Summary
G4 Resolvase1 binder seg til G-quadruplex (G4) strukturer med de trangeste rapporterte affinitet for en G4-bindende protein og representerer flertallet av G4-DNA slappe aktivitet i HeLa celler. Vi beskriver en roman protokoll som utnytter affinitet og ATP-avhengig avvikling aktiviteten til G4-Resolvase1 å spesifikt rense katalytisk aktive rekombinant G4R1.
Abstract
Høyere ordens nukleinsyre strukturer kalles G-quadruplexes (G4S G4 strukturer) kan dannes i guanin rike regioner i både DNA og RNA og er svært termisk stabilt. Det er> 375.000 putative G4 dannende sekvenser i det humane genom, og de er anriket i promotorområdene, ikke-translaterte regioner (UTR), og inne i telomeric gjenta. På grunn av potensialet for disse strukturene for å påvirke cellulære prosesser, som for eksempel replikasjon og transkripsjon, har cellen utviklet enzymer for å håndtere dem. Et slikt enzym er G4 Resolvase 1 (G4R1), som ble biokjemisk co karakterisert ved vårt laboratorium og Nagamine et al. og funnet å binde ekstremt tett til både G4-DNA og G4-RNA (K d i det lav-pM området). G4R1 er kilden for de fleste av G4-løse-aktivitet i HeLa-cellelysatene og har siden blitt implisert å spille en rolle i metabolismen telomere, lymfe utvikling, gentranskripsjon, hematopoese, og immunovervåkning. Evnen til å efstrekkelig uttrykke og rense katalytisk aktive G4R1 er av betydning for laboratorier som er interessert i å få mer innsikt i den kinetiske samspillet mellom G4 strukturer og G4-løse enzymer. Her beskriver vi en detaljert fremgangsmåte for rensing av rekombinant G4R1 (rG4R1). Den beskrevne fremgangsmåten omfatter den tradisjonelle affinitets-baserte rensing av en C-terminal histidin-merket enzym uttrykt i humane kodonoptimalisert bakterier med utnyttelse av evnen til å binde rG4R1 og koble G4-DNA for å rense meget aktivt enzym i en ATP- avhengig eluering trinn. Protokollen omfatter også en kvalitetskontrolltrinn hvor den enzymatiske aktiviteten til rG4R1 blir målt ved å undersøke evnen til renset enzym for å koble av G4-DNA. En fremgangsmåte er også beskrevet som gjør det mulig for kvantifisering av renset rG4R1. Alternative tilpasninger av denne protokollen blir diskutert.
Introduction
G4 strukturer er meget stabile nukleinsyre sekundære strukturer som dannes i løpet av guanin-rike regioner av DNA og RNA. G4 strukturer er stabilisert via Hoogsteen-binding interaksjoner og koordinere bonding innenfor den sentrale hulrom med enverdige kationer (ie. K + og Na +) som i vesentlig grad bidrar til den bemerkelsesverdige termiske stabilitet G4 strukturer 1, 2. Tidlige bioinformatikk studier antydet at det menneskelige genom inneholder> 375.000 "potensielle G4 dannende motiver" 3, 4. Nyere studier beregninger tyder på at antallet av G4 motivene er høyere med en faktor på 2-5 5, mens en annen studie anslår 716,310 forskjellige potensielle G4 dannende sekvenser i det humane genom 6. G4-forming sekvenser er evolusjonært konserverte og ikke tilfeldig spredt igenomet. G4 motivene er beriket i genet som koder regioner, og i overkant av 40% av alle gener arrangører inneholde G4 motiver 7. Interessant nok har graden av anrikning av G4 motiver i et gen som er vist å foreslå funksjon av genet. For eksempel, proto-onkogener og gener som er involvert i utvikling har betydelig større berikelse av G4 strukturer enn tumorsuppressorgener 8, 9.
Med høye termiske stabiliteten, en nesten allestedsnærværende tilstedeværelse i hele genomet, og potensial til å påvirke viktige cellulære prosesser, er det overraskende å finne at cellen har utviklet enzymer for å administrere disse strukturene. Et slikt enzym er G4 Resolvase1 (G4R1; også kalt RHAU og DHX36), som vi har betegnet som kilde for de fleste tetramolecular G4-DNA løse aktivitet i humane (HeLa celler) 10. Siden da har det blitt vist that G4R1 tett binder og katalytisk unwinds tetramolecular og unimolecular G4-DNA og G4-RNA med de trangeste rapporterte KDS for en G4-bindende protein 11, 12, 13. I tillegg har G4-oppløsnings aktivitet av G4R1 blitt implisert i en rekke biokjemiske og cellulære prosesser, herunder telomere / telomerase biologi 11, 14, 15, 16, transkripsjon og skjøting 17, 18, 19, 20, utviklings 21, hematopoese 21, og immunregulering 22, 23. Med en overvekt av G4 sekvenser spesifikt ligger hele genomet og diverse celle processes at G4R1 har nylig vært innblandet å være involvert med, evnen til å uttrykke og effektivt rense svært aktiv rG4R1 vil være av største betydning for å belyse de biokjemiske mekanismer og atferd av dette proteinet.
Her viser vi en roman uttrykk og rensing ordningen (figur 1) som dro fordel av ATP-avhengige, G4-løse aktivitet rG4R1 å effektivt isolere aktivt enzym. Denne ordningen kan være innrettet til å rense andre ATP-avhengige nukleinsyre-enzymer som produktet av den enzymatiske reaksjon er ikke lenger et substrat for binding, slik tilfellet er for G4R1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av G4-DNA strukturer til bruk for rensing av rG4R1 (Dannelse av Biotinylated G4-DNA G-quadruplex)
- Bestill følgende DNA oligomer, heter Z33-Bio, på en 1 umol-skala: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3'. Kontroller at biotinrest er i 3'-enden av oligomeren.
- Forbered 10x G4-buffer: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, og 2.500 mM NaCl.
- Resuspender Z33 oligomeren i 250 ul av vann (slik at oligomeren er konsentrasjonen ~ 2,5 mM). Legg 25 ul av 10 x G4 buffer og bland. Inkuber oligomeren ved 50 ° C i ~ 48 timer.
- I korthet spinne ned i røret for å samle opp kondens (~ 1000 xg, 10 s). Legg ~ 50 mL av en høy-masse, hydrofilt polysakkarid (30% Ficoll i H 2 O) og bland. Hell en 10% akrylamid / 1x TBE / 10% glyserol gel (gel dimensjoner: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Så snart gelen er polymerisert, vaskes brønnene med 1 x TBE og belastningdet dannet Z33-Bio oligomer jevnt over det meste av gel (prøve kjørefelt lasting kan visualiseres med Schlieren linjer).
- I ett kjørefelt i enden av gelen, legger en liten fraksjon av oligomeren som har blitt oppvarmet ved 98 ° C i 10 minutter (dette vil tjene som en ustrukturert kontroll), så vel som en liten mengde gel lasting fargestoff i en annen kjørefelt for å overvåke hvor langt gelen har kjørt.
- Bruk 1x TBE som gelen rennende buffer og drives av gelen ved 120 V, inntil fargestoffet fram har tilbakelagt i det minste 1/3 av gelen.
- Legg et tynt lag kromatografi plate med sin røffe siden opp i et ark protector (eller dekk til med plastfolie). Fjerne en av glassplatene og overføre gelen til overflaten av arket beskytteren. Slå av lys og UV skygge gel (lang bølgelengde: 365 nm). Bruk en frisk barberblad og klipp ut G-quadruplex-Z33-Bio band, som vil bli sett på som kjører høyere opp i gelen (har lavere mobilitet) i forhold til smelteed kontroll.
- Plasser gelstykket inneholdende det dannede G4-DNA i et 50 ml rør og tilsett akkurat nok soaking buffer for å dekke gelen skive (soaking Bufferen består av 1/3 volum 10 x TBE, 1/3 volum mettet natrium-acetat, og 1/3 volum H2O). Plasser røret på en 37 ° C inkubator (nonhumidified) og inkuberes O / N.
- Overfør løsningen til et 15 ml rør og tilsett 1/10 volum glykogen (glykogen lager ved 20 mg / ml i 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8, og 0,05% natriumazid) og ~ 1,2 x volum isopropanol .
MERK: Natriumazid er akutt giftig, så bruk med forsiktighet!- Blande og plassere røret ved -20 ° C i minst 2 timer. Spinne rør ved 2700 xg i en bordsentrifuge avkjølt til 4 ° C i 12 min. Forsiktig dekanteres oppløsningen fra pelletert G4-DNA. Vask pelleten 3 ganger med 70% EtOH + 50 mM NaCl (saltet i vaske er kritisk for stabiliteten G4). Wick vekk overflødig væske med lofritt papir.
- Plassden vaskede pellet i kjøleskap i minst 2 timer for å hydratisere pellet og tillate enklere resuspensjon. Resuspender pelleten i 50 pl TNE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl og 0,05 mM EDTA pH 8).
- Plasser 5 pl av denne dannede DNA-G-quadruplex inn i 495 ul H2O og kvantifisere ved hjelp av et spektrofotometer som gjør det mulig for ekstinksjonskoeffisienten som skal bestemmes ved å angi nukleotid sammensetningen av oligomeren (ekstinksjonskoeffisienten for Z33 DNA-oligomer med en basesammensetning av A = 8, C = 3, G = 15, og T = 7 er 341946 l / mol / cm). Skriv fortynningsfaktoren som 25 (ikke 100), som dannet G-quadruplex består av 4 tråder av DNA.
- Delmengde volumet tilsvarende 3 ODS (OD 260 enheter) per rør og oppbevar ved -20 ° C; Hvis for eksempel de 5 ul som ble tilsatt til 495 pl H2O gir en OD 260 avlesning på 3, og deretter fremstille 5 ul alikvoter.
2. Utarbeidelse av G4-DNA strukturer til bruk i en enzymatisk aktivitet analyse av rG4R1 (Dannelse av TAMRA-merket G4-DNA)
- Bestill følgende DNA oligomer, heter Z33-TAM, på en 1 umol-skala: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Kontroller at TAMRA-delen er ved 5 'enden av oligomeren.
- Følg samme prosedyre som beskrevet i avsnitt 1 for dannelsen av G-quadruplex, bortsett fra at ultrafiolett (UV) skygge er ikke nødvendig fordi tetramethylrhodamine (TAMRA) -merket G-quadruplex vil være lett synlig med det blotte øye. Igjen, sørg for å inkludere en smeltet kontroll på gelen.
- Etter å ha tatt et spektrofotometer lesning av TAMRA-merket DNA G-quadruplex, som i trinn 1, fortynne det dannede G-quadruplex til 0,2 pmol / pl med TNE buffer. Til slutt legger glyserol til en 10% endelig konsentrasjon og oppbevares ved -20 ° C.
3. Transform (DE3) pLysS Competent Cells med PTRiEx4-DHX36 (Plasmid Encoding Menneskelig G4R1) og Grow / frembringe store bakteriekulturer
- Skaff TriEx4-DHX36 plasmid.
- Delmengde bakteriene inn i 20 pl aliquoter og lagres ved -80 ° C. Alikvoter av SOC-medium (2% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glukose) i 80 pl aliquoter og oppbevar ved -80 ° C.
- Forbered karbenicillin (CARB) / kloramfenikol (CAM) LB-agar plater. Lager konsentrasjoner av CARB og CAM er 50 mg / ml i H2O og 35 mg / ml i 70% EtOH, henholdsvis, og disse er 1,000x konsentrert; således de endelige konsentrasjoner i LB-agar seleksjonsskålene er 50 ug / ml og 35 ug / ml, respektivt.
- Plassere en alikvot av bakterier på is og sette inn en porsjon av SOC-medium ved RT. Tilsett 1 mikrogram av pTriEx4-DHX36 plasmid til bakterier og virvle forsiktig med pipettespissen å blande. Inkuber på is i ytterligere 5 minutter og deretter varmesjokk ved 42 & #176 C i 30 sek. Plasser på is i 2 min og legge til SOC medium.
- Plate de transformerte bakteriene på forvarmet seleksjonsplater (vanligvis plate et lite volum, for eksempel 5-10 ul, for å sikre lav kolonien tetthet slik at enkeltkolonier lett kan inokulert i store kulturer) og inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Forbered Terrific Buljong i henhold til produsentens instruksjoner 24. Gjør 500 ml per stor flaske (sørg for å legge til glyserol) og autoklav på en kort væske syklus.
- Legg CARB / CAM (50 ug / ml / 35 ug / ml) til mediet, og deretter inokulere kulturer ved å ta agar plugger (ved hjelp av en P1000 pipette) inneholdende en enkelt bakteriekoloni og pipettering inn i kjøttkraft. Virvel kulturer kraftig for å lufte dem og deretter inkuberes kulturene ved 37 ° CO / N uten risting.
- Neste dag, plasserer de kulturene i en 37 ° C shaker og rist på ~ 225 rpm. Grow kulturer til OD 600 er ca 0,4 -0,6, som typisk vil ta omtrent 4-6 timer, avhengig av den opprinnelige celletetthet.
MERK: Dette vil kreve periodisk tetthet overvåking via spektrofotometriske målinger, og det er viktig å ikke vokse kulturene til mye over 0,5 OD. Som en tom for spektrofotometriske avlesninger, spinne ned 1 ml av bakterier og bruke avklart kjøttkraft som blanking løsning. - Når den riktige OD 600 er oppnådd, umiddelbart plassere kulturene på is og raskt avkjøle seg til 10 ° C. Overvåk temperaturen med et termometer tørkes av med 70% EtOH. Fremskynde avkjølingen ved raskt å rotere flaskene mens på is, da dette vil begrense ytterligere bakterievekst før rekombinant protein induksjon.
- Legg IPTG til en 1 mM sluttkonsentrasjon (~ 120 mg / 500 ml kultur) og deretter riste ved 80 rpm ved 14 ° C i ~ 17 - 18 timer. Den ideelle temperaturen for proteininduksjon er funnet å være 14 ° C; til beste oppnå dette, bruker et avkjølt vannbad shaker locrerte i en konvensjonell kaldt rom og kontrollere temperaturen i vannbadet med et termometer manuelt.
MERK: kan eventuelt bruke en luftkjølt shaker / inkubator, selv om det er nødvendig å teste det digitalt innstilt temperaturinnstilling vil gi den ønskede væsketemperaturen (test dette ved inkubering av en kolbe med vann med et termometer i den og risting ved 80 rpm i noen timer, justering av digital temperaturinnstilling tilsvarende inntil 14 ° C er nådd). - Plasser kulturer på is og kjøle dem raskt, som i trinn 3.9. Ta en liten delmengde av bakterier og ta en OD 600 lesing; Ideelt sett vil kulturer har doblet i løpet av induksjon til ca 0,8 til 1,2 OD 600.
- Overfør bakterier til 500 ml sentrifugerør og manuelt balansere dem ved hjelp av bakteriekultur for å jevne vekten mellom rørene. Når balansert, sentrifuger dem på 3840 xg i 20 min ved 4 ° C. Hell av avklart kjøttkraft og fryse bakteriell pelkan ved -80 ° C inntil tiden for proteinrensing.
4. Rensing av menneskelige rG4R1
- Tine og lyserer bakterie pellets.
- Tine den bakterielle pellet i 3 ml TN-buffer ved romtemperatur (TN-buffer består av 100 mM Tris pH 7,5 og 50 mM NaCl). Hold flaskene i hånden og swirl å tine / resuspendere bakteriepelleten. Når tint og relativt jevnt suspendert, bringe volumet opp til 5 ml med TN buffer (ytterligere suspensjon kan gjøres via pipettere opp og ned med en 5 ml pipette).
MERK: Det er typisk å tine / prep enten 2 eller 4 flasker på forberedelsesdagen, avhengig av brukerens nivå av komfort med renseprosedyren. - Løs opp 20 mg av lysozym i 250 mL av H 2 O (per kultur) og legge til resuspendert bakterier. La lysozym å fordøye bakterier for ~ 5-10 min mens virvlende flaskene i hånden.
MERK: Fargen på suspensjonen vil begynne å lysne litt som fordøyelsen provenyet, og suspensjonen vil være relativt ikke-viskøs. Dersom kulturer er også overgrodde (dvs. mye større enn 1,2 OD 600), deretter kromosom bakterielt DNA kan føre til uønsket viskositeten på dette trinn. - Tilsett 250 ul av protease inhibitor cocktail (PIC) og en 10 ul alikvot av leupeptin. Bland grundig.
- Plasser på is og tilsett 10 ml kald TN-buffer og 22 ul av BME. Overføring til en 50 ml tube.
- Sonikere bakteriene på is med et digitalt sonikator satt til 30% amplitude. Puls 2 s PÅ og 2 s AV i 1 min. Gjenta ultralydbehandling 3 ganger, slik at prøvene avkjøles på is i minst 2 min mellom ultralydbehandling trinn.
MERK: Med flere kulturer, sonicate dem etter tur før du gjentar sonication gjentakelser. Under ultralydbehandling, være nøye med å holde ultralyd tips tilstrekkelig neddykket i bakterielysatet, men ikke berøre the sider av røret, da dette vil generere overskuddsvarme. - Legge til et like stort volum (15 ml) kaldt 4x SSC + 20 ul av BME + 50 ul av PIC + 1 aliquot av leupeptin og bland.
- I en bord-sentrifuge på forhånd avkjølt til 4 ° C, sentrifuger lysatene ved 2300 xg i 20 min. Overfør supernatanten til friske, pre-avkjølt 50 ml rør (1 tube per stor kultur blir preparert).
- Tine den bakterielle pellet i 3 ml TN-buffer ved romtemperatur (TN-buffer består av 100 mM Tris pH 7,5 og 50 mM NaCl). Hold flaskene i hånden og swirl å tine / resuspendere bakteriepelleten. Når tint og relativt jevnt suspendert, bringe volumet opp til 5 ml med TN buffer (ytterligere suspensjon kan gjøres via pipettere opp og ned med en 5 ml pipette).
- Forbered G4-magnetisk perler.
- Ta 1 ml av streptavidin paramagnetiske vulst (SPB) suspensjon (per 1 liter kultur) og overføre den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pelletere SPB med en magnet og vaskes 2 ganger med 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspender den vasket SPB i 200 ul av den samme løsning som brukes for å vaske perlene.
- Tilsett en 3 OD porsjon av G4-DNA (Z33-Bio G4 fremstilt i avsnitt 1) til SPB suspensjonen og blandes raskt ved å pipettere opp og ned flere ganger. Plasser rørene på en rotator og roterer ved romtemperatur i minst 30 min (og opp til 60 min).
- After denne perioden av rotasjon, blokkerer G4-bundet SPB ved tilsetning av 1 ml 0,4% lactalbumin, og holder på is inntil nødvendig. Fortynne 0,4% lactalbumin fra 4% lactalbumin lager bruker 1x Tris-glysin.
MERK: lager 4% lactalbumin (w / v) blir først fremstilt ved oppløsning i 2 M glycin pH 7,5, med den ytterligere tilsetning av 1x PIC og 0,05% natriumazid.
- Bind histidin-merket rG4R1 til kobolt perler (CB) (fortsatt fra trinn 4.1).
- Tilsett 1 ml CB slurry (tilsvarende en 0,5 ml vulst volum) til hver 50 ml rør inneholdende klaret bakteriell lysat. Inkuber i 20 minutter ved RT på en rotator.
MERK: 0,5 ml vulst volum anvendes per 1 liter av klaret lysat; for eksempel hvis to 500 ml bakteriekulturer blir fremstilt, bare legge CB i 50 ml rør inneholdende klaret lysat fra en av kulturene på dette punktet, som lysat fra den andre kulturen blir serielt bundet med den samme 0,5 ml av CB i step 4.3.3). - Spinn ned CB 110 xg i 5 min i en 4 ° C tabletop sentrifuge. Aspirer væsken forsiktig, og la et par ml væske, slik som å ikke forstyrre pelletert CB. Vask med 10 - 15 ml kald 4x SSC + BME (0,5 mL av BME / ml 4x SSC).
NB: For vasker, hell 10-15 mL direkte på de pelleterte kuler i stedet for kobolt pipettering, som pipettering vil føre til at perlene blir sittende fast til innsiden av pipetten og protein går tapt. - Pellet CB igjen via sentrifugering og deretter helle den neste klaret lysat (30 ml, som representerer to nd store induserte bakteriekultur) på pelleterte CB. Inkuber i ytterligere 20 minutter ved RT på dreianordningen og vask deretter to ganger med 10-15 ml av 4x SSC + BME. Pellet ved 110 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Etter den andre vask, suge væsken og la ca 2 ml perler / væske i bunnen av røret. Overfør den proteinbundne CB til en på forhånd avkjølt 2-ml rør avved hjelp av en 1 ml "wide-bore" pipette tips.
MERK: Bruk en frisk barberblad for å kutte enden av spissen før overføring, da bruken av denne "wide-bore" pipettespissen vil redusere tapet av proteinbundne kobolt perlene. - I korthet Sentrifuger kulene i 2 ml rør ved høy hastighet (~ 18 000 x g) i en mikrosentrifuge ved 4 ° C (~ 5 - 10 s er alt som er nødvendig for rask pelletering). Fjern forsiktig og kast supernatanten ved pipettering, er forsiktig med å ikke miste protein-bundet CB.
- Tilsett 1 ml CB slurry (tilsvarende en 0,5 ml vulst volum) til hver 50 ml rør inneholdende klaret bakteriell lysat. Inkuber i 20 minutter ved RT på en rotator.
- Eluere rG4R1 fra CB.
- Inkuber CB i 0,5 ml histidin elueringsbuffer (HEB) på en rotator i 5 minutter i et kaldt rom. Igjen, da tilsetning av HEB, bare Pipetter 0,5 ml på perlene (for å eliminere tap CB) og resuspender perlene ved å snu røret. HEB er 0,7 M L-histidin pH 6 (pH-verdien justeres ved hjelp av eddiksyre).
- Sentrifuger ved 18000 x g i en mikrosentrifuge 4 ° C i 1 min. Overfør supernatantentil en på forhånd avkjølt 15 ml tube. Fjern forsiktig og overføre den proteininneholdende supernatanten ved forsiktig pipettering, og etterlater en liten mengde av væske på toppen av CB.
- Gjenta trinn 4.4.1 og 4.4.2 for totalt 3 HEB elueringer.
- Eluering en gang med 0,2 M EDTA pH 6,0; fargen på CB vil endre seg fra rosa til hvitt som EDTA chelates kobolt.
- Etter denne fjerde og siste eluering har blitt overført til 15 ml tube, pipette rest elueringsbufferen fra CB ved hjelp av en gel-lasting spiss på enden av en 1 ml pipette; ved å dyppe spissen til bunnen av røret, kan gjenværende protein-inneholdende elueringsbuffer samles.
- Bind rG4R1 til G4-bundet SPB og elueres rekombinant enzym i en ATP-avhengig måte.
- Forbered 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, og 50% glycerol. Forbered 3x Res Buffer: 0,915 ml H2O, 2 ml av 5 x Res buffer, 0,33 ml av 0,4% lactalbumin (diluted fra 4% lactalbumin med 1 x Tris-glycin), 0,010 ml av BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, og 0,010 ml leupeptin. Hold på is.
MERK: lager 4% lactalbumin (w / v) blir først fremstilt ved oppløsning i 2 M glycin pH 7,5, med den ytterligere tilsetning av 1x PIC og 0,05% natriumazid. - Pellet G4-SPB til siden av røret med en magnet og kast supernatant (G4-SPB, som fremstilt i trinn 4.2). Tilsett 1 ml 3x Res buffer til G4-SPB og pipetten for å blande.
- Pipette denne 1 ml G4-SPB suspendert i 3x Res buffer inn i 15 ml rør inneholdende ~ 2 ml av proteininneholdende HEB / EDTA (eluatet fra trinn 4.4). Inkuber i 15 min i et 37 ° C vannbad under leilighetsvis omrøring, slik at perlene ikke slå seg.
- På is, pellet den proteinbundne G4-SPB til siden av røret med en magnet. Å vaske, tilsett 1 ml av 4x SSC + 0,4% lactalbumin (+ 0,5 mL / ml BME) og pipette for å resuspendere perlene. Pellet perler med tHan magnet på is. Gjenta dette vask for totalt 2 vasker.
MERK: Tålmodighet er nødvendig under vaskeprosessen for å sikre at alle de magnetiske kuler er pelletert mellom hver vask. Dette gjelder spesielt på grunn av den økte viskositet av oppløsningen på grunn av glycerol som inneholdes i de Res buffere. - Vask G4-SPB 1x med 1 ml 3x Res Buffer.
- Forbered elueringsbuffer (EB): 0,5 ml 3x Res buffer, 0,1 ml 0,1 M ATP, og 0,4 ml H2O
- Forvarm 1 ml av EB til 37 ° C i PCR-rør fordelt tvers over varmeblokk av en termosykler innstilt på 37 ° C.
- Pellet G4-SPB med magneten på is og resuspender perlene i 100 mL av forvarmet EB. Umiddelbart overføre perlene til en forvarmet PCR-rør og inkuberes i 30 s ved 37 ° C.
- Straks legge til 12 ul av 5 M NaCl og pipettere opp og ned kraftig 20 - 30 ganger. Kombinasjonen av den høye salt og ATP inneholdt i EBtjener til å eluere rG4R1 fra G4-perler.
MERK: Det er meget viktig å minimere antall bobler som dannes under pipettering prosessen, da bobler kan denaturere proteinet. - Umiddelbart pellet G4-SPB med en magnet og overføre den proteininneholdende eluatet til en ny PCR-rør på is (merket med datoen).
- Gjenta elueringen og overføring som er beskrevet i trinn 4.5.8-4.5.10; sluttproduktet av denne fremgangsmåte er således ~ 200 ul av EB inneholdende renset rG4R1. Satt til side to 7 pl alikvoter (i PCR-rørene merket med det riktige dato) til bruk i kvalitetskontrollen enzymatisk aktivitetsanalyse som vil teste hvorvidt høyaktiv rG4R1 har faktisk blitt renset.
- Oppbevar renset rG4R1 ved -80 ° C inntil tidspunktet for aktivitetsanalyse.
- Forbered 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, og 50% glycerol. Forbered 3x Res Buffer: 0,915 ml H2O, 2 ml av 5 x Res buffer, 0,33 ml av 0,4% lactalbumin (diluted fra 4% lactalbumin med 1 x Tris-glycin), 0,010 ml av BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, og 0,010 ml leupeptin. Hold på is.
5. Kvalitetskontroll enzymatisk aktivitet analyse av renset rG4R1
- For hvert preparat av rG4R1 som skal undersøkes, fremstille 300 ulav resolvase analysebuffer (RAB), hvor hver 30 uL inneholder 0,2 pmol av TAMRA-merket Z33 G4-DNA (fremstilt i trinn 2); sammensetningen av RAB er som følger: 0,1 ml av 3 x Res buffer, 0,01 ml av 0,2 pmol / pl G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP og 0,16 ml H2O I en stripe av seks PCR rør, pipettes 40 mL av RAB i det første røret og 30 mL av RAB inn de resterende rør (holde rørene på is på dette punktet).
- Hente en av de 7 mL rG4R1 porsjoner (fra trinn 4.5.11) og plassere den på is. Med en p20 pipette satt til 5 pl, forsiktig pipettere opp og ned noen ganger for å blande den rG4R1 i alikvoten og overføring 5 ul til det første rør av strimmelen 6 PCR-rørene (den som inneholder 40 pl av RAB). Deretter satt pipetten til 10 mL og serielt overføre 10 mL til de resterende PCR rør som inneholder RAB.
- Umiddelbart inkuber denne strimmel av PCR-rør ved 37 ° C i 30 minutter i en termosykler, etterfulgt av et 4 ° C hold.Åpne rørene så lenge de blir holdt ved 4 ° C og tilsett 2 pl 0,5 M EDTA pH 8 til hvert rør (for å stoppe den enzymatiske reaksjon).
- Hell en 10% akrylamid / 1x TBE / 10% glyserol gel. Etter å ha fjernet kam, vaske brønnene med 1x TBE. Tilsett 5 ul av en høy-masse, hydrofilt polysakkarid (30% Ficoll i H 2 O) til hvert rør og last 15 ul fra hvert rør (lasting av brønner kan igjen observeres ved hjelp av Schlieren linjer).
- Som en kontroll for G4-DNA mobilitet, tilsett 4 mL av en høymesse, hydrofil polysakkarid til 20 mL RAB, og last 15 mL; som en kontroll for å vikles av monomere Z33, varme 20 ul av RAB ved 98 ° C i 10 minutter, tilsett 4 ul av en høy masse, hydrofil polysakkarid, og lasten 15 ul.
- Kjør gelen ved 120 V i 2 timer med 1 x TBE som løpebuffer. Bilde gelen på en multimodal kamera med fluorescens-bildekapasitet ved hjelp av Tamra spesifikke filtre (opphisse med en 532 nm grønn laser og bruke en 580 nm bandet passere 30 filter (580 BP 30)).
MERK: En meget aktiv fremstilling av rG4R1 vil gi fullstendig oppløsning av TAMRA-merket Z33 i de første 3 baner som ble lastet på gelen, som vist i figur 2.
6. Samling av høyaktiv rG4R1 Preps, alikvoteringsprosessen og oppbevaring
MERK: Dette trinnet krever 2 personer. Antallet og enzymatiske krav nedstrøms analyser som den rensede rG4R1 vil bli brukt i vil bestemme hvor mange preparater er nødvendig før alikvoteringsprosessen. Et typisk preparat består av stor kontinuitets 8 høyaktive preparater (og dermed ved hjelp av et totalt 16 induserte 500 ml bakteriekulturer), men dette er et vilkårlig tall og er laboratorie-spesifikk.
- Beregn det totale volum av meget aktive, rensede rG4R1 som skal alikvotert. Vanligvis er 7 pl alikvoter anvendt i nedstrøms analyser. Fyll blokk med en termisk syklusener innstilt på 4 ° C med strimmel PCR-rørene (disse vil bli deles opp i porsjoner, som den faste karakter av blokken vil fremskynde hurtig lukking av PCR-strimler).
- Hente PCR-rør inneholdende meget aktive rG4R1 fra -80 ° C og raskt å tine rørene i hånden; når en liten mengde is som er igjen i røret, plasser rørene på is. Kombiner alle de raskt-tinte forberedelsene til en forhåndsavkjølt, 15 ml tube og bland godt, og pass på å minimalisere bobler.
- Ved hjelp av en automatisk gjenta pipette, dispensere ønsket delmengde volum inn i pre-avkjølte PCR strips i termosykler. Så snart 1 - 2 strimler er fullført, må den andre personen lukkes lokkene og overføre dem til 96-brønns skiver som er flytende i flytende nitrogen (flash-frysing er nødvendig for å bevare enzymaktivitet).
MERK: Ikke ta mer enn 200 mL av rG4R1 inn i tuppen av den automatiske pipette om gangen for å redusere tiden at enzymet ikke er på 4° C. - Når forhåndsavkjølt PCR strips i termosykleren har vært fylt med porsjoner og ordentlig frosset, raskt overføre mer pre-avkjølte PCR strips fra is til termosykleren og fortsette alikvoteringsprosessen. Fortsett på denne måte til resten av enzymet er blitt delt i porsjoner, flash-frosset i flytende nitrogen, og overføres til tørris. Til slutt overfører alikvotene til -80 ° C for langtidslagring.
7. Kvantifisering av renset rG4R1 Konsentrasjon
- Hell en standard 5% stabling / 12% løsning akrylamid / SDS gel for proteinseparasjon.
- Tine ca 50 mL av porsjonert rG4R1, sammen til ett rør, og bland godt. Måle den eksakte volum med en pipette og legge til en lik mengde av 2 x Laemmli-prøvebuffer (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (vekt / volum) glyserol, 2,1% SDS og 0,02% bromfenolblått) + BME (50 ul / 950 mL av 2x Laemmli buffer). Denaturere proteinet ved 98 ° C i 10 min.
- Fjerne kammen fra gelen og vaskes brønnene med standard 1x SDS / glycin rennende buffer. Last tilsvarende 25 og 12,5 ul av rG4R1 (som er 50 og 25 ul av denaturert protein), selv om den optimale volum av enzym for å laste bør bestemmes av brukeren, som konsentrasjonen av de enzymholdige preparater vil variere (f.eks, 35 pl ble applisert på gelen i figur 3). Last protein standarder utarbeidet i trinn 7.3. Kontroller at pipettene er kalibrert riktig, og sørg for å være så presis som possible med pipetteringsteknikk å sikre nøyaktig kvantifisering.
- Kjør gelen ved 120 V, inntil fargestoffet fram har gjennomløpt omtrent 2/3 av gelen (for å sikre tilfredsstillende separering av proteinene som utgjør bredt spekter MW markører).
- Fjerne gelen og kast den del av gelen som ikke inneholder protein ved å skjære den bort med et barberblad. Plasser gel i et glass ildfast form eller en tilsvarende beholder. Flekk gelen med Coomassie-farge (50 mg Coomassie R-250 per 100 ml 50:10:40 vol / vol metanol: eddiksyre: H 2 O som har blitt filtrert gjennom et filter-papir trakt) O / N ved RT på en orbital-rystemaskin sett for å sikre tilstrekkelig omrøring av gelen.
- De-flekker på gel med 30:10:60 v / v metanol: eddiksyre: H 2 O hjelp balled opp, lofri silkepapir å fremskynde avfarging. Endre avfarging løsning etter behov. Fortsett avfarging til bakgrunnen er tilstrekkelig lav til å visualisere rG4R1 og protein standarder; en typisk gel ved dennetrinn er vist i figur 3.
- Plasser avfarget gel i mellom et ark beskytter og skanne gel på ≥300 dpi oppløsning. Åpne det skannede bildet i et bildeanalyseprogram (for eksempel Fuji Multiguage eller tilsvarende) og lage standardkurver fra proteinstandarder som tilsvarer 75, 100, og 150 kDa (kurvene representerer grammengder versus densitometriske målinger). Sørg for å trekke bakgrunnen fra hvert kjørefelt blir kvantifisert under prosessen med å skaffe densitometriske verdier.
- Forutsatt at den volummengde av rG4R1 som ble lastet på gelen inneholder en mengde av protein som er innenfor det lineære området av disse standardkurver, gram Mengden av protein per mikroliter rG4R1 lastet kan ekstrapoleres.
- Omdanne den ekstrapolerte gram mengden av rG4R1 inn i en molar mengde ved hjelp av molekylvekten til G4R1, som er 120 000 g / mol.
MERK: For hver gel, vil tre ekstrapolerte verdier væregenerert (en for hver av de tre proteiner markørene brukes for å generere standardkurvene: 75, 100, og 150 kDa). Kjør ytterligere to geleer og beis og kvantifisere dem ved å gjenta trinn 07.01 til 07.10. Med resultatene av kvantifiseringen av den første gelen, vil brukeren være i stand til å måle hvor mye rG4R1 må lastes om ytterligere geler for å gi en mengde som er innenfor det lineære området av proteinstandarder. Samlet ekstrapolere ni verdier som representerer konsentrasjonen av høyaktiv, renset rG4R1. Gjennomsnittlig disse verdiene for å gi den endelige sats-spesifikke rG4R1 konsentrasjon, noe som er typisk i området på 20-100 nM. Beregne standardavviket fra disse verdiene (n = 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen (figur 1) gir rutinemessig nesten ren, katalytisk aktive rG4R1. Som et mål på enzymatisk aktivitet, blir det vanligvis observert at 50% av 0,2 pmol av TAMRA-merket tetramolecular G4-DNA blir omdannet til monomerer innenfor 0,2 til 0,013 mL rekke rG4R1, som analysert ved hjelp av G4 aktivitetsanalyse som er beskrevet ovenfor (figur 2). Coomassie-farging av renset rG4R1 angir et enkelt bånd ved de forventede 120 kDa størrelse, med en mindre forurensende bånd ved ~ 75 kDa, noe som kan representere avkortet rG4R1 som har beholdt sin evne til å binde G4-DNA-kulene og for å eluere i en ATP-avhengig måte (figur 3). Bandet av interesse er kvantifisert mot et protein standardkurve, og denne protokollen får vanligvis 200 pi 20-100 nM renset enzym per 1 liter bakteriekultur.
Figur 1: Skjematisk av en to-trinns Rensing av G4R1. En 6xHis-merket rG4R1 er bulk-renset fra E. coli-lysatene ved først å binde seg til og eluere fra Co 2+ konjugert perler. Et forpliktende skritt til G4-DNA-konjugert magnetiske kuler følger. Til slutt, er en ATP-avhengig eluering trinn nødvendig for å oppnå relativt ren og enzymatisk aktiv rG4R1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvalitet-kontroll G4-DNA Avkobling analysen. Baner 1 - 6: En konstant konsentrasjon av TAMRA-merket tetramolecular G4-DNA ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i nærvær av 4 x serielle fortynninger av rensede rG4R1 representerer 3,9 ul, 0,83 ul, 0,2 ul, 0,05 ul, 0,013 ul og 0- 0,003 ul, respektivt. Spor 7: tetramolecular G4-DNA i fravær av rG4R1. Lane 8: tetramolecular G4-DNA kokt for å redusere G4 strukturen til monomerene i fravær av rG4R1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering av renset rG4R1 konsentrasjon. Bred rekkevidde MW proteinmarkører ble lastet i følgende mengder: 500, 250, 125, 62,5, 31,3 og 15,7 ng i Lanes 1 - henholdsvis 6, og ble brukt til å generere en standardkurve for proteinkonsentrasjoner. Lane 7 representerer 35 mL av rG4R1. Denne spesielle gel ble kvantifisert som en del av et sett av tre eksemplarer geler, noe som resulterer i en gjennomsnittlig proteinkonsentrasjon på 62 ± 22 nM standard avvik (SD, N = 9)..com / filer / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er en svært effektiv ekspresjon, rensing og kvantifisering ordning for isolering av DHX36 genproduktet, G4-Resolvase1 (G4R1, også kalt RHAU og DHX36) (figur 1). Denne protokollen bruker to rensetrinn: His-tag affinitet rensing på kobolt affinitet perler og enzymatisk rensing på G4-DNA-konjugert perler. Sistnevnte steg er unik ved at den utnytter den stramme affinitet, høy spesifisitet, og katalytisk avkobling aktivitet som rG4R1 har for G4 strukturer. Den stramme affinitet for G4 strukturer (K d i det lav-pM området) gjør det mulig for en høy saltvasking (nær løselighetsgrensen av NaCl) før eluering fra G4 kulene, noe som reduserer nærværet av ikke-spesifikke proteiner. Den katalytiske aktivitet av G4R1 på G4 strukturer gjør det mulig for den spesifikke eluering av aktiv rG4R1 ved tilsetning av ATP og MgCl2. Denne to-trinns-renseskjemaet produserer konsekvent høyrent, Katalytisk aktive rG4R1 13 i mengder som passer for de fleste biokjemiske analyser.
Flere viktige skritt vil sikre et godt utbytte av svært ren, katalytisk aktive rG4R1. Den første er å sikre de riktige induksjons betingelsene for Hans-rG4R1 i bakterie uttrykket belastning. Vi har funnet at det beste utbyttet av rekombinant protein oppstår når cellene er dyrket til en OD 600 på ikke mer enn 0,4-0,6 like før induksjon. Å dyrke cellene utover dette punktet kan resultere i et tap av proteingjenvinning, muligens på grunn av inkorporering av rG4R1 inn i inklusjonslegemer. For det andre fikk vi en høyere konsentrasjon av renset protein av "serielt-bindende" lysatene til kobolt affinitet perler. For eksempel, bindes vi lysatet fra 0,5 L fra induserte kulturer til kobolt affinitet kulene og så utført en andre binding av en annen lysat fra ytterligere 0,5 l av kulturen til de samme kobolt affinitet perler. Dettetrinnet sikrer en mer konsentrert fremstilling av protein ved å øke antall rG4R1 molekyler bundet til et gitt volum av kulene, og dermed utnytte hele kapasiteten til kobolt affinitet perlene. For det tredje, sikrer høy saltvasking etter binding av kobolt affinitet elueringer til G4 perlene at nesten alle ikke-spesifikk proteinbinding til kulene er fjernet. For det fjerde gjør at ATP / MgCl2 eluering skritt for rG4R1 bundet til G4 perler til katalytisk slappe av tetramolecular struktur inn ett og ett hårstrå, forårsaker rG4R1 å bli løst fra perlene. Vi kan ikke helt utelukke muligheten for at ATP elueres rG4R1 i et konkurranse snarere enn en katalytisk måte; men dette er mindre sannsynlig å være tilfelle, siden vi tidligere har vist at en ikke-hydrolyserbar ATP analog er ikke tilstrekkelig for konkurrerende binding 13, 18. Affiniteten av rG4R1 for den avviklede, er enkeltkjedet DNA-en størrelsesorden mindre enn tHan starter tetramolecular G4-DNA, og således rG4R1 skal ikke gjenn bindes til kulene. For å redusere denne muligheten er imidlertid dette trinnet bør utføres ved 37 ° C, og elueringsvolumet bør skilles fra kulene så raskt som mulig. Elueringen trinnet ble gjentatt to ganger for å sikre maksimal utvinning. Dersom nedstrøms applikasjoner krever proteinet å være fri for DNA-forurensninger, anbefales det et ytterligere rensetrinn hvor det rensede fremstillingen er gjen bundet til streptavidin perlene for å fjerne eventuelle biotinylerte DNA-er, dersom de er tilstede.
Vi har funnet at rG4R1 er utsatt for nedbrytning hvis de riktige betingelsene ikke er opprettholdt gjennom hele protokollen. For å opprettholde integriteten og aktiviteten til enzymet, ansetter vi følgende viktige sikringstiltak. Protease-inhibitorer er holdt til stede gjennom hele renseprosedyren. Protokollen er utført ved 4 ° C, med mindre annet er angitt. Proteinet renses i nærvær av lactalbumin og β-merkaptoetanol. Protokollen er utført i tide (i en dag for rensing). I tillegg har vi funnet at flere fryse-tine-sykluser påvirke aktiviteten av proteinet negativt, så vi delmengde proteinet til "engangsbruk", 7 mL alikvoter etter rensing og lagre dem ved -80 ° C.
Selv om nærværet av laktalbumin i preparatet er nødvendig for å opprettholde integriteten og aktiviteten av proteinet, som nevnt ovenfor, er det funnet at dette kan også hindre nedstrøms applikasjoner. Andre mulige forstyrrende molekyler som er tilstede i den rensede rG4R1 fremstillingen omfatter ATP, β-merkaptoetanol, og blinket-trådet DNA. For eksempel har vi funnet det proteinpreparat til å være uforenlig med BIACORE analyse på grunn av den høye bakgrunnssignalet fra bufferkomponenter. Også tilstedeværelse av laktalbumin i proteinblandingen utelukker bruk av standard Bradfordog BCA proteinkvantifisering analyser. Imidlertid, har vi utviklet en alternativ gel-basert metode for kvantitering å omgå denne begrensningen.
Denne rensefremgangsmåten, som utnytter den enzymatiske aktiviteten til G4R1 som et middel for spesifikt å rense det, gjør denne metoden skiller seg fra andre metoder. For eksempel har andre grupper uttrykt FLAG-merket rG4R1 i humane celler 15, 25 eller GST-merket rG4R1 i insektceller 26 og renset det ved FLAG- eller GST-affinitetskromatografi, respektivt. Disse fremgangsmåter har fordelen av å være utført i et eukaryot ekspresjonssystem sammenlignet med et bakteriell ekspresjonssystem. Beregnede K d-verdier av det resulterende rensede GST-G4R1 for G4 strukturer ble funnet å være en størrelsesorden høyere 14 enn den rapporterte Kd-verdier 12, 13. Vi tilskriver this avvik i K d verdier forskjeller knyttet til en digre GST-tag versus en 6xHis-tag, forskjeller i renhet hentet fra disse to renseordninger, og forskjeller i omfanget og type posttranslasjonelle modifikasjoner kjøpt i en bakteriell kontra en insekt uttrykk system. Vår tilnærming har en distinkt fordel i forhold til de ovennevnte alternativer, fordi rensing av dette proteinet hengsler direkte på sin enzymatiske aktivitet. Derfor vi primært oppnå et enzym som er brettet og modifisert på en slik måte som opprettholder sine enzymatiske egenskaper. Andre affinitets-tag og / eller størrelses-eksklusjons teknikker er ute av stand til å skille aktivt enzym fra enzymatisk døde enzym. Det ville være nyttig for å fremtidig protokollutvikling for å kombinere styrken av andre gruppers renseprotokoller 15, 25, 26 (dvs. en human eller insektcelle uttrykkeligion system) med styrken av vår protokoll (dvs. katalytisk baserte rense) for ytterligere å forbedre denne metoden.
Selv om denne protokollen er foreløpig bestemt for G4R1, kan det lett tilpasses enhver ATP-avhengige, G4-løse proteiner, inkludert, men ikke begrenset til, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP proteiner, hPif1, og / eller ChlR1 / DDX1. Ved å endre sekvensen av nukleinsyren bindes til streptavidin perlene, kan denne protokollen kan tilpasses for å rense andre ATP-avhengige nukleinsyre-enzymer som produktet av den enzymatiske reaksjon er ikke lenger et substrat for enzymet, blant annet nukleinsyre-helikaser og nukleaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke våre finansieringskilder, inkludert en generøs gave fra Ware Foundation (til JPV), The National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (til PJS), og Ball State University oppstartsfond (til PJS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- BD Biosciences. , Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
