Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Abstract

Genetik ve teknik güçlü Zebra balığı omurgalı gen manipülasyon sonuçları hızlı gelişim dönemi boyunca in vivo izlenebilmektedir hangi önemli bir model organizmadır yaptık. Çoklu işlemler hücre çoğalması, gen ekspresyonu, hücre göçü ve morfojenezinin içeren incelenebilir. Önemli olarak, transplantasyon ile kimeralar üretimi kolayca mevcut ortamının etkisi altında mozaik etiketleme ve tek tek hücrelerin izleme sağlayan gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tek nakledilen verici hücreler üzerinde (morfolino mikroenjeksiyon yoluyla örneğin) ana embriyo fonksiyonel gen manipülasyonlar ve canlı görüntüleme, ekstrinsik etkileri (genetik olarak modifiye edilmiş bir ortamda sağlanan) hücre otonom olmayan sinyallerin birleştirilmesi ile değerlendirilebilir. İşte biz bu yaklaşım hücre kaderinin tanımlayabiliriz zamanlaması için bir vekil olarak floresan transgen ifadesi başlangıcını karşılaştırmak için kullanılır nasıl göstermekfarklı genetik konak ortamlarda tirme.

Bu yazıda, donör hücreleri işaretlemek için ve gen konak embriyolarda demonte, kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılan nakli tekniğinin bir açıklama ve hazırlanması ve in vivo time-lapse konfokal çalışan için protokol neden Zebra balığı embriyolar microinjecting için protokol sağlar birden çok embriyo görüntüleme. Bu tür bir gen ifadesinin başlangıcı gibi olaylar zamanlamasını karşılaştırırken Özellikle, birden çok noktaya görüntüleme gerçekleştirmek son derece önemlidir. Bu çoklu kontrol ve eş zamanlı olarak işlenen deneysel embriyolardan veri toplama gerektirir. Böyle bir yaklaşım, kolayca herhangi bir organ ya da görüntüleme yaşamak için erişilebilir seçim dokuda dış etkilerden çalışmaları için uzatılabilir, transplantasyonlar kurulan embriyonik kader haritalarına göre kolayca hedef olabilir şartıyla.

Introduction

In vivo omurgalı önemli gelişim süreçleri görselleştirmek için yeteneği normal ve hastalık koşullarını incelemek için Zebra balığı bir anahtar modeli yapma katkıda bulunmuştur (1 gözden, 2). Özellikle nöral retinanın merkezi sinir sistemi erişilebilir bir parçasıdır. Retina nedeniyle son derece organize, henüz nispeten basit yapısı ve omurgalı türlerin 3 genelindeki yüksek oranda korunmuş nöron tiplerine kolayca nöron çalışmalar yapmak için oldukça rahat. Böyle çoğalması, hücre döngüsü çıkış, asimetrik hücre bölünmesi, kader özellikleri, farklılaşma ve nöral devreler oluşumu gibi hücresel davranışları dinamikleri 3 gün postfertilization tarafından zebrabalıkları merkezi retinada tamamlanır retinogenesis tüm süreç boyunca takip edilebilir ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Bundan başka, yukarıda bahsedilen aşamaların her biri farklı genlerin fonksiyonel gereksinimler eş zamanlı olarak, sadece ölüm sonrası inceleme sonucunda tespit edilebilir olup, burada gen knockout tekniklerinin uygulanması sonucu ortaya çıkan fenotipler diğer omurgalı modeller üzerinde bir avantaj sağlayarak, zebra balığı retinada değerlendirilebilir dokularını düzeltildi. Özellikle, görselleştirmek ve retina raportör transgenler olarak floresan proteinleri ifade izleyebilen transgenik hatların kullanımı, ABD, belirli bir nöronal hücre tipinin oluşumunu altında yatan, gen sentezlenmesinin zamansal çözünürlüğü elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Nedeniyle zebrabalıkları hızlı gelişimine, bu olaylar dolayısıyla nöronal hücre kimlik edinme ve hücre davranışı ile ilgili olarak gen ifadesinin zamansal önemi hakkında daha ayrıntılı bilgiler sağlayarak, tüm gelişim döneminde görülebilir.

Son olarak, bu yaklaşımlar, gen fonksiyonu iki temel yönlerine ilişkin olarak elde edilen, transplantasyon ile kimera üretimi ile zebrabalıkları etkin birleştirilebilir. Birincisi, onlar bir etiketsiz vahşi tip ortamında geliştirmek iken belirli bir genin nakavt edildiği bir donör embriyo, nakledilen hücrelerin incelenmesi, hücre-otonom bir şekilde gen fonksiyonu hakkında ilgili bilgi almak için bize izin verir. Bu, normal olarak, artık, bu genler, 4, 6, fonksiyonel proteini oluşturabilir progenitörlerin gelişim kaderi sonucu incelenmesi ile örneklenmiştir. Bu ifade edilmiştir progenitör hücreler içinde retina kaderi belirleyici faktörleri işlevi hakkında önemli noktanın anlaşılmasını yol açar 8, 9. Bu yaklaşımı kullanarak, birçok kader belirleyici faktörler (örneğin, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) hücre hareket ettiklerini göstermiştir-autonomously belirli retina nöronal kaderi sürücü; Gen ifadesinin eksikliği temel olarak demonte gen ile hücreler alternatif bir hücre kaderine 4, 6, 7, 10 benimseyerek canlı kalır, öyle ki bir kader anahtar yol açar. İkincisi, bu tür kimerik deneyler farklı genetik ortamlar içinde geliştiğinde tip ataları nasıl davranacağını vahşi değerlendirmek için de kullanılabilir. Örneğin, genellikle manipüle ana bilgisayar ortamında (örneğin, gen nakavt / demonte) karşısında WT ilgi (ve muhabir transgen) bir gen ifade WT hücrelerinin gelişimini karşılaştırarak, gen ifadesi ve hücre kaderi üzerinde çıkan etkileri değerlendirilebilir . Ev sahibi ortamında bazı nöron tipleri olmaması, örneğin, daha az temsil o ayırma yöntemi önyargılı için onları, hücre otonom-olmayan bir şekilde, yabani tip progenitör davranışını etkilemek için gösterilmiştirNöron türleri 4, 7, 11, 12 eksik r. Retina nöronlar (13 gözden) belirli nöronal kaderi belirleyici gen sırayla zamanlı ifadesi (kader gen ifadesi) tarafından korunmuş histogenez sırayla doğarlar göz önüne alındığında, biz göstermek için bu yöntemleri nasıl kullandığını vahşi tip atalarıdır kader gen ifadesinin zamanlaması Bu tür atalarıdır kaynaklı anormal hücre kompozisyonlar ile retina konak ortamlarda gelişebilir zaman etkilenir. Nispeten standart ve yaygın olarak kullanılan tekniklerin kombinasyonu retina atalarıdır 8, 9 gelişmekte olan kader gen ifadesinin zamanlaması incelenmesini sağlar nasıl Burada delil olarak bu yaklaşımları özetlemektedir.

Bu protokol başına kolaylığı ile time-lapse görüntüleme birleştiren deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadırex vivo gelişmekte olan zebrafish embriyo nakli oluşturan bireysel mosaically gelişimsel retinogenesis tüm dönem boyunca etiketli hücreleri takip etmek. fonksiyonel gen manipülasyonlar yaparak ya ev sahibi embriyo, donör embriyo, her ikisi veya hiçbiri de, bir gen fonksiyonu hücre özerklik değerlendirebilir. Bu yaklaşım Burada özetlenen bileşenleri tek tek uygun olan herhangi bir başka sistemde benzer araştırma sorularına yaygın adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler hayvanların bakımı ve kullanımı için pratik Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi koduna hükümlerine göre yürütülür ve kurumsal etik komiteleri tarafından onaylandı.

Zebra balığı 1. Hazırlık

  1. Yetişkin balık eşleştirme
    1. Akşam kullanımdan önce uygun boyutta yetiştirme tankları çift (ya da iki çift) olarak yetişkin balık ayarlayın.
    2. erkek ayrılan kadın, tutmak görmek için balık sağlamak, ancak birbirine değecek bir böleni kullanın.
    3. Sabah, ışık açıldıktan sonra, bölücüler kaldırmak ve balık rahatsız çiftleşmek için izin verir.
    4. Başarılı çiftleşme özgün tanklar geri yetişkin balık koymak sonra.
      NOT: Ana ve donör suşları herhangi bir vahşi tip (WT) suşları, örneğin, aynı olabilir. (: GapRFP atoh7), Tg (atoh7: gapGFP) ya da, bu çalışma için donör embriyolar transgenik kuşaklar Tg türetilmişTg (vsx1: GFP) hangi kader belirleyici faktörlerin ifadesi erken sürüş veya geç nöral kader sırasıyla 14, 15, 16, görüntülenebilir. aşağıda tarif edildiği gibi genetik ortamları farklı etkilerini karşılaştırmak amacıyla, ev sahibi embriyolar belirli mutantlar veya morphants olabilir.
  2. embriyo toplama
    1. üreme kutusundan yumurtaları toplamak için bir çay süzgeci kullanın. Yumurtalar için doğum zamanını belirlemek ve tek hücreli dönem embriyoların daha sonraki adımlar için toplanan sağlamak için her 15 dakikada kontrol edin.
    2. E3 ortamında (5 mM NaCI, 0.2 mM KCI, 0.4 mM CaCl2, 0.9 mM MgC damıtılmış su içinde 2 ve% 2 metilen mavisi) ile embriyolar durulayın ve maksimum 50 yoğunlukta ~ 40 mL E3 17 ihtiva eden petri çanakları koyun 90 mm çaplı Petri kabı başına yumurta.
    3. suşu adı, tarih ve saat ile Petri kapları Etiketdoğum. Diseksiyon mikroskobu altında embriyoların izlerken herhangi bir enkaz kaldırmak için Pasteur transfer pipet kullanın.
    4. Transplantasyon için ~ 3 saat postfertilization (hpf) kadar 28.5 ° C embriyolar tutmak, ya da microinjections devam edin.
      NOT: transplantasyon için, benzer yaşlarda donör ve host embriyolar için hedefliyoruz. Kimmel ve diğerleri olarak 32 ° C - Bu nedenle, 25 arasında farklı yetiştirme sıcaklıkları kullanmaktadır. 18 yavaşlatmak ya da diğer maç embriyoların bir debriyaj hızlandırmak için.
    5. (- 28 saat sonra 24) time-lapse görüntüleme kadar toplama zaman 32 ° C'de uninjected transgenik donör embriyo ~ 20 tutun.
      NOT: Bu deneysel kohort daha hızlı gelişecek ve daha önce floresan belirteçler ifade edecektir. Dolayısıyla görüntüleme parametrelerini (lazer güç, kazanç) kurmak için de kullanılabilir. Bu özel örnekte, deneysel grupta görüntüleme transgen ekspresyonu önce başlar (değerlendirmekBu olayın tam zamanlama).

Mikroenjeksiyon için 2. Hazırlık

  1. Mikroenjeksiyon iğne hazırlık
    1. aynı uzunluktaki iki iğne elde etmek için merkezde her borosilikat cam kılcal boru (1.0 mm OD / 0.78 mm ID / 100 mm uzunluğunda cam kapiller) iğneleri çekmek için bir iğne çektirmesi kullanın. Uzun milleri ile konik iğne hedefleyin.
      Not: Burada kullanılan iğne çektirmesi için örnek ayarlar temin edilir Malzeme Listesi.
    2. Petri kabı çekti iğneler saklayın ve moldable macun veya yapıştırıcı bir bantla içine bastırarak sabitleyin.
    3. Enjeksiyondan önce bir mikroskop altında odak iğne ucu getirmek ve ucunda açık iğne kırmak için forseps kullanabilir. Küçük bir açıklık (Şekil 1C) ile keskin konik ucu hedefleyin.
    2. <li> ana embriyoların için Morfolino hazırlık
    1. Sipariş morfolino oligonükleotitler, özellikle ilgi konusu gen ve bir standart kontrol morfolino veya usul ve taşıma etkileri kontrol etmek için uygun bir 5 baz çiftli uyuşmazlık için tasarlanmıştır.
      Not: Burada, insan beta-globin intronu mutasyonu hedef ara madde doğan yatay ve amacrine hücrelerinin gelişimini inhibe eden 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'morfolino Ptf1a engelleme için ve standart bir kontrol zebra balığı morfolino (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA ) 7 '-3, 19 kullanılmıştır.
    2. Oda sıcaklığında ve mağaza - 1 mM morfolino stok solüsyonu (8.5 ng / nL ~ 8) hazırlayın.
    3. Enjeksiyon gününde, 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta morfolino bir kısım (10 uL) ısı 65 ° C (daha sonra, kullanım esnasında oda sıcaklığında muhafaza edilebilir) soğumasını kısa bir süre buzda ve bir yerde döndürün. thPotansiyel demonte etkinliğini azaltabilir morfolino çözümü içinde agregasyon herhangi tersine olacaktır.
      1. Ptf1a morfolino ve eşdeğer standart kontrol morfolino için distile su ile morfolino stok solüsyonu seyreltilmesi ile 6 ng / nL bir çalışma solüsyon hazırlanır. Oda sıcaklığında saklayınız.
        Not: Daha önce, 7 belirlenen kullanımlar Ptf1a morfolino gibi embriyo başına morfolino 2 nL embriyo başına 12 ng nispeten yüksek bir çalışma konsantrasyonu gerektirir. En morpholinos için, 2 - embriyo başına 5 ng etkilidir, yani 2 stok sulandırmak - 5 ng / nL ve her embriyo içine 1 nL enjekte edilir.
  2. floresan histon füzyon muhabiri hazırlanması etiketleme donör embriyoların yapıları
    NOT: Ana embriyoların içinde donör hücreleri / ayırt görselleştirmek için, H2A-GFP mikroenjeksiyon dahil donör embriyo etiket farklı yaklaşımlar vardır (transgenik donörler kullanıyorsanızkırmızı floresan gazetecilere) ya da tek hücreli aşama donör embriyo sarısı içine H2B-RFP (yeşil flüoresan gazetecilere transgenik donörler kullanılıyorsa) mRNA.
    1. Haberci DNA ihtiva eden, en az 1 ug plazmid linearize.
      NOT: Burada pCS2 plazmid (oluşturulur ve nazik Biyomedikal Merkezi Münih Michigan ve Prof. Ralph Rupp Üniversitesi'nden Prof. David Turner tarafından sağlanan) H2A-GFP veya Dr Christopher Wilkinson, Royal Holloway tarafından oluşturulan H2B-RFP (içeren, University of London) Notl sınır enzimi sindirimi ile doğrusal.
    2. üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak DNA saflaştırılır.
    3. üreticinin talimatlarına göre uygun bir polimeraz ile ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak mRNA uyarlamak. pCS2 plazmid, bir SP6 polimeraz kiti kullanın.
    4. mRNA ve üretici talimatlarına göre izopropanol çökeltme izlenmiş ve ticari kitler ya da fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak saflaştınlırs. ultra saf su içinde mRNA seyreltilir (20-30 ul), -80 ° C'de bir spektrofotometre ve mağaza ile konsantrasyonları ölçülür.
    5. Enjeksiyon gününde, 100 ng / uL nihai konsantrasyon ile, steril su içinde bir mRNA çalışma çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun. geri -80 ° C'ye kadar kullanılmayan mRNA stok dönün.

