Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

doi: 10.3791/55496 Published: March 18, 2017
* These authors contributed equally

Summary

G4 Resolvase1 بربط (G4) هياكل G-quadruplex مع أشد تقارب الإبلاغ عنها من بروتين ملزمة G4 ويمثل غالبية النشاط الفك G4 الحمض النووي في خلايا هيلا. نحن تصف بروتوكول رواية تسخر تقارب والنشاط الفك ATP التي تعتمد على G4-Resolvase1 لتنقية تحديدا G4R1 المؤتلف نشاطا تحفيزيا.

Abstract

العليا الهياكل الحمض النووي تسمى G-quadruplexes (G4S، والهياكل G4) يمكن أن تشكل في المناطق جوانين الغنية على حد سواء DNA و RNA وهي غاية مستقرة حراريا. هناك> 375،000 المفترضة تسلسل تشكيل G4 في الجينوم البشري، ويتم إثراء هم في مناطق المروج والمناطق غير مترجمة (UTRs)، وخلال تكرار telomeric. نظرا لإمكانية هذه الهياكل تؤثر على العمليات الخلوية، مثل التكرار والنسخ، وتطورت الخلية الانزيمات لإدارتها. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase 1 (G4R1)، الذي كان كيميائيا شارك في تتميز مختبرنا ونغامين وآخرون. وجدت لربط بإحكام على حد سواء G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي (K د في المنخفض مساء المدى) للغاية. G4R1 هو مصدر معظم النشاط حل G4 في الخلية لست] هيلا ومنذ ذلك الحين تورط للعب دور في عملية التمثيل الغذائي التيلومير والتنمية الليمفاوية، النسخ الجيني، تكون الدم، والمراقبة المناعية. القدرة على EFficiently التعبير وتنقية نشاطا تحفيزيا G4R1 هو من أهمية للمختبرات المهتمة في الحصول على مزيد من التبصر في التفاعل الحركي هياكل G4 والإنزيمات حل G4. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لتنقية G4R1 المؤتلف (rG4R1). الإجراء الموضح يشتمل على تنقية التقليدية القائمة على تقارب من إنزيم الحامض الاميني الموسومة C-محطة أعربت في البكتيريا الأمثل كودون الإنسان مع الاستفادة من قدرة rG4R1 لربط وفك G4 الحمض النووي لتنقية انزيم نشط للغاية في ATP- خطوة شطف التابعة. ويشمل البروتوكول أيضا خطوة لمراقبة الجودة حيث يتم قياس النشاط الأنزيمي من rG4R1 عن طريق فحص قدرة الانزيم النقي للاسترخاء G4 الحمض النووي. ووصف الأسلوب أيضا أن يسمح لتقدير حجم rG4R1 تنقيته. وتناقش التعديلات بديلة من هذا البروتوكول.

Introduction

هياكل G4 هي هياكل الثانوية الحمض النووي مستقرة للغاية التي تشكل داخل الأقاليم جوانين الغنية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. واستقرت الهياكل G4 عبر التفاعلات Hoogsteen-الترابط والتنسيق الترابط داخل تجويف مركزي مع الكاتيونات الأحادي التكافؤ (أي. K + و + نا) التي تساهم إلى حد كبير في الاستقرار الحراري ملحوظا هياكل G4 1 و 2. وتشير دراسات المعلوماتية الحيوية في وقت مبكر أن الجينوم البشري يحتوي على> 375000 "الزخارف المكونة G4 المحتملة" 4. وتشير تقديرات عن دراسة حديثة أن عدد من الزخارف G4 أعلى بعامل 02-05 مايو، في حين تتوقع دراسة أخرى 716310 تسلسل تشكيل G4 المحتملة متميزة في الجينوم البشري 6. G4 تشكيل متواليات يتم حفظها تطويريا وليس فرقت عشوائيا فيالجينوم. يتم إثراء الزخارف G4 في المناطق ترميز الجينات، وأكثر من 40٪ من جميع المروجين الجين يحتوي G4 الزخارف 7. ومن المثير للاهتمام، وقد تجلى درجة تخصيب الزخارف G4 في جين تشير إلى وظيفة الجين. على سبيل المثال، بروتو الجينات المسرطنة والجينات المسؤولة عن تطوير لها تخصيب أكبر بكثير من الهياكل G4 من الجينات الكابتة للورم 8 و 9.

مع بثبات الحرارية العالية، وجود في كل مكان تقريبا في جميع أنحاء الجينوم، ويمكن أن يؤثر بشكل كبير العمليات الخلوية الرئيسية، فمن غير المستغرب أن نجد أن الخلية قد تطور من الأنزيمات لإدارة هذه الهياكل. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase1 (G4R1، ويسمى أيضا RHAU وDHX36)، وهو ما وصفها بأنها مصدر لغالبية tetramolecular G4 الحمض النووي النشاط حل في خلايا (هيلا) الإنسان 10. ومنذ ذلك الحين، فقد تبين ثار G4R1 بإحكام الربط وحفزي بالمرافعة tetramolecular وunimolecular G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي مع أشد KDS ذكرت لبروتين ملزمة G4 11 و 12 و 13. بالإضافة إلى ذلك، فقد نسب النشاط، حل G4 من G4R1 في مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية والخلوية، بما في ذلك التيلومير / التيلوميراز علم الأحياء 11، 14، 15، 16، النسخ والربط 17، 18، 19، 20، والتنمية 21، تكون الدم 21، والمناعة اللائحة 22، 23. مع كثرة متواليات G4 تقع تحديدا في جميع أنحاء الجينوم وص الخلوية المتنوعةrocesses أن G4R1 تم مؤخرا تورط في المشاركة مع والقدرة على التعبير وتنقية نشطة للغاية وrG4R1 تكون ذات أهمية قصوى لتوضيح الآليات والسلوكيات الحيوية من هذا البروتين بكفاءة.

هنا، علينا أن نظهر التعبير الرواية ونظام تنقية (الشكل 1) أن يستفيد من لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد على والنشاط، حل G4 من rG4R1 لعزل بكفاءة الإنزيم النشط. ويمكن تكييف هذا المخطط لتنقية ATP التي تعتمد على أنزيمات الحمض النووي الأخرى التي نتاج رد فعل الأنزيمي لم يعد الركيزة ملزمة، كما هو الحال بالنسبة لG4R1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الهياكل G4 الحمض النووي لاستخدامها لتنقية rG4R1 (تشكيل البيروكسيديز G4 الحمض النووي G-Quadruplex)

  1. تأمر قليل وحدات التالية الحمض النووي، ودعا Z33-بيو، على نطاق μmole-1: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG غا GGA عقاري GGA CCT البيوتين 3 ". تأكد من أن شاردة البيوتين هي في 'نهاية 3 من قليل وحدات.
  2. إعداد العازلة 10X G4: 450 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 و 25 ملي EDTA، و 2،500 مم كلوريد الصوديوم.
  3. Resuspend وقليل وحدات Z33 في 250 ميليلتر من الماء (حتى أن تركيز قليل وحدات غير ~ 2.5 ملم). إضافة 25 ميكرولتر من العازلة 10X G4 وتخلط. احتضان قليل وحدات عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ~.
  4. تدور لفترة وجيزة إلى أسفل أنبوب لجمع التكثيف (~ 1000 x ج، 10 ثانية). إضافة ~ 50 ميكرولتر من كتلة عالية، السكاريد ماء (30٪ Ficoll في H 2 O) وتخلط. صب 10٪ الأكريلاميد / 1X TBE / 10٪ هلام الجلسرين (أبعاد هلام: 16 سم × 16 سم × 1 مم). مرة واحدة هلام هو بلمرة، وغسل الآبار مع 1X TBE وتحميلوشكلت قليل وحدات Z33-بيو بالتساوي عبر أكثر من هلام (عينة حارة تحميل يمكن تصور مع خطوط انعراجي).
    1. في حارة واحدة في نهاية هلام، تحميل جزء صغير من قليل وحدات الذي تم تسخينه عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (وهذا سيكون بمثابة عنصر تحكم غير منظم)، فضلا عن كمية صغيرة من الصبغة هلام تحميل في آخر ممر لمراقبة مدى وتشغيل هلام.
  5. استخدام 1X TBE باعتبارها منطقة عازلة هلام تشغيل وتشغيل هلام في 120 V حتى اجتاز الجبهة صبغ 1/3 على الأقل من هلام.
  6. وضع رقيقة لوحة طبقة اللوني مع الجانب الخشن في مواجهة في حامية ورقة (أو مع تغطية غلاف بلاستيكي). إزالة واحدة من لوحات الزجاج ونقل الجل على سطح حامية ورقة. إطفاء الأنوار العلوية والظل للأشعة فوق البنفسجية هلام (الطول الموجي الطويل: 365 نانومتر). استخدام شفرة حلاقة جديدة وقطع الفرقة G-quadruplex-Z33-بيو، الذي سينظر إليه على أنه يعمل على مستوى اعلى في هلام (وجود تباطؤ الحركة) نسبة إلى ذوبانالسيطرة أد.
  7. ضع شريحة هلام يحتوي على تشكيل G4 الحمض النووي في أنبوب 50 مل وإضافة عازلة تمرغ ما يكفي لتغطية شريحة هلام (عازلة تمرغ يتكون من 1/3 حجم 10X TBE، 1/3 حجم المشبعة خلات الصوديوم، و1/3 حجم H 2 O). وضع أنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية (nonhumidified)، واحتضان O / N.
  8. نقل الحل إلى أنبوب 15 مل وإضافة 10/01 حجم الجليكوجين (المخزون الجليكوجين في 20 ملغ / مل في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 2.5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8، و 0.05٪ أزيد الصوديوم) و~ 1.2X حجم الأيزوبروبانول .
    ملاحظة: أزيد الصوديوم هو شديدة السمية، لذلك تستخدم بحذر!
    1. خلط ووضع أنبوب في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. تدور الأنبوب في 2700 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة تبرد إلى 4 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. صب بلطف الحل من مكعبات G4 الحمض النووي. يغسل بيليه 3 مرات مع 70٪ ETOH + 50 ملي كلوريد الصوديوم (الملح في غسل هو أمر حاسم لاستقرار G4). الفتيل السوائل الزائدة بعيدا مع المناديل الورقية خالية من الوبر.
  9. مكانبيليه غسلها في الثلاجة لمدة 2 ساعة على الأقل لترطيب بيليه والسماح لتسهيل إعادة تعليق. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من العازلة TNE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8).
  10. ضع 5 ميكرولتر من هذا الحمض النووي G-quadruplex شكلت في 495 ميكرولتر من H 2 O وتحديد باستخدام مقياس الطيف الضوئي الذي يسمح للمعامل الانقراض يتم تحديدها عن طريق إدخال تركيبة النوكليوتيدات من قليل وحدات (معامل انقراض قليل وحدات Z33 الحمض النووي مع تكوين قاعدة من A = 8، ج = 3، G = 15، و T = 7 هو 341946 L / مول / سم). أدخل عامل التخفيف إلى 25 (لا 100)، ويتكون تشكيل مجموعة quadruplex من 4 فروع من الحمض النووي.
  11. قسامة ما يعادل حجم 3 المواد المستنفدة للأوزون (OD 260 وحدة) في أنبوب ومخزن في -20 درجة مئوية. على سبيل المثال، إذا كان 5 ميكرولتر التي تم إضافتها إلى 495 ميكرولتر من H 2 O يعطي OD 260 قراءة 3، ثم إعداد 5 مكل.

2. إعداد الهياكل G4 الحمض النووي لاستخدامه في الأنزيمية آخر الفحص من rG4R1 (تشكيل طمرة المسمى G4-DNA)

  1. تأمر قليل وحدات الحمض النووي التالية، ودعا Z33-TAM، على نطاق μmole-1: 5 'طمرة-AAA GTG ATG GTG GTG GGG غا GGA عقاري GGA CCT 3 ". تأكد من أن شاردة طمرة هي في 'نهاية 5 من قليل وحدات.
  2. اتبع نفس الإجراء على النحو المبين في المادة (1) لتشكيل مجموعة quadruplex، إلا أن الأشعة فوق البنفسجية (UV) التظليل ليست ضرورية لأن tetramethylrhodamine (طمرة) -labeled سوف G-quadruplex تكون مرئية بسهولة بالعين المجردة. مرة أخرى، تأكد من تضمين عنصر تحكم المذابة على هلام.
  3. بعد أخذ القراءة معمل الحمض النووي G-quadruplex المسمى طمرة، كما في الخطوة 1، يخفف من تشكيل مجموعة quadruplex إلى 0.2 بمول / ميكرولتر مع العازلة TNE. أخيرا، إضافة الجلسرين إلى التركيز النهائي 10٪ ومخزن في -20 درجة مئوية.

3. تحويل (DE3) PlysS الخلايا المختصة مع PTRiEx4-DHX36 (البلازميد ترميز G4R1 الإنسان) وتنمو / الحث على الثقافات البكتيرية كبيرة

  1. الحصول على البلازميد TriEx4-DHX36.
  2. قسامة الجراثيم في 20 مكل وتخزينها في -80 درجة مئوية. قسامة المتوسطة SOC (2٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 10 ملي MgCl 2 و 10 ملي MgSO و 20 ملي الجلوكوز) إلى 80 مكل ومخزن في -80 درجة مئوية.
  3. إعداد كربنيسيلين (كارب) / الكلورامفينيكول (CAM) لوحات LB-أجار. تركيزات المخزون من كارب وCAM هي 50 ملغ / مل في H 2 O و 35 ملغ / مل في 70٪ ETOH، على التوالي، وهذه هي 1،000x تتركز. وبالتالي، فإن تركيزات النهائي في لوحات اختيار أجار LB هي 50 ميكروغرام / مل و 35 ميكروغرام / مل على التوالي.
  4. ضع 1 قسامة من البكتيريا على الجليد ووضع 1 قسامة المتوسطة SOC في RT. إضافة 1 ميكروغرام من pTriEx4-DHX36 البلازميد البكتيريا ودوامة بلطف مع طرف ماصة للمزيج. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق ثم صدمة مزيد من الحرارة في 42 & #176؛ ج لمدة 30 ثانية. وضع على الجليد لمدة 2 دقيقة وإضافة المتوسطة SOC.
  5. لوحة البكتيريا تتحول على لوحات مختارة prewarmed (عادة، لوحة من الحجم الصغير، مثل 5-10 ميكرولتر، لضمان منخفض الكثافة مستعمرة بحيث المستعمرات واحد يمكن تلقيح بسهولة في ثقافات كبيرة)، واحتضان عند 37 درجة CO / N.
  6. إعداد رائع مرق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 24. جعل 500 مل لكل قارورة كبيرة (تأكد من إضافة الجلسرين) والأوتوكلاف على دورة السائلة قصيرة.
  7. إضافة كارب / CAM (50 ميكروغرام / مل / 35 ميكروغرام / مل) إلى المرق ثم تلقيح الثقافات من خلال اتخاذ أجار المقابس (باستخدام ماصة P1000) التي تحتوي على مستعمرة بكتيرية واحدة وpipetting لفي مرق. دوامة الثقافات بقوة أن يهوي بها ثم احتضان الثقافات عند 37 درجة CO / N دون أن تهتز.
  8. في اليوم التالي، ووضع الثقافات في 37 درجة مئوية شاكر ويهز في ~ 225 دورة في الدقيقة. تنمو الثقافات حتى OD 600 حوالي 0.4 -0.6، والتي سوف تأخذ عادة حوالي 4 - 6 ساعات، اعتمادا على كثافة الخلية الأولية.
    ملاحظة: هذا يتطلب مراقبة كثافة الدوري عبر قراءات طيفية، ومن الضروري أن لا تنمو الثقافات كثيرا فوق 0.5 المواد المستنفدة للأوزون. كما فارغة للقراءات طيفية، وتدور بنسبة 1 مل من البكتيريا واستخدام مرق أوضح كحل والمسح.
  9. حالما يتم الحصول على التطوير التنظيمي السليم 600، المكان على الفور الثقافات على الجليد وسرعة تبريدها إلى 10 درجة مئوية. رصد درجات الحرارة باستخدام ميزان حرارة محو النظيفة مع 70٪ ETOH. الإسراع في التبريد بواسطة بسرعة تدوير القوارير في حين على الجليد، حيث سيؤدي ذلك إلى الحد من مزيد من النمو البكتيري قبل الاستقراء بروتين المؤتلف.
  10. إضافة IPTG إلى 1 ملي تركيز النهائي (~ 120 ملغ / 500 مل الثقافة) ثم يهز في 80 دورة في الدقيقة في 14 درجة مئوية لمدة ~ 17-18 ساعة. تم العثور على درجة الحرارة المثالية لتحريض البروتين لتكون 14 درجة مئوية. لتحقيق هذا أفضل، واستخدام المياه المبردة حمام شاكر الموضعATED في غرفة باردة التقليدية والتحقق من درجة حرارة حمام الماء مع الحرارة يدويا.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم شاكر / الحاضنة تبريد الهواء، على الرغم من أنه لا بد من اختبار ما حدده رقميا تحديد درجة الحرارة سوف تسفر عن درجة حرارة السائل المطلوب (اختبار هذه التي يحتضنها قارورة من الماء مع الحرارة فيه، واهتزاز في 80 دورة في الدقيقة لبضع ساعات، وضبط درجة الحرارة الرقمية وضع وفقا لذلك حتى 14 درجة مئوية وصلت).
  11. ضع الثقافات على الجليد وتبريدها بسرعة، كما في الخطوة 3.9. اتخاذ قسامة صغيرة من البكتيريا واتخاذ OD 600 القراءة؛ من الناحية المثالية، سوف تضاعفت الثقافات خلال الاستقراء إلى حوالي 0،8-1،2 OD 600.
  12. نقل البكتيريا إلى 500 مل أنابيب الطرد المركزي والتوازن يدويا باستخدام ثقافة البكتيرية لمعادلة الوزن بين الأنابيب. مرة واحدة متوازنة، الطرد المركزي لها في 3840 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. تخلصي من المرق وأوضح وتجميد ااا البكتيريةيتيح في -80 درجة مئوية حتى وقت تنقية البروتين.

