Summary
行为测试用于临床试验, 以评估疾病或治疗对动物福祉的表型影响。为了在全球范围内评估电机的功能, 我们选择了一般运动, 肌肉力量和协调的测试: 开放现场测试, 网格测试, 和 rotarod 测试, 分别。
Abstract
行为测试用于临床前试验, 以评估特定疾病或治疗对动物的福祉和健康的表型效应和结果。有许多行为测试可以应用。我们选择了一般运动测试, 野外测试 (经常);肌肉强度的测试, 网格测试 (MT);和测试的协调, rotarod 测试 (RR)。测试可以在每周或每月的基础上完成。作为一般运动的一个测试, 经常工作通过客观地监测运动参数, 而鼠标是在野外设备。该领域通常是一个 2 ' x 2 ' 盒, 并通过激光传感或视频捕获记录的运动。鼠标放在开放字段的中心, 允许自由移动以进行测试。MT 使用鼠标从一个倒置的屏幕上掉下来作为衡量肌肉力量的时间。将鼠标放在屏幕上, 在一个清晰的框上反转, 并定时等待它们的滞后时间下降。进行了三项试验, 最好的三项试验是在当天取得的。六十年代的分数是鼠标左倒的最长时间。在网格测试试验中, 给老鼠5分钟的休息时间。最后, 关于 RR 的加速的协议评估马达协调和耐力。在试验中, 鼠标在旋转杆上行走, 因为它在转速从 4 rpm 增加到 40 rpm 超过5分钟。试验结束时, 鼠标接触磁化压力传感器后下降。每只老鼠经历了三次试验, 最好的试验是在那一天取得的。这种综合行为数据允许对测试动物的移动性、协调性、强度和运动进行全球评估。在三行为测试措施中, 至少有两项必须表现出对动物的改进, 以使其具有整体改善运动功能的资格。
Introduction
行为测试的目的是测量表型特征, 无论是研究新的小鼠模型的疾病影响中枢神经系统或试用新的治疗。有各种各样的行为测试可供选择。使用行为测试组合的基本原理通常是充分评估临床治疗前的结果。行为测试的电池包括开放现场测试 (经常), 网格测试 (MT) 和 rotarod 测试 (RR)。
常用于一般运动活动的测量1,2,3,4,5,6,7。此评估允许鼠标在一个开放的领域自由移动, 并采取的测量是鼠标在行为试验过程中的动作。使用一个经常包括饲养, 距离移动, 时间花费移动 (例如,行走和跑步) 和活动随着时间的变化 (例如,跳跃和慢/多动运动) 的定量分析, 这就是为什么它是一个有用的和彻底分析啮齿动物的行为。
MT 用于评估鼠标的强度1,2,8,910。使用所有的四肢体挂断铁丝网网格允许非侵入性测量的能力的小鼠表现出持续的肢体张力, 而反对的影响重力。这一评估是通过把鼠标放在一个倒置的网格上, 并定时它的滞后时间下降。这项测试通过测量在脱落前它能在倒置的屏幕上保持多久来评估鼠标的肌肉强度。
RR在使用加速协议1、2、7、8、9、1213中评估鼠标的协调性。rotarod 装置由一个圆柱形光束组成, 在空气中旋转 4 rpm。鼠标可以学习这种运动协调的技能, 然后由缓慢, 增量增加到 40 rpm 挑战。经典的, 恒定速度协议是衡量肌肉力量, 而加速的协议为 RR 评估协调, 耐力和肌肉力量1,2,7,14。
这三行为测试的优点是, 他们被广泛接受的整个啮齿动物行为测试社区2,7,8,9, 当采取不只是作为总和个别测试, 但总的来说, 他们可以被用来作为一个全球评估的表型行为时, 调查不同的结果, 实验治疗。经常是唯一的测试为整体运动活动2。RR 也是评估协调2的唯一方法之一, 而不是使用步态分析软件, 这在这里不会讨论。有几种方法可以评估老鼠的肌肉强度;然而, 使用 MT, 或线挂测试, 已被普遍使用的文献和被接受为可靠的方法测试肌肉力量2,8,9,10,11. 测量一般运动和协调的许多其他技术非常耗时, 可能不会产生可靠的数据 (例如,手动定时鼠标移动或手动绘制用于步态分析的爪子)。自动系统的经常和 RR 增加了数据的可靠性和有效性, 并节省了时间和精力。
例如, 考虑到山德霍夫病小鼠模型的神经, 在执行这一测试电池时, 经常会是这些测试的第一个, 用来评估通常在3月大的时候从这个小鼠模型中看到的运动异常。在12周的年龄, 运动协调方面的赤字也应该开始显现。肌肉力量的缺陷应该在14周的年龄开始, 但最终会比16周更重要。
这些测试是有用的, 当研究导致重大运动损伤的疾病, 包括神经退行性疾病9如山德霍夫疾病1,8,13, 帕金森病7,亨廷顿氏病多发性硬化症这些测试还可以用来研究衰老, 并进行比较的老年评估或健康测量。步态紊乱和运动和平衡的变化在许多这些疾病状态中被看到。然而, 这些测试的用处并不局限于有普遍神经肌肉症状的疾病。
请注意, 在动机或任何被描述的行为测试措施的新奇性方面, 都没有发现混杂变量。在老鼠显示出任何表型症状之前, 研究者获得初步的行为数据是某些疾病状态和病症的必要条件;研究员应该周期性地 (每周) 保证所有马达损伤被交代。许多疾病有快速出现的表型症状, 没有每周的测试, 这些症状不会被占。
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Protocol
本文所述的所有协议都是按照女王大学动物保育委员会的批准进行的。行为测试的频率可以是每周或每月, 或者是两个的组合 (即,每周一次, 当你期望看到最大的差异, 每月在别处)。
注意: 小鼠的行为研究主要是性/年龄/应变依赖性, 因此, 必须收集适当的时间点, 并保持一致的跨实验组。环境因素 (例如,气味、噪音、温度、湿度照明、等) 极大地影响了小鼠的行为和焦虑。尽量减少这些环境因素。
1. 野外试验
注意: 在进行行为测试之前, 动物应该习惯于测试开始前 10-15 分钟的房间。确保行为测试协议遵循适当的个人防护设备和所有当地设施的指导方针。
注: 测试前不进行培训。
- 确保计算机和经常程序已打开、正在运行, 并正确连接到照相机或开放域框。单击 smartware 程序、打开字段图标和 "确定"。从摄像机选项中选择了 "数字模拟转换器" 源。点击 "检测", 并确保整个开放领域的空间是可视化的, 尺寸是 30 cm x 30 厘米。
注意: 设备布局可能会因空间限制而异, 但要确保计算机和开放的现场设备在光线充足的房间内彼此接近, 以便进行适当的视频捕获。 - 单击 "校准"、"快照", 然后 "确定" 以确保在打开的域范围内检测到鼠标。单击 "时间" 以预先设置测试鼠标的时间量;在这种情况下, 设置5分钟。
- 通过单击 "主题" 图标输入主题。单击 "计划程序", 并突出显示所有测试对象, 然后单击 "双绿色箭头" 和 "第一阶段, 第一节"; 这将带来所有的主题, 以开始收集数据。
- 将鼠标放在打开字段的中心, 然后单击 "开始" 图标以提示程序开始录制。一次只测试一只老鼠。
- 一旦5分钟完成, 程序将自动移动到下一个主题。在这种情况下, 请移除已完成测试的鼠标, 并将下一个主题放到打开的字段中。单击 "开始"。
- 把设备擦干净对其余的测试对象重复步骤 1.3-1.4。
- 为了在所有的实验对象都经过测试后分析数据, 点击屏幕右上方的 "分析" 图标。再次单击 "分析", 然后 "汇总报告"。(可选) 将数据导出到 USB 上。
2. 网格测试
注: MT 的表面面积和网格大小可能会影响性能。在 MT 上, 如果一只老鼠在第一个十年代的第一个2收集时间点内脱落, 它们将立即被放回网格上进行第二次尝试。这里使用的网格是一个金属丝网, 网孔直径约1.5 毫米。
注意: 建议在一天的同一时间运行这些测试, 因为生理和生物化学参数在一天中波动。体重可能影响这项试验的表现, 因此必须加以考虑。
- 将鼠标放在网格的中心, 并将网格翻转到至少20厘米以上的透明容器上。一旦反转, 启动计时器。
- 时间和记录的滞后时间下降。如果鼠标不属于六十年代, 给它一个分数六十年代和不进行进一步的试验。允许鼠标至少休息5分钟。这是1审判的结束。
- 擦拭设备, 并在5分钟内试验间隔, 如果需要, 测试第二个鼠标。重复步骤 2.1-2.2 为试验2和 3, 如果需要 (只要鼠标不得分六十年代, 它应该接受三试验)。
3. Rotarod 测试
注: 在 RT 上的杆的表面和直径可能会影响性能。在 RT 上, 如果一只老鼠在第一个十年代的第一个2收集时间点内脱落, 就把它立即放回标尺上进行第二次尝试。
注意: 建议在一天的同一时间运行这些测试, 因为生理和生物化学参数在一天中波动。体重可能影响这项试验的表现, 因此必须加以考虑。
- 打开理事会 rotarod 和计算机。确保它们已正确连接以进行数据记录。
- 确保程序正在运行加速协议。将 rotarod 测试的所需长度设置为 xxx (有效范围为000到 999);在这种情况下, 按 300 *。设置用于 xxx 的车道数 (有效范围为001到 005);在这种情况下, 按 005 *。将起始速度设置为 xxx rpm (输入3005作为 5 rpm; 有效范围为001到 045);在这种情况下, 按 004 *。
- 将最高速度设置为 xxx rpm (输入4030为 30 rpm; 有效范围为001到 045);在这种情况下, 按 040 *。将坡道速度设置为 xxx (输入5030以使30秒的坡道进入最高速度; 有效范围为000到 999);在这种情况下, 按 300 *。将单元设置为鼠标模式 (输入6001用于鼠标前进, 6002 用于鼠标反转);在这种情况下, 按 6001 *。
- 在开始试验之前, 确保所有磁化车道都是平衡的。将一只老鼠放在 rotarod 的每条车道上。
- 按 "开始" 启动程序。当老鼠倒下时, 立即把它们从车道上移开, 以确保它们不会 "绊倒" 其他车道。
- 允许老鼠休息10分钟的间隔试验时间。这是1审判的结束。在试验间隔时间内, 擦拭设备, 开始试验下一组小鼠。
- 根据需要重复步骤 4-6。如果鼠标停留在 rotarod 上进行完整的5分钟试验, 则不需要对该鼠标进行进一步的试验。
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Representative Results
研究动物可以每周或每月接受行为测试范式, 以适应分析所需的必要时间点。有关行为测试计时的示例, 请参见图 1 。在下面的代表性数据中, 取自 Osmon et al。(2016), 小鼠每月接受行为测试, 从12周开始, 直到他们的人性化终点大约40周龄。行为测试的时间对实验来说有时是至关重要的, 特别是当未经处理的与经过治疗的动物的生存范围很广并且需要进行比较时。
虽然这些测试并非仅用于神经退行性疾病, 但我们使用了山德霍夫小鼠 (参见图 2)。这种鼠标模型变得越来越不稳定和不协调从 12-16 周的年龄, 如果未经处理, 通常需要 euthanization 在16周的年龄1。图 2D中的数据演示了如何使用 rotarod 作为一种方法来查看被处理的小鼠与正常的杂小鼠的行为。两组在40周的差异表示治疗组的开始减少协调与正常对照。在其他的小鼠模型中, 一个温和的表型正在检查, 进一步扩大和专业化的这一电池的测试建议。
在选择发布的相关结果时, 重要的是要记住两个主要因素。第一个是, 所使用的指标应选择是特定的动物模型正在使用。在经常使用的度量中, 最常用的是 "时间移动" (如图 2所示);然而, "距离旅行" 也是一般运动的共同指标。在 RR 中, "结束 rpm" 和 "距离旅行" 是常用的度量标准。选择应选择哪个指标作为适当结果的第二个因素围绕着哪个指标揭示了行为结果中最显著的分歧或收敛, 这取决于预期的结果。
收集的数据可以使用多个统计测试进行分析, 但对于每周或每月使用相同的小鼠进行的行为测试, 我们建议对方差进行2路重复测量分析 (2 路 RM 方差计算)。重复的测量方差分析能够对同一动物的结果进行纵向评估, 并允许比较动物行为随时间变化的情况, 以及群体之间的差异。Bonferroni 校正也被建议。在对同一 timepoint 中的治疗进行比较时, 建议进行单向方差分析, 如图 2所示。
图 1: 行为测试的可能实验时间线示例.行为测试可以通过各种时间线来完成, 这取决于实验的需要。测试可以在每月、每周或组合的基础上进行。在提供的例子中, 研究期间持续23周, 其中周0是治疗管理。当测试按月进行时, 测试将在4、8、12、16和20周进行。当每周进行测试时, 每个星期 (1-22 周) 在23周的端点之前进行测试。当测试在一个组合的基础上进行时, 测试每周在 1-8 周执行, 然后在20周的终结点之前按周12、16和23进行测试。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:每月行为测试结果表明, 经过治疗的动物优于未经处理的动物.在12周内, 经过治疗的动物在 "时间移动" 中的(A)和 MT (E)中的 "潜伏期" 上胜过未经处理的动物。在12周的(C)中, 治疗和未处理的动物在 "rotarod 结束 rpm" 中没有统计学差异。在每月的行为测试中, 经过处理的小鼠对经常的(B)、RR (D)和 MT (F)中的正常杂控件执行类似的操作。所有的统计分析都是使用统计软件 (例如GraphPad) 进行的, 对12周分析 (2A、C和e) 进行了单向分析方差测试, 并对每月进行了2路 RM 方差检验 (2B、D、和F)。所有误差线都是 SEM。此图从 Osmon et al.中修改1并在 Liebert 发布者的许可下重印, Inc.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
对所有的测试, 清洁和消毒的表面, 以尽量减少感染和干扰的小鼠。同时, 在使用经常、RR 和 MT 时, 一定要让老鼠在试验之间和行为测试之间有足够的休息时间。
在经常的情况下, 关键的是每个鼠标都放在开放字段的中间, 并在鼠标释放到中心时启动程序。确保没有手的动作, 传感器可以注册后启动程序。
对于 MT, 重要的是有一个屏障之间的网格区域的鼠标将悬挂和双方的容器, 他们落入。人们已经注意到, 当老鼠能够到达容器的一侧时, 它们会慢慢地松开它们的前爪, 然后它们的背爪往下跳。在墙壁和网格的中心之间贴上一道屏障, 可以大大减少这种行为, 并能更精确地测量肌肉力量。
单独, 这些测试是一个很好的措施, 一般运动 (开放现场测试), 肌肉力量 (网测试) 和协调 (rotarod)2,7,8。然而, 在一起, 这三行为测试的完整收集允许对小鼠的运动的广泛评估。这组测试独立地证实了在复杂的马达功能上缺乏混杂的影响。这些方法的主要限制是他们对运动的一般评估, 这是在行为功能的极端具体的缺陷问题。此外, 这些测试, 像所有的行为测试, 是受外部压力, 如声音, 温度变化, 和轻周期行为的变化。为所有测试对象保持一个一致的外部环境是谨慎的。这一电池的行为测试可以扩大, 包括测试共济失调和记忆。其他研究肌肉力量的方法2,8,9包括传导恒速 RR, 以关联肌肉力量的结果与 MT。对于肌肉力量, 协调, 或共济失调的更具体的评估, 有握力强度2和重量测试15和平衡梁或步态分析检测2, 分别。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢新希望研究基金会继续支持和资助我们的调查。我们还要感谢理事会对这项工作的部分财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
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