Tek hücreli Sahne Embriyolar içine morpholinos ve / veya mRNA 3. Mikroenjeksiyon

Not: Microinjections tüm verici hücreleri işaretlemek için ve farklı ana ortamları (kontrol ve gen yok etme) hazırlanması ve mRNA veya morfolino antisens oligonükleotitler 20, 21 enjeksiyonları dahil etmek için kullanılır.

  1. Yükleme ve enjeksiyon iğnesi kalibre
    1. Microloader pipet uçları kullanılarak 3 morfolino uL ve / veya histon-floresan füzyon mRNA çözeltisi ile iğne Backload.
    2. solut sallayınKalan hava kabarcığı kalmayıncaya kadar enjeksiyon iğne ucu doğru iyon. Çözelti öncelikle kılcal hareket ile ucuna kadar çekilecek şekilde yerleştirin, bir iç cam enjektör kullanın.
    3. Bir mikromanipülatör (3D manuel mikromanipülatör) monte edilen bir tutucu enjeksiyon iğnesi takın ve tüp konut içinde sıkı bir sızdırmazlık sağlamak.
    4. Basınç ayarlı mikroenjektör güç ve gaz arzının açın.
    5. (A graticule mercek kullanıyorsanız) bir tabak içinde madeni yağ bir damla iğne ucu batırın veya açılan hacmini kalibre etmek için bir mikrometre slayt üzerinde doğrudan iğne ucu getirin. Ayak pedalına basarak enjeksiyon hacmini ölçmek ve enjeksiyon hacmi 1 nL (125 mikron çapında) eşdeğerdir kadar gaz basıncını ve / veya Süreyi ayarlayın.
      NOT: mikrometre slayt avantajı ölçümleri mercek graticule ins kullanarak ancak mikroskopta kullanılan büyütme bağımsız olmasıdırtead, enjeksiyon damla ve ölçek aynı anda odak olabilir.
  2. embriyo mikroenjeksiyon
    1. Bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı yerleştirin ve slayt kenarı boyunca tek hücreli sahne embriyolar yatırmak için bir transfer pipet kullanın. kesilmiş ince ucu yarısı ile Microloader pipet kullanarak tek bir sütuna aynı hizaya getirin. Enjeksiyonlar (Şekil 1A) sırasında hareketlerini önlemek için ince bir transfer pipet yardımıyla kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın.
    2. Her embriyo doğru iğne indirin ve koryon nüfuz ve bir yumuşak inme (Şekil 1B) sarısı.
    3. İğne ucu ayak pedalına basarak sarısı, Microinject merkezli sonra. Tek hücreli bir sahne donör embriyo (transgenik) sarısı içine H2A-GFP 1 nL enjekte veya H2B-RFP mRNA. iki ayak pedalına basarak tek hücreli bir sahne vahşi tip konak embriyo sarısı içine standart MO veya Ptf1a MO 2 nL enjekte edilir. Başarılı enjeksiyonları Smal tarafından görüntülenmiştir olabilir sarısında l mekansal deformasyon.
    4. (- 60 embriyolar 50) pozisyonuna sonraki embriyo getirmek ve embriyoların tüm sütunu enjekte kadar enjekte devam etmek embriyoları içeren çanağı hareket, enjeksiyon iğnesi çıkarın.
    5. tüm embriyolar enjekte ettikten sonra, bir 30 çanak yukarı kaldırın - 45 ° açı ile yeni bir temiz Petri kabı içine enjekte edilen embriyolar transfer etmek E3 orta (sıkmak şişe) hafif bir akışı kullanın.
    6. bir kuluçka makinesi içinde embriyo tabağına yerleştirin (ya da 28.5 ° C ya da diğer bir sıcaklıkta, verici ve bir ev sahibi embriyolar eş yaşlarda olduğundan emin olmak için).
    7. 250 konak embriyolar - ~ 100 donör embriyolar ya da ~ 200 elde etmek için 3.2.6 gerekli - Tekrar 3.2.1 adımları.
    8. 1 at - 2 hpf, bir mikroskop altında embriyoların kontrol ve Pasteur transfer pipet yardımıyla 2 veya 4 hücreli aşamalarına gelişmiş değil herhangi bir gübresiz yumurta kaldırmak.

Transplantasyon için 4. Hazırlık

ontent "> Not: Nakli, farklı genetik çevrelerdeki etkilerini sağlayan kimerik embriyo oluşturmak için kullanılan eş WT donör progenitör 9, 22, 23 içinde değerlendirilmelidir.

