Summary
Testes comportamentais é utilizado em ensaios pré-clínicos para avaliar os efeitos fenotípicos de uma doença ou tratamento no bem-estar do animal. Para globalmente avaliar o funcionamento do motor, nós selecionamos testes para locomoção geral, força muscular e coordenação: teste do campo aberto, a malha e o teste de rotarod, respectivamente.
Abstract
Testes comportamentais é utilizado em ensaios pré-clínicos para avaliar os efeitos fenotípicos e resultados que uma determinada doença ou tratamento tem sobre a saúde e o bem-estar do animal. Existem inúmeros testes comportamentais que podem ser aplicadas. Nós selecionamos um teste para a locomoção geral, o campo aberto teste (OFT); um teste de força muscular, a malha de teste (MT); e um teste para a coordenação, o teste de rotarod (RR). Teste pode ser realizado em uma base semanal ou mensal. Como um teste para a locomoção geral, as obras OFT objetivamente monitorando parâmetros de movimento enquanto o mouse está em um aparelho de campo aberto. O campo é geralmente uma caixa 2' x 2', e os movimentos são registrados por meio de sensoriamento laser ou através de captura de vídeo. O mouse é colocado no centro do campo aberto e permitido mover-se livremente para o teste. O MT usa a latência para um mouse para cair uma tela invertida como uma medida da força muscular. Um rato é colocado em uma tela, que é invertida sobre uma caixa clara e é cronometrada para sua latência a cair. São realizados três ensaios, com o melhor dos três ensaios marcados para esse dia. Uma pontuação de 60 s é o tempo máximo é deixado um mouse invertido. Os ratos são dado um período de repouso de 5 min entre testes de malha. Por último, um protocolo acelerado no RR avalia a resistência e coordenação motora. Durante um julgamento, um rato entra em uma haste rotativa como aumenta a velocidade de 4 rpm para 40 rpm mais 5 min. O julgamento termina quando o mouse toca o sensor de pressão magnetizada em cima caindo. Cada rato sofre três julgamentos, e o melhor julgamento é marcado para esse dia. Este dados comportamentais combinados permite a avaliação global da mobilidade, coordenação, força e movimento dos animais de teste. Pelo menos duas das três medidas testes comportamentais deve mostrar melhoria para um animal para se qualificar como tendo geral melhorou a função motora.
Introduction
O objetivo do teste comportamental é medir a caracterização fenotípica, seja em estudos para um novo modelo de mouse de doenças que afetam o sistema nervoso central ou para um julgamento de um novo tratamento. Há uma variedade de testes comportamentais para escolher. A justificativa para usar uma combinação de testes comportamentais é muitas vezes totalmente, avaliar os resultados do tratamento pré-clínicos. A bateria de testes comportamentais neste documento inclui o teste de campo aberto (OFT), o teste de malha (MT) e o rotarod teste (RR).
O OFT é usado como uma medida da atividade locomotora geral1,2,3,4,5,6,7. Esta avaliação permite que o mouse para mover-se livremente em um campo aberto, e as medidas tomadas são os movimentos do mouse ao longo do ensaio comportamental. As análises quantitativas feitas usando um OFT incluem criação, mudou-se de distância, tempo gasto em movimento (por exemplo, caminhada e corrida) e alterações na atividade ao longo do tempo (por exemplo, pulando e mais lento/hiperativo movimentos), que é por isso que é um útil e análise aprofundada do comportamento de roedor.
A MT é usado para avaliar a força dos ratos1,2,8,9,10,11. O uso de todos os quatro membros para pendurar fora de uma malha de grade de arame permite a medição não invasiva da capacidade dos ratos para mostrar tensão sustentada membro enquanto opondo-se os efeitos da gravidade. Esta avaliação é feita colocando um rato em uma malha invertida e cronometrar sua latência a cair. Este teste avalia a força muscular do mouse medindo quanto tempo ele pode prender-se na tela invertida antes de cair.
A RR avalia a coordenação de um rato enquanto estiver usando a aceleração protocolo1,2,7,8,9,12,13. O aparelho de rotarod consiste de uma viga cilíndrica que gira no ar começando a 4 rpm. O mouse pode aprender esta habilidade de coordenação motora e em seguida é desafiado por lenta, incremental aumenta até 40 rpm. Classicamente, o protocolo de velocidade constante é uma medida da força muscular, Considerando que o protocolo acelerado para o RR avalia a coordenação, resistência e força muscular1,2,7, 14.
As vantagens destes três testes comportamentais são que eles são amplamente aceitos em todo o roedor comportamental teste Comunidade2,7,8,9e quando tomado não apenas como a soma da testes individuais, mas coletivamente, eles podem ser usado como uma avaliação global do comportamento fenotípica ao investigar os diferentes resultados de tratamentos experimentais. O OFT é um dos apenas testes de atividade locomotora total2. O RR é também uma das únicas maneiras de avaliar a coordenação2, além de para usar o software de análise da marcha, que não será discutido aqui. Existem algumas maneiras em que pode ser avaliada a força muscular de um rato; no entanto, usando o MT ou teste de pendurar um fio, foi predominantemente usado na literatura e é aceito como um método confiável para testar a força muscular,2,8,9,10, 11. muitas outras técnicas de medição geral locomoção e coordenação são extremamente demoradas e pode não produzir dados confiáveis (por exemplo, cronometrar manualmente o movimento do mouse ou pintar manualmente as patas para análise de marcha). Os sistemas automatizados para o OFT e o RR aumentam a confiabilidade e a validade dos dados produzidos e economize tempo e esforço.
Por exemplo, dada a neurodegeneração do modelo de mouse de doença de Sandhoff, ao realizar esta bateria de testes, o OFT seria o primeiro destes testes utilizados para avaliar as motor anormalidades que geralmente são vistas neste modelo do rato começando aos 3 meses de idade. Déficits na coordenação motora também devem tornar-se aparente início às 12 semanas de idade. Déficits na força muscular devem começar por volta de 14 semanas de idade, mas, finalmente, tornam-se muito mais significativos por 16 semanas.
Estes testes são úteis para estudar doenças que causam deficiências motor significativas, incluindo de doenças neurodegenerativas9 como Sandhoff doença1,8,13, doença de Parkinson7, A doença de Huntington, esclerose múltipla. Os testes também podem ser usados para estudar o envelhecimento e fazer avaliações comparativas de geriátricas ou medições de saúde. Distúrbios da marcha e alterações na locomoção e equilíbrio são vistas em muitos destes Estados de doença. No entanto, a utilidade destes testes não está limitada a doenças com sintomas neuromusculares prevalentes.
Por favor, note que há sem variáveis de confundimento observados com relação a motivação ou a novidade de qualquer das medidas comportamentais testes descritas. É imperativo para determinados Estados de doenças e patologias que os investigadores adquirem dados comportamentais preliminares antes do mouse mostra quaisquer sintomas fenotípicas; o pesquisador deve então periodicamente (semanalmente) garantir que todas as deficiências de motor são contabilizadas. Muitas doenças tem um início rápido dos sintomas fenotípicos, e sem testes semanais, estes sintomas que não ser contabilizados.
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Protocol
Todos os protocolos descritos neste documento foram realizados de acordo com e foram aprovados, conta Comissão do Animal Universidade da rainha. A frequência de testes comportamentais pode ser semanal ou mensal ou uma combinação dos dois (isto é, mensal e semanal, quando o que se espera para ver a maior diferença em outro lugar).
Nota: Estudos comportamentais murino são largamente sexo/idade/tensão-dependente, e, portanto, é essencial para recolher os pontos de tempo adequado e permanecem consistentes entre grupos experimentais. Fatores ambientais (por exemplo, perfumes, ruído, temperatura, iluminação de umidade, etc.) afetam grandemente o comportamento e a ansiedade em ratos. Tente reduzir estes fatores ambientais, tanto quanto possíveis.
1. teste de campo aberto
Nota: Antes do teste comportamental, os animais devem ser habituados à sala onde o teste está a ter lugar por 10-15 min antes do início do teste. Certifique-se de que equipamentos de proteção individual adequado e todas as instalações locais orientações são seguidas para os protocolos de testes comportamentais.
Nota: Não há treino antes do teste.
- Certifique-se de que o computador e o programa OFT são, execução e conectado corretamente para a câmera ou a caixa de campo aberto. Clique sobre o programa smartware, o ícone de campo aberto e "Okey". Escolheu a fonte "conversor digital para analógico" entre as opções de câmera. Clique em "detecção" e certifique-se que o espaço do campo todo aberto é visualizado e que as dimensões são de 30 x 30 cm.
Nota: Layout de equipamento pode variam de acordo com as restrições de espaço, mas garantir que o computador e campo aberto aparelhos estão perto uns aos outros em uma sala bem iluminada para captura de vídeo adequada. - Clique em "calibração", "instantâneo" e, em seguida, "Okey" para certificar-se de que o mouse está sendo detectado dentro dos limites do campo aberto. Clique em "tempo" para pré-definir uma quantidade de tempo para testar os ratos; Nesse caso, defina a 5 min.
- Digite os temas clicando no ícone "temas". Clique em "Agendador" e destaque teste todos os temas e, em seguida, clique nas setas verdes duplas e "fase um, sessão;" isto trará em todas as questões para começar a coleta de dados.
- Coloque o mouse no centro do campo aberto e clique no ícone "Iniciar" para solicitar que o programa para começar a gravação. Rato de teste único de cada vez.
- Assim 5 min for concluída, o programa automaticamente passa para o próximo assunto. Neste caso, remova o mouse que completou o teste e colocar o assunto na próxima em campo aberto. Clique em "Iniciar".
- Limpe o equipamento. Repita as etapas 1.3-1.4 para os restantes indivíduos do teste.
- A fim de analisar os dados, uma vez que todos os indivíduos passaram por testes, clique no ícone "analisar" na parte superior direita da tela. Clique em "analisar" novamente e, em seguida, "relatório resumido". Opcionalmente, exporte os dados em uma porta USB.
2. teste de malha
Nota: A área de superfície e o tamanho da malha em MT podem influenciar o desempenho. Sobre a MT, se um rato cair dentro do primeiro 10 s durante o tempo da coleção primeiro 2 pontos, eles serão colocados volta na malha imediatamente para uma segunda tentativa. A malha usada neste documento foi um engranzamento de fio, com os furos de malha aproximadamente 1,5 mm de diâmetro.
Nota: Estes testes em execução ao mesmo tempo do dia é recomendado, desde que os parâmetros fisiológicos e bioquímicos flutuarem ao longo do dia. Peso corporal pode influenciar o desempenho neste teste e, portanto, deve ser levado em consideração.
- Coloque um rato no meio de uma malha e inverter a malha pelo menos 20 cm acima de um recipiente transparente. Uma vez invertido, inicie o temporizador.
- Tempo e registrar o tempo de latência para cair. Se o mouse não se enquadra dentro 60 s, dar-lhe uma pontuação de 60 s e conduta não mais ensaios. Permitir que o mouse para descansar pelo menos 5 min. Este é o fim do julgamento 1.
- Limpe o equipamento e durante o intervalo inter trial de 5 min, testar um segundo mouse, se necessário. Repita os passos 2.1-2.2 ensaios 2 e 3, se necessário (como o mouse não marcar 60 s, deve ser submetidos a ensaios de três).
3. Rotarod teste
Nota: A superfície e o diâmetro da haste na RT podem influenciar o desempenho. Sobre o RT, se um rato cair dentro do primeiro 10 s durante os primeiros pontos de tempo de 2 coleção, coloque de volta a haste imediatamente para uma segunda tentativa.
Nota: Estes testes em execução ao mesmo tempo do dia é recomendado, desde que os parâmetros fisiológicos e bioquímicos flutuarem ao longo do dia. Peso corporal pode influenciar o desempenho neste teste e, portanto, deve ser levado em consideração.
- Ligue o IITC rotarod e computador. Certifique-se de que eles estão corretamente conectados para gravação de dados.
- Certifique-se de que o programa está sendo executado o protocolo acelerado. Defina o comprimento desejado do teste rotarod para xxx (o intervalo válido é de 000 a 999); Neste caso, pressione 300 *. Definir o número de vias para ser usado para xxx (o intervalo válido é de 001 a 005); Neste caso, pressione 005 *. Definir a velocidade inicial para rpms xxx (digite 3005 para 5 rpms, o intervalo válido é 001 a 045); Neste caso, pressione 004 *.
- Definir a velocidade máxima para rpms xxx (digite 4.030 para 30 rpms, o intervalo válido é 001 a 045); Neste caso, pressione 040 *. Definir a velocidade de subida para xxx em s (introduzir 5.030 para uma rampa de 30-s, a velocidade máxima, o intervalo válido é de 000 a 999); Neste caso, pressione 300 *. Definir a unidade para o modo mouse (digite 6001 para mouse para a frente e 6002 para rato reverso); Neste caso, pressione 6001 *.
- Certifique-se de que todas as faixas magnetizadas são balançadas antes do início do julgamento. Coloque um rato em cada raia do rotarod.
- Pressione Iniciar para iniciar o programa. Como os ratos caem, removê-los de suas rotas prontamente para assegurar que eles não "viagem" as outras pistas.
- Permitir que os ratos descansar durante um intervalo de 10 min inter experimental. Este é o fim do julgamento 1. Durante o intervalo inter experimental, limpar o equipamento e começar o julgamento para o próximo conjunto de ratos.
- Repita os passos 4-6, conforme necessário. Se um mouse permanece sobre o rotarod para o julgamento completo 5-min, não há mais testes são necessários para esse rato.
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Representative Results
Os estudo de animais podem sofrer o paradigma comportamental de teste semanalmente ou mensalmente para acomodar os pontos de tempo necessário exigidos para análise. Veja a Figura 1 para obter exemplos de temporização de teste comportamental. Os dados representativos abaixo, retirado Osmon et al. (2016), os ratos foram submetidos a bateria de testes comportamentais mensalmente, começando em 12 semanas de idade, até seu ponto de extremidade humana cerca de 40 semanas de idade. O calendário de testes comportamentais às vezes é fundamental para uma experiência, especialmente quando a sobrevivência dos não tratados contra animais tratados varia drasticamente e as comparações são necessárias.
Embora estes testes não são utilizados unicamente para doenças neurodegenerativas, usamos ratos de Sandhoff (ver Figura 2). Este mouse modelo fica cada vez mais instável e descoordenada de 12-16 semanas de idade, se não for tratada e normalmente requerem eutanásia às 16 semanas de idade1. Os dados na Figura 2D demonstram o uso da rotarod como um meio para ver como os ratos tratados estão se comportando em relação aos ratos normais heterozigotos. A divergência dos dois grupos em 40 semanas denota o início da coordenação de diminuição do grupo de tratamento em comparação com controles normais. Em outros modelos de rato onde um fenótipo suave está sendo examinado, é recomendado mais expansão e especialização desta bateria de testes.
Ao selecionar os resultados relevantes para publicação, é importante manter-se em dois fatores principais de mente. A primeira é que a métrica utilizada deve ser escolhida para ser específico para o modelo animal sendo usado. No OFT, a métrica mais comumente usada é "movendo-se para sempre" (como visto na Figura 2); no entanto, "distância percorrida" também é uma métrica comum para locomoção geral. Em RR, "rpm final" e "distância percorrida" são comumente usadas métricas. O segundo fator em selecionar qual métrica deve ser escolhida como um resultado adequado gira em torno de qual métrica revela a mais significativa divergência ou convergência em termos de resultados comportamentais, dependendo de quais resultados são antecipados.
Dados coletados podem ser analisados usando vários testes estatísticos, mas para consistentes semanais ou mensais comportamentais testes usando os mesmos ratos, sugere-se um 2 vias repetido-medidas de análise de variância (RM-ANOVA de 2 vias). As medidas repetidas ANOVA permite a avaliação longitudinal dos resultados do mesmo animal e permite a comparação das alterações no comportamento animal ao longo do tempo, bem como entre grupos. Sugere-se também a correção de Bonferroni. Comparando-se tratamentos dentro da mesma Commit, uma One-Way ANOVA sugere-se, como visto na Figura 2.
Figura 1: exemplos de possível Timeline Experimental para testes comportamentais. Testes comportamentais podem ser feito com uma variedade de linhas de tempo, dependendo da necessidade experimental. Teste pode ser feito numa base mensal, semanal, ou combinatória. No exemplo fornecido, o período de estudo tem a duração de 23 semanas, onde a semana 0 é a administração de tratamento. Quando testes ocorre em uma base mensal, os testes são realizados em semanas 4, 8, 12, 16 e 20. Quando testes ocorre em uma base semanal, os testes são realizados todas as semanas (semanas 1-22) antes do ponto de extremidade de 23 semanas. Quando testes ocorre em uma base de combinatória, os testes são realizados semanalmente em semanas 1-8, e em seguida os testes são realizados mensalmente em semanas, 12, 16 e 20 antes o ponto de extremidade de 23 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados de testes comportamentais mensais onde os animais tratados superam animais não tratados. Às 12 semanas, os animais tratados superam animais não tratados sobre "o tempo está passando" na OFT (A) e a latência"cair" no MT (E). Não há nenhuma diferença estatística entre os animais tratados e não tratados no "rpm rotarod final" em 12 semanas (C). Sobre testes comportamentais mensal, os ratos tratados para executar da mesma forma os controles normais heterozigotos em OFT (B), o RR (D)e o MT (F). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico (por exemplo, GraphPad), One-Way ANOVA testes foram realizados na análise da semana 12 (2A, Ce E) e 2-way ANOVA RM testes foram realizados na análise mensal ( 2B, D, e F). Todas as barras de erro são o SEM. Esta figura modificada de Osmon et al 1 e reimpresso com permissão da Mary Ann Liebert Publishers, Inc. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para todos os testes, limpar e desinfectar a superfície para minimizar a contaminação e desviadores para os ratos. Além disso, certifique-se que os ratos estão tendo em conta os períodos de descanso suficientes entre ensaios e comportamentais testando quando usando o OFT, RR e Mt.
No OFT, é fundamental que cada rato é colocado no meio do campo aberto e que o programa é iniciado após o lançamento do mouse para o centro. Certifique-se de que não existem mão movimentos que os sensores podem registrar após iniciar o programa.
Para o MT, é importante ter uma barreira entre a área de malha onde o rato vai travar e os lados do recipiente que eles estão caindo. Tem-se observado que quando os ratos podem chegar ao lado do recipiente, liberam lentamente suas patas da frente e em seguida as costas as patas para saltar para baixo. Gravar uma barreira entre as paredes e o centro da malha grandemente reduz esse comportamento e permite uma medida mais precisa de força muscular.
Em paz, cada um destes testes é uma boa medida para locomoção geral (teste de campo aberto), força muscular (teste de malha) e coordenação (rotarod)2,7,8. No entanto, tomados em conjunto, a coleção completa destes três testes comportamentais permite a avaliação ampla da locomoção em ratos. Este grupo de testes independente confirma a falta de confundir efeitos em deficiência motora no complexo funcionamento motor. A principal limitação destes métodos é a sua avaliação geral da locomoção, o que é problemática para extremamente específicos déficits no funcionamento comportamental. Além disso, esses testes, como todos os testes comportamentais, estão sujeitos a mudanças de comportamento devido a estressores externos, tais como som, mudanças de temperatura e ciclos de luz. É prudente manter um ambiente externo consistente para todos os assuntos de teste. Esta bateria de testes comportamentais pode ser expandida para incluir testes para ataxia e memória. Outros métodos para estudar a força muscular,2,8,9 incluem a realização de RR de velocidade constante para correlacionar os resultados de força muscular com o MT Para avaliações mais específicas na força muscular, coordenação ou ataxia, há força de aperto2 e testes de pesos15 e trave de equilíbrio ou de ensaios da análise da marcha2, respectivamente.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a New Hope Resarch Foundation por seu contínuo apoio e financiamento de nossa pesquisa. Também gostaríamos de agradecer IITC apoio financeiro parcial para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
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