4. تنقية rG4R1 الإنسان

  1. ذوبان الجليد وليز الكريات البكتيرية.
    1. ذوبان الجليد بيليه البكتيرية في 3 مل من العازلة TN في RT (العازلة TN يتكون من 100 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 50 ملي كلوريد الصوديوم). عقد الزجاجات في متناول اليد ودوامة لذوبان الجليد / resuspend الكرية الجرثومي. إذابة مرة واحدة، وعلقت بشكل متساو نسبيا، جعل حجم ما يصل الى 5 مل مع العازلة TN (مزيد من تعليق يمكن أن يتحقق عن طريق pipetting صعودا وهبوطا مع 5 مل ماصة).
      ملاحظة: انه يعتبر نموذجا لذوبان الجليد / الإعدادية إما 2 أو 4 زجاجات في اليوم من التحضير، اعتمادا على مستوى المستخدم من الراحة مع إجراء تنقية.
    2. حل 20 ملغ من الليزوزيم في 250 ميكرولتر من H 2 O (لكل ثقافة) وإضافة إلى البكتيريا معلق. السماح للالليزوزيم لهضم البكتيريا ل~ 5-10 دقيقة في حين يحوم الزجاجات في متناول اليد.
      ملاحظة: لون سوسوسوف تبدأ التقاعد لتخفيف قليلا من حيث العائدات الهضم، وسوف يكون التعليق نسبيا غير اللزج. إذا كان الثقافات هي متضخمة جدا (أي أكبر بكثير من 1.2 OD 600)، ثم الكروموسومات الحمض النووي للبكتيريا يمكن أن يسبب لزوجة غير المرغوب فيها في هذه المرحلة.
    3. إضافة 250 ميكرولتر من الكوكتيل مثبط البروتياز (PIC) واحد قسامة 10 ميكرولتر من leupeptin. تخلط جيدا.
    4. ضع على الجليد وإضافة 10 مل من العازلة TN البارد و 22 ميكرولتر من أساسيات إدارة الأعمال. نقل إلى أنبوب 50 مل.
    5. يصوتن البكتيريا على الجليد مع sonicator الرقمي المقرر أن 30٪ السعة. نبض في 2 ثانية ON و OFF 2 ثانية لمدة 1 دقيقة. كرر صوتنة 3 مرات، والسماح للعينات لتبرد على الجليد لمدة 2 دقيقة على الأقل بين الخطوات صوتنة.
      ملاحظة: مع ثقافات متعددة، يصوتن كل واحد بدوره قبل تكرار تكرار صوتنة. خلال صوتنة، وتوخي الحذر للحفاظ على رأس صوتنة مغمورة بما فيه الكفاية في المحللة للبكتيريا، ولكن ليس لمس عشرسوف الجانبين (ه) من الأنبوب، وهذا يولد الحرارة الزائدة.
    6. إضافة حجم مساو (15 مل) من البرد 4X SSC + 20 ميكرولتر من BME + 50 ميكرولتر من الموافقة المسبقة عن علم + 1 قسامة من leupeptin وتخلط.
    7. في جهاز للطرد المركزي الطاولة قبل تبريده إلى 4 درجات مئوية، الطرد المركزي لست] في 2300 x ج لمدة 20 دقيقة. طاف لنقل، 50 مل أنابيب تبريد قبل الطازجة (1 أنبوب في كل ثقافة كبيرة يجري هيأهم).
  2. إعداد حبات-G4 المغناطيسي.
    1. خذ 1 مل من حبة streptavidin ممغطس (SPB) تعليق (لكل 1 لتر الثقافة) وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه SPB مع المغناطيس وغسل 2X مع 2X SSC + 5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8. Resuspend وSPB غسلها في 200 ميكرولتر من نفس الحل تستخدم لغسل الخرز.
    2. إضافة واحد 3 OD قسامة من G4 الحمض النووي (Z33-بيو G4 أعدت في القسم 1) إلى تعليق SPB وتخلط بسرعة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. وضع أنابيب على محور دوار وتناوب على RT لمدة 30 دقيقة على الأقل (وتصل إلى 60 دقيقة).
    3. الخلفإيه هذه الفترة من التناوب، وكتلة SPB محددة G4 بإضافة 1 مل من 0.4٪ ألبومين اللبن، والحفاظ على الجليد لحين الحاجة إليها. تمييع ألبومين اللبن 0.4٪ من الأسهم ألبومين اللبن 4٪ باستخدام 1X تريس الجلايسين.
      ملاحظة:٪ ألبومين اللبن الأسهم 4 (ث / ت) والتي حل أعدت في البداية في 2 M الجلايسين الرقم الهيدروجيني 7.5، مع إضافة المزيد من 1X الموافقة المسبقة عن علم و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
  3. ربط الحامض الاميني الموسومة rG4R1 إلى حبات الكوبالت (CB) (تابع من الخطوة 4.1).
    1. إضافة 1 مل من الطين CB (ما يعادل مل حجم حبة 0.5) إلى كل أنبوب 50 مل تحتوي أوضحت المحللة البكتيرية. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT على محور دوار.
      ملاحظة: يتم استخدام 0.5 مل حجم حبة لكل 1 لتر من المحللة أوضح. على سبيل المثال، إذا كنت على استعداد اثنين من 500 مل الثقافات البكتيرية، فقط إضافة CB إلى أنبوب 50 مل تحتوي على المحللة توضيح من واحدة من الثقافات في هذه المرحلة، كما المحللة من ثقافة الثانية سوف تكون ملزمة بشكل متسلسل مع نفس 0.5 مل من CB في الحادي والعشرينالجيش الشعبي 4.3.3).
    2. تدور باستمرار CB في 110 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية الطاولة الطرد المركزي. نضح السائل بعناية، وترك بضع مل من السوائل حتى لا تعكر صفو CB مكعبات. يغسل مع 10-15 مل من البرد 4X SSC + BME (0.5 ميكرولتر من أساسيات إدارة الأعمال / مل من 4X SSC).
      ملاحظة: للحصول على يغسل، صب 10-15 مل مباشرة على حبات الكوبالت مكعبات بدلا من pipetting ل، كما pipetting لسيتسبب الخرز لتتعثر إلى داخل ماصة والبروتين سوف تضيع.
    3. بيليه CB مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي ثم صب المحللة أوضح المقبل (30 مل، وهو ما يمثل 2 الثانية الكبيرة التي يسببها ثقافة البكتيرية) على CB مكعبات. احتضان لمدة 20 دقيقة أخرى في RT على محور دوار ثم يغسل مرتين مع 10-15 مل من 4X SSC + BME. بيليه في 110 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. بعد غسل الثاني، نضح السائل وترك حوالي 2 مل من الخرز / السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل CB-بروتين محدد لأنبوب تبريد قبل 2 مل من قبلباستخدام 1 مل "على نطاق تتحمل" ماصة.
      ملاحظة: استخدام شفرة حلاقة جديدة لخفض نهاية غيض قبل نقل، واستخدام هذا "على نطاق تتحمل" ماصة سوف يقلل من فقدان حبات الكوبالت المرتبط بالبروتين.
    5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة حبات في أنبوب 2 مل بسرعة عالية (~ 18000 x ج) في microcentrifuge عند 4 درجات مئوية (~ 5-10 الصورة هو كل ما هو ضروري لالتكوير سريع). بلطف إزالة والتخلص من طاف قبل pipetting، والحرص على عدم فقدان CB-بروتين محدد.
  4. أزل rG4R1 من CB.
    1. احتضان CB في 0.5 مل من العازلة الحامض الاميني شطف (عب) على محور دوار لمدة 5 دقائق في غرفة باردة. مرة أخرى، عند إضافة البسكويت عالي الطاقة، تماما ماصة 0.5 مل على حبات (للقضاء على فقدان CB) و resuspend حبات من أنبوب للقلب. هب 0.7 M L-الحامض الاميني درجة الحموضة 6 (يتم ضبط درجة الحموضة باستخدام حامض الخليك).
    2. أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج في 4 درجات مئوية microcentrifuge لمدة 1 دقيقة. نقل طافإلى ما قبل المبردة 15 مل أنبوب. بلطف إزالة ونقل وطاف التي تحتوي على البروتين من قبل pipetting دقيق، وترك كمية صغيرة من السائل على الجزء العلوي من CB.
    3. كرر الخطوات من 4.4.1 و 4.4.2 ليصبح المجموع 3 elutions البسكويت عالي الطاقة.
    4. أزل مرة واحدة مع 0.2 M EDTA 6.0 درجة الحموضة. ولون CB تغير من اللون الوردي إلى اللون الأبيض مثل EDTA يخلب الكوبالت.
    5. بعد أن تم نقل هذا شطف الرابع والأخير لأنبوب 15 مل، ماصة للشطف العازلة المتبقية من CB باستخدام طرف جل التحميل على نهاية 1 مل ماصة. التي تغرق طرف إلى أسفل الأنبوب، شطف العازلة التي تحتوي على البروتين المتبقية يمكن جمعها.
  5. ربط rG4R1 إلى الالتزام G4 SPB وأزل انزيم المؤتلف بطريقة ATP التي تعتمد على.
    1. إعداد 5X الدقة العازلة: 250 ملي تريس، خلات الرقم الهيدروجيني 7.8، 250 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي MgCl و 50٪ الجلسرين. إعداد 3X الدقة العازلة: 0.915 مل من H 2 O، 2 مل من 5X الدقة العازلة، 0.33 مل من 0.4٪ ألبومين اللبن (دiluted من 4٪ ألبومين اللبن مع 1X تريس جليكاين)، 0.010 مل من أساسيات إدارة الأعمال، 0.015 مل من 1 M MgCl 0.050 مل من الموافقة المسبقة عن علم، و0.010 مل من leupeptin. الحفاظ على الجليد.
      ملاحظة:٪ ألبومين اللبن الأسهم 4 (ث / ت) والتي حل أعدت في البداية في 2 M الجلايسين الرقم الهيدروجيني 7.5، مع إضافة المزيد من 1X الموافقة المسبقة عن علم و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
    2. بيليه G4-SPB إلى جانب أنبوب مع المغناطيس وتجاهل طاف (G4-SPB، كما أعدت في الخطوة 4.2). إضافة 1 مل من 3X الدقة العازلة للG4-SPB وماصة للمزيج.
    3. ماصة هذا 1 مل من G4-SPB علقت في المخزن 3X الدقة في أنبوب 15 مل تحتوي على ~ 2 مل من هب / EDTA التي تحتوي على البروتين (شطافة من الخطوة 4.4). احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 ° C حمام الماء مع الإثارة في بعض الأحيان حتى حبات لا يستقر.
    4. على الجليد، بيليه بروتين محدد G4-SPB إلى جانب أنبوب مع المغناطيس. أن يغسل، إضافة 1 مل من 4X SSC + 0.4٪ ألبومين اللبن (+ 0.5 ميكرولتر / مل BME) وماصة للresuspend والخرز. الخرز بيليه مع تيانه مغناطيس على الجليد. كرر هذا يغسل ما مجموعه 2 يغسل.
      مطلوب الصبر أثناء إجراء الغسيل للتأكد من أن كل من الخرز المغناطيسي قد تم مكعبات بين يغسل: ملاحظة. هذا ينطبق بشكل خاص نظرا لزيادة اللزوجة من حل هذا بسبب الجلسرين الواردة في مخازن الدقة.
    5. غسل G4-SPB 1X مع 1 مل من 3X الدقة العازلة.
    6. إعداد شطف العازلة (EB): 0.5 مل من 3X الدقة العازلة، 0.1 مل من 0.1 M اعبي التنس المحترفين، و 0.4 مل من H 2 O.
    7. قبل دافئ 1 مل من EB إلى 37 درجة مئوية في PCR أنابيب موزعة على كتلة التدفئة من cycler الحرارية مجموعة إلى 37 درجة مئوية.
    8. بيليه G4-SPB مع المغناطيس على الجليد و resuspend الخرز في 100 ميليلتر من قبل تحسنت EB. على الفور نقل الخرز لأنبوب PCR قبل تحسنت واحتضان لمدة 30 ثانية عند 37 درجة مئوية.
    9. على الفور إضافة 12 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وماصة صعودا وهبوطا بقوة 20 - 30 مرة. مزيج من الملح العالية وATP الواردة في EBيعمل على أزل rG4R1 من الخرز G4.
      ملاحظة: من المهم للغاية للحد من عدد من الفقاعات تشكلت أثناء عملية pipetting ل، كما فقاعات يمكن أن تفسد البروتين.
    10. على الفور بيليه G4-SPB مع المغناطيس ونقل شطافة التي تحتوي على البروتين لأنبوب PCR جديدة على الجليد (المسمى مع التاريخ).
    11. تكرار شطف ونقل هو موضح في الخطوات 4.5.8-4.5.10. المنتج النهائي لهذه العملية وبالتالي ~ 200 ميكرولتر من EB تحتوي على تنقية rG4R1. يوضع جانبا مدة 7 مكل (في أنابيب PCR المسمى مع التاريخ المناسب) لاستخدامها في مراقبة الجودة فحص النشاط الأنزيمي التي سيتم اختبار ما إذا كانت نشطة للغاية rG4R1 وقد تم بالفعل تنقيته.
    12. تخزين rG4R1 تنقيته في -80 درجة مئوية حتى وقت الفحص النشاط.

5. مراقبة الجودة الأنزيمية آخر الفحص من تنقية rG4R1

  1. لكل إعداد rG4R1 أن يعاير، وإعداد 300 ميكرولترمن العازلة resolvase فحص (RAB)، حيث يحتوي كل 30 ميكرولتر 0.2 بمول من المسمى طمرة-Z33 G4 الحمض النووي (المعد في الخطوة 2)؛ ماكياج للRAB كما يلي: 0.1 مل من 3X الدقة العازلة، 0.01 مل من 0.2 بمول / ميكرولتر G4-Z33-TAM، 0.03 مل من 0.1 M اعبي التنس المحترفين، و 0.16 مل من H 2 O. في شريط من 6 PCR أنابيب، ماصة 40 ميكرولتر من RAB في الأنبوب الأول و 30 ميكرولتر من RAB في أنابيب المتبقية (إبقاء الأنابيب على الجليد في هذه النقطة).
  2. استرداد واحدة من 7 مكل rG4R1 (من الخطوة 4.5.11) ووضعه على الجليد. مع ماصة P20 المقرر أن 5 ميكرولتر، ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط rG4R1 في قسامة ونقل 5 ميكرولتر إلى أنبوب الأول من شريط من 6 أنابيب PCR (الذي يحتوي على 40 ميكرولتر من RAB). بعد ذلك، تعيين ماصة 10 ميكرولتر ومتسلسل نقل 10 ميكرولتر للأنابيب PCR المتبقية تحتوي على RAB.
  3. على الفور احتضان هذا الشريط أنابيب PCR عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في cycler الحرارية، تليها 4 ° C الانتظار.فتح أنابيب بينما هم محتجزون في 4 درجات مئوية، وإضافة 2 ميكرولتر من 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8 إلى كل أنبوب (لوقف التفاعل الأنزيمي).
  4. صب 10٪ الأكريلاميد / 1X هلام TBE / 10٪ الجلسرين. بعد إزالة مشط، وغسل الآبار مع 1X TBE. إضافة 5 ميكرولتر من كتلة عالية، السكاريد ماء (30٪ Ficoll في H 2 O) إلى كل أنبوب وتحميل 15 ميكرولتر من كل أنبوب (يمكن مرة أخرى أن لاحظت تحميل الآبار باستخدام خطوط انعراجي).
    1. كعنصر تحكم للتنقل G4 الحمض النووي، إضافة 4 ميكرولتر من كتلة عالية، السكاريد ماء إلى 20 ميكرولتر RAB، وتحميل 15 ميكرولتر. كعنصر تحكم عن المساس بها Z33 أحادى، حرارة 20 ميكرولتر من RAB في 98 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، إضافة 4 ميكرولتر من كتلة عالية، السكاريد ماء، وتحميل 15 ميكرولتر.
  5. تشغيل هلام في 120 V لمدة 2 ساعة مع 1X TBE باعتبارها منطقة عازلة على التوالي. صورة هلام على تصوير المتعدد الوسائط مع القدرة مضان التصوير باستخدام طمرة محددة المرشحات (تثير مع 532 ليزر أخضر نانومتر، واستخدام 58الفرقة 0 نانومتر تمر 30 فلتر (580 BP 30)).
    ملاحظة: سوف إعداد نشط للغاية من rG4R1 تسفر عن حل كامل من Z33 المسمى طمرة في الممرات 3 الأولى التي تم تحميلها على هلام، كما هو مبين في الشكل 2.

6. تجميع نشطة للغاية rG4R1 إستعداد، Aliquoting، والتخزين

ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب 2 الناس. عدد ومتطلبات الأنزيمية من المقايسات المصب التي سيتم استخدامها في rG4R1 تنقيته في سيحدد عدد الاستعدادات اللازمة قبل aliquoting. وإعداد كبير نموذجي يتكون من تجميع 8 استعدادات نشطة للغاية (وبالتالي استخدام ما مجموعه 16 الناجم عن 500 مل الثقافات البكتيرية)، ولكن هذا هو عدد التعسفي وغير مختبر محدد.

  1. حساب الحجم الكلي للنشطة للغاية، rG4R1 تنقيته التي سيتم aliquoted. عادة، يتم استخدام 7 مكل في المقايسات المصب. ملء كتلة من cycl الحراريإيه وضع إلى 4 درجات مئوية مع أنابيب الشريط PCR (سيتم aliquoted هذه في، وطبيعة صلبة من كتلة والإسراع في إغلاق السريع للشرائط PCR).
  2. استرداد أنابيب PCR التي تحتوي على درجة عالية من النشاط rG4R1 من -80 درجة مئوية وسرعة ذوبان الجليد الأنابيب في اليد. عندما يتم ترك كمية صغيرة من الجليد في أنبوب، ووضع أنابيب على الجليد. تجمع بين كل من الاستعدادات إذابة بسرعة-إلى prechilled، 15 مل أنبوب وتخلط جيدا، والتأكد من أن تقليل الفقاعات.
  3. باستخدام ماصة تكرار التلقائي، الاستغناء عن حجم قسامة المطلوب في مرحلة ما قبل المبردة أنابيب الشريط PCR في cycler الحرارية. حالما 1 - يتم الانتهاء من شرائح 2، أطلب من الشخص الثاني إغلاق الأغطية ونقلها إلى رقائق 96-جيدا أن تطفو في النيتروجين السائل (فلاش تجميد أمر ضروري للحفاظ على النشاط الأنزيمي).
    ملاحظة: لا تأخذ أكثر من حوالي 200 ميكرولتر من rG4R1 إلى غيض من ماصة أوتوماتيكية في وقت لتقليل الوقت الذي الانزيم ليس في 4° C.
  4. مرة واحدة أن يتم شغل prechilled أنابيب الشريط PCR في cycler الحرارية مع قسامات والمجمدة بشكل صحيح، بسرعة نقل أكثر قبل المبردة أنابيب الشريط PCR من الجليد إلى cycler الحرارية ومواصلة aliquoting. تستمر على هذا المنوال حتى تم aliquoted ما تبقى من الانزيم، فلاش المجمدة في النيتروجين السائل، ونقل إلى الثلج الجاف. وأخيرا، ونقل قسامات إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

7. الكمي لتنقية rG4R1 تركيز

  1. صب القياسية 5٪ التراص / 12٪ حل الأكريلاميد / SDS هلام لفصل البروتين.
  2. ذوبان الجليد حوالي 50 ميكرولتر من rG4R1 aliquoted، والجمع في أنبوب واحد، وتخلط جيدا. قياس حجم بالضبط مع ماصة وإضافة مبلغ مساو من عينة العازلة 2X Laemmli (65.8 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 26.3٪ (ث / ت) الجلسرين، 2.1٪ SDS، و 0.02٪ برموفينول الزرقاء) + BME (50 ميكرولتر / 950 ميكرولتر من العازلة 2X Laemmli). تفسد البروتين في 98 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ملاحظة: كل معيار البروتين الواردة في علامات ميغاواط مجموعة واسعة موجودة عند 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، باستثناء البروتين كيلو دالتون 50، التي هي موجودة عند 0.3 ميكروغرام / ميكرولتر. هذه العلامات لا تحتاج إلى أن يكون للحرارة التشويه والتحريف.
  4. إزالة المشط من الجل وغسل الآبار مع العازلة تشغيل / الجلايسين 1X SDS القياسية. تحميل ما يعادل 25 و 12.5 ميكرولتر من rG4R1 (والذي هو 50 و 25 ميكرولتر من البروتين المعطل)، على الرغم من أن حجم الأمثل للانزيم لتحميل ينبغي أن تحدد من قبل المستخدم، كما تركز على الاستعدادات الأنزيمية ستختلف (على سبيل المثال، 35 تم تحميل ميكرولتر على جل في الشكل 3). تحميل معايير البروتين المعد في الخطوة 7.3. تأكد من أن الماصات يتم معايرة بشكل صحيح، والتأكد من أن تكون دقيقا بقدر وقت possibلو مع تقنية pipetting لضمان تقدير دقيق.
  5. تشغيل هلام في 120 V حتى اجتاز الجبهة صبغ حوالي 2/3 من هلام (لضمان الفصل السليم من البروتينات التي تشكل علامات المدى الواسع ميغاواط).
  6. إزالة جل والتخلص من جزء من هلام التي لن تحتوي على البروتين عن طريق خفض بعيدا بشفرة حلاقة. وضع الجل في طبق زجاج خزفي أو وعاء ما يعادلها. وصمة عار الجل مع Coomassie صبغ (50 ملغ من Coomassie R-250 في 100 مل من 50:10:40 ت / ت الميثانول: حمض الخليك: H 2 O الذي تم تصفيته من خلال مرشح ورقة قمع) O / N في RT على مجموعة شاكر المداري لضمان التحريض كافية من هلام.
  7. دي وصمة عار الجل مع 30:10:60 ت / ت الميثانول: حمض الخليك: H 2 O باستخدام تكور المتابعة، المناديل الورقية خالية من الوبر لتسريع destaining. تغيير حل destaining حسب الحاجة. تواصل destaining حتى خلفية منخفضة لتصور معايير rG4R1 والبروتين بما فيه الكفاية. هلام نموذجي في هذاويظهر مرحلة في الشكل (3).
  8. وضع الجل destained بين حامية ورقة ومسح هلام في ≥300 نقطة في البوصة. فتح الصورة الممسوحة ضوئيا في برنامج صورة برامج التحليل (مثل فوجي Multiguage أو ما يعادلها)، وإعداد منحنيات القياسية من معايير البروتين التي تتوافق مع 75، 100، و 150 كيلو دالتون (منحنيات تمثل مبالغ غرام مقابل قراءات الكثافات). تأكد من طرح الخلفية من كل حارة يجري كميا خلال عملية الحصول على القيم الكثافات.
  9. على افتراض أن كمية حجم rG4R1 التي تم تحميلها على هلام يحتوي على كمية من البروتين الذي هو ضمن مجموعة خطية من هذه المنحنيات القياسية، ومقدار غرام من البروتين لكل ميكروليتر من rG4R1 تحميلها ويمكن استقراء.
  10. تحويل مبلغ غرام استقراء من rG4R1 إلى كمية المولي باستخدام الوزن الجزيئي للG4R1، وهو 120،000 جم / مول.
    ملاحظة: لكل جيل، وسوف تكون ثلاث قيم استقراءولدت (واحد لكل من علامات البروتين الثلاثة المستخدمة لتوليد المنحنيات القياسية: 75، 100، و 150 كيلو دالتون). تشغيل اثنين من مزيد من المواد الهلامية وصمة عار وتحديد لهم بتكرار الخطوات 7،1-7،10. مع نتائج القياس الكمي للهلام الأولى، وسيكون المستخدم قادرا على قياس مدى يحتاج rG4R1 ليتم تحميلها على مزيد من المواد الهلامية لتسفر عن المبلغ الذي هو ضمن مجموعة خطية من المعايير البروتين. وإجمالا، استقراء تسعة القيم التي تمثلها تركيز نشطة للغاية، تنقيته rG4R1. متوسط ​​هذه القيم لإعطاء دفعة-محددة تركيز rG4R1 النهائي، الذي يكون عادة في حدود 20-100 نانومتر. حساب الانحراف المعياري من هذه القيم (ن = 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول (الشكل 1) ينتج بشكل روتيني نقية تقريبا، نشاطا تحفيزيا rG4R1. كإجراء والنشاط الأنزيمي، وعادة ما وحظ أن يتم تحويل 50٪ من 0.2 بمول من المسمى طمرة-tetramolecular G4 الحمض النووي إلى أحادية ضمن 0.2 - مجموعة ميكرولتر 0.013 من rG4R1، كما يعاير بواسطة فحص النشاط G4 المذكورة أعلاه (الشكل 2). Coomassie تلطيخ تنقيته rG4R1 يشير إلى وجود فرقة واحدة في المتوقع 120 حجم كيلو دالتون، مع فرقة تلويث طفيفة في ~ 75 كيلو دالتون، والتي قد تمثل اقتطاع rG4R1 التي حافظت على قدرتها على ربط الخرز G4 الحمض النووي وأزل في ATP التي تعتمد على الطريقة (الشكل 3). وكميا الفرقة التي تهم ضد منحنى القياسية البروتين، وهذا البروتوكول عادة يحصل 200 ميكرولتر من 20-100 نانومتر انزيم المنقى في 1 لتر من ثقافة البكتيريا.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتنقية خطوتين من G4R1. وrG4R1 الموسومة 6xHis-هو الأكبر-تنقيته من كولاي لست] بواسطة الربط الأول لويبلغ حجمه من شركة 2+ -conjugated الخرز. يتبع خطوة ملزمة لحبات مغناطيسية G4 الحمض النووي مترافق. وأخيرا، خطوة شطف تعتمد على ATP ضرورية للحصول نقي نسبيا ونشط إنزيمي rG4R1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مراقبة الجودة G4 الحمض النووي الفك الفحص. الممرات 1-6: تم المحتضنة لتركيز ثابت من المسمى طمرة-tetramolecular G4 الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وجود التخفيفات المسلسل 4x ومن rG4R1 تنقيته تمثل 3.9 ميكرولتر، 0.83 ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر، 0.05 ميكرولتر، 0.013 ميكرولتر و0 0،003 ميكرولتر، على التوالي. لين 7: tetramolecular G4 الحمض النووي في غياب rG4R1. لين 8: tetramolecular G4 الحمض النووي المغلي للحد من هيكل G4 إلى أحادية في غياب rG4R1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الكمي لتنقية rG4R1 تركيز. تم تحميل واسع المدى علامات البروتين ميغاواط في الكميات التالية: 500، 250، 125، 62.5، 31.3، و 15.7 نانوغرام في الممرات 1-6 على التوالي، وكانت تستخدم لتوليد منحنى مستوى تركيزات بروتين. لين 7 يمثل 35 ميكرولتر من rG4R1. وكان كميا هذا الجل معين، كجزء من مجموعة ثلاث نسخ من المواد الهلامية، مما أدى إلى متوسط ​​تركيز البروتين من 62 ± 22 نانومتر الانحراف المعياري (SD؛ ن = 9).كوم / ملفات / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمثل هذا البروتوكول على كفاءة عالية التعبير، وتنقية، ونظام القياس الكمي لعزل الجين المنتج DHX36، G4-Resolvase1 (G4R1، وتسمى أيضا RHAU وDHX36) (الشكل 1). هذا البروتوكول يستخدم خطوتين تنقية: صاحب العلامة تقارب تنقية على حبات تقارب الكوبالت وتنقية الأنزيمية على حبات G4 الحمض النووي مترافق. الخطوة الأخيرة هي فريدة من نوعها من حيث أنه يستفيد من تقارب ضيق، خصوصية عالية، والنشاط الفك المحفز الذي rG4R1 ديه لهياكل G4. تقارب ضيق للهياكل G4 (K د في نطاق المنخفض PM) يسمح لغسل عالية من الملح (بالقرب من الحد ذوبان كلوريد الصوديوم) قبل شطف من الخرز G4، والحد بشكل كبير من وجود البروتينات غير محددة. النشاط التحفيزي من G4R1 على هياكل G4 يسمح لشطف معين من rG4R1 نشطة على إضافة للاعبي التنس المحترفين وMgCl 2. هذا المخطط تنقية خطوتين تنتج باستمرار نقية للغايةونشطة حفاز rG4R1 13 بكميات مناسبة لمعظم التحليلات الكيميائية الحيوية.

والعديد من الخطوات الرئيسية ضمان تحقيق عائد جيد من الذهب الخالص للغاية، rG4R1 نشاطا تحفيزيا. الأول هو لضمان الظروف المناسبة تحريض صاحب-rG4R1 في سلالة التعبير البكتيرية. لقد وجدنا أن أفضل عائد من البروتين المؤتلف يحدث عندما تزرع الخلايا إلى OD 600 لا تزيد عن 0،4-0،6 فقط قبل الاستقراء. تزايد الخلايا بعد هذه النقطة قد يؤدي إلى خسارة إجمالية الانتعاش البروتين، وربما يعود ذلك إلى إدماج rG4R1 إلى الهيئات إدراج. ثانيا، حصلنا على تركيز أعلى من البروتين النقي من قبل "ملزمة بالتسلسل" ولست] إلى حبات الكوبالت تقارب. على سبيل المثال، لا بد لنا المحللة من 0.5 لتر من الثقافات التي يسببها لحبات تقارب الكوبالت وثم يقوم ملزم الثانية من المحللة آخر من 0.5 لتر إضافي من ثقافة لنفس الخرز الكوبالت تقارب. هذهخطوة يضمن إعداد أكثر تركيزا من البروتين عن طريق زيادة عدد جزيئات rG4R1 منضم إلى حجم معين من الخرز، وبالتالي الاستفادة من كامل قدرات حبات الكوبالت تقارب. ثالثا، وارتفاع غسل الملح بعد ربط elutions الكوبالت التقارب إلى حبات G4 يضمن أن ما يقرب من جميع البروتينات غير محددة ملزمة لحبات تتم إزالة. رابعا، شطف خطوة ATP / MgCl 2 تسمح rG4R1 منضمة إلى حبات G4 للاسترخاء حفاز هيكل tetramolecular إلى خيوط واحدة، مما تسبب في rG4R1 ستصدر من الخرز. ونحن لا يمكن أن يستبعد تماما احتمال أن ATP elutes rG4R1 في المنافسة وليس بطريقة الحفازة. ومع ذلك، وهذا هو أقل احتمالا أن يكون عليه الحال، منذ أظهرنا سابقا أن التماثلية ATP غير hydrolyzable ليس كافيا للمنافسة ملزمة 13، 18. تقارب من rG4R1 لالمساس بها، والحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل هو أمر من حجم أقل من طنانه بدءا tetramolecular G4 الحمض النووي، وبالتالي يجب أن rG4R1 لا إعادة ربط إلى الخرز. من أجل الحد من هذا الاحتمال، ومع ذلك، ينبغي أن تتم هذه الخطوة في 37 درجة مئوية، ويجب أن يفصل في حجم شطف من الخرز في أسرع وقت ممكن. ويتكرر الخطوة شطف مرتين لضمان أقصى قدر من الانتعاش. إذا تتطلب التطبيقات المصب البروتين أن تكون خالية من الملوثات الحمض النووي، ونحن نوصي خطوة تنظيف إضافية التي لا بد إعادة إعداد النقي لحبات streptavidin من أجل إزالة أي السلطات الوطنية المعينة المعقدة البيروكسيديز، إذا كان موجودا.

لقد وجدنا أن rG4R1 هو عرضة للتدهور إذا لم يتم الحفاظ على الظروف المناسبة في جميع أنحاء البروتوكول. من أجل الحفاظ على سلامة ونشاط الإنزيم، ونحن توظيف الضمانات الهامة التالية. يتم الاحتفاظ مثبطات الأنزيم البروتيني الحالي في جميع أنحاء الداخلي تنقية. يتم تنفيذ البروتوكول في 4 درجات مئوية، ما لم يذكر خلاف ذلك. يتم تنقيته من البروتين في وجود لاctalbumin وβ-المركابتويثانول. يتم تنفيذ البروتوكول في الوقت المناسب (في 1 يوم لتنقية). بالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن عدة دورات تجميد أذاب تؤثر سلبا على النشاط من البروتين، لذلك نحن قسامة البروتين إلى "الاستخدام لمرة واحدة،" 7 مكل عقب تنقية وتخزينها في -80 درجة مئوية.

على الرغم من أن يطلب من وجود ألبومين اللبن في إعداد للحفاظ على سلامة ونشاط البروتين، كما ذكر أعلاه، فقد وجدنا أن هذا قد تعوق أيضا تطبيقات المصب. غيرها من الجزيئات التدخل المحتملة التي تكون موجودة في إعداد rG4R1 تنقية تشمل اعبي التنس المحترفين، بيتا المركابتويثانول، والحمض النووي خص الذين تقطعت بهم السبل. على سبيل المثال، وجدنا هذا المستحضر البروتين لتكون متوافقة مع التحليل BIACORE بسبب إشارة خلفية عالية من العناصر العازلة. أيضا، فإن وجود ألبومين اللبن في إعداد البروتين يمنع استخدام معيار برادفوردوBCA المقايسات البروتين الكميات. ومع ذلك، قمنا بتطوير القائم على هلام طريقة الكميات بديل للتحايل على هذا القيد.

هذا الإجراء تنقية، الذي يسخر النشاط الأنزيمي من G4R1 كوسيلة لتنقية على وجه التحديد، ويجعل هذا الأسلوب يختلف عن أساليب أخرى. على سبيل المثال، وعبرت منظمات أخرى الموسومة FLAG rG4R1 في الخلايا البشرية 15، 25 أو الموسومة GST rG4R1 في خلايا الحشرات 26 و تنقيته من قبل FLAG- أو اللوني GST تقارب، على التوالي. هذه الأساليب لديها ميزة يجري القيام به في نظام التعبير حقيقية النواة بالمقارنة مع نظام التعبير البكتيرية. تم العثور على القيم المقدرة K د من الناتج تنقيته GST-G4R1 لهياكل G4 أن يكون لحجم أعلى 14 من تقريرنا K د قيم 12 و 13. ونحن نعزو ثيالصورة التناقض في القيم د ك الخلافات المرتبطة أضخم GST العلامة مقابل 6xHis العلامة، والاختلافات في درجات نقاء تم الحصول عليها من هذه المخططات تنقية اثنين، والاختلاف في مدى ونوع من التعديلات بعد متعدية المكتسبة في بكتيريا مقابل ل نظام التعبير الحشرات. نهجنا لديها ميزة واضحة على البدائل المذكورة آنفا لتنقية هذا البروتين يتوقف مباشرة على نشاطها الأنزيمي. ولذلك، فإننا الحصول في المقام الأول وهو الانزيم الذي تم طيها وتعديلها في مثل هذه الطريقة التي تحافظ على خصائصها الأنزيمية. أخرى تقارب العلامة و / أو حجم الإقصاء تقنيات غير قادرة على فصل انزيم نشط من انزيم ميتا إنزيمي. وسيكون من المفيد لتطوير بروتوكول في المستقبل على الجمع بين نقاط القوة في بروتوكولات تنقية مجموعات أخرى "15، 25، 26 (أي صريحة خلية بشرية أو الحشراتنظام أيون) مع قوة بروتوكول لدينا (أي تنقية الحفازة على أساس) لمواصلة تحسين على هذا الأسلوب.

وعلى الرغم من هذا البروتوكول هو محدد حاليا لG4R1، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف مع أي ATP التي تعتمد، البروتينات حل G4، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، بلم، WRN، FANCJ والبروتينات hnRNP، hPif1، و / أو ChlR1 / DDX1. عن طريق تغيير تسلسل الحمض النووي ملزمة الخرز streptavidin، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتنقية الإنزيمات الأخرى ATP التي تعتمد النووية حامض الذي نتاج رد فعل الأنزيمي لم يعد الركيزة للانزيم، بما في ذلك helicases الحمض النووي و nucleases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونود أن نشكر مصادر تمويلنا، بما في ذلك هدية سخية من مؤسسة وير (لJPV)، والمعاهد الوطنية للHealthGrant T32-CA079448 (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين)، وصناديق بدء التشغيل جامعة الكرة الدولة (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl, pH 8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or from standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH 8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or from standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90, (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25, (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33, (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33, (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44, (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44, (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35, (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34, (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39, (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280, (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40, (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283, (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39, (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31, (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10, (7), e0132668 (2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42, (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40, (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13, (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10, (3), e1004012 (2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119, (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34, (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (34), 15181-15186 (2010).
  24. BD Biosciences. Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
  25. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  26. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38, (18), 6219-6233 (2010).
نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).More

Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter