Summary
Atferdsmessige testing brukes i pre kliniske forsøk for å vurdere fenotypiske effekten av en sykdom eller behandling på et dyr velvære. For å vurdere globalt motor fungerer, vi valgte tester for generelle bevegelse, muskel styrke og samordning: Åpne feltet test, mesh testen og den rotarod testen, henholdsvis.
Abstract
Atferdsmessige testing brukes i pre kliniske forsøk for å vurdere fenotypiske virkningen og resultatene som en bestemt sykdom eller behandling på dyrets velvære og helse. Det er mange opptreden tester som kan brukes. Vi valgte en test for generelle bevegelse, åpne-feltet test (ofte); en test for muskelstyrke, mesh test (MT); og en test for koordinering, den rotarod testen (RR). Testing kan gjøres på en ukentlig eller månedlig basis. Som en test for generelle bevegelse, den ofte fungerer ved å overvåke objektivt bevegelse parametere under musen er i et åpent felt apparat. Feltet er generelt en 2' x 2'-boks, og bevegelsene er registrert via laser sensing eller videoopptak. Musen er plassert midt i åpne-feltet og kan bevege seg fritt for testen. MT bruker ventetiden for mus for å falle av en invertert skjerm som et mål på muskelstyrke. En mus er plassert på en skjerm, som er invertert over en klar boks og er tidsbestemt for deres ventetid å falle. Tre studier er utført, med beste av tre scoret for den dagen. En score på 60 s er maksimumstiden en mus er igjen invertert. Mus gis en 5 minutters hvileperiode mellom mesh test prøvelser. Til slutt, en akselerert protokoll på RR vurderer motorisk koordinasjon og utholdenhet. Under et prøveabonnement går en mus på en roterende stang øker hastigheten fra 4 rpm til rpm 40 over 5 min. Rettssaken avsluttes når musen berører de magnetisert trykksensor på faller. Hver musen gjennomgår tre forsøk, og beste rettssaken er scoret for den dagen. Denne kombinerte atferdsdata gir global vurdering av mobilitet, koordinasjon, styrke og bevegelse av testen dyrene. Minst to av de tre atferdsmessige testing tiltakene må vise forbedring for et dyr å kvalifisere som har samlet forbedret funksjon.
Introduction
Målet med atferdsdata testing er å måle fenotypiske karakterisering, enten i studier for en ny musemodell av sykdommer som påvirker sentralnervesystemet eller en prøveversjon av en ny behandling. Det finnes en rekke atferdsmessige tester å velge mellom. Begrunnelsen for en kombinasjon av atferdsmessige tester er ofte helt kan vurdere de pre-klinisk behandlingsresultatene. Batteriet atferdsmessige testing inkluderer her åpen testen (ofte), mesh testen (MT) og rotarod test (RR).
OFTE brukt som et mål på generelle locomotor aktivitet1,2,3,4,5,6,7. Denne vurderingen lar musen å bevege seg fritt i et åpent felt målinger tatt er bevegelsene til musen i løpet av atferdsmessige rettssaken. Kvantitative analyser laget med en ofte inkluderer oppdrett, flytte avstanden, tid brukt flytte (f.eks gå og kjører) og endringer i aktivitet over tid (f.eks hopping og tregere/hyperaktiv bevegelser), som er hvorfor det er en nyttig og grundig analyse av gnager atferd.
MT brukes til å vurdere styrken på mus1,2,8,9,10,11. Bruk av alle fire lemmer å henge ut av et rutenett netting gir ikke-invasiv måling av evne til mus å vise vedvarende lem spenning mens motsatte effekten av tyngdekraften. Denne vurderingen er gjort ved å plassere musen på en invertert mesh og timing sin ventetid å falle. Denne testen vurderer muskelstyrke museklikk ved å måle hvor lang tid det kan holde seg på invertert skjermen før tilbakegang.
RR vurderer samordning av musen mens akselererende protokollen1,2,7,8,9,12,13. Rotarod apparatet består av en sylindriske strålen som roterer i luften fra 4 rpm. Musen kan lære dette koordinasjon dyktighet og deretter utfordret av langsom, gradvis øker til 40 rpm. Klassisk, er konstant hastighet protokollen et mål av muskelstyrke, mens akselererende protokollen for RR vurderer koordinasjon, utholdenhet og muskelstyrke1,2,7, 14.
Fordelene med disse tre atferdsmessige testene er at de er allment akseptert i gnager atferdsmessige testing samfunnet2,7,8,-9, og når ikke bare som summen av de testene, men samlet, de kan brukes som en helhetsvurdering fenotypiske atferd når undersøke de ulike resultatene av eksperimentelle behandlinger. OFTE er en av de eneste testene for total locomotor aktivitet2. RR er også en av de eneste måtene å vurdere koordinering2, annet enn for å bruke gangart analyseprogramvare, som ikke vil bli omtalt her. Noen måter som muskelstyrke museklikk kan vurderes; imidlertid bruker MT eller en wire henge test, brukes prevalently i litteraturen, og er akseptert som en pålitelig metode for testing muskelstyrke2,8,9,10, 11. mange andre teknikker for måling av generelle bevegelse og samordning er svært tidkrevende og kan ikke gi pålitelige data (f.eks manuelt timing musen bevegelse eller manuelt male paws for gait analyse). De automatiserte systemene for ofte og RR øker påliteligheten og gyldigheten av data produsert og Spar tid og krefter.
For eksempel vil gitt neurodegeneration av Sandhoff sykdom musemodell, når du utfører denne batteri av tester, ofte være først av disse testene brukes til å vurdere motor forandringene som vanligvis ses i denne musen modellen starter på 3 måneder av alderen. Underskudd i koordinasjon bør også bli tydelig begynner på 12 ukens av alderen. Underskudd i muskelstyrke bør begynne rundt 14 uker gammel, men de til slutt blir mye mer betydningsfulle 16 uker.
Disse testene er nyttige når studere sykdommer som forårsaker betydelig motor impairments, inkludert nevrodegenerative sykdommer9 som Sandhoff sykdom1,8,13, Parkinsons sykdom7, Huntingtons sykdom, multippel sklerose. Testene kan også brukes til å studere aldring og gjøre sammenlignende geriatrisk vurderinger eller målinger av helse. Gangart forstyrrelser og endringer i bevegelse og saldo er sett i mange av disse sykdomstilstander. Nytten av disse testene er imidlertid ikke begrenset til sykdommer med utbredt nevromuskulær symptomer.
Vær oppmerksom på at det har vært noen forvirrende variabler bemerket motivasjon eller nyheten av beskrevet atferdsmessige testing tiltak. Det er viktig for enkelte sykdom stater og patologi at forskerne erverve foreløpige atferdsdata før musen viser fenotypiske symptomer; forskeren deretter bør regelmessig (ukentlige) sikre at alle motor impairments regnskapsføres. Mange sykdommer har en rask innsettende fenotypiske symptomer, og uten ukentlige testing, disse symptomene ville ikke være rede for.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller Her beskrives ble utført i samsvar med, og ble godkjent av, Queen's University dyr komiteen. Hyppigheten av atferdsmessige testing kan ukentlig eller månedlig, eller en kombinasjon av to (dvs. ukentlige når man forventer å se den største forskjellen og månedlige andre steder).
Merk: Murine atferdsmessige studier er hovedsakelig kjønn/alder/belastning-avhengige, og derfor er det viktig å samle på riktig tidspunkt og å være konsekvent på tvers av eksperimentelle grupper. Miljøfaktorer (f.eks duft, støy, temperatur, fuktighet belysning, etc.) i stor grad påvirke atferden og angst i mus. Prøv å redusere disse miljøfaktorer som mulig.
1. Åpne felttest
Merk: Før atferdsmessige testing, dyrene skal bli habituated til rommet hvor testing er å finne sted i 10-15 minutter før begynnelsen av testing. Kontroller at riktig personlig verneutstyr og alle lokale anlegget retningslinjer følges for atferdsdata testingen protokoller.
Merk: Ingen opplæring før testen.
- Kontroller at datamaskinen og ofte programmet er på, kjører og riktig koblet til kameraet eller åpne felt. Klikk på the smartware programmet, åpen-ikonet og "OK". Velg "digital analog converter" kilden fra kameraalternativene. Klikk på "oppdagelsen" og kontroller at hele åpen plass er visualisert og at er 30 cm x 30 cm.
Merk: Utstyr layout kan variere avhengig av plassbegrensninger, men at datamaskinen og åpne feltet apparater er nær hverandre i et godt opplyst rom for riktig videoopptak. - Klikk "kalibrering," "øyeblikksbilde," og deretter "OK" for å sørge for at musen registreres innenfor rammen av åpne-feltet. Klikk "tid" å forhåndsinnstilt tiden teste mus; i dette tilfellet angi 5 min.
- Angi emner ved å klikke ikonet "fag". Klikk "scheduler" og markere alle test fag og klikker doble grønne pilene og "fase én, økt." Dette vil bringe i alle fag for å begynne å samle inn data.
- Plasser musen midt i åpne-feltet og klikk på "start"-ikonet for å be programmet begynne innspillingen. Teste bare en mus for.
- Når 5 min er fullført, vil programmet automatisk gå til neste fag. I dette tilfellet fjerne musen som har gjennomført testen og plasser neste fag i åpne-feltet. Klikk "start".
- Tørke ned utstyret. Gjenta trinn 1.3-1.4 for gjenværende testen fag.
- For å analysere dataene når alle emner har gått gjennom testing, klikk på ikonet "analysere" øverst høyre på skjermen. Klikk "analysere" igjen og deretter "sammendragsrapport." Du kan også eksportere data til en USB.
2. mesh Test
Merk: Areal og størrelsen på nettet på MT kan påvirke ytelsen. På MT, hvis musen faller innenfor de første 10 s under 2 første samling tid poeng, de blir lagt tilbake på nettet umiddelbart for et nytt forsøk. Mesh brukes her var en netting, netting hullene ca 1,5 mm i diameter.
Merk: Kjøre testene på samme tid på dagen anbefales, siden fysiologiske og biokjemiske varierer hele dagen. Kroppsvekt kan påvirke ytelsen i denne testen, og derfor må tas i betraktning.
- Plasser musen midt i en maske og invertere mesh minst 20 cm over en klar beholder. Når invertert, starte tidtakeren.
- Gang og oppføring av ventetid å falle. Hvis musen ikke er innenfor 60 s, gir den en snes av 60 s og atferd ikke videre studier. Lar musen hvile i minst 5 minutter. Dette er slutten av prøveperioden 1.
- Tørk ned utstyret og under 5 minutters Inter prøve intervall, teste andre mus, hvis nødvendig. Gjenta trinn 2.1-2.2 for forsøk 2 og 3, eventuelt (så lenge musen ikke scorer 60 s, det bør gjennomgå tre forsøk).
3. Rotarod Test
Merk: Overflaten og diameteren på stangen på RT kan påvirke ytelsen. På RT, hvis musen faller innenfor de første 10 s under første 2 tid innsamlingspunkter, sette den tilbake på stangen umiddelbart for et nytt forsøk.
Merk: Kjøre testene på samme tid på dagen anbefales, siden fysiologiske og biokjemiske varierer hele dagen. Kroppsvekt kan påvirke ytelsen i denne testen, og derfor må tas i betraktning.
- Slå på IITC rotarod og datamaskinen. Kontroller at de er riktig koblet til datainnspilling.
- Kontroller at programmet kjører akselerert protokollen. Angi ønsket lengden på rotarod testen til xxx (gyldige er 000 gjennom 999); i dette tilfellet trykker 300 *. Angi antall baner for xxx (gyldige er 001 gjennom 005); i dette tilfellet trykker 005 *. Angi starter hastigheten til xxx RPM (angi 3005 for 5 RPM, gyldige er 001 gjennom 045); i dette tilfellet trykker 004 *.
- Angi øverst hastigheten til xxx RPM (angi 4,030 for 30 RPM, gyldige er 001 gjennom 045); i dette tilfellet trykker 040 *. Stille rampen til xxx i s (angi 5,030 for en 30-s rampe til toppfart, gyldige er 000 gjennom 999); i dette tilfellet trykker 300 *. Angi tidsenheten til musmodus (angi 6001 musen frem og 6002 for musen omvendt); i dette tilfellet trykker 6001 *.
- Kontroller at alle magnetisert baner er balansert før du begynner rettssaken. Plass en mus i hver kjørefelt på rotarod.
- Trykk start for å starte programmet. Som mus faller, kan du fjerne dem fra sine baner umiddelbart for å sikre at de ikke "tur" den andre baner.
- Tillate at mus til å hvile i en 10-minutters Inter prøve intervall. Dette er slutten av prøveperioden 1. Under Inter prøve intervall, tørke ned utstyret og begynne rettssaken for neste sett med mus.
- Gjenta trinn 4-6 etter behov. Hvis musen forblir på rotarod for hele 5-min rettssaken, er ingen videre studier nødvendig for at musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien dyrene kan gjennomgå atferdsmessige testing paradigmet ukentlig eller månedlig til grunnpoeng nødvendig tid for analyse. Se figur 1 for eksempler på atferdsdata testing timing. Representant dataene nedenfor, tatt fra Osmon et al. (2016), mus gjennomgikk batteriet atferdsmessige testing månedlig begynner på 12 ukens av alderen, til deres Human endepunktet rundt 40 uker gammel. Tidspunktet for atferdsdata testing er avgjørende for et eksperiment, spesielt når overlevelse av ubehandlet versus behandlede dyr varierer drastisk og sammenligninger kreves.
Selv om disse ikke brukes utelukkende for nevrodegenerative lidelser, brukte vi Sandhoff mus (se figur 2). Denne musen modell blir stadig mer ustø og ukoordinerte fra 12-16 ukens av alderen hvis ubehandlet og vanligvis krever euthanization for 16 ukens av alderen1. Dataene i figur 2D demonstrerer bruken av rotarod å se hvordan de behandlede mus er oppfører seg i forhold til normal heterozygote mus. Divergensen to gruppene på 40 uker angir begynnelsen av gruppen behandling redusert koordinasjon i forhold til vanlige kontroller. I andre musen modeller der en mild fenotypen er undersøkt, anbefales videre ekspansjon og spesialisering av batteriet tester.
Når du velger relevante resultater for publisering, er det viktig å holde i sinn to hovedfaktorer. Først er at beregning brukes bør velges bestemt dyr modellen brukes. OFTE, beregning brukes vanligvis er "tid flytte" (som sett i figur 2); men er "avstand reist" også en vanlig beregning for generelle bevegelse. RR er "slutten rpm" og "avstand reist" brukte beregninger. Den andre faktoren i å velge hvilken beregning bør velges som en egnet resultat dreier hvilke metrisk avslører den viktigste divergens eller konvergens i atferdsdata resultater, avhengig av hvilke resultater er forventet.
Data samlet inn kan analyseres ved hjelp av flere statistiske tester, men for konsistent ukentlige eller månedlige atferdsmessige tester med samme musene, blir det foreslått en 2-veis gjentatt-tiltak analyse av varians (2-veis RM-ANOVA). De gjentatte measures ANOVA gjør langsgående vurdering av resultatene fra samme dyret, og tillater sammenligning av endringer i dyr oppførsel over tid og mellom grupper. Bonferroni korreksjon foreslås også. Når du sammenligner behandlinger innenfor den samme timepoint, en enveis ANOVA foreslås, som vist i figur 2.
Figur 1: eksempler på mulige eksperimentelle tidslinje for atferdsdata Testing. Atferdsmessige testing kan gjøres med en rekke tidslinjer, avhengig av behovet for eksperimentell. Testing kan gjøres på månedlig, ukentlig eller kombinasjon basis. I eksemplet gitt studietiden varer i 23 uker, hvor uke 0 er administrasjonen for behandling. Når testing oppstår på månedlig basis, utføres testene på uker 4, 8, 12, 16 og 20. Når testing skjer ukentlig, utføres testene hver uke (uker 1-22) før 23 ukers sluttpunktet. Når testing oppstår på kombinasjon basis, testene utføres ukentlig på uker 1-8, og deretter tester utføres månedlig for 12, 16 og 20 før 23 ukers sluttpunktet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Månedlig atferdsmessige Testing resultater der behandlede dyr utkonkurrere ubehandlet dyr. Ved 12 uker utkonkurrere behandlede dyr ubehandlet dyr "tid flytte" i ofte (A) og på "ventetid å falle" i MT (E). Det er ingen statistisk forskjeller mellom behandlet og ubehandlet dyrene i «rotarod slutten rpm"på 12 uker (C). Over månedlige atferdsmessige testing, utføre behandlet musene tilsvarende normal heterozygote kontrollene i ofte (B), RR (D)og MT (F). Alle statistiske analyser ble utført med statistisk programvare (f.eks GraphPad), enveis ANOVA-testene ble utført på uke 12 analyse (2A, Cog E) og 2-veis RM-ANOVA testene ble utført på månedlig analyse ( 2b, D, og F). Alle feilfelt er SEM. Dette tallet endret fra Osmon et al. 1 og gjengitt med tillatelse fra Mary Ann Liebert utgivere, Inc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For alle tester, rengjør og desinfiser overflaten for å minimere contagions og distraktører til mus. Også gjøre enkelte at mus er gitt tilstrekkelig hvileperioder mellom forsøk og mellom atferdsmessige tester når ofte, RR og MT.
I ofte er det avgjørende at hver musen er plassert midt i åpne-feltet og at programmet er startet etter utgivelsen av musen i midten. Pass på at det ikke er noen håndbevegelser sensorene kan registrere på starte programmet.
For MT er det viktig å ha en barriere mellom mesh området der musen henger og sidene av beholderen de faller inn i. Det har blitt bemerket at når mus kan nå siden av beholderen, de langsomt slipper sin front paws og deretter ryggen paws for å hoppe ned. Taping en barriere mellom veggene og midten av mesh sterkt reduserer dette og gir en mer nøyaktig måling av muskelstyrke.
Alene, er hver av disse testene et godt mål for generelle bevegelse (åpen test), muskelstyrke (mesh test) og koordinering (rotarod)2,7,8. Men gir sammen den komplette samlingen av disse tre atferdsmessige tester omfattende vurdering av bevegelse i mus. Denne gruppen av tester bekrefter uavhengig mangel på confounding effekter i motor verdifall på komplekse motor fungerer. Den viktigste begrensningen av disse metodene er deres generelle vurdering av bevegelse, som er problematisk for svært spesifikke svekkelser i atferdsdata fungerer. Dessuten, er disse testene, som alle opptreden tester, underlagt endringer i virkemåte på grunn av eksterne stressorer, som lyd og temperaturendringer lyset sykluser. Det er forsvarlig å opprettholde en konsistent ytre miljø for alle test fag. Dette batteriet atferdsmessige testing kan utvides med tester for ataksi og minne. Andre metoder for å studere muskelstyrke2,8,9 inkluderer gjennomføre konstant hastighet RR å relatere muskelstyrke resultater med MT. For mer spesifikk vurderinger på muskulær styrke, koordinasjon eller ataksi finnes grep styrke2 og vekter tester15 og bom eller gangart analyse analyser2, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke The New Hope inntil Foundation for deres fortsatte støtte og finansiering av forskningen. Vi vil også gjerne takke IITC for delvis finansiell støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
- Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
- Menalled, L. B., et al. Early motor dysfunction and striosomal distribution of huntingtin microaggregates in Huntington's disease knock-in mice. J.Neurosci. 22, 8266-8276 (2002).
- Grusser, C., Grusser-Cornehls, U. Improvement in motor performance of Weaver mutant mice following lesion of the cerebellum. Behav. Brain Res. 97, 189-194 (1998).
- De Leonibus, E., et al. Spatial deficits in a mouse model of Parkinson's disease. Psychopharmacology (Berl). 194, 517-525 (2007).
- Morris, M., Koyama, A., Masliah, E., Mucke, L. Tau Reduction Does Not Prevent Motor Deficits in Two Mouse Models of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6 (12), 1-7 (2011).
- Abo-ouf, A., et al. Deletion of tumour necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. Human Molecular Genetics. , 1-16 (2013).
- Dumont, M. Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neurodegeneration. Neurodegeneration : Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 793, 229-237 (2011).
- Cabe, P. A., Tilson, H. A., Mitchell, C. L., Dennis, R. A simple recording grip strength device. Pharmacol. Biochem. 8, 101-102 (1978).
- Barnēoud, P., Loliver, J., Sanger, D., Moser, P. Quantitative motor assessment in FALS mice: a longitudinal study. Neuroreport. 8, 2861-2865 (1997).
- Lui, Y., et al. Mouse model of GM2 activator deficiency manifests cerebellar pathology and motor impairment. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8133-8143 (1997).
- Sango, K., et al. Mouse models of Tay-Sachs and Sandhoff diseases differ in neurologic phenotype and ganglioside metabolism. Nature Genetics. 11 (2), 170-176 (1995).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor inco-ordination in naïve mice. Nauyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 259 (2), 211 (1968).
- Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (76), (2013).
