Summary
G4 Resolvase1 binder til G-quadruplex (G4) strukturer med de strammeste rapporterede affinitet for et G4-bindende protein og repræsenterer størstedelen af G4-DNA unwinding aktivitet i HeLa-celler. Vi beskriver en hidtil ukendt protokol, der udnytter affinitet og ATP afhængige afvikling aktivitet af G4-Resolvase1 til specifikt oprense katalytisk aktivt rekombinant G4R1.
Abstract
Højere orden nukleinsyrestrukturer kaldet G-quadruplexes (G4S, G4 strukturer) kan dannes i guanin-rige regioner af både DNA og RNA og er stærkt termisk stabile. Der er> 375.000 formodede G4-dannende sekvenser i det humane genom, og de er beriget med promotorområder, utranslaterede regioner (UTR'er), og inden for telomere repeat. På grund af risikoen for disse strukturer til at påvirke cellulære processer, såsom replikation og transkription, har cellen udviklet enzymer til at håndtere dem. Et sådant enzym er G4 resolvase 1 (G4R1), der blev biokemisk co-karakteriseret ved vores laboratorium og Nagamine et al. og fundet at binde ekstremt tæt til både G4-DNA og G4-RNA (K d i lav-pM område). G4R1 er kilden til hovedparten af G4-løsning aktivitet i HeLa cellelysater og er siden blevet impliceret at spille en rolle i telomer metabolisme, lymfe udvikling, gentranskription, hæmatopoiese, og immunovervågning. Evnen til at efkeligt udtrykke og rense katalytisk aktiv G4R1 er af betydning for laboratorier interesseret i at få yderligere indsigt i den kinetiske interaktion af G4 strukturer og G4-løsning enzymer. Her beskriver vi en detaljeret metode til oprensning af rekombinant G4R1 (rG4R1). Den beskrevne procedure inkorporerer den traditionelle affinitet-baseret oprensning af en C-terminal histidin-mærket enzym udtrykt i humane kodonoptimerede bakterier med udnyttelsen af evnen hos rG4R1 at binde og slappe G4-DNA at oprense højaktiv enzym i en ATP- afhængig elueringstrin. Protokollen indeholder også en kvalitetskontrol trin, hvor den enzymatiske aktivitet af rG4R1 måles ved at undersøge muligheden for det rensede enzym at slappe G4-DNA. Fremgangsmåde er også beskrevet, som muliggør kvantificering af oprenset rG4R1. Alternative tilpasninger af denne protokol diskuteres.
Introduction
G4 strukturer er meget stabile nukleinsyre sekundære strukturer, der danner inden guanin-rige områder af DNA og RNA. G4 strukturer stabiliseres via Hoogsteen-bonding interaktioner og koordinere binding i den centrale hulrum med monovalente kationer (dvs.. K + og Na +), der bidrager betydeligt til at bemærkelsesværdige termiske stabilitet af G4 strukturer 1, 2. Tidlige bioinformatiske undersøgelser antydet, at det humane genom indeholder> 375.000 "potentielle G4-dannende motiver" 3, 4. Nyere undersøgelse skøn tyder på, at antallet af G4 motiver er højere med en faktor på 2-5 5, mens en anden undersøgelse forudsiger 716,310 distinkte potentielle G4-dannende sekvenser i det humane genom 6. G4-dannende sekvenser er konserveret evolutionært og ikke tilfældigt dispergeret igenomet. G4 motiver er beriget i gen kodende regioner, og op mod 40% af alle genpromotorer indeholder G4 motiver 7. Interessant nok er blevet påvist berigningsgrad af G4 motiver i et gen, der tyder funktionen af genet. For eksempel, proto-onkogener og gener involveret i udvikling har signifikant større berigelse af G4 strukturer end tumorsuppressorgener 8, 9.
Med høje termiske stabiliteter, en næsten allestedsnærværende i genomet, og potentialet til væsentlig indvirkning store cellulære processer, er det ikke overraskende at finde, at cellen har udviklet enzymer til at håndtere disse strukturer. En sådan enzym er G4 Resolvase1 (G4R1, også kaldet RHAU og DHX36), som vi karakteriseret som kilde til de fleste tetramolecular G4-DNA løse aktivitet i humane (HeLa-celler) 10. Siden da er det blevet vist that G4R1 stramt binder og katalytisk vikler tetramolecular og unimolekylær G4-DNA og G4-RNA med de snævreste indberettede KDs for en G4-bindende protein 11, 12, 13. Derudover har G4-løsning aktivitet af G4R1 blevet impliceret i en lang række biokemiske og cellulære processer, herunder telomer / telomerase biologi 11, 14, 15, 16, transkription og splejsning 17, 18, 19, 20, udvikling 21, hæmatopoiese 21, og immune regulering 22, 23. Med en overvægt af G4 sekvenser specifikt placeret i hele genomet og forskelligartede cellulære processes at G4R1 nylig har været impliceret at være involveret med, evnen til at udtrykke og effektivt rense højaktive rG4R1 vil være af største betydning for at belyse de biokemiske mekanismer og adfærd i dette protein.
Her udviser vi en hidtil ukendt ekspression og oprensning ordning (figur 1), der drager fordel af ATP-afhængige, G4-løsning aktivitet af rG4R1 til effektivt at isolere aktive enzym. Denne ordning kan tilpasses til at oprense andre ATP-afhængige nucleinsyre enzymer, som produktet af den enzymatiske reaktion er ikke længere et substrat til binding, som det er tilfældet for G4R1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af G4-DNA strukturer, som skal anvendes til rensning af rG4R1 (Dannelse af biotinyleret G4-DNA G-quadruplex)
- Bestil følgende DNA-oligomer, kaldet Z33-Bio, på en 1 pmol-skala: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA FTT-biotin 3'. Sikre, at biotindelen er på 3'-enden af oligomeren.
- Forbered 10x G4 buffer: 450 mM Tris-HCI pH 8, 25 mM EDTA og 2,500 mM NaCl.
- Resuspender Z33 oligomeren i 250 pi vand (således at oligomeren koncentrationen er ~ 2,5 mM). Tilsættes 25 eliter 10X G4 puffer og blandes. Inkuber oligomeren ved 50 ° C i ~ 48 timer.
- Kort spin ned i røret til at indsamle kondens (~ 1000 xg, 10 s). Tilføj ~ 50 pi af en høj masse, hydrofilt polysaccharid (30% Ficoll i H2O) og blandes. Hæld en 10% acrylamid / 1x TBE / 10% glycerol gel (gel dimensioner: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Når gelen er polymeriseret, vaske brøndene med 1x TBE og belastningden dannede Z33-Bio oligomer jævnt over det meste af gelen (prøve lane belastning kan visualiseres med Schlieren linjer).
- I én lane i slutningen af gelen, indlæse en lille brøkdel af oligomeren, der er blevet opvarmet til 98 ° C i 10 minutter (dette vil tjene som et ustruktureret kontrol), samt en lille mængde gel loading dye i en anden bane til at overvåge, hvor langt gelen har kørt.
- Bruge 1x TBE som gelen løbebufferen og køre gelen ved 120 V indtil farvefronten er ført til mindst 1/3 af gelen.
- Placer en tyndtlagskromatografi plade med sin ru side opad i et ark protektor (eller dække med plast wrap). Fjerne en af glaspladerne og overføre gelen til overfladen af arket beskytter. Sluk loftslampe og UV skygge gelen (lang bølgelængde: 365 nm). Bruge en frisk barberblad og klip G-quadruplex-Z33-Bio band, som vil blive opfattet som kører højere op i gelen (med langsommere mobilitet) i forhold til smeltened kontrol.
- Placer gelskiven indeholdende det dannede G4-DNA i et 50 ml rør, og der tilsættes lige nok iblødsætning buffer til at dække gelskiven (iblødsætning puffer består af 1/3 volumen 10x TBE, 1/3 volumen mættet natriumacetat og 1/3 volumen H2O). Glasset anbringes i et 37 ° C inkubator (nonhumidified) og inkuberes O / N.
- Opløsningen overføres til en 15 ml rør, og der tilsættes 1/10 volumen glycogen (glycogen lager ved 20 mg / ml i 10 mM Tris-HCI pH 8, 2,5 mM EDTA, pH 8, og 0,05% natriumazid) og ~ 1.2x volumen isopropanol .
BEMÆRK: Natriumazid er akut giftigt, så brug med forsigtighed!- Bland og placere røret ved -20 ° C i mindst 2 timer. Spin røret ved 2.700 xg i en bordcentrifuge afkølet til 4 ° C i 12 min. dekanteres forsigtigt opløsningen fra pelleteret G4-DNA. Vask pelleten 3 gange med 70% EtOH + 50 mM NaCl (saltet i vask er kritisk for G4 stabilitet). Wick væk overskydende væske med fnugfri silkepapir.
- Placereden vaskede pellet i køleskabet i mindst 2 timer til hydratisering af pellet og give mulighed for lettere resuspension. Pellet resuspenderes i 50 pi TNE-buffer (10 mM Tris-HCI pH 8, 50 mM NaCl og 0,05 mM EDTA, pH 8).
- Placer 5 pi dette dannede DNA G-quadruplex i 495 pi H2O og kvantificere ved hjælp af et spektrofotometer, der tillader ekstinktionskoefficienten skal bestemmes ved at indtaste nukleotid sammensætning af oligomeren (ekstinktionskoefficienten af Z33 DNA-oligomer med en basesammensætning A = 8, C = 3, G = 15, og T = 7 er 341.946 L / mol / cm). Indtast fortyndingsfaktor som 25 (ikke 100), som det dannede G-quadruplex består af 4 DNA-strenge.
- Alikvot volumen svarer til 3 OD (OD 260 enheder) pr rør og opbevares ved -20 ° C; for eksempel, hvis de 5 pi der blev sat til 495 pi H2O giver en OD260 aflæsning på 3 og derefter forberede 5 pi prøver.
2. Udarbejdelse af G4-DNA strukturer, som skal bruges i en enzymatisk aktivitet Analyse af rG4R1 (Dannelse af TAMRA-mærket G4-DNA)
- Bestil følgende DNA-oligomer, kaldet Z33-TAM, ved et 1 pmol-skala: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA FTT 3'. Sikre, at TAMRA delen er ved 5'-enden af oligomeren.
- Følg samme procedure som beskrevet i afsnit 1 for dannelsen af G-quadruplex, bortset fra at ultraviolet (UV) shadowing er ikke nødvendig, fordi tetramethylrhodamin (TAMRA) -mærket G-quadruplex vil være synlig med det blotte øje. Igen, sørg for at inkludere en smeltet kontrol på gelen.
- Efter at have taget et spektrofotometer læsning af TAMRA-mærkede DNA G-quadruplex, som i trin 1, fortyndes den dannede G-quadruplex til 0,2 pmol / pl med TNE-buffer. Sidst tilsættes glycerol til en 10% slutkoncentration og opbevares ved -20 ° C.
3. Transform (DE3) pLysS Kompetente celler med PTRiEx4-DHX36 (Plasmid Encoding Menneskelig G4R1) og Grow / Fremkald Store bakteriekulturer
- Anskaf TriEx4-DHX36 plasmid.
- Alikvot bakterierne i 20 pi alikvoter og opbevares ved -80 ° C. Alikvot SOC medium (2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glucose) i 80 pi alikvoter og opbevares ved -80 ° C.
- Forbered carbenicillin (CARB) / chloramphenicol (CAM) LB-agarplader. Omgående koncentrationer af CARB og CAM er 50 mg / ml i H2O og 35 mg / ml i 70% EtOH, henholdsvis og disse er 1.000 x koncentreret; Således er de slutkoncentrationer i agaren selektionsplader LB er 50 ug / ml og 35 ug / ml.
- Placer 1 alikvot af bakterier på is og placere 1 alikvot af SOC-medium ved stuetemperatur. Tilføj 1 ug pTriEx4-DHX36 plasmid til bakterierne og bland forsigtigt med pipettespidsen at blande. Der inkuberes på is i yderligere 5 minutter og derefter varmechok ved 42 & #176; C i 30 s. Anbring på is i 2 minutter og tilsæt SOC-medium.
- Plate de transformerede bakterier på forvarmede selektionsplader (typisk plade et lille volumen, såsom 5 - 10 pi, for at sikre lav koloni massefylde, således at enkelte kolonier let kan podes i store kulturer) og inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Forbered Terrific Broth ifølge producentens anvisninger 24. Lav 500 ml pr stor kolbe (sørg for at tilføje glycerol) og autoklave på en kort flydende cyklus.
- Tilføj CARB / CAM (50 ug / ml / 35 ug / ml) til bouillon og derefter pode kulturerne ved at tage agarpropper (under anvendelse af en P1000 pipette) indeholdende en enkelt bakteriekoloni og pipettering bouillon. Swirl kulturerne kraftigt for at lufte dem og derefter inkuberes kulturerne ved 37 ° CO / N uden at ryste.
- Den næste dag, placere kulturerne i en 37 ° C rysteapparat og omrystes ved ~ 225 rpm. Grow kulturerne indtil OD600 er omkring 0,4 -0,6, hvilket typisk vil tage omkring 4 - 6 timer, afhængigt af den initiale celledensitet.
BEMÆRK: Dette vil kræve periodisk overvågning tæthed via spektrofotometriske aflæsninger, og det er afgørende for ikke vokse kulturerne til meget over 0,5 OD. Som et råemne til spektrofotometriske aflæsninger, spin ned 1 ml bakterier og bruge den klarede bouillon som blanking opløsning. - Når den korrekte OD600 opnås, straks placere kulturerne på is og hurtigt afkøle dem til 10 ° C. Overvåg temperaturen med et termometer aftørres med 70% EtOH. Fremskynde køling ved hurtigt roterende kolberne mens på is, da dette vil begrænse yderligere bakterievækst inden rekombinant protein induktion.
- Tilføj IPTG til en 1 mM slutkoncentration (~ 120 mg / 500 ml kultur) og ryst ved 80 rpm ved 14 ° C i ~ 17 - 18 timer. Den ideelle temperatur for protein induktion er blevet fundet at være 14 ° C; bedst opnå dette, skal du bruge en afkølet vandbad shaker located i en konventionel kølerum og manuelt at kontrollere temperaturen af vandbadet med et termometer.
BEMÆRK: Alternativt bruge en luftkølet shaker / inkubator, selv om det er nødvendigt at teste, hvad digitalt-sæt temperaturindstilling vil give den ønskede væsketemperatur (teste dette ved at inkubere en kolbe af vand med et termometer i det og omrystning ved 80 rpm et par timer, justering af digitale temperaturindstilling i overensstemmelse hermed indtil den 14. ° C er nået). - Placer kulturerne på is og køle dem hurtigt, som i trin 3.9. Tag en lille portion af bakterier og tage en OD 600 læsning; Ideelt set vil kulturerne være fordoblet under induktion til ca. 0,8 - 1.2 OD 600.
- Overfør bakterier til 500 ml centrifugerør og manuelt balancere dem ved hjælp af bakteriekultur til selv vægten mellem rørene. Når afbalanceret, centrifugeres dem på 3.840 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Hæld den klarede bouillon og fryse den bakterielle pellader ved -80 ° C indtil tidspunktet for proteinoprensning.
4. Oprensning af human rG4R1
- Optø og lyserer bakterielle pellets.
- Optø den bakterielle pellet i 3 ml TN-buffer ved stuetemperatur (TN buffer består af 100 mM Tris pH 7,5 og 50 mM NaCl). Hold flasker i hånden og hvirvel til at tø / opblande den bakterielle pellet. Når optøet og forholdsvis jævnt suspenderet, bringe volumen op til 5 ml med TN buffer (yderligere suspension kan opnås via pipettering op og ned med en 5 ml pipette).
BEMÆRK: Det er typisk at tø / prep enten 2 eller 4 flasker på dagen for forberedelse, afhængig af brugerens niveau af komfort med rensning procedure. - Opløs 20 mg lysozym i 250 pi H2O (per kultur) og tilsæt til de resuspenderede bakterier. Tillad lysozymet at fordøje bakterierne for ~ 5 - 10 minutter under hvirvling flaskerne i hånd.
BEMÆRK: Farven på suspension vil begynde at lysne lidt som fordøjelsen skrider frem, og suspensionen vil være relativt ikke-tyktflydende. Hvis kulturerne er for tilgroet (dvs. langt større end 1,2 OD 600), derefter kromosomale bakteriel DNA kan forårsage uønsket viskositet på nuværende tidspunkt. - Tilsættes 250 pi af proteasehæmmer cocktail (PIC) og en 10 pi alikvot af leupeptin. Bland grundigt.
- Placer på is og tilsæt 10 ml kold TN buffer og 22 pi BME. Overførsel til en 50 ml rør.
- Sonikeres bakterierne på is med en digital sonikator indstillet til 30% amplitude. Pulse på 2 s ON og 2 s OFF i 1 min. Gentag lydbehandling 3 gange, lade prøverne køle på is i mindst 2 minutter mellem lydbehandling trin.
BEMÆRK: Med flere kulturer, sonikeres dem en efter en, før gentage lydbehandling iterationer. Under lydbehandling, være omhyggelig med at holde sonication spids tilstrækkeligt nedsænket i den bakterielle lysat, men ikke røre the sider af røret, da dette vil generere overskudsvarme. - Tilsættes samme mængde (15 ml) kold 4x SSC + 20 pi BME + 50 pi PIC + 1 aliquot af leupeptin og blandes.
- I en bordcentrifuge forafkølet til 4 ° C, centrifugeres lysaterne ved 2.300 xg i 20 min. Supernatanten overføres til friske, pre-kølet 50 ml rør (1 tube pr stor kultur bliver prepped).
- Optø den bakterielle pellet i 3 ml TN-buffer ved stuetemperatur (TN buffer består af 100 mM Tris pH 7,5 og 50 mM NaCl). Hold flasker i hånden og hvirvel til at tø / opblande den bakterielle pellet. Når optøet og forholdsvis jævnt suspenderet, bringe volumen op til 5 ml med TN buffer (yderligere suspension kan opnås via pipettering op og ned med en 5 ml pipette).
- Forbered G4-magnetiske perler.
- Tag 1 ml streptavidin paramagnetiske perle (SPB) suspension (per 1 l kultur), som overføres til en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelletere SPB med en magnet og vaskes 2 gange med 2 x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspender den vaskede SPB i 200 pi af den samme opløsning, der anvendes til vask af perlerne.
- Tilsæt en 3 OD aliquot af G4-DNA (Z33-Bio G4 forberedt i afsnit 1) til SPB suspension og bland hurtigt ved pipettering op og ned flere gange. Anbring glassene på en rotator og rotere ved stuetemperatur i mindst 30 min (og op til 60 min).
- Aftare denne periode med rotation, blokere G4-bundne SPB ved tilsætning af 1 ml 0,4% lactalbumin, og holde på is indtil brug. Fortynd 0,4% mælkealbumin fra 4% mælkealbumin lager ved hjælp 1x Tris-glycin.
BEMÆRK: lager 4% lactalbumin (vægt / volumen) fremstilles indledningsvist ved opløsning i 2 M glycin pH 7,5, med den yderligere tilsætning af 1x PIC og 0,05% natriumazid.
- Bind histidin-mærket rG4R1 til kobolt perler (CB) (fortsat fra trin 4.1).
- Tilsæt 1 ml CB opslæmning (ækvivalent med en 0,5 ml perlevolumen) til hver 50 ml rør indeholdende afklaret bakterielysat. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur på en rotator.
BEMÆRK: 0,5 ml perle volumen bruges pr 1 liter klaret lysat; fx hvis to 500 ml bakterielle kulturer fremstilles, kun tilføje CB til 50 ml rør indeholdende klaret lysat fra en af kulturerne på dette punkt, som lysat fra den anden kultur vil blive serielt bundet med den samme 0,5 ml CB i step 4.3.3). - Spin ned CB ved 110 xg i 5 minutter i et 4 ° C bordcentrifuge. Aspirer væsken forsigtigt, og efterlade et par ml væske, således at den ikke forstyrrer det pelleterede CB. Vask med 10 - 15 ml kold 4x SSC + BME (0,5 pi BME / ml 4x SSC).
BEMÆRK: vask, hæld 10-15 ml direkte på de pelleterede kobolt perler i stedet for pipettering, som pipettering vil forårsage perlerne til at sidde fast på indersiden af pipetten og protein vil gå tabt. - Pelletering af CB igen via centrifugering og derefter hælde det næste klarede lysat (30 ml, der repræsenterer den 2. store induceret bakteriekultur) på pelleteret CB. Inkuberes i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur på rotatoren og derefter vaske to gange med 10-15 ml 4x SSC + BME. Pellet ved 110 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Efter den anden vask, opsug væsken og efterlader ca. 2 ml perler / væske på bunden af røret. Overfør proteinbundne CB til en forafkølet 2-ml rør vedanvendelse af en 1 ml "wide-boring" pipettespids.
BEMÆRK: Brug en frisk barberblad til at skære enden af spidsen før overførsel, da brugen af dette "wide-boring" pipettespidsen vil reducere tabet af proteinbundne kobolt perler. - Kort fortalt centrifugeres perlerne i 2 ml rør ved høj hastighed (~ 18.000 xg) i en mikrocentrifuge ved 4 ° C (~ 5 - 10 s er alt, der er nødvendigt for hurtig pelletering). Fjern forsigtigt og kassér supernatanten ved pipettering, være omhyggelig med at ikke miste proteinbundet CB.
- Tilsæt 1 ml CB opslæmning (ækvivalent med en 0,5 ml perlevolumen) til hver 50 ml rør indeholdende afklaret bakterielysat. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur på en rotator.
- Eluer rG4R1 fra CB.
- Inkubér CB i 0,5 ml histidin elueringspuffer (HEB) på en rotator i 5 minutter i et koldt rum. Igen, når du tilføjer HEB, bare pipettere de 0,5 ml onto perlerne (for at eliminere CB tab) og resuspender perlerne ved at vende røret. HEB er 0,7 M L-histidin pH 6 (pH justeres med eddikesyre).
- Der centrifugeres ved 18.000 xg i et 4 ° C mikrocentrifuge i 1 min. Supernatanten overførestil en forafkølet 15 ml rør. forsigtigt fjerne og overføre den proteinholdige supernatant ved omhyggelig pipettering, efterlader en lille mængde væske på toppen af CB.
- Gentag trin 4.4.1 og 4.4.2 i i alt 3 HEB elueringer.
- Eluer en gang med 0,2 M EDTA, pH 6,0; farven på CB skifter fra lyserød til hvid som EDTA chelaterer cobalt.
- Efter denne fjerde og sidste eluering er blevet overført til 15 ml rør, pipette den resterende elueringspuffer fra CB ved anvendelse af en gel-loading spids på enden af en 1 ml pipettespids; ved indstikning spidsen til bunden af røret kan resterende proteinholdig elueringsbuffer indsamles.
- Binde rG4R1 til G4-bundet SPB og eluer rekombinante enzym i en ATP-afhængig måde.
- Forbered 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 og 50% glycerol. Forbered 3x Res Buffer: 0,915 ml H2O, 2 ml 5x Res Buffer, 0,33 ml 0,4% lactalbumin (diluted fra 4% lactalbumin med 1x Tris-glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, og 0,010 ml leupeptin. Hold på is.
BEMÆRK: lager 4% lactalbumin (vægt / volumen) fremstilles indledningsvist ved opløsning i 2 M glycin pH 7,5, med den yderligere tilsætning af 1x PIC og 0,05% natriumazid. - Pellet G4-SPB til siden af røret med en magnet og kassér supernatanten (G4-SPB, som fremstillet i trin 4.2). Tilsæt 1 ml 3x Res Buffer til G4-SPB og pipette til at blande.
- Pipettere denne 1 ml G4-SPB suspenderet i 3x Res puffer i 15 ml rør indeholdende ~ 2 ml proteinholdige HEB / EDTA (eluat fra trin 4.4). Inkuber i 15 minutter i et 37 ° C vandbad med lejlighedsvis omrøring, så perlerne ikke nøjes.
- På is pelletere protein-bundne G4-SPB til siden af røret med en magnet. At vaske, tilsættes 1 ml af 4x SSC + 0,4% mælkealbumin (+ 0,5 uL / mL BME) og pipette at resuspendere perlerne. Pellet perler med than magnet på is. Gentag denne vask for i alt 2 vaske.
BEMÆRK: Tålmodighed er nødvendig under vask proceduren for at sikre, at alle de magnetiske perler er pelleteret mellem vaske. Dette gælder især i betragtning af den forøgede viskositet af opløsningen på grund af glycerol indeholdt i Res buffere. - Vask G4-SPB 1x med 1 ml 3x Res Buffer.
- Forbered elueringspuffer (EB): 0,5 ml 3x Res Buffer, 0,1 ml 0,1 M ATP og 0,4 ml H2O
- Pre-varm 1 ml EB til 37 ° C i PCR-rør fordelt på varmeblokken for en termisk cyklusapparat indstillet til 37 ° C.
- Pellet G4-SPB med magneten på is og resuspenderes perlerne i 100 pi forvarmet EB. overdrage perlerne til en forvarmet PCR-rør og inkuberes i 30 s ved 37 ° C.
- Straks tilføje 12 pi 5 M NaCl og pipette op og ned kraftigt 20 - 30 gange. Kombinationen af høj saltkoncentration og ATP indeholdt i EBtjener til eluering rG4R1 fra G4-beads.
BEMÆRK: Det er yderst vigtigt at minimere antallet af bobler dannet under pipettering proces, som bobler kan denaturere proteinet. - Umiddelbart pelletere G4-SPB med en magnet og overføre den proteinholdige eluat på en frisk PCR-rør på is (mærket med datoen).
- Gentag elueringen og overførsel beskrevet i trin 4.5.8-4.5.10; slutproduktet af denne proces er således ca. 200 pi af EB med rensede rG4R1. Braklægning to 7 pi prøver (i PCR-rør mærket med den passende dato) til brug i kvalitetskontrol enzymatisk aktivitet assay, der vil teste, om højaktive rG4R1 faktisk er blevet renset.
- Opbevar oprenset rG4R1 ved -80 ° C indtil tidspunktet for aktivitet assay.
- Forbered 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 og 50% glycerol. Forbered 3x Res Buffer: 0,915 ml H2O, 2 ml 5x Res Buffer, 0,33 ml 0,4% lactalbumin (diluted fra 4% lactalbumin med 1x Tris-glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl2, 0,050 ml PIC, og 0,010 ml leupeptin. Hold på is.
5. Kvalitetskontrol Enzymatisk aktivitetsassay af renset rG4R1
- For hvert præparat af rG4R1 der skal analyseres, forberede 300 piaf resolvase assaybuffer (RAB), hvor hver 30 pi indeholder 0,2 pmol TAMRA-mærket Z33 G4-DNA (fremstillet i trin 2); makeup af RAB er som følger: 0,1 ml 3x Res Buffer, 0,01 ml 0,2 pmol / pl G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP og 0,16 ml H2O i en stribe af 6. PCR rør, pipette 40 pi RAB i det første rør og 30 pi af RAB til de resterende rør (holde rørene på is på dette tidspunkt).
- Hent en af de 7 uL rG4R1 portioner (fra trin 4.5.11) og placere den på is. Med en p20 pipette sat til 5 uL, forsigtigt pipette op og ned et par gange for at blande rG4R1 i portionen og overførsel 5 uL til det første rør af strimlen af 6 PCR-rør (den, der indeholder 40 pi RAB). Dernæst indstilles pipetten til 10 uL og serielt overføre 10 uL til de resterende PCR-rør, der indeholder RAB.
- inkuber straks denne strimmel af PCR-rør ved 37 ° C i 30 minutter i en thermal cycler, fulgt af en 4 ° C hold.Åben tuberne, mens de bliver holdt ved 4 ° C og tilsæt 2 pi 0,5 M EDTA pH 8 til hvert rør (for at standse den enzymatiske reaktion).
- Hæld en 10% acrylamid / 1x TBE / 10% glycerol gel. Efter fjernelse af kammen, vaske brøndene med 1x TBE. Tilsæt 5 pi af en høj masse, hydrofilt polysaccharid (30% Ficoll i H2O) til hvert rør og belastning 15 pi fra hvert rør (igen kan observeres lastning af brønde med Schlieren linjer).
- Som en kontrol for G4-DNA mobilitet, tilsættes 4 pi af en høj masse, hydrofile polysaccharid til 20 uL RAB og belastning 15 uL; som en kontrol for afviklet monomere Z33, varme 20 pi RAB ved 98 ° C i 10 minutter, tilsættes 4 pi af en høj masse, hydrofile polysaccharid, og belastningen 15 pi.
- Kør gelen ved 120 V i 2 timer med 1x TBE som løbebufferen. Billede gelen på en multimodal imager med fluorescens-imaging kapacitet under anvendelse TAMRA-specifikke filtre (excitere med en 532 nm grøn laser og bruge en 580 nm band pass 30 filter (580 BP 30)).
BEMÆRK: En særdeles aktiv fremstilling af rG4R1 vil give fuldstændig opløsning af TAMRA-mærket Z33 i de første 3 baner, der blev påsat gelen, som vist i figur 2.
6. Sammenlægning af højaktiv rG4R1 Preps, alikvotere og opbevaring
BEMÆRK: Dette trin kræver 2 personer. Antallet og enzymatiske krav i de efterfølgende analyser, som det rensede rG4R1 vil blive anvendt i vil bestemme, hvor mange præparater nødvendig før udportionering. En typisk stor forberedelse består af en sammenlægning af 8 meget aktive præparater (hvilket bruger i alt 16 inducerede 500 ml bakteriekulturer), men dette er et vilkårligt antal og er laboratorie-specifik.
- Beregn det samlede volumen af højaktive, oprensede rG4R1, der skal alikvoteret. Typisk 7 pi alikvoter anvendt i efterfølgende assays. Fyld blok af et termisk CYCLis sat til 4 ° C med strip PCR-rør (disse vil blive opdelt i alikvoter i, som den faste karakter af blokken vil fremskynde den hurtige lukning af PCR strimler).
- Hent PCR-rørene indeholdende højaktiv rG4R1 fra -80 ° C og hurtigt tø rørene i hånden; når en lille mængde is efterlades i røret, at placere rørene på is. Kombiner alle de hurtigt-optøede præparater i en forafkølet, 15 ml rør og bland godt, og sørg for at minimere bobler.
- Ved hjælp af en automatisk gentage pipette, dispensere den ønskede rumfanget i pre-kølede PCR bånd rør i den termiske cycler. Så snart 1 - 2 strimler er afsluttet, har den anden person lukke lågene og overføre dem til 96-brønds wafere, der svæver i flydende nitrogen (flash frysning er nødvendige for at bevare enzymaktivitet).
BEMÆRK: Du må ikke tage mere end omkring 200 pi rG4R1 ind i spidsen af den automatiske pipette på et tidspunkt at reducere den tid, at enzymet ikke er på 4° C. - Når de forud afkølet PCR striben rør i det termiske cykliseringsapparat er blevet fyldt med alikvoter og ordentligt frosset, hurtigt overføre mere præ-kølet PCR bånd rør fra isen til det termiske cyklusapparat og fortsætte udportionering. Fortsæt på denne måde indtil den resterende del af enzymet er blevet opdelt i portioner, lynfrosset i flydende nitrogen og overført til tøris. Endelig overføre alikvoter til -80 ° C til langsigtet opbevaring.
7. Kvantificering af renset rG4R1 Koncentration
- Hæld en standard 5% stabling / 12% løse acrylamid / SDS-gel for protein separation.
- Thaw ca. 50 pi alikvoteret rG4R1, kombinere til et rør, og bland godt. Måle den nøjagtige volumen med en pipette og der tilsættes samme mængde 2x Laemmli-prøvebuffer (65,8 mM Tris-HCI pH 6,8, 26,3% (vægt / vol) glycerol, 2,1% SDS og 0,02% bromphenolblåt) + BME (50 pi / 950 uL af 2x Laemmli buffer). Denaturere proteinet ved 98 ° C i 10 min.
- Fjern kammen fra gelen og vaskes brøndene med standard 1x SDS / glycin løbebufferen. Indlæse svarer til 25 og 12,5 pi af rG4R1 (som er 50 og 25 pi af denatureret protein), selv om den optimale mængde enzym for at indlæse bør bestemmes af brugeren, når koncentrationen af de enzympræparater vil variere (f.eks 35 pL blev fyldt på gelen i figur 3). Læg protein standarder udarbejdet i trin 7.3. Sørg for, at pipetter er korrekt kalibreret, og sørg for at være så præcis som possible med pipettering teknik til at sikre nøjagtig kvantificering.
- Kør gelen ved 120 V indtil farvefronten er ført omkring 2/3 af gelen (for at sikre passende adskillelse af proteinerne, der udgør de bredspektrede MW markører).
- Fjern gelen og bortskaffe den del af gelen, der ikke indeholder protein ved at skære det væk med et barberblad. Gelen anbringes i et glas fad eller en tilsvarende beholder. Farv gelen med Coomassie-farvestof (50 mg Coomassie R-250 per 100 ml 50:10:40 v / v methanol: eddikesyre: H2O, der er blevet filtreret gennem et filter-papir tragt) O / N ved stuetemperatur på en orbitalryster sæt for at sikre tilstrækkelig omrøring af gelen.
- De-pletten gelen med 30:10:60 v / v methanol: eddikesyre: H 2 O ved hjælp rullede op, fnugfri silkepapir at fremskynde affarvning. Skift Affarvningsopløsningen efter behov. Fortsæt affarvning indtil baggrunden er tilstrækkelig lav til at visualisere rG4R1 og proteinstandarder; en typisk gel ved dettetrin er vist i figur 3.
- Placer affarvet gel i mellem et ark beskytter og scanne gelen på ≥300 dpi opløsning. Åbn det scannede billede i et billede analyse software program (såsom Fuji Multiguage eller tilsvarende) og forberede standardkurver fra protein standarder, som svarer til 75, 100 og 150 kDa (kurverne repræsenterer gram beløb versus densitometriske aflæsninger). Sørg for at trække baggrunden fra hver bane kvantificeres under processen med at få densitometriske værdier.
- Forudsat at lydstyrken mængde rG4R1 der blev sat på gelen indeholder en mængde af protein, der er inden for det lineære område af disse standardkurver, den gram mængde protein pr mikroliter rG4R1 indlæst kan ekstrapoleres.
- Konvertere den ekstrapolerede gram mængde rG4R1 i en molær mængde ved hjælp af molekylvægten af G4R1, hvilket er 120.000 g / mol.
BEMÆRK: For hver gel, vil tre ekstrapolerede værdier væregenereres (en for hver af de tre proteinmarkører anvendt til generering af standardkurver: 75, 100, og 150 kDa). Kør yderligere to geler og pletten og kvantificere dem ved at gentage trin 7,1-7,10. Med resultaterne af kvantificeringen for første gel, vil brugeren være i stand til at måle, hvor meget rG4R1 skal indlæses på yderligere geler til opnåelse af en mængde, der er inden for det lineære område af proteinstandarder. I alt ekstrapolere ni værdier som repræsenterer koncentrationen af meget aktive, renset rG4R1. Gennemsnit disse værdier til opnåelse af endelige batch-specifikke rG4R1 koncentration, som typisk er i området 20-100 nM. Standardafvigelsen fra disse værdier (n = 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol (figur 1) rutinemæssigt giver næsten ren, katalytisk aktiv rG4R1. Som et mål for enzymatisk aktivitet, er det typisk observeret, at 50% af 0,2 pmol TAMRA-mærket tetramolecular G4-DNA omdannes til monomerer inden for 0,2 - 0,013 pi række rG4R1, som analyseret ved G4 aktivitetsassay ovenfor (figur skitseret 2). Coomassie-farvning af oprenset rG4R1 angiver et enkelt bånd ved den forventede 120 kDa størrelse, med en mindre kontaminerende bånd ved ~ 75 kDa, som kan repræsentere trunkeret rG4R1 der har bevaret sin evne til at binde G4-DNA perler og eluere i en ATP-afhængig måde (figur 3). Bandet af interesse kvantificeres mod en protein standardkurve, og denne protokol typisk opnår 200 pi 20-100 nM renset enzym pr 1 liter bakteriekultur.
Figur 1: Skematisk af en to-trins Rensning af G4R1. En 6xHis-tagget rG4R1 er hovedparten-oprenset fra E. coli lysater ved først at binde til og eluering fra Co2 + -konjugeret perler. En bindende trin til G4-DNA-konjugeret magnetiske perler følger. Endelig en ATP-afhængig elueringstrin er nødvendig for at opnå relativt ren og enzymatisk aktivt rG4R1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvalitet-kontrol G4-DNA Unwinding analysen. Bane 1 - 6 ud: En konstant koncentration af TAMRA-mærket tetramolecular G4-DNA blev inkuberet ved 37 ° C i 30 min i nærvær af 4x serielle fortyndinger af oprensede rG4R1 repræsenterer 3,9 pi, 0,83 pi, 0,2 pi, 0,05 pi, 0,013 pi og 0 .003 Pi, henholdsvis. Bane 7: tetramolecular G4-DNA i fravær af rG4R1. Bane 8: tetramolecular G4-DNA kogt at reducere G4 struktur ind monomerer i fravær af rG4R1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af renset rG4R1 Concentration. Broad-range MW proteinmarkører blev fyldt i følgende mængder: 500, 250, 125, 62,5, 31,3, og 15,7 ng i bane 1 - 6, henholdsvis og blev anvendt til at generere en standardkurve for proteinkoncentrationer. Bane 7 betegner 35 pi af rG4R1. Denne særlige gel blev kvantificeret som en del af en tredobbelt sæt af geler, hvilket resulterer i en gennemsnitlig proteinkoncentration på 62 ± 22 nM standardafvigelse (SD, n = 9)..com / filer / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er et yderst effektiv ekspression, oprensning og kvantificering ordning for isolering af DHX36 genproduktet, G4-Resolvase1 (G4R1, også kaldet RHAU og DHX36) (figur 1). Denne protokol udnytter to rensningstrin: His-tag rensning affinitet på kobolt affinitet perler og enzymatisk oprensning på G4-DNA-konjugerede perler. Det sidstnævnte trin er enestående, fordi den udnytter den stramme affinitet, høj specificitet, og katalytisk unwinding aktivitet, rG4R1 har til G4 strukturer. Den stramme affinitet for G4 strukturer (Kd i lav-pM) giver mulighed for en høj salt vask (nær opløselighedsgrænsen for NaCl) før eluering fra G4 perler, hvilket reducerer tilstedeværelsen af ikke-specifikke proteiner. Den katalytiske aktivitet af G4R1 på G4 strukturer giver mulighed for specifik eluering af aktiv rG4R1 ved tilsætning af ATP og MgCI2. Denne to-trins rensningsskema konsekvent frembringer særdeles rent, Katalytisk aktivt rG4R1 13 i mængder der er egnede til de fleste biokemiske analyser.
Flere vigtige skridt vil sikre et godt udbytte af meget rent, katalytisk aktiv rG4R1. Den første er at sikre de rette induktion betingelser for His-rG4R1 i den bakterielle udtryk stamme. Vi har fundet, at den bedste udbytte af rekombinant protein opstår, når celler dyrkes til en OD 600 på ikke mere end 0,4-0,6 umiddelbart før induktion. Voksende cellerne ud over dette punkt kan resultere i et samlet tab af protein nyttiggørelse, muligvis på grund af indarbejdelsen af rG4R1 i inklusionslegemer. Sekund, opnåede vi en højere koncentration af oprenset protein ved "serielt-bindende" lysaterne til cobalt affinitetsperler. For eksempel har vi bundet af lysatet fra 0,5 I inducerede kulturer til kobolt affinitetsperler og derefter udført en anden binding af en anden lysatet fra yderligere 0,5 L af kultur til de samme cobalt affinitetsperler. Det hertrin sikrer en mere koncentreret præparat af protein ved at øge antallet af rG4R1 bundet til et givet volumen af perler, således at udnytte den fulde kapacitet af cobalt affinitetsperler. For det tredje, den høje salt vask efter binding af cobalt affinitet elueringer til G4 perler sikrer, at næsten alle ikke-specifik proteinbinding til perlerne fjernes. For det fjerde, ATP / MgCl2 elueringstrin giver mulighed for rG4R1 bundet til G4 perler til katalytisk slappe den tetramolecular struktur i enkelte tråde, der forårsager rG4R1 til at blive frigivet fra perlerne. Vi kan ikke helt udelukke muligheden for, at ATP eluerer rG4R1 i et konkurrencepræget snarere end en katalytisk måde; men dette er mindre tilbøjelige til at være tilfældet, da vi tidligere har vist, at en ikke-hydrolyserbar ATP analog ikke er tilstrækkelig til kompetitiv binding 13, 18. Affiniteten af rG4R1 for den afviklede, enkeltstrengede DNA er en størrelsesorden mindre end than starter tetramolecular G4-DNA, og dermed rG4R1 bør ikke re-binde til perlerne. For at reducere denne mulighed, men dette trin bør ske ved 37 ° C, og elueringsvolumenet bør adskilles fra perlerne så hurtigt som muligt. Elueringstrinnet gentages to gange for at sikre maksimal udvinding. Hvis downstream applikationer kræver, at proteinet er fri for DNA-kontaminanter, anbefaler vi et yderligere oprydning trin, hvor det oprensede præparat er re-bundet til streptavidin-perler, for hvis til stede for at fjerne eventuelle biotinylerede DNA'er,.
Vi har fundet, at rG4R1 er modtagelige for nedbrydning, hvis de rette betingelser ikke opretholdes under protokollen. For at bevare integriteten og aktiviteten af enzymet beskæftiger vi følgende kritiske sikkerhedsforanstaltninger. Proteaseinhibitorer holdes stede i hele oprensningsproceduren. Protokollen er udført ved 4 ° C, medmindre andet er angivet. Proteinet oprenses i nærvær af lactalbumin og β-mercaptoethanol. Protokollen er udført i tide (1 dag til oprensning). Derudover har vi fundet, at multiple fryse-tø cykler negativ indflydelse på aktiviteten af proteinet, så vi udportionerer proteinet til "engangsbrug", 7 pi alikvoter efter oprensning og opbevare dem ved -80 ° C.
Selv om tilstedeværelsen af lactalbumin i præparatet er nødvendig for at opretholde integriteten og aktiviteten af proteinet, som nævnt ovenfor, har vi fundet, at dette også kan hindre efterfølgende anvendelser. Andre potentielle interfererende molekyler, der er til stede i den oprensede rG4R1 præparat indbefatter ATP, β-mercaptoethanol, og udpeget DNA. For eksempel har vi fundet dette protein præparat uforenelig med BIAcore-analyse på grund af den høje baggrundssignal fra bufferen komponenter. Også tilstedeværelsen af mælkealbumin i udarbejdelsen protein udelukker anvendelsen af standard Bradfordog BCA proteinkvantificering assays. Vi har imidlertid udviklet en alternativ gel-baserede kvantificering metode til at omgå denne begrænsning.
Denne oprensningsprocedure, som udnytter den enzymatiske aktivitet af G4R1 som et middel til specifikt rense det, gør denne metode adskiller sig fra andre metoder. For eksempel har andre grupper udtrykt FLAG-mærket rG4R1 i humane celler 15, 25 eller GST-mærket rG4R1 i insektceller 26 og oprenset det ved flag- eller GST-affinitetschromatografi henholdsvis. Disse metoder har den fordel, at der gøres i et eukaryot ekspressionssystem sammenlignet med et bakterielt ekspressionssystem. Anslåede K-værdier for den resulterende rensede GST-G4R1 til G4 strukturer viste sig at være en størrelsesorden højere 14 end vores rapporteret Kd værdier 12, 13. Vi tilskriver this uoverensstemmelsen i Kd-værdier til forskelle forbundet med en tykkere GST-tag versus en 6xHis-tag, forskelle i renheder opnået fra disse to oprensningsskemaer, og forskelle i omfanget og typen af post-translationelle modifikationer erhvervet i en bakteriel versus en insekt ekspressionssystem. Vores tilgang har en klar fordel i forhold de ovennævnte alternativer, fordi oprensningen af dette protein direkte afhænger af dets enzymatiske aktivitet. Derfor har vi primært opnå et enzym, der er foldet og modificeret på en sådan måde, der opretholder dets enzymatiske egenskaber. Andre affinitet-tag og / eller størrelse-udelukkelse teknikker er i stand til at adskille aktivt enzym fra enzymatisk døde enzym. Det ville være nyttigt for fremtidig protokol udvikling til at kombinere styrkerne i andre gruppers rensning protokoller 15, 25, 26 (dvs. et menneske eller insekt celle expression-system) med styrken af vores protokol (dvs. katalytisk-baseret oprensning) til yderligere at forbedre denne fremgangsmåde.
Selvom denne protokol er i øjeblikket specifikt for G4R1, kunne det let tilpasses til enhver ATP-afhængige, G4-løsning proteiner, herunder, men ikke begrænset til, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP proteiner, hPif1, og / eller ChlR1 / DDX1. Ved ændring af sekvensen af nukleinsyren bundet til streptavidinperlerne kunne denne protokol tilpasses til oprensning andre ATP-afhængige nucleinsyre enzymer, som produktet af den enzymatiske reaktion er ikke længere et substrat for enzymet, herunder nukleinsyre-helicaser og nukleaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke vores finansieringskilder, herunder en generøs gave fra Ware Foundation (til JPV), National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (til PJS), og Ball State University startup midler (til PJS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or from standard source |
| 1 M Tris-HCl, pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or from standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or from standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or from standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or from standard source |
| 0.2 M EDTA, pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or from standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | From standard source | ||
| 500 mL centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- BD Biosciences. , Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