  1. Donör embriyo seçimi
    1. 3 hpf, 2 de donör embriyolar kontrol - etiketleme sinyali 5X büyütme bir floresan mikroskop altında. 580 nm eksitasyon, 610 nm - GFP artı filtre (460-500 nm uyarma, 510 nm uzun geçiş emisyon) ya da Texas Red filtre (540 kullanarak güçlü floresan sinyali ile embriyolar iyi gelişmiş (eşit büyüklükte hücreler ile simetrik hücre kütlesi) seçin uzun geçiş emisyon) (Şekil 1D). Transgenik gazetecilere henüz ifade edilmez.
  2. Agaroz enjeksiyon plakası ve Petri hazırlığı
    1. 90 mm çaplı Petri kabı içine E3 ortamında seyreltilmiş erimiş% 2 agaroz dökün ve çanak güvenli olana kadar soğumasını bekleyindokunmak. Sıcak agaroz aksi halde kalıp deforme olabilir.
    2. Agaroz (Şekil 2D, E) kama şekilli çıkıntıların (6 x 25 / kalıp) bir plastik kalıp Float. Agaroz üzerine kalıp bir tarafı yerleştirerek ve diğer tarafında aşağı yavaş yavaş daha düşük hava kabarcıkları kaçının. Kalıp nakli iğne için yeterli boşluk bırakın için çanak veya kama şeklinde çıkıntılar derin noktasının tarafına doğru merkezli olduğundan emin olun.
    3. Agaroz tamamen oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin.
    4. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de agaroz tabağına yerleştirin ve yavaşça (forseps ile, örneğin) bir köşesinden kaldırarak kalıpları çıkarın. kurumasını önlemek için E3 orta ve parafın filmi contanın küçük bir hacme sahip, 4 ° C'de bir gün önce deney ve saklamak için agaroz enjeksiyon tabak hazırlayın.
    5. Transplantasyon öncesinde, E3 orta agaroz enjeksiyon plaka doldurmak ve en az 30 dakika süreyle bir 28.5 ° C inkübatör içine yerleştirin.
      6. <li> dechorionated embriyolar ya kullanım cam tabaklar veya ceket E3% 2 agaroz ince bir tabaka ile Petri (90 mm çapında) iç plastik sopa beri. dechorionated ana embriyoların için bir tabak, dechorionated donör embriyo için bir çanak ve her 40 nakledilen embriyoların için bir yemek hazırlamak. Enjeksiyon plakası (4.2.4) için tarif edildiği gibi saklayın.
  3. Aktarım pipet hazırlığı
    1. ince cam ucu Pasteur pipeti çekti uzun bir form ucu kesilmiş (2 mL hacim, 230 mm uzunluk, 100 mm uzunluğunda ucu) uç düşme kadar dönen iken bir elmas bıçak ile kazıyarak rahat manevra (isteğe bağlı) için izin veren bir uzunluğa kapalı (Şekil 1F).
    2. kesim düz olduğundan emin olun. Yangın lehçe dechorionated embriyolar (Şekil 1F) zarar vermeyecek şekilde yumuşak uçları üretmek için bir Bunsen beki kesme yüzeyi çevirerek cam transferi pipet.
      NOT: w çok uzun süre alev pipet tutulmasıaçılış kötü sonuç kadar mühürlü veya embriyolar için çok küçük hale ediliyor.
  4. Blastula sahne donör ve host embriyolar Dechorionating
    1. Dechorionate embriyolar elle embriyo dokunarak ya da enzimatik olarak embriyoların 9, çok sayıda eş zamanlı hızlı dechorionation izin vermek için proteaz kullanmadan her koryon yırtarak iki ince forseps ile.
      1. , 50 mg / mL proteaz karışımının 100X'lik bir stok çözelti hazırlayın 100 uL'lik yapabilir ve -20 ° C'de saklayın.
      2. 10 ml E3 ortamında (0.5 mg / mL proteaz nihai konsantrasyon) stok proteaz, 100 uL ekleyin.
      3. iki ayrı küçük bir Erlenmeyer cam bardak (10 ml) içinde iyi gelişmiş host ve donör embriyoların yerleştirin ve mümkün olduğunca çok sıvı kaldırmak.
      4. her behere 0.5 mg / ml proteaz çözeltisi 5 ml ilave edilir ve yavaşça bir mikroskop altında onlara bakan iken embriyolar girdap. koryon deformasyonu herhangi bir işaret için izleyin.
      5. türbülans tutun. En kısa sürede ilk embriyo koryon (Şekil 1D, yıldızlar) dışında olduğu gibi, sıvı çoğu dökülen ve yavaşça tarafında E3 dökerek balon dolumu ile proteaz çözüm kaldırmak için E3 orta üç hızlı durulama gerçekleştirin. onlar patlama gibi dechorionated embriyolar, transplantasyon (bölüm 5) sonuna kadar takip eden adımlardan herhangi birini hava ile temas etmesine izin vermeyin. durulama arasındaki şişe içinde yeterli bir çözüm bırakın.
      6. Yangın cilalı cam transferi pipet, cam Petri veya agaroz (E3 ortamında% 2) kaplı plastik tabaklar içine Erlenmeyer beher embriyolar transfer. Yavaşça kalan zayıflamış koryon kaldırmak için transferi sırasında pipetle.
  5. Transplantasyon iğne hazırlık
    1. Her borosilikat ince duvar cam tüp (1,0 mm OD iki iğne çekmek için bir iğne çektirmesi kullanın/ Mikroenjeksiyon pipetler aynı ayarlarla 0.78 mm ID / 100 mm uzunluğunda).
      Not: Burada kullanılan iğne çektirmesi için örnek ayarlar Malzeme Listesinde verilir. Bu zarar hücreleri iğne içine çekilir olarak transplantasyon iğneler, cam ekleme yok.
    2. Petri kabındaki, önceden mağaza iğneleri çekin ve moldable macun veya yapıştırıcı bant şerit halinde basarak sabitleyin.
    3. Önceki nakli için bir tahlil mikroskobu altında odak iğne ucu getirmek ve ucunda açık bir iğne freni için forseps kullanır. Bir flüt-şekil (Şekil 2G) için amaç, ya da ucu şekli 23 oluşturmak için açıklanan alternatif yöntemleri kullanmak için iğne şeklini ayarlamak için ince forseps kullanın.

Blastula Nakli aracılığıyla 5. Chimera Nesil

  1. transplantasyon kurulumu
    NOT: Burada, kendi kendine monte nakli cihazı kullanıldı (Şekil 2A
  2. Yukarıdaki mikroenjeksiyon için kullanılan aynı iğne tutucu nakli iğne monte (Şekil 2A) (mikromanipülatör, aşama 3.1.3 monte).
  3. microinjections için kullanılan basınç ayarlı mikroenjektör mikropipet sahibinin bağlantıları sonunda enjekte hortumunu ayırın. Nakli teçhizat bir 1 ml şırınga (Şekil 2A, B) ile bağlantılı enjeksiyon boru takın.
    1. Tüm bağlantıların sıkıca parafin film ya moldable macun kullanılarak sızdırmaz olduğundan emin olun. transplantasyon iğne kendisinde bazı E3 orta her zaman vardır sağlayarak hava ile temas embriyolar önleyin. içine ve nakli iğne dışarı hücre / sıvıyı emmek için elle şırıngayı çalıştırın.
  • embriyo hizalama
    1. agaroz kalıp ilk sütuna cam pipet ile donör embriyolar transfer. sütunlar halinde konak embriyo transferine 2agaroz kalıp (Şekil 2F) 6. blastomer tarafı yukarı bakacak şekilde pipet ile embriyolar yerleştirin.
  • Transplantasyon
    1. Yavaşça donör embriyo bir blastomer hücre üzerine nakli iğne dinlenme ve yavaş yavaş yaklaşık 20 emmek - transplantasyon iğne (Şekil 2H) 50. hücreleri. sarısı yalakalık kaçının.
    2. Mikromanipülatör kullanarak donör embriyo nakli iğne kaldırın. sola agaroz kalıp çanağı hareket ve ilk ev sahibi embriyo hayvan kutup içine hücre kütlesinin tarafında aracılığıyla nakli iğne ucu yerleştirin. Depozito 5 - Bu alanda ön beyin / göz alanında 24 (Şekil 2I) neden olduğunu gösteren kader haritalama göre yüzeye yakın 10 hücreleri. Bütün işlem boyunca E3 orta dalmış iğne ucu tutun.
  • nakledilen embriyoların Bakımı
    1. Donör embriyolar a kaldır28.5 ° C'de 2 saat - nd 1 agaroz kalıp içinde ev sahibi embriyolar bırakın. Bu görüntüleme ile engel olacak şekilde pigment oluşumunu önlemek için% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) içeren E3 orta cam ya da (% 2 agaroz ile kaplı) plastik Petri kapları doldurun. Yangın cilalı cam pipet ile bu yemeklerin ev sahibi embriyo transferine ve 28.5 ° CO / N inkübe.
      DİKKAT: PTU tutarken eldiven giyin.

    • 6. Canlı Görüntüleme Kurulumu

    NOT: küçük boyutlu ve hızlı bir gelişme ile birlikte zebrafish optik şeffaflık farklı hücrelerin ve organların in vivo görüntüleme için önemli bir omurgalı model haline sağladı. Görüntüleme kurulum ve parametreleri farklı olacaktır Mikroskop çeşitli gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki retina gelişimi 5, 8 görüntüleme için uygun bir konfokal görüntüleme kurulumu anlatılmaktadır.

    1. Kimerik embriyoseçim
      1. 24 at - 26 hpf, bir floresan diseksiyon kapsamında nakledilen embriyoların gelişmekte göz primordiumunun içinde (etiketli H2A-GFP veya H2B-RFP) nakledilen donör hücreleri göstermek sağlıklı iyi gelişmiş embriyoların seçmek için ekran.
      2. Yeni bir çanak içine pipetleme montaj 40 embriyolar kadar kenara koyun ve embriyoların uyutmak için 0.4 mg / ml tricaine methanesulfate (MS222) ekleyin.
        DİKKAT: MS222 tutarken eldiven giyin.
    2. montaj embriyolar
      NOT: görüntüleme 8 ters çevrilmiş veya dik mikroskop (burada anlatılan) üzerinde yapılacaktır bağlı olarak, uygun montaj çanak kullanın.
      1. E3 ortamı içinde 0.4 mg / ml MS222 içinde% 1 düşük erime agaroz 1 mL içeren 1.5 Birkaç ml plastik tüpleri hazırlayın ve 40 ° C su banyosu içinde eritilmiş tutun.
      2. plastik bir transfer pipet içine 5 embriyolar emmek ve embriyolar yerçekimi ile ucu birikir sağlar. transfer pipet dokunun% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz ve 0.4 mg hazırlanmış plastik borular arasında bir yüzeyi üzerine / ml MS222 embriyolar E3 transferi miktarını sınırlayan iken tüp içine batar izin verir.
      3. dik mikroskop ve ters mikroskop görüntüleme için cam alt Petri kabı (herhangi bir boyut) görüntüleme için 90 mm çaplı Petri kabındaki Dağı embriyolar. görsel görüntü (bir tarafta) WT hosts donörlerin veya aynı deneyde morphant hosts (diğer tarafı) ikiye çanak ya bölmek için kalıcı bir kalem kullanın.
      4. 1 ml agaroz - 0.5 ile Petri kabı ya agaroz plastik tüp beş embriyolar transfer. kalır - sadece küçük bir damla (300 uL ~ 200) için bir transfer pipeti ile fazla agaroz çıkarın. dik mikroskobu ile görüntüleme varsa, Petri çevresinin 1 cm mesafede embriyolar koymaktan kaçının. Görüntüleme için kullanılan suya daldırma daldırma objektif nedeniyle Petri kabı duvara o bölgede merkezli olmak mümkün olmayabilir (Şekil 3A </ Strong> ').
      5. Agaroz katılaşır kadar yanal embriyoların hizalamak için (kırık ucu ile) microloading pipet kullanın. Başın her iki yanında iki gözü (Şekil 3B) tamamen üst üste binen (XY boyutta şekilde) ise yemekler her iki tip için, embriyolar doğru yanal olarak açılıdır. ters mikroskop kullanımı için, lamel yakın göz olası odak seviyeleri kısıtlamaları içinde z-boyut yoluyla görüntüleme sağlamak için, mümkün olduğunca lamel yakın itilmesi gerekir.
      6. Bireysel agaroz damla bir seferde beş embriyolar montaj devam edin. Agaroz birbirlerine ve görüntüleme (Şekil 3A) boyunca herhangi bir yerinden ayrılmasını ve yanal hareketini önlemek için çanağın yan damla katılması için daha fazla% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz kullanın.
      7. Bir kez tamamen katılaşmış E3 ortamı ile çanak kapak içeren (% 0.003 PTU, 0.4 mg / ml MS222) 28.5 ° C'ye önceden ısıtılmış.
      8. adımda 6.2.2 tarif edilen yaklaşımı kullanarak- 6.2.8, ~ ayrı bir kapta 32 ° C (adım 1.2.5) yetiştirilen 20 transgenik embriyolar monte edin.
    3. Görüntüleme parametreleri
      NOT: Görüntüleme yüksek uzaysal hücre içi kararı gerektirmeyen floresan transgenlerin başlamasını analiz etmek. 1.5 zoom W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70 mm objektif ile yapılabilir.
      1. (; Adım 6.2.8 yani 32 ° C'de yükseltilmiş) hızlandırılmış geliştirme ile ~ 20 transgenik embriyolar için transgen yoğunluğuna göre lazer gücü ve maruz kalma süresi ayarlayın.
        NOT: transgen ifadesi başlangıç ​​çalışmaları için, deneysel embriyolar time-lapse böylece kurmak ve tarihte hiçbir floresan göstermek, bu hızlandırılmış embriyolar görüntüleme parametrelerini belirlemek için çok önemlidir.
      2. Deneysel yemek için, embriyoların seviyeleri her bir embriyo görselleştirmek ve konumunu kaydetmek ve odaklanın.
        1. Yanal s ile doğru montaj açısına sahiptir embriyolar (yani seçinmümkün olduğunca yatay göz) ve kuvvetli bir kalp atışı (sağlığın bir göstergesi) ve ide. Öncelikle (gen ifadesinin dalga başlar) gelişmekte olan retina (Şekil 3C) ön ventral kadranda (H2A-GFP veya H2B-RFP etiketleme tarafından tanımlanan) bir kaç nakledilen donör hücreleri ile embriyolar seçin.
          NOT: - 25 dakika 180 atım / Zebra balığı embriyolarının, ortalama heartrate 120 olduğunu. 120 vuruş / dakika - anestezi embriyolarda, sağlıklı bir kalp atışı 60 aralığında olabilir. Yavaş kalp atışı azaltılmış canlılığı göstergesi olabilir ve bu embriyolar çalışmanın dışında tutulmalıdır.
      3. 15'e kadar embriyo retina ile 2 mikron aralıklarla optik bölümden z-yığınları ayarlayın.
        NOT: Bu parametrelerin (maruz kalma süresi ve z yığın büyüklüğü) bağlıdır herhangi bir deneyde görüntülenebilir embriyo sayısı. seçilen embriyoların tüm görüntü 1 kez noktası için harcanan zaman sh olmalızaman noktaları arasındaki aralığından daha Örter. Bazı derinlik çözünürlüğü feda ederek, daha fazla embriyolar zaman aralıklarında içinde görüntülü olabilir. z-yığınının sınırları monte embriyolar gözün lateral ve medial uç olarak seçilir ve 30 mikron z yönünde bu kurulum kayması olarak gelişmekte olan embriyoların gözünde gibi dik mikroskopi kurulumunda yan tarafına eklenir embriyolar gecede büyür. 170 mikron kalınlığında (50 - - 85 images / göz) Bu yığınlar halinde 100 sonuçlanır.
      4. transgen lazer / kanal uygun olan kullanılarak (0.5 HPF aralıklarla denk) 32 ° C 'de görüntüleri her 24 dakika sürer.
        NOT: embriyolar tüm mikroskop kapsayan ısıtılmış bir bölme içinde tüm time-lapse boyunca sahnede kalır. 24 saat time-lapse dönemi - deney 28 ° C'de yapılabilir iken, sıcak sıcaklıklar gelişimini hızlandırmak ve deneyde ilgili zaman noktaları 16 içinde görüntülü olmasını sağlamak için kullanılır.
      5. görüntüsıralı tarama kullanarak (GFP: RFP veya Vsx1 Atoh7) ve transgen - donör etiketi (isteğe bağlı H2A-GFP veya H2B-RFP) temsil eden kanallar. analizi için, tarif edildiği gibi uygun embriyolar seçmek için sadece donör etiketi kullanan (görüntüleme başında bir z-yığını almak) ve daha sonra transgen ifade yakalamak için sadece kanalda time-lapse gerçekleştirin.
        NOT: Alternatif olarak, uygun embriyolar seçmek için sadece donör etiketini kullanın (yani teyit nakledilen ön ventral kadranda hücreler olanlar) ve görüntü sadece transgen kanalı, kabaca görüntüleme süresini yarıya indirmek ve neredeyse görüntülü ve başına analiz edilebilir embriyo sayısını iki katına deney (Şekil 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Bu çalışma yabani tip retina atalarıdır bir morphant ev sahibi embriyo içinde geliştiğinde gen ifadesi zamanlama değişiklikleri değerlendirmek için deneysel bir protokol sunar. Deneysel ana embriyolar retina 7, 26 ara doğan yatay ve amacrine internöronlardan eksikliği Ptf1a morphants vardır. Bunlar standart bir kontrol morfolino enjekte edildi konak embriyolar, kontrol karşılaştırılmıştır.

    (Retina dahil) merkezi sinir sistemi boyunca nöron farklı türde nöron oluşur yana yüksek oranda korunan bir sonraki kaderin ilerlemesi hücre otonom-olmayan geri bildirim bağlıdır sırası 27, 28, 29, 30, 31, histogenezDaha önce doğan nöron tipleri biriken. Bu hipotez, ara madde doğan nöron türlerinden yokluğunda geliştirilmesi nakledilen projenitör hücrelerin daha sonra doğmuş nöral türlerinin üretimi zamanlaması konusunda test edilmiştir. Bir kontrol olarak, erken doğan hücrelerin zamanlaması, bağımsız bir şekilde, ara hücreleri oluşturulacak olup olmadığına etkilenmeyen olması gereken nicelleştirilmiştir. Hattı geç başlangıçlı analiz etmek için kullanıldı, bu amaçla, Tg (atoh7: RFP) veya TG (atoh7: gapGFP) Tg (GFP vsx1) ise hatları ilk doğan ganglion hücre nöron başlamasını görselleştirmek için kullanıldı doğan bipolar nüfus. ayrıca muhabir transgenlerin ifade dışında, bu embriyolardan donör hücreleri genetik olarak WT vardır.

    3 HPF floresan bildirici protein ekspresyonu tek hücreli aşamada embriyolar sonuçların sarısı içine (etiket donör hücreleri) 1 nL mRNA Mikroenjeksiyonsahne parlak donörler (Şekil 1) seçilir. Embriyolar 2 hpf (Şekil 2) etrafında olduğunda nakli kurulumu hazırlayın. 24 hpf ilgili retina yerle nakledilen verici hücreler embriyolar seçilir ve beş (Şekil 3) grupları içinde% 1 düşük erime agaroz monte edilebilir. 24 saat - z-yığını ve zaman parametreleri ayarlayarak, embriyo konumunu kaydettikten sonra, zaman atlamalı görüntüleme 16 için gerçekleştirilir. ilk doğan ganglion hücrelerinin Zamanlama Atoh7 başlaması ile gösterilir: RFP veya Atoh7: GFP transgen, aynı zamanda belirgin düşük parlaklıkta ifade edilir: gapGFP transgen ve son doğan bipolar nesil zamanlaması Vsx1 güçlü upregülasyonu ile gösterilir gelişmekte olan atalarda seviyeleri. Bu Atoh7 ilk transgen ekspresyonu, zamanlama: gapGFP görüntüleme her bir zaman noktasında (beyaz ok başları, Şekil 4) tek tek hücrelerde tanımlanır. Atoh7: gapGFP ve gangliyon hücre farklılaşması occune olursa olsun ev sahibi embriyo WT veya Ptf1a morphant eksik ara (yani ganglion hücre doğumdan sonra) yatay ve amacrine hücreleri olup olmadığı eşdeğer zamanlarda rs.

    Sunulan veriler bu deneysel yaklaşım normal gelişimsel süreçleri anlamak için değil, aynı zamanda normal ve hastalıklı şartlarda hücre yeniden programlama stratejileri gelecekteki uygulamalar için değil sadece ilgili sonuçları ile, gen ifadesi zamanlaması özellikle retina ortamlarda rolünü değerlendirmek için güçlü bir araç sağladığını gösterir .

    Şekil 1
    Şekil 1: Tek hücreli Sahne Embriyolar Yolk içine Mikroenjeksiyon Donör Hücreleri Etiket ve farklı ana Ortamları oluşturmak için kullanılır. A) Embriyolar çevreleyen sıvı yeniden çoğu bir cam slayt kenarına dayandığındantaşındı. B) İğne sarısı ve H2A-GFP veya H2B-RFP mRNA ya (donör) veya ana bilgisayar için morfolino (standart MO veya Ptf1a MO) merkezine yerleştirilir enjekte edilir. C) Enjeksiyon iğnesi her kılcal boşluktan iki simetrik iğneler üreten bir iğne çektirmenin kullanılarak oluşturulur. Her çekilmiş İğne daha sonra kolayca embriyolara sokulabilir (künt olan) bir keskin açılı ucu temin ederken iğne açma forseps ile kırık ucu olması gerekir. Tek hücreli aşamada H2B-RFP mRNA enjekte D) Donör embriyolar en parlak ve en eşit etiketli embriyolar seçilebilir sahne hangi 2.5 hpf tarafından floresan muhabiri proteinleri ifade başlar. E) Yaklaşık 2,5-3 hpf, donör ve host embriyolar enzimatik proteazları kullanılarak dechorionated edilir. Bir Erlenmeyer şişesine türbülanslı açık zayıflatılmış chorions kırmak için gerekli olan mekanik gücü sağlar ve dechorionated embriyo getirirmerkezine s. En kısa birinci (yıldız) ya da birkaç dechorionated embriyolar gibi, gözlemlenen hızlı, ancak hafif bir durulama proteaz çözeltisi bertaraf edilmesi garantiye alınır edilir. Dechorionated embriyoların transferi için F), cam transferi pipetler kullanılmaktadır. Bunlar başlangıçta rahatça kapalı oturana kadar bir elmas bıçak ile uygun pozisyonda cam çizilerek, kullanıcı tarafından manevra herhangi bir uzunluk (isteğe bağlı) kısaltılabilir. Bu yangın cilalı hücrelerine zarar verebilir kenarlarındaki smoothen transferi sırasında pipet içine çekileceklerinden olması gerekir keskin kesme ucu, sonuçlanır. Ölçek çubukları, A, B, D, E = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2: Transplantasyon Kur. B) gösterilen nakil boru eklem potansiyel sızıntı sadece moldable macun ve parafin film kullanılarak engellenir nasıl gösterir. C) Enjeksiyon boru ve herhangi bir uygun boru arasındaki bağlantı daha yüksek bir büyütme görünüşüdür şırıngaya bağlamak için kullanılır. bir boru kullanılabilir, ancak burada kullanılan boru sıkı 10 uL pipet uyan bir çapa sahiptir. sıkı bir mühür sağlamak için parafin filmi kullanın. D) kalıp agaroz enjeksiyon plakası üçgen divots oluşturmak için 150 (6 x 25) takozlar vardır. E) Her kama şekli yaklaşık boyutları gösterilmiştir. şirket ölçümleri tescillidir. F)Ev sahibi embriyolar ile dolu 6 - kama şeklindeki girintilerine hazırlanmış agaroz püskürtme levhalar donör birinci sütuna eklendi embriyolar ve sütunlar 2 ile birlikte kullanılır. Transplantasyonları her satırda bir donörden toplanan hücreler 5 ana embriyolara nakledilen sayede satırda, karşısında yapılır. Her bir kalıp içinde, en fazla 25 vericiden hücreler 125 ana embriyoların kadar transplante edilebilir. kalıp Petri kabı kenarına yakın kama derin ucuyla asimetrik yerleştirilir unutmayın. Bu Petri kabı kenarına isabet olmadan Sağ taraftan nakli iğne sağlar. G) nakli iğne Burada gösterilen uzun konik ucu ile sonuçlanması enjeksiyon iğnesi ile aynı parametrelerle çekilir. İğne onları deforme olmadan hücreler sürebilir büyük bir iç çapı üretmek için kırılması gerekir. yüksek güç ilave gösterildiği gibi transplantasyon iğne ucu açılı olması ve ideal bir "flüt" şeklinde olması gerektiğini göstermektedirBu örnekte. H) Yüksek güç görünümü üstündeki hücreleri ile ev sahibi embriyoların yönünü gösterir. nakli iğne yanal blastula sahne konak embriyo hücre kütlesi (beyaz yıldız) yerleştirilir ve burada gösterildiği gibi gelecek gözüne itilir. Donör hücreleri nakli iğne (ok) ve bu şekilde kontrol edilebilir nakledilen hücrelerin kaba sayıda görülebilir. I) sol ve sağ) gösteren iki örnek (hemen naklinden sonra, doğru yerde başarıyla nakledilen hücrelerle embriyolar derhal donör etiketi (örn H2B-RFP) kullanılarak dizildi edilebilir. Bir floresan kanal "doğrusal soldurma (ekleyin)" raster grafik editörü katman menüsü altında seçeneği kullanarak aydınlık eklendi. = 500 um (H, I için) Ölçek çubuğu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


    Şekil 3: Time-lapse Görüntüleme için Montaj Embriyo. A) Beş embriyoları içeren birden çok, düşük erime sıcaklığı olan agaroz damla gösteren Petri kabı (90 mm), agaroz ile bağlı, her ayırma tek tek damla önlemek için sağlam bir ağ oluşturmak için. B) 24 hpf embriyoların yanal hizalanmış ve katılaşmış agaroz içinde gömülü Yüksek güç görünümü. İdeal bir açı için, iki göz (z-boyutunda) birbirinin üzerine yerleştirilmesi gerekir. , Ilgilenilen genin bağlı ilgili zamanlama hemen önce kadar ertelenmesi gerektiğini montaj (örneğin, ganglion hücre farklılaşması için 26 hpf veya bipolar hücre farklılaşması başlaması için 35 hpf). C) aydınlık ve kırmızı kanalları kaplamayı gösteren tek bir optik z bölümün Konfokal görüntü (kullanarak "doğrusal atlatmak (eklemek)" katman menüsü altında seçenekAksi takdirde etiketsiz konak ortamında birkaç etiketli donör hücreleri (kırmızı) ile gelişmekte olan gözün raster grafik editörü). Ölçek çubuğu B = 1 mm çaplı çubuk C = 50 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4: nöron Zamanlama Farklı Sunucu Ortamlarında içine nakledilen Transgenik Donör Hücreleri görülebilir. Etiketsiz WT konağa nakledilen transgenik embriyolar: Tg (gapGFP atoh7) gelişen WT donör hücrelerinin time-lapse görüntü mikrograjlar. Transgen ekspresyonu başlangıçlı beyaz ok başları bir kaç hücre endikedir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Daha büyük bir sürüm o görmek için lütfen buraya tıklayınızBu rakam f.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    verimli, belirli bir post-mitotik hücre tipinde, hatta desenli doku içine ayırt etmek için embriyonik veya uyarılmış multipotent kök hücreleri talimat amaçlayan zaman hangi ölçüde komşu hücrelerin hücre zarı kaderi belirleyen faktörlerin ifade zamanlamasını etkilemesi anlamak esastır. Ayrıca, canlı hayvanın gelişmekte olan hücrelerde bu moleküler olayları inceleyen ayrıca ilgili dinamiği in vivo bu olaylar ile ilgili özel hücresel bağlamlarda (zamansal ve mekansal) bilgi sağlar. Bu tür çalışmalar kolayca tüm omurgalı modellerinde elde edilemez.

    Sunulan protokolde, mükellef Zebra balığı embriyosu gözdeki henüz son derece organize, nispeten basit üç boyutlu desenli dokuda, in vivo bu soruları yanıtlamak için bir omurgalı model olarak istismar edilmektedir. Bu, belirli bir retina hücresi tüketen hipotezini test ederek örneklenmiştirtip gen ifadesi zamanlaması ve retina progenitör hücrelerin gelişim kaderini etkiler. Biz ayrıca, örneğin, tekrar değerlendirmek için zaman içinde belirli hücreleri izlemek için verici hücre işaretçisini kullanabilir bir postmitotik hücrenin son bölümü uygulanan ya da bu hücreden genel davranışlarını değerlendirmek kadar uzun bir transjenin ifade önce (örneğin yer değiştirme) farklı ortamlar transgen ekspresyonu önce çeşitli aşamalarında. Bu çalışmalar için, nispeten kolay bir arada transplantasyon ve canlı görüntüleme yıkmak morfolino-aracılı gen dahil olan teknikler sunulmuştur gerçekleştirmek için. transplantasyon yöntemi için protokol bir roman, nispeten kolay ve ucuz nakli kulesi tanıtır ve bu işletim kurulum kolaylığı gösterir.

    Bu protokol, retina ile sınırlı değildir. Ayrıca, hücre özerk developm çözülmesinden gerektiren farklı dinamik hücresel süreçlerin bir dizi çalışma uygulanabilirHücre dışı özerk çevresel etkenlerden ental programları. küçük sorun giderme gerekli Bununla birlikte, kritik adımlar bir dizi öncesinde bir deney başlamadan dikkate alınması gerekir. tekniğinin başarılı uygulama için önemli bir ön koşul seçimi organ veya doku kolayca kader haritayı kullanarak erken embriyo hedef gerektiğidir. Doku hedefleme etkinliği daha önce test edilmemiş ise, bu ilk optimize edilmiş ve standart edilmesi gerekmektedir. microinjected ve nakledilen embriyoların sayısı arttı ve donör hücreleri ile yeterli embriyolar doğru entegre ve ilgili dokusu içinde yer almak için görüntüleme yaşamak için önce taranabilir. Buna ek olarak, bu protokol kolayca iki nedenden dolayı daha zor hale artan larva olarak, erken dönemde embriyo zebrabalıkları aşamalarında sonraki aşamalarında uygulama uygulanabilir ise. Birincisi, morpholinos ile elde demonte genin etkinliği zamanla azalır (deHer morfolino bekleyen, o) genellikle 3 dpf'e önce en etkili yöntemdir. Bu sorunu geçersiz kılmak için, nakli için donör embriyoların genetik mutantların kullanılması tercih edilir. Zebra balığı büyüdükçe İkincisi, larvaların derin kısımları, özellikle mikroskop objektif çalışma mesafesi daha sınırlıdır yüksek büyütme (yüksek güç hedefleri) de, bir konfokal mikroskop ile görüntüleme için daha az erişilebilir hale gelir. Böylece, ilgili yaşta ilgi her doku için, birinci görüntüleme kendi amenability için değerlendirilmesi gerekmektedir.

    zaman atlamalı görüntüleme ters veya dik konfokal mikroskop ya da gerçekleştirilebilir.

    Dik mikroskop bir çok avantaj, veya mevcut bulunmaktadır. Gerekli sıcaklıkta, kullanılan daldırma maddesinin buharlaştırılması (örn, su kırılma endeksi su veya daldırma yağı), bir ters mikroskop tam kuruması yol açabilir. Bu sürekli izlenmesi gerekir vesonunda odak dışı numune yerleştirme riski, dolumu. Bu kısmen, nesnel bir tanımlanmış mesafe düşürmek için otomasyon kullanılarak daldırma madde eklenmesi ve bizim deneyim olsa, yine objektif yükselterek önlenebilir, refocusing hala sık sık görüntüleme dahaki sefere noktasının başlamadan önce gerçekleşmesi gereken, gerekli . İkincisi, biz kaynaklı en büyük lamel alt yemekler hala dik mikroskopi için kullanılan standart 90 mm çaplı Petri daha (çapı 50 mm) çok daha küçüktür. Bu ters mikroskop kullanarak monte edilebilir embriyoların sayısı ile eklenen embriyo orta hacimli daha sınırlı olduğu anlamına gelmektedir. Bununla birlikte, zaman atlamalı parametreler genellikle görüntülü ve bu nedenle yemeğin boyutu yine uygundur edilebilir embriyo sayısı için ana sınırlayıcı faktör oluşturmaktadır. Çok yüksek büyütme hedefleri kullanırken, ters mikroskopi göz gibi z-boyutta daha büyük bir derinlik izin verebilir veAmaç sadece ince bir lamel ile ayrılır. Dik mikroskobu ile çok yüksek bir büyütme birleştirirken, embriyo kapsayan agaroz damla mümkün olduğunca ince tutulmalıdır. Genel olarak, dik veya ters mikroskopi kullanılarak elde edilen veriler eşdeğer kalitede.

    yüksek kaliteli veri üretimi, dikkat edilmesi gereken ek kritik adımlar vardır. Birincisi, parlak etiketli donör seçimi time-lapse film başında gözünde nakledilen hücrelerin uygun sayıda nakledilen embriyoların elde edilmesi için çok önemli (birkaç değil, çok) 'dir. proteaz enzimatik dechorionation proteaz önemli bir adımdır ve inkübasyon hızlı takip minimumda tutulmalıdır, ancak yumuşak embriyoların sonradan sağlığını etkileyen değil durular. donör ve host embriyoların yaş eşleştirme kaderi haritasına ve hücrelerin etkin entegrasyonu için uygun hedefleme doğru dokusu sağlar. İyi biçimli transplantasyon neEdle ucu nakledildikten hücrelere mekanik hasara neden değil, küçük ve fazla zarar vermeden ana embriyolara eklemek için yeterince keskin, ancak iç çapı yeterince büyük olması sağlanmış, önemlidir. ekipmanlar tamamen (özellikle bağlantı noktalarında) mühürlü değilse nakli sırasında, elle içine ve nakli iğne dışarı E3 orta ve hücrelerin hareketini kontrol etmek çok zordur. elle şırınga ses seviyesini değiştirmeden içine veya transplantasyon iğnenin dışarı ya akış varken bu en açıktır. Bu durumda tüm eklemler yeniden kontrol ve tekrar kapatılmalı. Bu deneyde önceden test edilmesi gerekir.

    Son olarak, transplantasyon ve zaman atlamalı kurulum arasında geçen süre içinde, nakledilen embriyoların titizlikle herhangi sağlıksız embriyoların temizleme iken düşük yoğunlukta geliştirmek için izin verilen önem taşımaktadır. Bu, özellikle önemli olduğunda geliştirme veya gen zamanlamasıE ifadesi araştırılmaktadır. Herhangi bir işlem (örneğin, gen ekspresyonu) zamanlamasını değerlendirilirken, kontrol morfolino teknolojisinin spesifik olmayan yan etkileri ortadan için kullanılmalıdır. Bizim çalışmamızda, morfolino tarafından hedeflenen belirli gen tarafından etkilenmeyen bir ilişkisiz doku (örneğin, kas) transgen ekspresyonunun zamanlama kullanmak.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Bu eser (PO 1440 / 1-1) LP PRJ bir ARC Decra (DE120101311) tarafından ve bir Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) araştırma bursu ile desteklenmiştir. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Federal Hükümeti fonları tarafından desteklenmektedir. Biz Kei ve ark yayınlanan Burada anlatılan deneyler yaptılar Dr. Jeremy Ng Chi Kei, kabul. 2016 Prof. Higashijima gelen transgenik balık hükümleri için minnettarız ve Profs teşekkür ederiz. H2B-RFP ve H2A-GFP yapıları oluşturmak için pCS2 plazmid Dr. Wilkinson sağlanması için Turner ve Rupp. Biz hayvanların bakımı için FishCore tesis personeli (Monash Üniversitesi) teşekkür ederim.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    Gelişimsel Biyoloji Sayı 121 Zebra balığı transplantasyon chimera canlı görüntüleme hücre özerk olmayan retina gen ifade zamanlaması nörogenez
    Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade <em>Vivo</em> Görüntüleme <em>Hücre</em> otonom olmayan Etkiler Eğitim için
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter