Summary
病気や動物の健康の治療の表現型の影響を評価するために臨床試験で使用行動テストします。モーター機能をグローバルに評価するために我々 は、一般的な歩行、筋力、調整テストを選択: オープン フィールド試験、メッシュ テストと rotarod テストそれぞれ。
Abstract
特定の病気または治療は動物の幸福と健康、表現型効果と成果を評価するために臨床試験で使用行動テストします。適用可能性があります多数の行動テストがあります。我々 は一般的な歩行のためのテストを選択すると、オープン フィールド テスト (OFT);筋力のテスト、メッシュのテスト (MT);rotarod テスト (RR) の調整のためのテスト。毎週または毎月の基礎のテストが実施できます。一般的な歩行のためのテストとして客観的にマウスの動作パラメーターを監視することによって OFT 作品は、オープン フィールド機器です。フィールド 2' x2 ' ボックス、およびレーザー検出やビデオ キャプチャの動きが記録されます。マウスはオープン フィールドの中央に配置、テストを自由に移動できます。MT は、筋肉の強さの尺度として画面の反転から落ちないようにマウスの遅延を使用します。マウスは、クリア ボックスの上が反転し、秋にその遅延時間は画面に配置されます。3 つの試験は、その日に獲得した 3 つの試験の最高の実行されます。60 点 s は反転マウスが残っている最大の時間。マウスは、メッシュ テスト試験の間の 5 分間の休息期間が与えられています。最後に、RR の加速プロトコルは運動協調性と耐久性を評価します。40 rpm 5 分間に 4 回転数から速度を増加すると、試用期間中に回転棒上マウスを歩きます。マウス落下時に磁化の圧力センサーに触れたときに、試用が終了。各マウスは、3 つの試験を受けるし、その日の最高のトライアルを獲得します。この結合された行動データは、移動、調整、強さ、および実験動物の動きの全体的な査定のためことができます。少なくとも 2 つの 3 つの行動のテスト対策は全体的な改善運動機能を持つものとして修飾する動物のための改善を示す必要があります。
Introduction
行動テストの目的は、中枢神経系に影響を与える疾患の新しいマウス モデル、あるいは新しい治療法の試みの研究でかどうか表現型特性を測定するためです。さまざまなから選択する行動のテストがあります。行動テストの組み合わせを使用するための理論的根拠は頻繁完全に前臨床試験の治療成績を評価します。メッシュ テスト (MT) と、rotarod テスト (RR)、行動テスト バッテリーに本オープン フィールド試験 (OFT) が含まれています。
OFT は一般的な自発運動1,2,3,4,5,6、7のメジャーとして使用されます。この評価により、オープン フィールドを自由に移動するマウスと測定した行動の裁判の過程でマウスの動きがあります。飼育、移動距離、時間を含める、OFT 使用定量分析過ごした移動 (例えば、歩行・走行)、および変更活動でなぜそれが便利である (例えば、ジャンプと遅い/非常に活発な動き)、時間の経過と齧歯動物の行動を徹底的に分析。
MT は、マウス1,2,8,9,10,11の強さを評価するために使用されます。ワイヤー グリッド メッシュのオフにハングアップするすべての 4 つの手足は、重力の影響を反対している間持続的な手足の緊張を表示するマウスの機能の非侵襲的計測の使用します。この評価は、倒立のメッシュにマウスを配置して落下する待機時間のタイミングで行われます。このテストは、どのくらいの期間保持できる自体反転画面上に落下する前に測定することによって、マウスの筋力を評価します。
RR は、加速プロトコル1,2,7,8,9,12,13を使用している間、マウスの調整を評価します。Rotarod 装置は、4 rpm から始まる空気で回転する円筒形根太で構成されています。マウスはこのモーターの調整スキルを学ぶことができる、40 rpm までゆっくりと、増分量の増加は、挑戦します。RR の加速プロトコル評価調整、持久力と筋力1,2,7,クラシック、定速プロトコルは筋肉の強さの測定14。
これらの 3 つの行動テストの利点は、齧歯動物行動テスト コミュニティ2,7,8,9、全体との合計としてだけではなく撮影時に広く受け入れられていること、個々 のテストしかし、総称して、彼らは、実験的治療の異なる結果を調査するときに、表現型の動作の全体的な査定として使用できます。OFT は、全体的な自発運動2の唯一のテストであります。RR はまた、ここでは説明しません、歩行分析ソフトウェアを使用するよりも、他調整2を評価する唯一の方法の 1 つです。マウスの筋力を評価できます。 いくつかの方法があります。ただし、海抜文献で使用されている MT、またはワイヤー ハング テストを使用して、筋力2,8,9,10、をテストするための信頼性の高い方法として受け入れられています。11. 一般的な歩行運動と調整を測定するための他の多くの技術は非常に時間がかかり、信頼性の高いデータ (例えば、手動でマウスの動きのタイミングや手動で歩行分析のため足の塗装) を生成可能性があります。OFT と RR のための自動化されたシステムは、信頼性と妥当性の生産データと時間と労力を節約を増やします。
たとえば、サンドホフ病マウスモデルの神経変性を与えられて、この一連のテストを実行するとき、OFT は最初の通常生後 3 か月から始まるこのマウス モデルで見られるモーターの異常を評価するために使用されるこれらのテストの最初になります。モーターの調整で赤字も 12 週齢で見かけの先頭になります。筋力の赤字は、年齢の約 14 週間を開始するが、彼らは最終的にはるかに重要な 16 週目になります。
これらのテストは、サンドホフ病1,8,13,7パーキンソン病など神経変性疾患9を含む、重要な運動障害を引き起こす病気を勉強して役に立つハンチントン病、多発性硬化症。テストは、高齢化を研究し、比較的高齢者評価や健康の測定にも使えます。歩行障害と歩行とバランスの変化は、これらの疾病の多くで見られます。ただし、これらのテストの有用性は一般的な神経筋症状を伴う疾患に限定ではありません。
動機や説明の行動テストの手段のいずれかの目新しさについて指摘した交絡変数がずっとないことに注意してください。それは命令の特定の病気の状態と病態マウス表現型の症状を示しています前に、研究者が予備行動データを取得すること研究者が、定期的にすべての運動障害が考慮できるように (毎週)。多くの病気の表現型の症状を簡単に発症、毎週テストすることがなくこれらの症状が考慮されません。
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Protocol
記載のすべてのプロトコルに則し、行ったし、女王の大学動物ケア委員会によって承認されました。行動テストの頻度は、毎週または毎月、または 2 つの組み合わせをすることができます (すなわち、 1 つ期待する最大の違いを確認するときは毎週、毎月他の所で)。
注: マウスの行動学主性別/年齢/ひずみ依存したがって適切な時間ポイントを収集して実験のグループ間で一貫性を維持するために不可欠です。環境要因 (例えば香り、騒音、温度、湿度照明、等) は、動作とマウスの不安に大きく影響します。可能な限り、これらの環境要因を軽減しようとします。
1. オープン フィールド試験
注: 行動テストの前に動物は、テストの開始前に 10-15 分のための場所を取ることですテスト部屋に慣れさせる必要があります。その適切な個人用保護具とガイドラインに従う行動のテスト プロトコルすべてのローカル施設を確認します。
注: テスト前にトレーニングはなし。
- 実行、され、カメラまたはオープン フィールド ボックスに正しく接続されているコンピューターと OFT プログラムは、上にことを確認します。Smartware プログラム、オープン フィールドのアイコンと"OK"をクリックします。カメラのオプションから「デジタル ・ アナログ ・ コンバーター」ソースを選んだ。「検出」をクリックし、、全体のオープン フィールド領域を可視化すると寸法が 30 cm × 30 cm であることを確認します。
注: 機器のレイアウトにスペースの制約によって異なりますがコンピューターとオープン フィールド装置が適切なビデオ キャプチャのための明るい部屋でお互いに近くにいることを確認します。 - 「校正」を「スナップショット」し、オープン フィールドの範囲内で、マウスが認識されていることを確認して「OK」をクリックします。事前; マウスをテストする時間の量を設定する「時間」をクリックこの場合は、5 分を設定します。
- 「科目一覧」アイコンをクリックして科目を入力します。「スケジューラ」および強調表示 all テスト科目し、緑の二重矢印クリックをクリックし、、データの収集を開始するためにすべての被験者にもたらすこの「フェーズ 1、1 セッション」。
- オープン フィールドの中心にマウスを置き、録音を開始するプログラムを要求する「スタート」アイコンをクリックしますします。一度に 1 つだけのマウスをテストします。
- 5 分が完了すると、プログラムは自動的に次の話題に移動します。この場合、テストを完了しているマウスを取り外してオープン フィールドに次の科目を配置します。クリックして「スタート」。
- 機器を拭きます。残りの試験科目について、手順 1.3 1.4。
- 上部に「分析」アイコンをクリックしてすべての科目のテストを経て後データを分析するために、画面の右。もう一度「分析」し「要約レポート」をクリックします。必要に応じて、USB にデータをエクスポートします。
2. メッシュ テスト
注: 面積と MT 上のメッシュのサイズのパフォーマンスに影響可能性があります。MT、マウスは最初の 10 の内で落ちる場合にコレクションの最初の 2 時間の間に s のポイントは、彼らに戻される 2 番目の試みのためにすぐにメッシュ。ここで使用されるメッシュは、メッシュ穴直径約 1.5 mm のワイヤー メッシュだった。
注: 同じ時間帯にこれらのテストを実行している推奨は 1 日を通して生理学的および生化学的パラメーターが変動するので。体重はこのテストでパフォーマンスに影響を与える可能性があり、従って考慮する必要があります。
- メッシュの中心にマウスを置き、上記の明確なコンテナー メッシュ、少なくとも 20 cm を反転します。逆に一度タイマーを開始します。
- 時間とレコードに落ちる待ち時間の時間。マウスが 60 に該当しない場合 s、いいえそれの 60 s および行為のスコアを与える試験をさらに。少なくとも 5 分の残りの部分にマウスを許可します。これはトライアル 1 の終わりです。
- ワイプ装置を 5 分間試験期間中に、必要な場合、2 番目のマウスをテストします。必要に応じて手順を繰り返します 2 と 3、試験 2.1 2.2 (マウスに 60 得点しない限り、s、それは 3 つの試験を受ける必要があります)。
3. Rotarod テスト
注: 表面と RT の棒の直径のパフォーマンスに影響可能性があります。マウスが最初の 10 の内で落ちる場合は、RT の最初 2 コレクションの時間ポイントの間に s は、2 番目の試みのためにすぐにロッドにそれを戻します。
注: 同じ時間帯にこれらのテストを実行している推奨は 1 日を通して生理学的および生化学的パラメーターが変動するので。体重はこのテストでパフォーマンスに影響を与える可能性があり、従って考慮する必要があります。
- IITC rotarod とコンピューターを入れます。データ記録に正しく接続されていることを確認します。
- プログラムで加速のプロトコルが実行されていることを確認します。Xxx (有効範囲は 000 ~ 999); rotarod テストの目的の長さを設定します。この場合、300 を押します *。Xxx (有効範囲は 001 005 ~); に使用される車線の数を設定します。この場合、005 を押します *。開始速度を xxx rpm に設定 (5 rpm の 3005 を入力; 有効範囲は 001 ~ 045);この場合、押して 004 *。
- Xxx rpm に最高速度を設定 (30 rpm の 4,030 を入力; 有効範囲は 001 ~ 045);この場合、040 を押します *。ランプ速度 s の xxx に設定 (30 のランプのトップ スピードに 5,030 を入力; 有効範囲は 000 ~ 999);この場合は 300 を押します *。ユニットをマウスモードに設定 (マウス前方の 6001 と 6002 逆のマウスを入力してください;)この場合、6001 を押します *。
- すべて磁化レーンが試験を開始する前にバランスがとれていることを確認します。Rotarod の各車線に 1 つのマウスを置きます。
- プログラムを開始して開始を押す。マウスが落ちるよう速やかに、彼ら「は旅行をしない」他の車線を確保するための車線からそれらを削除します。
- 10 分間間隔の残りの部分にマウスを許可します。これはトライアル 1 の終わりです。間の間隔の間に機器を拭くし、マウスの次のセットのための試験を開始します。
- 必要に応じて、手順 4-6 を繰り返します。マウスが完全 5 分試用版の rotarod に残っている場合、さらに試験のマウスの必要はありません。
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Representative Results
研究動物は、解析に必要な必要な時間ポイントに合わせて毎週または毎月の行動テスト パラダイムを受ける可能性があります。行動テスト タイミング例については図 1を参照してください。以下の代表的なデータで、Osmonらから撮影。(2016) マウスの毎月、行動テスト バッテリーを受けた年齢の約 40 週間、人道的エンドポイントまでの生後 12 週から始まります。行動テストのタイミングは、実験の重要な特にとき扱われた動物対未処理の生存範囲大幅にあり、比較が必要。
これらのテストは、神経変性疾患のため使用していませんが、サンドホフ マウス (図 2を参照) を使用しました。このマウスは、ますます不安定と放置し、通常年齢1の 16 週間で euthanization を必要とする場合の年齢の 12-16 週間からまとまりのない取得をモデルします。図 2 Dのデータは、どのように扱われたマウスは、通常のヘテロ接合体マウスと比較して動作するための手段として、rotarod の使用を示します。40 週で 2 つのグループの相違は、健常者と比較すると治療群の低下調整の先頭を示します。軽度の表現型が検討されている他のマウス モデルで今後のエクスパンションおよびこの一連のテストの特殊な形式を推奨します。
パブリケーションに関連する結果を選択すると、それは心の 2 つの要因に注意してください。最初のメトリックを使用する必要があります使用されている動物モデルに固有のものに選択されることです。しばしば、最も一般的に使用されるメトリックは、(に見られるように図 2);「時間移動」しかし、「距離の旅」はまた一般的な歩行のための一般的なメトリックです。RR で「終わり rpm」と「距離の旅」は、一般的に使用される指標です。適切な結果として選択されるメトリックを選択する第 2 の要因はメトリックを明らかに最も重要な分岐または結果の予想に応じて、行動の結果に収束を中心に展開します。
収集されたデータは、複数の統計的検定を用いた分析でしたが、一貫して毎週または毎月行動テスト同じマウスを使用して、2 方向繰り返し対策分析の分散 (2 ウェイ RM-ANOVA) お勧め。反復測定 ANOVA により、同じ動物から結果の縦断的評価とグループ間だけでなく、時間をかけて、動物の行動の変化の比較が可能になります。ボンフェローニ補正も示唆されました。同じ timepoint 内で試験治療を比較するとき図 2に見られるように、一方向の分散分析が示唆されました。
図 1: 行動テストの可能な実験的タイムラインの例。実験の必要性に応じて、タイムラインの様々 な行動テストを行うことができます。毎月、毎週、または組合せごとにテストを行うことができます。例では、研究期間は、0 週は治療管理 23 週間続きます。毎月発生するテストと、4、8、12、16、20 週間のテストが実行されます。毎週発生するテストと、テストが 23 週エンドポイントの前に毎週 (週 1-22) を実施します。組合せに基づいて発生するとテスト、試験の週 1-8 には毎週と毎月 23 週エンドポイント前に、20、16、12 週間のテストの実行。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:扱われた動物が未処理動物を上回る月間行動テスト結果。12 週間で扱われた動物は MT (E)未処理動物 OFT (A)で「時間移動」、秋に「待ち時間」を上回る。12 週間(C)で「rotarod エンド rpm」の処理と未処理の動物間の統計的な差異がないです。毎月の行動テストで扱われたマウスは OFT (B)、 (D)RR MT (F)で通常のヘテロ接合体のコントロールに同様に実行します。統計ソフトウェア (例えばグラフパッド) を使用してすべての統計的解析を行った、12 週の解析 (2 a C、およびE) の一方通行 ANOVA テストを行った、月次分析 (の 2 ウェイ RM ANOVA テストを行った2 b、D、 、 F)。すべての誤差範囲が SEM次の図は、Osmonらから変更1メアリー アン リーバート出版社から許可を得て転載とこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
すべてのテストのためきれいにし contagions とマウスにディスを最小限に抑えるために表面を消毒します。また、ことマウス試験および行動間の十分な休憩時間の与えられたテスト OFT、RR と MT を使用する場合を確認してください。
OFT の各マウスがオープン フィールドの真ん中に配置されていると、プログラムが中心にマウスのリリース時に開始が重要です。プログラムの開始時に、センサーを登録可能性があります手の動きがないことを必ずください。
MT、マウスがハング メッシュ領域とに下落しているコンテナーの側面間の障壁を持つことが重要です。それはマウス コンテナーの側に到達することができます、彼らは、彼らの前部足をゆっくりと解放し、ジャンプする足の裏を指摘されています。壁とメッシュの中心間の障壁を大きくテーピングこの現象を減少し、筋肉の強さのより正確な測定のためできます。
単独では、これらのテストの一般的な歩行 (オープン フィールド試験)、筋力 (メッシュ テスト)、調整 (rotarod)2,7,8の良い測定です。ただし、一緒に取られて、これらの 3 つの行動テストの完全なコレクションは、マウスにおける運動の広範な評価できます。このテスト群は、複雑なモーター機能のモーター減損の効果の欠如を個別に確認します。これらのメソッドの主な制限は、非常に特定の赤字の問題行動の機能は、移動の彼らの一般的な評価です。さらに、すべての行動のテストと同様に、これらのテストは予告音、温度変化や光のサイクルなどの外部ストレスによる行動の変化。テスト主題すべての一貫性のある外部環境を維持することをお勧めします。行動テストのこのバッテリーは、運動失調とメモリのテストを含めるように拡張できます。筋力2,8,9の勉強のため他の方法など山と筋力の結果を相関する定速 RR を実施筋力、調整、または失調症の具体的な評価は、あるグリップ強度2重量テスト15平均台や歩行分析試金2、それぞれ。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
継続的な支援と当社の研究の資金のため、新たなる希望研究財団に感謝したいと思います。我々 はまた IITC をありがとうこの仕事の一部を支援したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
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