedömas . Bristen på vissa neuron typer i värdmiljön, till exempel, har visat sig påverka vildtyp gångarbeteende i en cell icke-självständigt sätt, för att pressa dem mot differentiera till det underrepresenterade or saknas neuron typerna 4, 7, 11, 12. Med tanke på att näthinnans nervceller föds i en konserverad histogenic order av sekventiellt tids uttrycket av specifika neuronala öde bestämnings gener (ödet genuttryck) (översikt i 13), använde vi dessa metoder för att visa hur tidpunkten för ödet genuttryck i vild typ stamceller påverkas när sådana stamceller utvecklas i näthinnan värd miljöer med inducerade avvikande cellulära kompositioner. Här, vi beskriva dessa metoder som bevis för hur kombinationen av relativt vanliga och mest använda tekniker gör det möjligt att undersöka tidpunkten för ödet genuttryck i utvecklingen av retinala stamceller 8, 9.

Detta protokoll beskriver en experimentell metod som kombinerar tidsförlopp avbildning med enkel perbildande transplantation i ex vivo utveckla zebrafisk embryo att följa individuella mosaically märkta celler under hela perioden av utvecklings retinogenesis. Genom att utföra funktionell gen manipulationer antingen i värd embryo, givare embryo, båda eller ingen, kan man bedöma cell autonomi av geners funktion. Detta tillvägagångssätt kan anpassas i stor utsträckning på liknande frågeställningar i något annat system för vilka de enskilda komponenterna som beskrivs här är lämpliga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med bestämmelserna i Australian National Health och Medical Research Council uppförandekod för skötsel och användning av djur och godkändes av institutionella etiska kommittéer.

1. Framställning av Zebrafish

  1. Vuxna fiskar parning
    1. Inrätta vuxna fiskar som par (eller två par) i lämplig storlek avelstankar kvällen före användning.
    2. För att hålla den kvinnliga separeras från den manliga, använda en avdelare för att göra det möjligt för fisk att se, men inte vidrör varandra.
    3. På morgonen, efter att ha slagits på ljuset, ta bort avdelare och låt fisken att para ostört.
    4. Efter lyckad parning sätta vuxen fisk tillbaka till sina ursprungliga tankar.
      OBS: värdstammar och donator kan vara samma, t ex några vildtyp (WT) stammar. För denna studie donator embryon från de transgena linjerna Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) ellerTg (vsx1: GFP) i vilken uttrycket av ödet bestämningsfaktorer kör tidigt eller sent neural öde kan visualiseras, respektive 14, 15, 16. För att jämföra effekterna av olika genetiska miljöer, kan embryon värd vara specifika mutanter eller morphants som beskrivs nedan.
  2. embryosamlings
    1. Använd en tesil för att samla ägg från avelsboxen. Kontrollera för ägg var 15 min för att bestämma tiden för födseln och säkerställa encelliga stegs embryona uppsamlas för efterföljande steg.
    2. Skölj embryon med E3-medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2 och 2% metylenblått i destillerat vatten) och placera dem i Petri-skålar innehållande ~ 40 ml E3 17 vid en maximal densitet av 50 ägg per 90 mm i diameter petriskål.
    3. Märka petriskålar med stammen namn, datum och klockslagfödelse. Använd en Pasteur överföringspipett att ta bort eventuellt skräp samtidigt visa embryona under dissekera mikroskop.
    4. Håll embryon vid 28,5 ° C tills ~ 3 h postfertilization (HPF) för transplantation, eller fortsätta med microinjections.
      OBS: För transplantationer, sikta på givar- och värd embryon vid liknande åldrar. Därför utnyttjar olika uppfödnings temperaturer mellan 25-32 ° C enligt Kimmel et al. 18 för att bromsa eller påskynda en koppling av embryon för att matcha den andra.
    5. Håll ~ 20 av de transgena givare embryon icke injicerade vid 32 ° C från tidpunkten för insamlingen tills tidsförlopp imaging (24 - 28 timmar senare).
      OBS: Dessa kommer att utvecklas snabbare än den experimentella kohort och kommer att uttrycka fluorescerande markörer tidigare. De kan således användas för att ställa in parametrar (lasereffekt, Gain) för avbildning. I detta speciella exempel börjar avbildning av den experimentella kohorten före transgenexpression (för att bedömaden exakta tidpunkten för denna händelse).

2. Förberedelse för mikroinjektion

  1. Mikroinjektion nål beredning
    1. Använd en nål avdragare för att dra nålar från varje borosilikatglas kapillärrör (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lång glaskapillär) i mitten för att erhålla två nålar av samma längd. Sikta på nålar som avsmalnar med långa skaft.
      OBS: Exempel på inställningar för nålen avdragare används här levereras i Materiallista.
    2. Förvara drog nålar i en petriskål och säkra genom att trycka in dem i en remsa av form kitt eller tejp.
    3. Före injektionen föra spetsen av nålen i fokus under ett dissektionsmikroskop och använda pincett för att bryta upp nålen vid spetsen. Sikta på en skarp konisk spets med en liten öppning (Figur 1C).
    2. <li> morfolino förberedelse för embryon värd
    1. För morpholino oligonukleotider särskilt utformade för genen av intresse, liksom en standardkontroll morfolino eller en lämplig 5 baspar mismatch att kontrollera för procedur och hanterings effekter.
      OBS: Här, en översättning blockerande Ptf1a morfolino med sekvensen 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'som hämmar utvecklingen av de mellanliggande födda horisontella och amakrina celler, och en standardkontroll zebrafisk morfolino targeting humant beta-globin intron mutation (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 användes.
    2. Bered en 1 mM morfolino stamlösning (~ 8-8,5 ng / NL) och förvara vid rumstemperatur.
    3. På dagen för injektion, värma en alikvot (10 mikroliter) av morfolino vid 65 ° C under 10 min, snurra kort och placera på is för att kyla ner från 65 ° C (efter vilken den kan förvaras i rumstemperatur under användning). thär att vända potentiellt aggregation inom morpholino lösning, som kan minska effektiviteten av knockdown.
      1. För Ptf1a morfolino och likvärdig standard kontroll morpholino, förbereder en fungerande lösning av 6 ng / NL genom att späda morpholino stamlösningen med destillerat vatten. Förvara vid RT.
        OBS: Använd två nL av morpholino per embryo som Ptf1a morfolino kräver en relativt hög arbetskoncentration av 12 ng per embryo som tidigare 7 fastställts. För de flesta morpholinos, 2 - är 5 ng per embryo effektiv, så späd beståndet till 2 - 5 ng / NL och injicera en nL i varje embryo.
  2. Förbereda fluorescerande histon fusions reporter konstruktioner för märkning givare embryon
    OBS: För att skilja / visualisera donatorceller i värd embryon, det finns olika sätt att märka donator embryot, inklusive mikroinjektion av H2A-GFP (om du använder transgena givare medröd fluorescerande reportrar) eller H2B-RFP (om du använder transgena givare med gröna fluorescerande reportrar) mRNA i äggulan av encelliga stadiet donator embryo.
    1. Linjärisera minst 1 | j, g plasmid innehållande reporter DNA.
      OBS: Här pCS2 + plasmid (genereras och vänligt från professor David Turner från University of Michigan och professor Ralph Rupp från Biomedicinskt Centrum München) innehållande H2A-GFP eller H2B-RFP (genereras av Dr Christopher Wilkinson, Royal Holloway, University of London) linjäriserades med NotI restriktionsenzymdigerering.
    2. Rena DNA med användning av kommersiellt tillgängliga kit enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Transkribera mRNA med användning av kommersiellt tillgängliga kit med lämplig polymeras enligt tillverkarens instruktioner. För pCS2 + plasmiden, använda en SP6-polymeras kit.
    4. Rena mRNA med användning av kommersiella kit eller fenol-kloroform-extraktion följt av isopropanol utfällning som per tillverkarens anvisningars. Späd mRNA i ultrarent vatten (20-30 mikroliter), mäta koncentrationen med en spektrofotometer och förvara vid -80 ° C.
    5. På dagen för injektionen, förbereda en arbetslösning av mRNA i sterilt vatten med en slutlig koncentration av 100 ng / mikroliter och hålla på is. Oanvänt mRNA lager tillbaka till -80 ° C.

3. Mikroinjektion av Morpholinos och / eller mRNA till enkelcellstadiet Embryon

OBS: microinjections används för att markera alla givarceller och förbereda olika värdmiljöer (kontroll och gen knockdown) och innebär injektioner av mRNA eller morfolino antisensoligonukleotider 20, 21.

  1. Lastning och kalibrering av injektionsnålen
    1. Skjuta upp den injektionsnålen med 3 mikroliter av den morfolino och / eller histon-fluorescent fusion mRNA lösning med hjälp av micro pipettspetsar.
    2. Skaka solution mot injektions nålspetsen tills det inte finns några bubblor kvar. Använd injektionsnålar med en inre glasinsats så att lösningen i första hand kommer att dras till spetsen genom kapillärverkan.
    3. Fäst injektionsnål till en hållare monterad i en mikromanipulator (3D manuell mikromanipulator) och säkerställa en tät förslutning inuti röret huset.
    4. Slå på strömmen och gastillförseln till tryckreglerad microinjector.
    5. Sänk nålspetsen i en droppe mineralolja i en skål (om du använder en graticule okular) eller sväva nålspetsen direkt över en mikrometerskalor att kalibrera droppvolymen. Mät injektionsvolymen genom att trycka på fotpedalen och justera gastrycket och / eller varaktigheten tiden tills injektionsvolym är ekvivalent med 1 nL (125 | j, m diameter).
      OBS: Fördelen med mikrometer bilden är att mätningarna är oberoende av förstoringen som används vid mikroskop, men genom att använda okularfokalplattan instead kan injektionen släpp och skala vara i fokus samtidigt.
  2. embryomikroinjektion
    1. Placera ett objektglas i en petriskål och använda en överföringspipett att deponera encelliga stegsembryon längs glidkanten. Rikta in en enda kolonn med användning av en micro pipettspets med hälften av den tunna spetsen avskuren. Ta bort så mycket vätska som möjligt med en fin överföringspipett för att förhindra rörelser under injektioner (Figur 1A).
    2. Sänka nålen mot varje embryo, och penetrera chorion och äggula i en jämn stroke (Figur 1B).
    3. När nålspetsen är centrerad i äggulan, mikroinjicera genom att trycka på fotpedalen. Injicera en nL av H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA till äggulan för ett enkelcellstadiet donator embryo (transgen). Injicera 2 nL av standard MO eller Ptf1a MO in i äggulan för ett enkelcellstadiet vildtyp värd embryo genom att trycka ned fotpedalen två gånger. Framgångsrika injektioner kan visualiseras genom den smal l rumslig deformation i äggula.
    4. Ta bort injektionsnålen, flytta skålen som innehåller embryon för att få nästa embryot på plats och fortsätta att injicera tills hela kolumnen av embryon injiceras (50 - 60 embryon).
    5. Efter injicering alla embryon, lyft upp skålen i 30-45 ° vinkel och använda en mild ström av E3 medium (klämflaska) för att överföra den injicerade embryon till en ny ren petriskål.
    6. Placera embryo skålen i en inkubator (antingen vid 28,5 ° C eller annan temperatur för att säkerställa att givar- och värd embryon är på motsvarande åldrar).
    7. Upprepa steg 3.2.1 - 3.2.6 som krävs för att uppnå ~ 100 givare embryon eller ~ 200 - 250 värd embryon.
    8. Vid 1-2 HPF, kontrollera embryon under ett dissektionsmikroskop och ta bort eventuella obefruktade ägg som inte har avancerat till 2- eller 4-cells steg med en Pasteur pipett.

4. Förberedelser för transplantation

INNEHÅLL "> OBS: Transplantationer används för att generera chimära embryon gör det möjligt för effekterna av olika genetiska värdmiljöer som ska bedömas inom motsvarande WT donatorstamfäder 9, 22, 23.

  1. Donator embryo val
    1. Vid tre HPF, kontrollera givar embryon vid 2 - 5 gångers förstoring för märkning signal under ett fluorescensmikroskop. Välj väl utvecklad (symmetrisk cellmassa med lika stora celler) embryon med en stark fluorescerande signal med hjälp av GFP plus filter (460-500 nm excitation, 510 nm lång passning emission) eller Texas Red filter (540-580 nm excitation, 610 nm lång passning emission) (Figur 1D). De transgena reportrar ännu inte uttrycks.
  2. Agarose injektion plattan och petriskål förberedelse
    1. Häll smält 2% agaros utspädd i E3-medium i en 90 mm diameter petriskål och låt den svalna tills skålen är säkeratt röra. Varm agaros kan annars deformera formen.
    2. Float en plastform med kilformade utsprången (6 x 25 / mögel) på agaros (figur 2D, E). Undvika luftbubblor genom att placera en sida av formen på agaros och långsamt lägre ner på andra sidan. Se till formen är centrerad i skålen eller i riktning mot den sida av den djupaste punkten av de kilformade utsprång för att tillåta tillräckligt med fritt utrymme för transplantation nålen.
    3. Tillåta agarosen att helt stelna vid RT.
    4. Placera agaros skålen vid 4 ° C under 30 minuter och ta bort formarna genom att försiktigt lyfta från ett hörn (t.ex. med pincett). Förbered agarosen injektion plattor dagen före experimentet och förvara vid 4 ° C med en liten volym av E3 medium och paraffin film tätning för att förhindra dem från uttorkning.
    5. Före transplantation, fylla agarosen injektion plattan med E3 medium och placera i en 28,5 ° C inkubator under minst 30 minuter.
      6. <li> Eftersom dechorionated embryon fastnar på plast, antingen använda glas rätter eller belägga insidan av petriskålar (90 mm diameter) med ett tunt lager av 2% agaros i E3. Förbered en maträtt för dechorionated värd embryon, en maträtt för dechorionated givare embryon och en maträtt för varje 40 transplanterade embryon. Lagra såsom beskrivits för injektionsplattan (4.2.4).
  3. Överföringspipett förberedelse
    1. Skär spetsen av en lång form fint drog glas spets pasteurpipett (2 ml volym, 230 mm längd, 100 mm lång spets) och en längd som gör det möjligt för bekväm manövrering (tillval) genom att skrapa med en diamant kniv samtidigt rotera tills spetsen faller rabatt (figur 1F).
    2. Se till att snittet är rakt. Brand polera glas överföringspipett genom att rotera den skurna ytan i en bunsenbrännare för att generera jämna ändar för att inte skada de dechorionated embryon (figur 1F).
      OBS: Att hålla pipettspetsen i flamman för länge wsjuk resultat i öppningen förseglas upp eller blir för liten för embryon.
  4. Dechorionating blastula skede givar- och värd embryon
    1. Dechorionate embryon antingen manuellt med två fin pincett genom att riva upp varje chorion utan att röra embryot, eller enzymatiskt med användning av proteas för att möjliggöra samtidig snabb dechorionation av ett stort antal embryon 9.
      1. Förbered en 100 x stamlösning av 50 mg / ml proteas blandning, göra 100 mikroliter alikvoter och förvara dem vid -20 ° C.
      2. Tillsätt 100 | il av det bestånd proteas till 10 ml E3-medium (slutkoncentration av 0,5 mg / ml proteas).
      3. Placera väl utvecklade värd och donator embryon i två separata små Erlenmeyer glasbägare (10 ml) och ta bort så mycket vätska som möjligt.
      4. Tillsätt 5 ml av 0,5 mg / ml proteas lösning till varje bägare och snurra försiktigt embryona samtidigt tittar på dem under ett dissektionsmikroskop. Titta efter tecken på deformation av chorion.
      5. Håll virvlande. Så snart den första embryot är ur chorion (figur 1D, asterisker), utföra tre snabba sköljningar med E3 medium för att avlägsna proteaset lösning genom att hälla ut det mesta av vätskan och påfyllning kolven genom att försiktigt hälla i E3 längs sidan. Tillåter inte dechorionated embryon för att komma i kontakt med luften i något av de efterföljande stegen fram till slutet av transplantation (avsnitt 5), eftersom de kommer att brista. Lämna lämplig lösning i kolven mellan sköljningar.
      6. Med elden polerat glas överföringspipett, överföra embryon från Erlenmeyer bägaren i glaspetriskålar eller agaros (2% i E3 medium) belagda plastskålar. pipett försiktigt under överföringen för att avlägsna eventuella kvarvarande försvagats chorion.
  5. Transplantation nål beredning
    1. Använd en nål avdragare för att dra två nålar från varje borosilikat tunnväggiga glasrör (1,0 mm OD/ 0,78 mm ID / 100 mm längd) med samma inställningar som mikroinjektion pipetter.
      OBS: Exempel på inställningar för nålen avdragare används här levereras i materiallistan. Transplantations nålar inte har en glasinsats, eftersom detta skadar cellerna sugs in nålen.
    2. Dra nålar i förväg, förvara i en petriskål och säkra genom att trycka in en remsa av form kitt eller tejp.
    3. Före transplantation bringa spetsen på nålen i fokus under ett dissektionsmikroskop och använda pincett för att bryta upp nålen vid spetsen. Använd fin pincett för att justera formen på nålen för att sträva efter en flöjt-form (figur 2G), eller använda alternativa metoder som beskrivs för att generera spetsen formen 23.

5. Chimera Generation via blastula Transplantation

  1. transplantation inställnings
    OBS: Här var en självmonterad transplantation apparat som används (Figur 2A
  2. Montera transplantation nålen i samma nålhållare som används för mikroinjektion ovan (monterad på mikromanipulator, steg 3.1.3) (Figur 2A).
  3. Koppla bort injicera slangen som förbinder slutet av mikropipett innehavaren till det tryck som regleras microinjector används för microinjections. Fästa injektions slangen som är kopplad till en 1 ml spruta (figur 2A, B), som representerar den transplantation riggen.
    1. Se till att alla anslutningar är tätt förslutna med hjälp av paraffin film eller formbar kitt. Förhindra embryon från att komma i kontakt med luft genom att se till att det alltid finns någon E3 medium i transplantations själva nålen. Manövrera sprutan manuellt för att suga celler / vätska in i och ut ur transplantations nålen.
  • embryo uppriktning
    1. Överföra donator embryon med glaspipett in i den första kolumnen i agaros mögel. Överför värd embryon i kolumner 2till 6 av agarosen formen (Figur 2F). Placera embryon med pipetten så att blastomere sidan vänd uppåt.
  • Transplantation
    1. Vila försiktigt transplantation nålen på en blastomere cell i en donator embryo och sakta suga upp ca 20-50 celler i transplantations nål (Figur 2H). Undvik att suga upp äggulan.
    2. Lyft transplantation nålen från givaren embryo med hjälp av mikromanipulator. Flytta agarosen formen skålen till vänster och för in transplantation nålspetsen genom sidan av cellmassan i djuret pol av den första värd embryot. Insättning 5 - 10 celler i närheten av ytan enligt ödet kartläggning visar att detta område ger upphov till framhjärnan / ögon fält 24 (fig 2i). Håll kanylspetsen nedsänkt i E3-medium under hela förfarandet.
  • Vård av transplanterade embryon
    1. Ta bort givaren embryon ennd lämna värd embryon i agarosen formen under 1-2 h vid 28,5 ° C. Fyll glas eller plast (belagd med 2% -ig) petriskålar med E3-medium innehållande 0,003% N-fenyltiourea (PTU) för att förhindra pigmentbildning eftersom detta kommer att störa avbildning. Överför värd embryon i dessa rätter med elden polerat glaspipett och inkubera vid 28,5 ° CO / N.
      VARNING: Använd handskar vid hantering av PTU.

    • 6. Live avbildning Setup

    OBS: Den lilla storleken och optisk transparens av zebrafisk i kombination med den snabba utvecklingen har gjort det möjligt att bli en viktig ryggradsdjur modell för in vivo avbildning av olika celler och organ. Avbildning kan utföras på en mängd olika mikroskop, som kommer att skilja sig åt i setup och parametrar. Nedan beskrivs en lämplig konfokal avbildning setup för avbildning av retinal utveckling 5, 8.

    1. chimärt embryourval
      1. Vid 24 - 26 HPF, screena transplanterade embryon under ett fluorescerande dissekera utrymme att välja hälsosamma väl utvecklade embryon som visar de transplanterade givarceller (H2A-GFP eller H2B-RFP märkta) i utvecklings ögat primordium.
      2. Ställ åt sidan upp till 40 embryon för montering genom att pipettera i en ny maträtt och tillsätt 0,4 mg / ml tricaine methanesulfate (MS222) att söva embryona.
        VARNING: Använd skyddshandskar vid hantering MS222.
    2. monterings embryon
      OBS: Använd lämplig monteringsskål, beroende på om avbildning kommer att utföras på en inverterad 8 eller upprätt mikroskop (som beskrivs här).
      1. Förbered ett par 1,5 ml plaströr som innehåller en ml 1% låg smältpunkt agaros i 0,4 mg / ml MS222 i E3 medium och hålla smält i en 40 ° C vattenbad.
      2. Suga upp 5 embryon i en plast överföringspipett och låt embryona ansamlas i spetsen av tyngdkraften. Tryck överföringspipettenpå ytan av en av de framställda plaströr innehållande 1% låg-smält agaros och 0,4 mg / ml MS222 tillåta embryona att sjunka in i röret samtidigt som man begränsar mängden av E3 överföring.
      3. Montera embryon i en 90 mm diameter petriskål för avbildning i upprätt mikroskop och glas botten petriskål (vilken storlek som helst) för avbildning i inverterat mikroskop. Använd en permanent markör för att visuellt dela antingen skålen i två halvor för bildgivare i WT värdar (på ena sidan) eller morphant värdar (andra sidan) i samma experiment.
      4. Överföra de fem embryon från agarosen plaströr till antingen petriskål med 0,5-1 ml agaros. Ta bort överflödigt agaros med en överföringspipett så att endast en liten droppe (~ 200-300 mikroliter) kvarstår. Om avbildning med upprätt mikroskopi, undvika att placera embryon inom 1 cm petriskålen omkrets. Vattnet nedsänkning doppa lins som används för avbildning kan kanske inte att vara centrerad i detta område på grund av den petriskål väggen (figur 3A </ Strong>).
      5. Använd en microloading pipett (med spetsen avbrutna) för att rikta in embryon i sidled tills agarosen stelnar. För båda typerna av rätter är embryona korrekt vinklad i sidled om de två ögonen på vardera sidan av huvudet är helt överlappande (i linje XY dimension) (Figur 3B). För inverterad mikroskopi användning måste ögat nära täck skjutas så nära täck som möjligt, för att möjliggöra avbildning genom z-dimensionen inom ramarna för de möjliga fokusnivåerna.
      6. Fortsätt att montera fem embryon i taget i enskilda agaros droppar. Använda mer 1% låg smält agaros att ansluta sig till agarosen sjunker till varandra och den sida av skålen för att förhindra varje rubbning och sidorörelse under avbildning (figur 3A).
      7. När helt stelnad, täcka skålen med E3-medium (innehållande 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) förvärmd till 28,5 ° C.
      8. Genom att använda samma metod som beskrivs i steg 6.2.2- 6.2.8, montera ~ 20 transgena embryon upp vid 32 ° C (steg 1.2.5) i en separat skål.
    3. avbildningsparametrar
      OBS: Imaging för att analysera uppkomsten av fluorescerande transgener inte kräver hög rumslig intracellulär upplösning. Det kan ske med en W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70 mm mål på 1,5 zoom.
      1. Ställ upp lasereffekt och exponeringstiden baserad på transgen intensiteten för ~ 20 transgena embryon med accelererad utveckling (dvs. upp vid 32 ° C, steg 6.2.8).
        OBS: För studier av uppkomsten av transgen uttryck, de experimentella embryon visar ingen fluorescens vid den tidpunkt då tidsförlopp ställs in och därmed är dessa accelererade embryon är avgörande för att bestämma parametrarna för avbildning.
      2. För den experimentella skålen, visualisera varje embryo och spara ställning och fokusera nivåer av embryon.
        1. Välj embryon som har rätt monteringsvinkel (dvs med sido side i ögat så horisontell som möjligt) och en stark hjärtslag (en indikator på hälsa). Välj embryon med några transplanterade givarceller (identifierade genom H2A-GFP eller H2B-RFP märkning) i första hand i den främre ventrala kvadranten av utvecklings näthinnan (där den våg av genuttryck börjar) (Figur 3C).
          OBS: I zebrafiskembryon, är den genomsnittliga hjärtslag 120 - 180 slag / minut 25. På anestetiserad embryon, kan en frisk hjärtslag vara i området av 60 - 120 slag / minut. Långsammare hjärtslag kan vara ett tecken på minskad livsduglighet och dessa embryon bör uteslutas från studien.
      3. Ställa z-staplar av optiska sektioner vid 2 | j, m intervall genom näthinnan på upp till 15 embryon.
        OBS: Det totala antalet embryon som kan avbildas i en viss experiment kommer att bero på individuella parametrar (exponeringstid och z-stack storlek). Den tid det tar för att avbilda en tidspunkt för alla de valda embryon måste vara shÖrter än intervallet mellan tidpunkterna. Genom att offra en del djup upplösning kan fler embryon avbildas inom tidsintervallen. Gränserna för z-stack väljs som laterala och mediala extrema den monterade embryon ögat och 30 um läggs till den laterala sidan i upprätt mikroskopi setup, som ögon utvecklings embryon i denna inställning förskjutning i z-riktningen som embryona växa över natten. Detta resulterar i staplar 100-170 um tjocklek (50 - 85 bilder / öga).
      4. Ta bilder varje 24 minuter vid 32 ° C (motsvarande 0,5 HPF intervall) med hjälp av laser / kanal lämplig för transgenen.
        OBS: Embryona kvar på scenen under hela tidsförlopp i en uppvärmd kammare omfattar hela mikroskop. Medan experimentet kan utföras vid 28 ° C, är varmare temperaturer för att påskynda utvecklingen och se till att de relevanta tidpunkter i experimentet avbildas inom 16-24 h time-lapse perioden.
      5. Bildkanaler som representerar givar etikett (H2A-GFP eller H2B-RFP - tillval) och transgen (Atoh7: RFP eller Vsx1: GFP) med hjälp av sekventiell skanning. För analys, utnyttjar endast donator etikett att välja lämpliga embryon enligt beskrivning (ta en z-stack i början av avbildnings) och utför sedan tidsförlopp endast på kanalen för att fånga transgenexpression.
        OBS: Du kan även använda endast givaren etikett för att välja lämpliga embryon (dvs. de med bekräftade transplanterade celler i främre ventrala kvadranten) och bilden bara transgen kanalen, ungefär halvera imaging tid och nästan fördubbla antalet embryon som kan avbildas och analyseras per experiment (Figur 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Detta arbete presenterar ett experimentellt protokoll för att bedöma förändringar i genuttryck timing när vildtyp retinala stamceller utvecklas inom en morphant värd embryo. De experimentella värd embryon är Ptf1a morphants, som saknar de mellanliggande födda horisontella och amakrina interneuronen av näthinnan 7, 26. Dessa har i jämförelse med kontroll värd embryon som injicerades med en standardkontroll morfolino.

    Eftersom neurogenes av olika typer av nervceller i hela centrala nervsystemet (inklusive näthinnan) sker i en mycket konserverad histogenic ordning 27, 28, 29, 30, 31 utvecklingen av den efterföljande öde kan bero på cell icke-självständiga kopplingaransamlas tidigare födda neuron typer. Denna hypotes testades genom att bedöma tidpunkten för generering av senare födda neurala typer i transplanterade stamceller utvecklas i frånvaro av mellanliggande födda neuron typer. Som en kontroll, var tidpunkten för tidigt födda celler även kvantifieras, som bör vara opåverkad oberoende av om de mellanliggande cellerna genereras eller inte. För detta ändamål, Tg (atoh7: RFP) eller Tg (atoh7: gapGFP) linjer användes för att visualisera uppkomsten av den första född gangliecell neurogenes medan Tg (vsx1: GFP) linjen användes för att analysera uppkomsten av den sena född bipolär befolkningen. Annat än dessutom uttrycker reporter transgener, givarceller från dessa embryon är genetiskt WT.

    Mikroinjektion av en nL mRNA (till etikettgivarceller) i gulan av encelliga embryon scenresulterar i fluorescerande reporterproteinuttryck med 3 HPF, därStage ljus givarna väljs (Figur 1). Förbered transplantation inställning när embryona är runt 2 HPF (Figur 2). Vid 24 HPF, är embryon med transplanterade donatorceller i de berörda retinala platser väljs och monteras i 1% låg smältpunkt agaros i grupper om fem (Figur 3). Efter att ha sparat embryot läge, inställning av z-stack och tidsparametrar är tidsförlopp avbildning utförs för 16-24 timmar. Tidpunkt för första födda ganglion celler indikeras av uppkomsten av Atoh7: RFP eller Atoh7: gapGFP transgen och tidpunkten för den sista född bipolära generationen indikeras av den starka uppreglering av Vsx1: GFP transgen, som också uttrycks i betydligt lägre ljusstyrka nivåer i utvecklings stamceller. Tidpunkten för första transgen uttryck, såsom Atoh7: gapGFP identifieras i enskilda celler vid varje tidpunkt av bild (vita pilspetsar, Figur 4). Atoh7: gapGFP och ganglion celldifferentiering Occurs vid motsvarande tidpunkter oavsett om värden embryot är WT eller en Ptf1a morphant saknar mellan (dvs efter gangliecell födseln) horisontella och amakrina celler.

    De data som presenteras visar att detta experimentella metod ger ett kraftfullt verktyg för att bedöma betydelsen av särskilda retinala miljöer på genuttryck timing, med relevanta konsekvenser, inte bara för att förstå normala utvecklingsprocesser utan också för framtida tillämpningar av cell omprogrammering strategier i normala och sjukdomstillstånd .

    Figur 1
    Figur 1: mikroinjektion i äggulan i Single-cell Stage Embryon användas för att märka givarceller och för att generera olika värdmiljöer. A) Embryon linje mot kanten av en glasskiva med de flesta av den omgivande vätskan återrörd. B) Nålen sätts in i mitten av äggula och antingen H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA (för donator) eller morfolino (standard MO eller Ptf1a MO värd) injiceras. C) Injektionsnålen genereras med användning av en nål avdragare som genererar två symmetriska nålar från varje kapillär. Varje drog nålen måste därefter ha spetsen brutit med pincett för att öppna nålen samtidigt som en skarp vinklad spets (inte trubbiga) som lätt kan införas i embryon. D) givare embryon som injicerats med H2B-RFP mRNA vid encelliga stadiet börjar uttrycka fluorescerande reporter proteiner med 2,5 HPF, i vilket skede de ljusaste och mest jämnt märkta embryon kan väljas. E) Omkring 2,5-3 HPF donator och värd embryon enzymatiskt dechorionated använder proteaser. Virvlande i Erlenmeyerkolven ger den mekaniska kraft som behövs för att bryta öppna försvagade chorions och ger dechorionated embryos in i centrum. Så snart som den första en (asterisk) eller ett fåtal dechorionated embryon observeras, snabb men mild sköljning säkerställer att proteaset lösningen avlägsnas. F) För överföring av dechorionated embryon, är glaspipetter används. Dessa kan initialt kortas (tillval) till valfri längd som bekvämt manövreras av användaren, genom att skrapa glaset i rätt läge med en diamant kniv tills den bryts loss. Detta resulterar i en kraftig minskning spets, som måste vara brand poleras för att jämna eventuella ojämna kanter som kan skada celler sugs in i pipetten under överföringen. Skalstrecken A, B, D, E = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: Transplantation Setup. B) Transplantations slang visas anger hur eventuella läckor i kopplingarna är enkelt förhindras med hjälp av form kitt och paraffin film. C) En högre förstoring vy av förbindelsen mellan injektionsslangen och eventuella lämpliga slangar för anslutning till sprutan. Medan eventuella slangar kan användas, röret utnyttjas här har en diameter som tätt passar en 10 mikroliter pipettspets. Använd paraffin film för att säkerställa en tät förslutning. D) Formen har 150 (6 x 25) kilar för att generera de triangulära divots i agarosen injektion plattan. E) Ungefärliga dimensioner av varje kilform är visade. Mätningarna företag är patentskyddad. F)Beredda agaros injektion plattor med kilformade fördjupningar används med donerade embryon till den första kolumnen och kolumner 2 - 6 fyllda med embryon värd. Transplantationer genomförs över raden, varigenom celler som samlats in från en donator i varje rad kan transplanteras in i 5 värd embryon. Inom varje form, kan celler från upp till 25 donatorer transplanteras in upp till 125 värd embryon. Notera formen är placerad asymmetriskt i den djupare änden av kilen närmare petriskålen kanten. Detta gör det möjligt för transplantation nålen från höger sida utan att träffa petriskålen kanten. G) Transplantation Nålen dragés med samma parametrar som injektionsnålen för att resultera i en lång avsmalnande spets som visas här. Nålen måste brytas för att generera en större inre diameter som kan ta upp celler utan att deformera dem. Den högre ström infällda bilden visar att spetsen på transplantation nålen ska vara vinklad och helst ha en "flöjt" form som visasi detta exempel. H) Högre makt vy visar orientering av embryon värd med celler på toppen. Transplantations nål sätts in i cellmassan av blastula steget värd embryot i sidled (vitt asterisker) och skjuts in i framtiden ögat såsom visas här. Donatorceller kan ses inom transplantations nål (pil) och sålunda den grova antalet celler transplanterade kan kontrolleras. I) Två exempel (vänster och höger) visar att omedelbart efter transplantation, embryon med framgångsrikt transplanterade cellerna i rätt läge kan omedelbart redas ut med hjälp av donator etikett (t.ex. H2B-RFP). En fluorescerande kanal sattes till ljusfält med hjälp av "linjär Dodge (lägg)" alternativ under lagret menyn i rastergrafik redaktör. Skalstrecket (för H, I) = 500 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


    Figur 3: Embryo Montering för Time-lapse avbildning. A) petriskål (90 mm) visar flera låg smält agaros droppar innehållande fem embryon vardera förbundna med agaros för att bilda ett fast nätverk för att hindra enskilda droppar lossnar. B) Högre makt syn på 24 HPF embryon inriktade i sidled och inbäddade i stelnat agaros. För den ideala vinkeln, bör de två ögonen placeras ovanpå varandra (i z-dimensionen). Beroende på genen av intresse, montering bör skjutas upp tills strax före relevant timing (t.ex. 26 HPF för ganglion celldifferentiering eller 35 HPF för starten av den bipolära celldifferentiering). C) Confocal bilden av en enda optisk z-sektion som visar överlagring av ljusfält och röda kanaler (med "linjär Dodge (lägg)" alternativ under lagret menyn irastergrafik redaktör) av utvecklings öga med några märkta givarceller (röda) i en annars omärkt värdmiljön. Skala bar B = 1 mm, skala bar C = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4: Tidpunkt för Neurogenesis kan visualiseras i transgena givarceller transplanteras in olika värdmiljöer. Mikrofoton från tidsförlopp bild av utvecklings WT donatorceller från Tg (atoh7: gapGFP) transgena embryon transplanteras in omärkt WT värd. Transgenexpression debut är indicerat för några celler genom vita pilspetsar. Skalstreck = 10 | im. Klicka här för att se en större version of denna figur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Förstå vilken utsträckning angränsande celler påverkar tidpunkten för uttrycket av avgörande cell öde avgörande faktorer är avgörande när syftet är att på ett effektivt sätt instruera embryonala eller inducerade multi stamceller att differentiera till en specifik post-mitotiska celltyp eller mönstrad vävnad. Dessutom undersöker dessa molekylära händelser i utvecklings cellerna i levande djur dessutom ger relevant dynamiska (tid och rum) information om de särskilda cellulära sammanhang i samband med dessa händelser in vivo. Sådana studier kan inte vara lätt att uppnå i alla ryggradsdjur modeller.

    I det presenterade protokollet är mottaglig zebrafisk embryot utnyttjas som ett ryggradsdjur modell för att ta itu med dessa frågor in vivo, i den relativt enkla, men mycket organiserad tredimensionell mönstrad vävnad i ryggradsdjur näthinnan. Detta exemplifieras genom att testa hypotesen att nedbrytande en viss retinal celltyp påverkar genuttryck timing och utvecklings öde retinala progenitorceller. Vi kan dessutom utnyttja donatorcellmarkör för att spåra specifika celler tillbaka i tid för att bedöma, till exempel, hur långt innan uttrycket av en transgen en postmitotisk cell genomgick sin sista division, eller bedöma den allmänna beteende av denna cell (t.ex. migration) vid olika steg före den transgent uttryck i olika miljöer. För dessa studier att en kombination av relativt lätt utföra tekniker presenteras, som omfattar morfolino-medierad gen slå ner, transplantation och levande bilder. För transplantationsmetod införs protokollet en ny, relativt enkel och billig transplantation rigg och visar hur lätt denna drifts installationen.

    Detta protokoll är inte begränsad till näthinnan. Den kan också tillämpas för att studera ett antal olika dynamiska cellulära processer, som kräver att reda av cellautonoma Developmental program från cell icke-självständiga miljöpåverkan. Även lite felsökning krävs ett antal kritiska åtgärder måste beaktas före start ett experiment. En viktig förutsättning för en framgångsrik tillämpning av tekniken är att det organ eller vävnad av val måste vara lätt riktas i det tidiga embryot med hjälp öde kartan. Om effektiviteten av vävnad inriktning inte tidigare har testats, måste detta först optimeras och standardiseras. Antalet mikroinjicerade och transplanterade embryon kan ökas och screenas innan leva avbildning för att erhålla tillräckliga embryon med givarceller korrekt integrerade och placerade inom den aktuella vävnaden. Dessutom, medan detta protokoll kan lätt appliceras på tidiga embryonala zebrafisk stadier, ansökan till senare skeden såsom växande larverna blivit svårare för två skäl. För det första, effektiviteten i genen knockdown erhållas med morpholinos minskar över tiden (deavvaktan på varje morpholino, är det i allmänhet mest effektiva innan 3 DPF). Att åsidosätta detta problem, är att föredra användning av genetiska mutanter som givare embryon för transplantation. För det andra, eftersom zebrafisk växer djupare delarna av larver blir mindre tillgängliga för avbildning med en konfokalmikroskop, speciellt vid högre förstoringar (hög effekt mål) där arbetsavstånd mikroskop målet är mer begränsad. Således måste först utvärderas för dess mottaglighet för avbildning varje vävnad av intresse i relevant ålder.

    Time-lapse avbildning kan utföras antingen på en inverterad eller upprätt konfokalmikroskop.

    Det finns ett antal fördelar med den upprätt mikroskop, om tillgängligt. Vid den erforderliga temperaturen, indunstning av nedsänkning ämne som används (t.ex., vatten eller immersionsolja med vatten brytningsindex) på ett inverterat mikroskop kan leda till fullständig uttorkning. Detta kräver ständig övervakning ochsmåningom påfyllning, med risk för att placera provet ur fokus. Detta kan delvis undvikas genom att använda automatisering för att sänka målet ett definierat avstånd, tillsätta nedsänkning ämnet och höja målet igen, men enligt vår erfarenhet är omfokusering fortfarande ofta krävs, vilket bör ske före början av nästa tidpunkt för avbildning . För det andra, de största täck botten rätter vi anskaffas är fortfarande mycket mindre (50 mm i diameter) än de vanliga 90 mm diameter petriskålar som används för upprätt mikroskopi. Detta innebär att antalet embryon som kan monteras och embryot medelhög volym tillsätts är mer begränsade när man använder inverterade mikroskop. Ändå tidsförlopp parametrar utgör oftast den viktigaste begränsande faktorn för antalet embryon som kan avbildas och därmed storleken på skålen är fortfarande lämplig. Vid användning av mycket höga mål förstoring kan inverterad mikroskopi tillåta ett större djup i z-dimensionen som ögat ochSyftet är endast åtskilda av en tunn täck. Vid kombination av mycket hög förstoring med upprätt mikroskopi, måste agarosen droppe täcker embryot hållas så tunt som möjligt. Totalt sett är de data som erhållits med hjälp av upprätt eller inverterad mikroskopi av likvärdig kvalitet.

    För generering av data av hög kvalitet, det finns ytterligare viktiga steg som måste beaktas. För det första är avgörande för erhållande av transplanterade embryon med ett lämpligt antal transplanterade celler i ögat vid början av tidsförlopp filmer (ett fåtal, men inte alltför många) val av ljust märkta givare. Proteaset enzymatiska dechorionation är ett kritiskt steg och inkubation i proteas bör hållas till ett minimum, följt av snabb, men mild sköljer att inte påverka den efterföljande hälsa embryon. Ålder matchning av givar- och värd embryon tillåter en exakt vävnad inriktning enligt öde karta och för effektiv integration av cellerna. En välformad transplantation needle är viktigt att se till att spetsen är liten och vass nog att sätta in embryon värd utan att orsaka mycket skada, men tillräckligt stor innerdiameter för att inte orsaka mekanisk skada på cellerna transplanteras. Vid transplantation, om utrustningen inte är helt förseglad (särskilt vid anslutningspunkter), är det mycket svårt att kontrollera förflyttning av E3-medium och cellerna manuellt in i och ut ur transplantationen nålen. Detta är mest uppenbart när det finns strömmar antingen in i eller ut ur transplantationen nålen utan att manuellt ändra sprutvolymen. I detta fall alla skarvar måste kontrolleras igen och återförslutas. Detta bör testas i förväg av experimentet.

    Slutligen, under den tid som förflutit mellan transplantation och time-lapse setup, är det viktigt att de transplanterade embryona får utvecklas vid låg densitet medan minutiöst rensa eventuella ohälsosamma embryon. Detta är särskilt viktigt när tidpunkten för utveckling eller gene uttryck utreds. Vid bedömningen av tidpunkten för varje process (t.ex. genuttryck), måste kontroller användas för att utesluta icke-specifika biverkningar av morpholino teknik. I vårt arbete använder vi tidpunkten för transgen expression i en obesläktad vävnad (t.ex. muskel) påverkas av den specifika genen måltavla morpholino.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Detta arbete stöddes av en ARC DECRA till PRJ (DE120101311) och en Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) forskningsanslag till LP (PO 1440 / 1-1). Den australiska regenerativ medicin Institute stöds av medel från delstatsregeringen i Victoria och den australiska federala regeringen. Vi erkänner Dr Jeremy Ng Chi Kei, som utfört experiment som beskrivs här som publiceras i Kei et al. 2016. Vi är tacksamma för bestämmelserna i transgen fisk från Prof. Higashijima och tack Profs. Turner och Rupp för tillhandahållandet av pCS2 + plasmiden och Dr. Wilkinson för att generera H2B-RFP och H2A-GFP konstruktioner. Vi tackar FishCore anläggning personal (Monash University) för att ta hand om våra djur.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    Utvecklingsbiologi Zebrafish transplantation chimär levande avbildning cell icke självständiga näthinnan genuttryck timing neurogenesis
    <em>In vivo</em> avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter