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Biochemistry

Enzymatically सक्रिय जी -4 Resolvase1 की शुद्धि के लिए एक जी quadruplex डीएनए आत्मीयता दृष्टिकोण

Published: March 18, 2017 doi: 10.3791/55496
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 3
1Department of Cancer Biology, Wake Forest School of Medicine, 2YX Genomics, 3Department of Biology, Ball State University, 4Department of Hematology and Oncology, Roper St. Francis Hospital
* These authors contributed equally

Summary

जी -4 Resolvase1 एक जी -4 बाध्यकारी प्रोटीन के लिए यानी कथित आत्मीयता के साथ जी-quadruplex (जी -4) संरचनाओं को बांधता है और हेला कोशिकाओं में जी -4 डीएनए तनाव गतिविधि के बहुमत का प्रतिनिधित्व करता है। हम एक उपन्यास प्रोटोकॉल है कि समानता और जी -4-Resolvase1 की एटीपी निर्भर तनाव गतिविधि harnesses विशेष catalytically सक्रिय पुनः संयोजक G4R1 को शुद्ध करने का वर्णन है।

Abstract

उच्च आदेश न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं बुलाया जी quadruplexes (जी 4 एस, जी -4 संरचनाओं) दोनों डीएनए और आरएनए के गुआनिन समृद्ध क्षेत्रों में फार्म कर सकते हैं और अत्यधिक thermally स्थिर रहे हैं। वहाँ मानव जीनोम में> 375,000 ख्यात जी -4 के गठन दृश्यों रहे हैं, और वे प्रमोटर क्षेत्रों, ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTRs) में समृद्ध कर रहे हैं, और telomeric दोहराने के भीतर। इन संरचनाओं ऐसे प्रतिकृति और प्रतिलेखन के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए क्षमता के कारण, सेल उन्हें प्रबंधित करने के एंजाइमों विकसित किया गया है। ऐसा ही एक एंजाइम जी -4 Resolvase 1 (G4R1), जो biochemically हमारी प्रयोगशाला और Nagamine एट अल द्वारा सह-विशेषता थी है। और अत्यंत दोनों जी -4 डीएनए और (कम प्रधानमंत्री रेंज में कश्मीर घ) जी -4 शाही सेना को कसकर बाँध पाया। G4R1 हेला सेल lysates में जी -4 के समाधान गतिविधि के बहुमत का स्रोत है और तब से टेलोमेर चयापचय, लसीका विकास, जीन प्रतिलेखन, hematopoiesis, और प्रतिरक्षा निगरानी में एक भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है। एफई की क्षमताficiently व्यक्त करने और शुद्ध catalytically सक्रिय G4R1 जी -4 संरचनाओं और जी -4 के समाधान एंजाइमों की गतिज बातचीत में और अधिक जानकारी पाने में रुचि प्रयोगशालाओं के लिए महत्व का है। यहाँ, हम पुनः संयोजक G4R1 (rG4R1) की शुद्धि के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन है। वर्णित प्रक्रिया को शामिल किया गया एक सी टर्मिनल हिस्टिडीन टैग एंजाइम की पारंपरिक समानता आधारित शुद्धि rG4R1 की क्षमता के उपयोग के साथ मानव कोडोन अनुकूलित बैक्टीरिया में व्यक्त बाँध और खोलना जी -4 डीएनए एक ATP- में अत्यधिक सक्रिय एंजाइम को शुद्ध करने के लिए निर्भर क्षालन कदम है। प्रोटोकॉल भी एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम जहां rG4R1 के enzymatic गतिविधि जी -4 डीएनए तनाव कम करने के लिए शुद्ध एंजाइम की क्षमता की जांच से मापा जाता है शामिल हैं। एक तरीका यह भी वर्णित है कि शुद्ध rG4R1 की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के वैकल्पिक रूपांतरों चर्चा कर रहे हैं।

Introduction

जी -4 संरचनाओं अत्यधिक स्थिर न्यूक्लिक एसिड माध्यमिक संरचनाओं कि डीएनए और आरएनए के गुआनिन समृद्ध क्षेत्रों के भीतर फार्म हैं। जी -4 संरचनाओं Hoogsteen संबंध बातचीत के माध्यम से स्थिर है और मोनोवैलेन्ट फैटायनों (यानी। कश्मीर + और ना +) उल्लेखनीय है कि जी -4 संरचनाओं 1, 2 की उल्लेखनीय थर्मल स्थिरता के लिए योगदान के साथ केंद्रीय गुहा के भीतर संबंध में समन्वय कर रहे हैं। प्रारंभिक जैव सूचना विज्ञान के अध्ययन का सुझाव है कि मानव जीनोम> 375000 "संभावित जी -4 के गठन रूपांकनों" 3, 4 में शामिल है। अधिक हाल के एक अध्ययन अनुमान के मुताबिक जी -4 रूपांकनों की संख्या 2-5 5 का एक पहलू से अधिक है, जबकि एक अन्य अध्ययन की भविष्यवाणी मानव जीनोम 6 में 716,310 अलग संभावित जी -4 के गठन दृश्यों। जी -4 के गठन दृश्यों evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं और बेतरतीब ढंग में बिखरे नहींजीनोम। जी -4 रूपांकनों जीन कूट क्षेत्रों में समृद्ध कर रहे हैं, और सभी जीन प्रमोटरों के 40% से अधिक की जी -4 रूपांकनों 7 होते हैं। दिलचस्प है, एक जीन में जी -4 रूपांकनों के संवर्धन की डिग्री जीन के समारोह के लिए सुझाव है कि प्रदर्शन किया गया है। उदाहरण के लिए, प्रोटो-ओंकोजीन और जीन के विकास में शामिल ट्यूमर शमन जीन 8, 9 की तुलना में जी -4 संरचनाओं की काफी अधिक संवर्धन की है।

उच्च तापीय stabilities के साथ, जीनोम भर में लगभग एक सर्वव्यापी उपस्थिति, और संभावित काफी प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए, यह unsurprising लगाने के लिए कि सेल एंजाइमों विकसित किया गया है इन संरचनाओं का प्रबंधन है। है, जो हम मानव (हेला) कोशिकाओं 10 में tetramolecular जी -4 डीएनए को हल करने गतिविधि के बहुमत के स्रोत के रूप में होती है, ऐसे ही एक एंजाइम जी -4 Resolvase1 (भी RHAU और DHX36 बुलाया G4R1) है। तब से, यह दिखाया गया है Thaटी G4R1 कसकर बांध और catalytically tetramolecular और unimolecular जी -4 डीएनए और एक जी -4 बाध्यकारी प्रोटीन 11, 12, 13 के लिए यानी कथित KDS के साथ जी -4-आरएनए unwinds। इसके अतिरिक्त, G4R1 के जी -4 के समाधान गतिविधि टेलोमेर / टेलोमिरेज जीव विज्ञान 11, 14, 15, 16, प्रतिलेखन और splicing 17, 18, 19, 20, विकास 21, hematopoiesis सहित जैव रासायनिक और सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज में फंसाया गया है 21, और प्रतिरक्षा विनियमन 22, 23। जी -4 दृश्यों के एक प्रमुखता विशेष जीनोम और विविध सेलुलर पी भर में स्थित के साथrocesses कि G4R1 हाल ही साथ, एक्सप्रेस और कुशलता से जैव रासायनिक तंत्र और इस प्रोटीन के व्यवहार elucidating के लिए अत्यधिक सक्रिय rG4R1 अत्यंत महत्व का हो जाएगा शुद्ध करने की क्षमता शामिल होना फंसाया गया है।

यहाँ, हम एक उपन्यास अभिव्यक्ति और शुद्धि योजना (चित्रा 1) कि rG4R1 की एटीपी निर्भर, जी -4 के समाधान गतिविधि का लाभ लेता है कुशलता से सक्रिय एंजाइम को अलग-थलग करने के लिए प्रदर्शित करता है। यह योजना, अन्य एटीपी निर्भर न्यूक्लिक एसिड एंजाइमों जिसके लिए enzymatic प्रतिक्रिया के उत्पाद अब बाइंडिंग के लिए एक सब्सट्रेट है शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता G4R1 के लिए मामला है।

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Protocol

1. जी -4-डीएनए संरचना की तैयारी rG4R1 (Biotinylated जी -4 डीएनए जी quadruplex के गठन) की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा

  1. 5 'एएए GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA टीटीसी GGA सी सी टी बायोटिन 3': निम्नलिखित डीएनए oligomer, Z33-जैव कहा जाता है, एक 1 μmole पैमाने पर आदेश। सुनिश्चित करें कि बायोटिन आधा भाग oligomer के 3 'अंत में है।
  2. 450 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8, 25 मिमी EDTA, और 2,500 मिमी NaCl: 10x जी -4 बफर तैयार करें।
  3. पानी के 250 μL में Z33 oligomer Resuspend (ताकि oligomer एकाग्रता ~ 2.5 मिमी है)। 10x जी -4 बफर के 25 μL और मिश्रण जोड़ें। ~ 48 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर oligomer सेते हैं।
  4. संक्षिप्त ट्यूब संघनन (~ 1000 XG, 10 एस) इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन। एक उच्च-जन के जोड़े ~ 50 μL, हाइड्रोफिलिक polysaccharide में (एच 2 ओ 30% Ficoll) और मिश्रण। एक 10% एक्रिलामाइड / 1x TBE / 10% ग्लिसरॉल जेल (: 16 सेमी x 16 सेमी x 1 मिमी जेल आयाम) डालो। एक बार जेल polymerized है, 1x TBE और लोड के साथ कुओं धोनेसमान रूप से जेल के सबसे भर का गठन Z33-जैव oligomer (नमूना लेन लोड हो रहा है Schlieren लाइनों के साथ देखे जा सकते हैं)।
    1. जेल के अंत में एक गली में, oligomer कि (यह एक असंरचित नियंत्रण के रूप में काम करेगा) 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया है का एक छोटा सा अंश है, साथ ही किसी अन्य रूप में जेल लोडिंग डाई की एक छोटी राशि लोड लेन पर नजर रखने के लिए कितनी दूर जेल चला गया है।
  5. जेल में चल रहे बफर के रूप में 1x TBE का प्रयोग करें और जब तक डाई सामने जेल के कम से कम 1/3 तय की है 120 वी पर जेल चला रहे हैं।
  6. एक पत्र रक्षक में अपनी किसी न किसी पक्ष चेहरे के साथ एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी थाली प्लेस (या प्लास्टिक की चादर के साथ कवर)। कांच की प्लेटों में से एक निकालें और चादर रक्षक की सतह के लिए जेल हस्तांतरण। भूमि के ऊपर रोशनी और पराबैंगनी छाया जेल (: 365 एनएम लंबे तरंगदैर्ध्य) बंद करें। एक ताजा धार का प्रयोग करें और जी quadruplex-Z33-जैव बैंड, जो जेल में उच्च ऊपर चल रहा है (धीमी गतिशीलता वाले) पिघल के सापेक्ष रूप में देखा जाएगा बाहर कटौतीएड नियंत्रण।
  7. जेल एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में गठित जी -4 डीएनए युक्त टुकड़ा रखें और जेल टुकड़ा कवर करने के लिए अभी काफी भिगोने बफर जोड़ने (भिगोने बफर 1/3 मात्रा 10x TBE, 1/3 मात्रा संतृप्त सोडियम एसीटेट, और 1/3 के होते हैं मात्रा एच 2 ओ)। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (nonhumidified) में ट्यूब प्लेस और सेते हे / एन।
  8. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब का हल स्थानांतरण और (10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8, 2.5 मिमी EDTA पीएच 8, और 0.05% सोडियम azide में 20 मिलीग्राम / एमएल में ग्लाइकोजन शेयर) 1/10 मात्रा ग्लाइकोजन जोड़ने और ~ 1.2x मात्रा isopropanol ।
    नोट: सोडियम azide तीव्रता से विषैला होता है, इसलिए सावधानी से प्रयोग करें!
    1. मिक्स और कम से कम 2 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब जगह। एक tabletop अपकेंद्रित्र में 2700 XG पर ट्यूब स्पिन 12 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा। धीरे pelleted जी -4 डीएनए से समाधान छानना। 70% के साथ गोली 3 बार धोएं EtOH + 50 मिमी NaCl (धोने में नमक जी -4 स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है)। बाती प्रकार का वृक्ष मुक्त टिशू पेपर के साथ दूर अतिरिक्त तरल।
  9. जगहकम से कम 2 घंटे के लिए फ्रिज में धोया गोली गोली हाइड्रेट और आसान मेजबान के लिए अनुमति देने के लिए। TNE बफर के 50 μL में गोली (10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8, 50 मिमी NaCl, और 0.05 मिमी EDTA पीएच 8) Resuspend।
  10. इस गठन डीएनए जी quadruplex के 5 μL एच 2 ओ के 495 μL में रखें और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विलुप्त होने के गुणांक न्यूक्लियोटाइड रचना oligomer का (एक साथ Z33 डीएनए oligomer के विलुप्त होने के गुणांक में प्रवेश द्वारा निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है कि का उपयोग करके यों एक = 8 के आधार संरचना, सी = 3, जी = 15, और टी = 7 341946 एल / मोल / सेमी) है। , 25 (100) के रूप में कमजोर पड़ने कारक दर्ज रूप में गठन जी quadruplex डीएनए के 4 किस्में के होते हैं।
  11. 3 ODS (आयुध डिपो 260 इकाइयों) ट्यूब और दुकान प्रति की मात्रा बराबर -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य; उदाहरण के लिए, यदि 5 μL कि एच 2 ओ के 495 μL को जोड़ा गया है 3 के एक आयुध डिपो के 260 पढ़ने देता है, तो 5 μL aliquots तैयार करते हैं।

2. जी -4-डीएनए संरचना की तैयारी rG4R1 की एक enzymatic गतिविधि परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए (के गठन Tamra लेबल जी -4 डीएनए)

  1. निम्नलिखित डीएनए oligomer, Z33-टैम कहा जाता है, के क्रम में एक 1 μmole पैमाने पर: 5 'Tamra-एएए GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA टीटीसी GGA सी सी टी 3'। सुनिश्चित करें कि Tamra आधा भाग oligomer के 5 'अंत में है।
  2. के रूप में जी quadruplex के गठन, सिवाय इसके कि पराबैंगनी (यूवी) ग्रहण के लिए धारा 1 में उल्लिखित क्योंकि tetramethylrhodamine (Tamra) -labeled जी quadruplex नग्न आंखों से आसानी से देखा जा सकेगा आवश्यक नहीं है उसी प्रक्रिया का पालन करें। फिर, जेल पर एक पिघला नियंत्रण शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. चरण 1 में के रूप में, Tamra लेबल डीएनए जी quadruplex की एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पढ़ने लेने के बाद, TNE बफर के साथ 0.2 pmol / μL करने के लिए गठित जी quadruplex पतला। अंत में, -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 10% अंतिम एकाग्रता और स्टोर करने के ग्लिसरॉल जोड़ें।

3. रूपांतरण (DE3) PlysS पीटीआर के साथ सक्षम कोशिकाओंiEx4-DHX36 (प्लाज्मिड एन्कोडिंग मानव G4R1) और / बड़े बैक्टीरियल संस्कृतियों प्रेरित बढ़ो

  1. TriEx4-DHX36 प्लाज्मिड प्राप्त करते हैं।
  2. 20 μL aliquots में बैक्टीरिया विभाज्य है और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। समाज मध्यम विभाज्य (2% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 10 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी MgSO 4, और 20 मिमी ग्लूकोज) 80 μL aliquots में और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. carbenicillin (CARB) / chloramphenicol (सीएएम) लेग अगर प्लेटें तैयार करें। Carb और सीएएम के शेयर सांद्रता रहे हैं 50 मिलीग्राम / एमएल एच 2 ओ में और 35 मिलीग्राम / एमएल 70% EtOH में, क्रमशः, और इन 1,000x केंद्रित कर रहे हैं; इस प्रकार, लेग अगर चयन प्लेटों में अंतिम सांद्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल और 35 माइक्रोग्राम / एमएल, क्रमशः रहे हैं।
  4. बैक्टीरिया का 1 विभाज्य बर्फ पर रखें और आरटी पर समाज के माध्यम से 1 विभाज्य जगह है। pTriEx4-DHX36 प्लाज्मिड की 1 ग्राम के बैक्टीरिया में जोड़ें और विंदुक टिप मिश्रण करने के साथ धीरे ज़ुल्फ़। 42 & # पर एक और 5 मिनट के लिए और फिर गर्मी झटका लिए बर्फ पर सेते176; 30 एस के लिए सी। बर्फ पर 2 मिनट के लिए रखें और समाज के माध्यम जोड़ें।
  5. प्लेट prewarmed चयन प्लेटों पर बदल बैक्टीरिया (आमतौर पर, एक छोटी मात्रा में, इस तरह के रूप में 5 प्लेट - 10 μL, कम घनत्व कॉलोनी सुनिश्चित इतना है कि एकल कालोनियों आसानी से बड़ी संस्कृतियों में inoculated किया जा सकता है) और 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 24 भयानक शोरबा तैयार। बड़े फ्लास्क प्रति 500 ​​मिलीलीटर एक छोटी तरल चक्र पर और आटोक्लेव (ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए सुनिश्चित बनाने के लिए)।
  7. CARB / सीएएम (50 माइक्रोग्राम / एमएल / 35 माइक्रोग्राम / एमएल) शोरबा में जोड़े और फिर प्लग अगर लेने के शोरबा में एक भी जीवाणु कॉलोनी और pipetting युक्त (एक P1000 पिपेट का उपयोग) द्वारा संस्कृतियों टीका लगाना। सख्ती संस्कृतियों भंवर उन्हें aerate और फिर मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सीओ / एन पर संस्कृतियों सेते हैं।
  8. अगले दिन, एक 37 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में डाल दिया है और संस्कृतियों ~ 225 rpm पर हिला। आयुध डिपो 600 तक संस्कृतियों आगे बढ़ें 0.4 के बारे में है -0.6, जो आम तौर पर लगभग 4 ले जाएगा - 6 घंटे, प्रारंभिक सेल घनत्व पर निर्भर करता है।
    नोट: यह spectrophotometric रीडिंग के माध्यम से समय-समय पर घनत्व निगरानी की आवश्यकता होगी, और यह 0.5 ओडीएस ऊपर ज्यादा संस्कृतियों विकसित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। spectrophotometric रीडिंग के लिए एक खाली के रूप में, बैक्टीरिया के 1 एमएल नीचे स्पिन और रिक्त समाधान के रूप में स्पष्ट किया शोरबा का उपयोग करें।
  9. एक बार जब उचित 600 आयुध डिपो प्राप्त की है, तुरंत बर्फ पर संस्कृतियों जगह है और उन्हें जल्दी से 10 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा। तापमान एक थर्मामीटर 70% EtOH के साथ साफ कर का उपयोग कर मॉनिटर। , जल्दी से बोतल जबकि बर्फ पर घूर्णन द्वारा ठंडा करने में तेजी लाने के रूप में इस पुनः संयोजक प्रोटीन प्रेरण से पहले आगे बैक्टीरिया विकास को सीमित कर देगा।
  10. एक 1 मिमी अंतिम एकाग्रता (~ 120 मिलीग्राम / 500 एमएल संस्कृति) को IPTG जोड़ें और उसके बाद के लिए ~ 17 14 डिग्री सेल्सियस पर 80 rpm पर हिला - 18 h। प्रोटीन शामिल करने के लिए आदर्श तापमान 14 डिग्री सेल्सियस होना पाया गया है; सबसे अच्छा इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक ठंडा पानी स्नान प्रकार के बरतन नियंत्रण रेखा का उपयोगएक पारंपरिक ठंडे कमरे में पैदा और स्वयं एक थर्मामीटर के साथ नहाने के पानी के तापमान की जाँच करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक एयर कूल्ड प्रकार के बरतन / इनक्यूबेटर का उपयोग हालांकि यह उस में एक थर्मामीटर के साथ पानी की एक कुप्पी incubating और 80 rpm पर झटकों से परीक्षण करने के लिए क्या डिजिटल सेट तापमान की स्थापना के लिए वांछित तरल तापमान (परीक्षण इस निकलेगा आवश्यक है कुछ घंटों के लिए, डिजिटल तापमान 14 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है उसके अनुसार स्थापना का समायोजन)।
  11. बर्फ पर संस्कृतियों रखें और उन्हें जल्दी से शांत, कदम 3.9 में के रूप में। बैक्टीरिया के एक छोटे से विभाज्य ले लो और एक आयुध डिपो के 600 पढ़ ले; 1.2 आयुध डिपो 600 - आदर्श, संस्कृतियों के बारे में 0.8 अधिष्ठापन के दौरान दोगुनी हो जाएगी।
  12. 500 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए बैक्टीरिया स्थानांतरण और मैन्युअल जीवाणु संस्कृति का उपयोग कर ट्यूबों के बीच वजन भी करने के लिए उन्हें शेष। एक बार जब संतुलित, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3840 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। स्पष्ट किया शोरबा डालो और बैक्टीरियल PEL फ्रीजप्रोटीन शुद्धि के समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर देता है।

4. मानव rG4R1 की शुद्धि

  1. गला लें और बैक्टीरियल छर्रों lyse।
    1. आरटी पर तमिलनाडु बफर के 3 एमएल में बैक्टीरिया गोली गला लें (तमिलनाडु बफर 100 मिमी Tris पीएच 7.5 और 50 मिमी NaCl के होते हैं)। हाथ और पिघलना करने के भंवर में बोतल पकड़ / बैक्टीरिया गोली resuspend। एक बार thawed और अपेक्षाकृत समान रूप से निलंबित कर दिया, तमिलनाडु बफर के साथ 5 एमएल मात्रा लाने (आगे निलंबन एक 5 एमएल विंदुक के साथ ऊपर pipetting के माध्यम से और नीचे से पूरा किया जा सकता है)।
      नोट: यह तैयारी के दिन पर पिघलना करने के लिए / प्रस्तुत करने का या तो 2 या 4 बोतलें, शोधन प्रक्रिया के साथ आराम के उपयोगकर्ता के स्तर के आधार पर विशिष्ट है।
    2. एच 2 ओ के 250 μL में लाइसोजाइम के 20 मिलीग्राम भंग (संस्कृति) और resuspended बैक्टीरिया में जोड़ें। हाथ में बोतल घूमता है, जबकि 10 मिनट - लाइसोजाइम ~ 5 के लिए बैक्टीरिया को पचाने के लिए अनुमति दें।
      नोट: SUS के रंगपेंशन पाचन आय के रूप में थोड़ा हल्का करने के लिए शुरू हो जाएगा, और निलंबन अपेक्षाकृत गैर चिपचिपा हो जाएगा। संस्कृतियों भी ऊंचा हो गया है (यानी ज्यादा 1.2 आयुध डिपो के 600 से अधिक) कर रहे हैं, तो गुणसूत्र जीवाणु के डीएनए को इस स्तर पर अवांछित चिपचिपाहट पैदा कर सकता है।
    3. protease अवरोध कॉकटेल (पीआईसी) और leupeptin में से एक 10 μL विभाज्य के 250 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण।
    4. बर्फ पर रखें और ठंडे तमिलनाडु बफर के 10 एमएल और बीएमई के 22 μL जोड़ें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    5. एक डिजिटल sonicator 30% आयाम करने के लिए सेट के साथ बर्फ पर बैक्टीरिया Sonicate। पर 2 रों में पल्स और 2 एस 1 मिनट के लिए रवाना। sonication दोहराएँ 3 बार, नमूने sonication कदम के बीच कम से कम 2 मिनट के लिए बर्फ पर शांत करने के लिए अनुमति देता है।
      नोट: कई संस्कृतियों के साथ, sonication पुनरावृत्तियों दोहरा से पहले बदले में प्रत्येक एक sonicate। sonication के दौरान, sonication टिप पर्याप्त बैक्टीरियल lysate में जलमग्न रखने के लिए सावधान रहना होगा, लेकिन छू वें नहींट्यूब के ई पक्षों, इस के रूप में अतिरिक्त गर्मी उत्पन्न होगा।
    6. ठंड 4x एसएससी + 20 + 50 बीएमई के μL leupeptin की PIC + 1 विभाज्य की μL के एक बराबर मात्रा (15 एमएल) और मिश्रण जोड़ें।
    7. एक tabletop अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व ठंडा, 20 मिनट के लिए 2300 XG पर lysates अपकेंद्रित्र। ताजा, पूर्व ठंडा 50 एमएल ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण (बड़े संस्कृति के अनुसार 1 ट्यूब तैयार किया जा रहा)।
  2. जी -4-चुंबकीय मोती तैयार करें।
    1. streptavidin समचुंबक मनका के 1 एमएल (संस्कृति के अनुसार 1 एल) (एसपीबी) निलंबन ले लो और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। एक चुंबक के साथ एसपीबी गोली और 2x 2x एसएससी + 5 मिमी EDTA पीएच 8. Resuspend के साथ मोती धोने के लिए इस्तेमाल एक ही समाधान के 200 μL में धोया एसपीबी धो लें।
    2. जी -4 डीएनए एसपीबी निलंबन के लिए (Z33-जैव धारा 1 में तैयार जी -4) में से एक 3 आयुध डिपो विभाज्य जोड़ें और कई बार नीचे से ऊपर pipetting और जल्दी से मिश्रण। एक रोटेटर पर ट्यूबों की जगह और कम से कम 30 मिनट (और अप करने के लिए 60 मिनट) के लिए आरटी पर बारी बारी से।
    3. पिछाड़ीएर रोटेशन की इस अवधि में 0.4% lactalbumin के 1 एमएल जोड़कर जी -4 बाध्य एसपीबी ब्लॉक, और जब तक की जरूरत बर्फ पर रहते हैं। 1x Tris ग्लाइसिन का उपयोग कर 4% lactalbumin स्टॉक से 0.4% lactalbumin पतला।
      नोट: शेयर 4% lactalbumin (डब्ल्यू / वी) शुरू में विघटन से 2 एम ग्लाइसिन पीएच 7.5 में, 1x तस्वीर और 0.05% सोडियम azide के आगे अलावा के साथ तैयार किया जाता है।
  3. कोबाल्ट मोती (सीबी) (4.1 कदम से जारी) को बाँध हिस्टिडीन टैग rG4R1।
    1. सीबी घोल (एक 0.5 एमएल मनका मात्रा के बराबर) के 1 एमएल युक्त स्पष्ट किया बैक्टीरियल lysate प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब में जोड़े। एक रोटेटर पर आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: 0.5 एमएल मनका मात्रा प्रति स्पष्ट lysate के 1 एल प्रयोग किया जाता है; जैसे, दो 500 एमएल बैक्टीरियल संस्कृतियों तैयार हैं, केवल सीबी इस बिंदु पर संस्कृतियों में से एक से स्पष्ट lysate युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब, lysate के रूप में दूसरी संस्कृति से जोड़ने के क्रमानुसार ही 0.5 सेंट में सीबी एमएल के साथ बाध्य हो जाएगाईपी 4.3.3)।
    2. नीचे एक 4 डिग्री सेल्सियस टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 110 XG पर सीबी स्पिन। ध्यान से तरल Aspirate, और तरल के एक जोड़े एमएल छोड़ के रूप में तो pelleted सीबी को परेशान नहीं करने के लिए। ठंड 4x एसएससी + बीएमई के 15 एमएल (4x एसएससी की बीएमई / एमएल के 0.5 μL) - 10 से धो लें।
      नोट: washes के लिए, 10-15 एमएल सीधे pipetting के बजाय pelleted कोबाल्ट मोती पर डालना pipetting के रूप में मोती पिपेट और प्रोटीन के अंदर करने के लिए अटक पाने के लिए खो जाएगा कारण होगा।
    3. Centrifugation के माध्यम से फिर से सीबी गोली और उसके बाद अगले डालना स्पष्ट lysate (30 मिलीलीटर, 2 एन डी बड़े प्रेरित जीवाणु संस्कृति का प्रतिनिधित्व) pelleted सीबी पर। एक और 20 रोटेटर पर आरटी पर मिनट के लिए सेते हैं और फिर 4x एसएससी + बीएमई के 10-15 एमएल के साथ दो बार धोने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 110 XG पर गोली।
    4. दूसरे धोने के बाद, तरल aspirate और ट्यूब के नीचे मोती / तरल के बारे में 2 एमएल छोड़ दें। द्वारा एक पूर्व ठंडा 2-एमएल ट्यूब प्रोटीन वाली सीबी स्थानांतरण1 एमएल "विस्तृत बोर" विंदुक टिप का उपयोग।
      नोट:, टिप हस्तांतरण से पहले के अंत में कटौती करने के लिए एक ताजा धार का प्रयोग करें "विस्तृत बोर" विंदुक टिप के उपयोग के रूप में प्रोटीन वाली कोबाल्ट मोतियों की हानि कम हो जाएगा।
    5. संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में उच्च गति (~ 18,000 XG) पर 2 मिलीलीटर ट्यूब में मोती अपकेंद्रित्र (~ 5 - 10 सब है कि जल्दी pelleting के लिए आवश्यक है)। धीरे हटाने और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें, प्रोटीन वाली सीबी खोना नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है।
  4. सीबी से rG4R1 Elute।
    1. एक ठंडे कमरे में 5 मिनट के लिए एक रोटेटर पर हिस्टिडीन क्षालन बफर (HEB) के 0.5 एमएल में सीबी सेते हैं। (सीबी नुकसान को खत्म करने के लिए) फिर, जब HEB उनका कहना है, सिर्फ मोती पर 0.5 एमएल पिपेट और inverting ट्यूब द्वारा मोती resuspend। HEB 0.7 एम एल हिस्टिडीन पीएच 6 (पीएच एसिटिक एसिड का उपयोग कर निकाला जाता है) है।
    2. 1 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस microcentrifuge में 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरणएक करने के लिए पूर्व ठंडा 15 एमएल ट्यूब। धीरे हटाने और सावधान pipetting द्वारा प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण, सीबी के शीर्ष पर तरल पदार्थ की एक छोटी राशि को छोड़कर।
    3. दोहराएँ 3 HEB elutions की कुल के लिए 4.4.1 और 4.4.2 कदम।
    4. 0.2 एम EDTA पीएच 6.0 के साथ एक बार Elute; के रूप में EDTA कोबाल्ट chelates सीबी का रंग सफेद करने के लिए गुलाबी से बदल जाएगा।
    5. इसके बाद चौथे और अंतिम क्षालन 15 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित किया गया है, एक 1 एमएल विंदुक टिप के अंत पर एक जेल लोडिंग टिप का उपयोग करके सीबी से अवशिष्ट क्षालन बफर पिपेट; ट्यूब के नीचे टिप डूबनेवाला द्वारा, अवशिष्ट प्रोटीन युक्त क्षालन बफर एकत्र किया जा सकता है।
  5. जी -4 के लिए बाध्य करने के लिए एसपीबी rG4R1 बाँध और एक एटीपी निर्भर तरीके से पुनः संयोजक एंजाइम elute।
    1. 250 मिमी Tris-एसीटेट पीएच 7.8, 250 मिमी NaCl, 2.5 मिमी 2 MgCl, और 50% ग्लिसरॉल: 5x रेस बफर तैयार करें। 3x रेस बफर तैयार: एच 2 ओ, 5x के 2 एमएल रेस बफर, 0.4% lactalbumin की 0.33 एमएल (घ की 0.915 एमएल1x Tris ग्लाइसिन), बीएमई के 0.010 एमएल, 1 मीटर की 0.015 एमएल 2 MgCl, तस्वीर की 0.050 एमएल, और leupeptin की 0.010 एमएल के साथ 4% lactalbumin से iluted। बर्फ पर रखें।
      नोट: शेयर 4% lactalbumin (डब्ल्यू / वी) शुरू में विघटन से 2 एम ग्लाइसिन पीएच 7.5 में, 1x तस्वीर और 0.05% सोडियम azide के आगे अलावा के साथ तैयार किया जाता है।
    2. एक चुंबक के साथ ट्यूब की ओर करने के लिए गोली जी -4-एसपीबी और (4.2 कदम में तैयार के रूप में, जी -4-एसपीबी) सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मिश्रण करने के लिए जी -4-एसपीबी और पिपेट को 3x रेस बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. जी -4-एसपीबी के इस 1 एमएल (कदम 4.4 से eluate) युक्त ~ 2 प्रोटीन युक्त HEB / EDTA एमएल 15 एमएल ट्यूब में 3x रेस बफर में निलंबित कर दिया पिपेट। कभी-कभी आंदोलन के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए सेते हैं तो मोती व्यवस्थित नहीं है।
    4. बर्फ पर, एक चुंबक के साथ ट्यूब की ओर करने के लिए प्रोटीन वाली जी -4-एसपीबी गोली। धोने के लिए, मोती resuspend 4x एसएससी + 0.4% lactalbumin (+ 0.5 μL / एमएल बीएमई) और पिपेट के 1 एमएल जोड़ें। टी के साथ गोली मोतीवह बर्फ पर चुंबक। 2 washes के एक कुल के लिए इस धोने दोहराएँ।
      नोट: सब्र सुनिश्चित करने के लिए कि चुंबकीय मोतियों के सभी washes के बीच pelleted दिया है कपड़े धोने की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक है। इस ग्लिसरॉल रेस बफ़र्स में निहित के कारण विशेष रूप से सच समाधान की वृद्धि की चिपचिपाहट दिया है।
    5. 3x रेस बफर के 1 एमएल के साथ जी -4-एसपीबी 1x धो लें।
    6. 3x रेस बफर के 0.5 एमएल, 0.1 एम एटीपी के 0.1 एमएल, और एच 2 के 0.4 एमएल ओ: क्षालन बफर (ईबी) तैयार
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पीसीआर में एक थर्मल साइक्लर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट की हीटिंग ब्लॉक में वितरित ट्यूबों के लिए ईबी के पूर्व गर्म 1 एमएल।
    8. बर्फ पर चुंबक के साथ गोली जी -4-एसपीबी और पूर्व गर्म ईबी के 100 μL में मोती resuspend। इसके तत्काल बाद एक पूर्व गर्म पीसीआर ट्यूब के लिए मोती हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए सेते हैं।
    9. तुरंत 5 एम NaCl के 12 μL जोड़ें और 20 विंदुक ऊपर और नीचे सख्ती - 30 बार। उच्च नमक और एटीपी के संयोजन में निहित ईबीजी -4-मोतियों से rG4R1 elute करने के लिए कार्य करता है।
      नोट: यह pipetting प्रक्रिया के दौरान गठित बुलबुले की संख्या को कम करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है, क्योंकि बुलबुले प्रोटीन denature कर सकते हैं।
    10. इसके तत्काल बाद एक चुंबक के साथ जी -4-एसपीबी गोली और बर्फ पर एक ताजा पीसीआर ट्यूब (तारीख के साथ लेबल) के लिए प्रोटीन युक्त eluate हस्तांतरण।
    11. क्षालन और कदम 4.5.8-4.5.10 में वर्णित हस्तांतरण दोहराएँ; इस प्रक्रिया के अंत उत्पाद इस प्रकार ~ 200 ईबी का μL शुद्ध rG4R1 युक्त है। एक तरफ दो 7 μL aliquots गुणवत्ता नियंत्रण enzymatic गतिविधि परख है कि क्या वास्तव में अत्यधिक सक्रिय rG4R1 शुद्ध किया गया है का परीक्षण करेंगे में उपयोग के लिए (उपयुक्त तिथि के साथ लेबल पीसीआर नलियों में) सेट करें।
    12. -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध rG4R1 स्टोर गतिविधि परख के समय तक।

5. गुणवत्ता नियंत्रण enzymatic गतिविधि शुद्ध rG4R1 की परख

  1. के लिए rG4R1 के प्रत्येक तैयारी यत्न किया जा करने के लिए, 300 μL तैयारresolvase परख बफर (आरएबी) है, जहां प्रत्येक 30 μL Tamra लेबल Z33 जी -4 डीएनए के 0.2 pmol होता है (चरण 2 में तैयार); 3x रेस बफर के 0.1 एमएल, 0.2 pmol की 0.01 एमएल / μL जी -4-Z33-टैम, 0.1 एम एटीपी के 0.03 एमएल, और 0.16 एच 2 ओ एमएल 6 पीसीआर की एक पट्टी में: शाही के श्रृंगार के रूप में निम्नानुसार है ट्यूब, पिपेट पहले ट्यूब में आरएबी के 40 μL और शेष ट्यूबों में आरएबी के 30 μL (इस बिंदु पर बर्फ पर ट्यूबों रखने के लिए)।
  2. 7 μL rG4R1 aliquots (कदम 4.5.11 से) से एक निकालते हैं और बर्फ पर जगह है। एक P20 पिपेट 5 μL करने के लिए सेट के साथ, धीरे विंदुक ऊपर और नीचे एक बार कुछ 6 पीसीआर नलियों (एक है कि आरएबी के 40 μL शामिल हैं) की पट्टी की पहली ट्यूब के लिए 5 μL विभाज्य और हस्तांतरण में rG4R1 मिश्रण करने के लिए। इसके बाद, 10 μL विंदुक सेट और क्रमानुसार शाही युक्त शेष पीसीआर ट्यूबों के लिए 10 μL हस्तांतरण।
  3. इसके तत्काल बाद एक थर्मल cycler में 30 मिनट, एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ के द्वारा पीछा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर ट्यूब की इस पट्टी सेते हैं।(Enzymatic प्रतिक्रिया को रोकने के लिए) है, जबकि वे 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा रहा है ट्यूब खुला और प्रत्येक ट्यूब 0.5 एम EDTA पीएच 8 के 2 μL जोड़ें।
  4. एक 10% एक्रिलामाइड / 1x TBE / 10% ग्लिसरॉल जेल डालो। कंघी को हटाने के बाद, 1x TBE के साथ कुओं धो लें। एक उच्च-जन की 5 μL जोड़ें, हाइड्रोफिलिक polysaccharide प्रत्येक ट्यूब और लोड प्रत्येक ट्यूब से 15 μL (कुओं की लोडिंग फिर Schlieren लाइनों का उपयोग कर देखा जा सकता है) से (एच 2 ओ में 30% Ficoll)।
    1. जी -4 डीएनए गतिशीलता के लिए एक नियंत्रण के रूप में, एक उच्च मास की 4 μL, 20 μL आरएबी को हाइड्रोफिलिक polysaccharide, और भार 15 μL जोड़ने; खुला हुआ monomeric Z33 के लिए एक नियंत्रण के रूप में, गर्मी 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर शाही के 20 μL, एक उच्च द्रव्यमान, हाइड्रोफिलिक polysaccharide, और भार 15 μL के 4 μL जोड़ें।
  5. चल बफर के रूप में 1x TBE के साथ 2 घंटे के लिए 120 वी पर जेल चला। छवि Tamra विशेष फिल्टर का उपयोग प्रतिदीप्ति इमेजिंग क्षमता के साथ एक बहुविध इमेजर पर जेल (एक 532 एनएम हरी लेजर के साथ उत्तेजित और एक 58 का उपयोग0 एनएम बैंड 30 फिल्टर (580 बीपी 30)) से गुजरती हैं।
    ध्यान दें: rG4R1 की एक अत्यधिक सक्रिय तैयारी पहले 3 गलियों कि, जेल पर लोड कर रहे थे के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया में Tamra लेबल Z33 की पूरी संकल्प निकलेगा।

6. अत्यधिक सक्रिय rG4R1 preps, aliquoting, और भंडारण की पूलिंग

नोट: यह कदम 2 लोगों की आवश्यकता है। संख्या और नीचे की ओर assays कि शुद्ध rG4R1 में इस्तेमाल किया जाएगा तय करेंगे कि कितने तैयारियों aliquoting करने से पहले आवश्यक हैं के enzymatic आवश्यकताओं। एक ठेठ बड़ी तैयारी 8 अत्यधिक सक्रिय तैयारी (इस प्रकार 16 प्रेरित 500 एमएल बैक्टीरियल संस्कृतियों की कुल उपयोग करते हुए) की पूलिंग के होते हैं, लेकिन यह एक मनमाना संख्या है और प्रयोगशाला विशिष्ट है।

  1. अत्यधिक सक्रिय, शुद्ध rG4R1 की कुल मात्रा है कि aliquoted जा करने के लिए की गणना। आमतौर पर, 7 μL aliquots नीचे की ओर assays में उपयोग किया जाता है। एक थर्मल cycl के ब्लॉक भरेंएर पट्टी पीसीआर ट्यूबों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस (इन, में aliquoted जाएगा के रूप में ब्लॉक के ठोस प्रकृति पीसीआर स्ट्रिप्स का तेजी से बंद करने में तेजी लाने जाएगा) के लिए निर्धारित किया है।
  2. डिग्री सेल्सियस -80 से अत्यधिक सक्रिय rG4R1 युक्त पीसीआर नलियों निकालते हैं और जल्दी से हाथ में ट्यूबों पिघलना; जब बर्फ की एक छोटी राशि के ट्यूब में छोड़ दिया जाता है, बर्फ पर ट्यूबों जगह है। एक prechilled, 15 मिलीलीटर ट्यूब में जल्दी-thawed तैयारी के सभी गठबंधन और मिश्रण अच्छी तरह से, बुलबुले को कम से कम करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
  3. एक स्वत: दोहरा पिपेट का प्रयोग, थर्मल cycler में पूर्व ठंडा पीसीआर पट्टी ट्यूबों में वांछित विभाज्य मात्रा बांटना। जैसे ही 1 - 2 स्ट्रिप्स पूरा कर रहे हैं, दूसरे व्यक्ति पलकों को बंद करने और उन्हें 96 अच्छी तरह से वेफर्स कि तरल नाइट्रोजन में तैर रहे हैं के लिए स्थानांतरण (फ़्लैश ठंड enzymatic गतिविधि को बनाए रखने के लिए आवश्यक है) है।
    नोट: एक समय में स्वत: पिपेट की नोक में rG4R1 के बारे में 200 μL से अधिक लेने के समय को कम करने के लिए मत है कि एंजाइम 4 में नहीं हैसी।
  4. एक बार थर्मल cycler में prechilled पीसीआर पट्टी नलियों aliquots के साथ भर दिया गया है और ठीक से जमे हुए हैं, जल्दी से थर्मल साइक्लर करने के लिए बर्फ से अधिक पूर्व ठंडा पीसीआर पट्टी ट्यूबों स्थानांतरण और aliquoting जारी है। इस तरह से जारी रखें जब तक एंजाइम के शेष aliquoted कर दिया गया है, फ्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और सूखी बर्फ के लिए स्थानांतरित कर दिया। अंत में, लंबी अवधि के भंडारण के लिए डिग्री सेल्सियस -80 के लिए aliquots हस्तांतरण।

7. शुद्ध rG4R1 एकाग्रता की मात्रा

  1. एक मानक 5% स्टैकिंग / 12% को हल करने के लिए प्रोटीन जुदाई एक्रिलामाइड / एसडीएस जेल डालो।
  2. पिघलना aliquoted rG4R1 के बारे में 50 μL, एक ट्यूब में गठबंधन है, और अच्छी तरह मिलाएँ। एक विंदुक के साथ सटीक मात्रा को मापने और (पीएच 6.8, 26.3% (w / v) ग्लिसरॉल, 2.1% एसडीएस, और 0.02% bromophenol नीले 65.8 मिमी Tris एचसीएल) + बीएमई (50 μL 2x Laemmli नमूना बफर के बराबर राशि जोड़ने / 2x Laemmli बफर के 950 μL)। 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन denature।
    3. नोट: प्रत्येक प्रोटीन मानक व्यापक रेंज मेगावाट मार्कर में निहित पर मौजूद है 0.1 माइक्रोग्राम / μL, 50 केडीए प्रोटीन है, जो 0.3 माइक्रोग्राम / μL पर मौजूद है के लिए छोड़कर। इन मार्करों गर्मी विकृत होने की जरूरत नहीं है।
  3. जेल से कंघी निकालें और मानक 1x एसडीएस / ग्लाइसिन चल बफर के साथ कुओं धो लें। 25 के बराबर है और rG4R1 (जो 50 है और विकृत प्रोटीन के 25 μL) की 12.5 μL लोड हालांकि लोड करने के लिए एंजाइम का इष्टतम मात्रा उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए, एंजाइमी तैयारियों की एकाग्रता के रूप में अलग-अलग होगा (जैसे, 35 μL चित्रा 3) में जेल पर लोड किया गया था। कदम 7.3 में तैयार प्रोटीन मानकों लोड। सुनिश्चित करें कि pipettes ठीक से calibrated हैं, और possib के रूप में सटीक होना करने के लिए सुनिश्चित करेंpipetting तकनीक के साथ Le सटीक मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए।
  4. 120 वी पर जेल चला जब तक डाई सामने बारे में 2/3 जेल की तय की है (प्रोटीन है कि व्यापक रेंज मेगावाट मार्कर बनाने का उचित जुदाई सुनिश्चित करने के लिए)।
  5. जेल निकालें और जेल है कि एक धार के साथ इसे दूर काटने से प्रोटीन को शामिल नहीं होगा के हिस्से के निपटान के। एक गिलास पुलाव डिश या समकक्ष संदूक में जेल रखें। Coomassie डाई के साथ जेल दाग (Coomassie के 50 मिलीग्राम आर-250 50:10:40 वी / वी मेथनॉल के 100 एमएल प्रति: एसिटिक एसिड: एच 2 ओ कि एक फिल्टर पेपर कीप के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है) हे / एन आरटी पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन सेट पर जेल की पर्याप्त आंदोलन सुनिश्चित करने के लिए।
  6. साथ 30:10:60 वी / वी मेथनॉल जेल डी-दाग: एसिटिक एसिड: एच 2 ओ balled-अप, प्रकार का वृक्ष मुक्त टिशू पेपर का उपयोग destaining तेजी लाने के लिए। जरूरत के रूप में destaining समाधान बदलें। destaining तक पृष्ठभूमि पर्याप्त rG4R1 और प्रोटीन मानकों कल्पना करने के लिए कम है जारी; इस पर एक ठेठ जेलचरण 3 चित्र में दिखाया गया है।
  7. एक चादर रक्षक के बीच में destained जेल प्लेस और ≥300 डीपीआई संकल्प पर जेल स्कैन। एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में स्कैन की गई छवि (जैसे फ़ूजी Multiguage या समकक्ष के रूप में) खोलें और प्रोटीन मानकों है कि 75, 100 के अनुरूप मानक घटता से तैयार है, और 150 केडीए (घटता densitometric रीडिंग बनाम ग्राम मात्रा में प्रतिनिधित्व करते हैं)। घटाना करने के लिए प्रत्येक लेन से पृष्ठभूमि densitometric मूल्यों प्राप्त करने की प्रक्रिया के दौरान मात्रा निर्धारित किया जा रहा सुनिश्चित करें।
  8. मान लिया जाये कि rG4R1 की मात्रा राशि है कि जेल पर लोड किया गया था प्रोटीन की एक राशि है कि इन मानक घटता के रैखिक सीमा के भीतर होता है कि, rG4R1 के microliter प्रति प्रोटीन के ग्राम राशि extrapolated किया जा सकता भरा हुआ है।
  9. G4R1, जो 120,000 जी / मोल है की आणविक वजन का उपयोग कर एक दाढ़ राशि में rG4R1 की extrapolated ग्राम मात्रा में परिवर्तित।
    नोट: प्रत्येक जेल के लिए, तीन extrapolated मान होंगेउत्पन्न (तीन प्रोटीन मानक घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया मार्कर से प्रत्येक के लिए एक: 75, 100, और 150 केडीए)। आगे के दो जैल और दाग चलाने के लिए और कदम 7.1 दोहरा द्वारा उन्हें यों - 7.10। पहले जेल के लिए मात्रा का ठहराव के परिणामों के साथ, उपयोगकर्ता rG4R1 एक राशि है कि प्रोटीन मानकों के रैखिक सीमा के भीतर है उपज के लिए आगे जैल पर लोड किया जा करने की जरूरत है कितना गेज करने में सक्षम हो जाएगा। कुल मिलाकर, अत्यधिक सक्रिय, शुद्ध rG4R1 की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करने वाले नौ मूल्यों एक्सट्रपलेशन। इन मूल्यों औसत अंतिम बैच विशेष rG4R1 एकाग्रता, जो 20-100 एनएम की रेंज में आम तौर पर देने के लिए है। इन मूल्यों से मानक विचलन की गणना (एन = 9)।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) नियमित तौर पर लगभग शुद्ध, catalytically सक्रिय rG4R1 अर्जित करता है। , के रूप में जी -4 गतिविधि (चित्रा ऊपर उल्लिखित परख द्वारा assayed rG4R1 की 0.013 μL रेंज - enzymatic गतिविधि का एक उपाय के रूप में, यह आम तौर पर देखा गया है कि Tamra लेबल tetramolecular जी -4 डीएनए के 0.2 pmol का 50% 0.2 भीतर monomers में बदल जाता है 2)। शुद्ध rG4R1 की Coomassie धुंधला ~ 75 केडीए, जो rG4R1 छोटा प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि जी -4 डीएनए मोती बाध्य करने के लिए और एक एटीपी निर्भर में elute करने की क्षमता को बनाए रखा है पर एक नाबालिग contaminating बैंड के साथ उम्मीद की 120 केडीए आकार में एक ही बैंड को इंगित करता है, ढंग (चित्रा 3)। ब्याज की बैंड एक प्रोटीन मानक वक्र के खिलाफ मात्रा निर्धारित है, और इस प्रोटोकॉल आमतौर पर बैक्टीरिया संस्कृति के एल 20-100 प्रति 1 एनएम शुद्ध एंजाइम के 200 μL प्राप्त करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: G4R1 की एक दो कदम शुद्धि के योजनाबद्ध। एक 6xHis टैग rG4R1 थोक शुद्ध होता है पहले करने के लिए बाध्य है और एल्यूटिंग से सह 2 + मोती संयुग्मित द्वारा ई कोलाई lysates से। जी -4 डीएनए संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के लिए एक बाध्यकारी कदम इस प्रकार है। अंत में, एक एटीपी निर्भर क्षालन कदम अपेक्षाकृत शुद्ध और enzymatically सक्रिय rG4R1 प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: गुणवत्ता नियंत्रण जी -4 डीएनए Unwinding परख। लेन 1 - 6: Tamra लेबल tetramolecular जी -4 डीएनए की एक निरंतर एकाग्रता 3.9 μL, 0.83 μL, 0.2 μL, 0.05 μL, 0.013 μL का प्रतिनिधित्व शुद्ध rG4R1 की 4x धारावाहिक dilutions की उपस्थिति में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated था , और 0 .003 ΜL, क्रमशः। लेन 7: rG4R1 के अभाव में tetramolecular जी -4 डीएनए। लेन 8: tetramolecular जी -4 डीएनए rG4R1 के अभाव में monomers में जी -4 संरचना को कम करने के लिए उबला हुआ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: शुद्ध rG4R1 एकाग्रता की मात्रा। व्यापक रेंज मेगावाट प्रोटीन मार्कर निम्न मात्रा में भरी हुई थी: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.7 और एनजी 1 गलियों में - 6, क्रमशः, और प्रोटीन सांद्रता का एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। लेन 7 rG4R1 के 35 μL प्रतिनिधित्व करता है। यह विशेष रूप से जेल जैल की एक तीन प्रतियों सेट के हिस्से के रूप में, मात्रा निर्धारित किया गया था, 62 ± 22 एनएम मानक विचलन के एक औसत प्रोटीन एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप (एसडी, n = 9)।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक अत्यंत कुशल अभिव्यक्ति, शुद्धि, और मात्रा का ठहराव DHX36 जीन उत्पाद, जी -4-Resolvase1 (G4R1 भी RHAU और DHX36 कहा जाता है) (चित्रा 1) के अलगाव के लिए योजना का प्रतिनिधित्व करता है। कोबाल्ट आत्मीयता के मनकों पर उनकी टैग आत्मीयता शुद्धि और जी -4 डीएनए संयुग्मित मनकों पर एंजाइमी शुद्धि: इस प्रोटोकॉल दो शुद्धि चरणों का इस्तेमाल करता है। बाद के चरण में तंग आत्मीयता, उच्च विशिष्टता, और उत्प्रेरक unwinding गतिविधि rG4R1 जी -4 संरचनाओं के लिए है कि का लाभ लेता है कि अद्वितीय है। जी -4 संरचनाओं के लिए तंग आत्मीयता (कम प्रधानमंत्री रेंज में कश्मीर घ) बहुत गैर विशिष्ट प्रोटीन की उपस्थिति को कम करने, एक उच्च नमक धोने (सोडियम क्लोराइड की घुलनशीलता सीमा के निकट) क्षालन करने से पहले जी -4 मोतियों से के लिए अनुमति देता है। जी -4 संरचनाओं पर G4R1 का उत्प्रेरक गतिविधि एटीपी और 2 MgCl के अलावा पर सक्रिय rG4R1 के विशिष्ट क्षालन के लिए अनुमति देता है। इस दो कदम शुद्धि योजना लगातार अत्यधिक शुद्ध पैदा करता है, Catalytically सबसे जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त मात्रा में सक्रिय rG4R1 13।

कई महत्वपूर्ण कदम अत्यधिक शुद्ध, catalytically सक्रिय rG4R1 की एक अच्छी उपज सुनिश्चित करेगा। पहले बैक्टीरियल अभिव्यक्ति तनाव में उनकी rG4R1 के समुचित प्रेरण शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए है। हमने पाया है कि पुनः संयोजक प्रोटीन का बेहतरीन उपज होती है जब कोशिकाओं से अधिक नहीं 0.4-0.6 सिर्फ प्रेरण से पहले के एक आयुध डिपो से 600 बड़े हो रहे है। इस बिंदु से आगे बढ़ रहा है कोशिकाओं संभवतः rG4R1 के समावेश शामिल किए जाने के शरीर में प्रोटीन के कारण वसूली का एक कुल नुकसान में परिणाम हो सकता है। दूसरा, हम द्वारा "क्रमानुसार बाध्यकारी" कोबाल्ट आकर्षण मोती lysates शुद्ध प्रोटीन के एक उच्च एकाग्रता प्राप्त की। उदाहरण के लिए, हम कोबाल्ट आकर्षण मोती के लिए प्रेरित संस्कृतियों के 0.5 एल से lysate बाध्य और फिर एक अतिरिक्त 0.5 ही कोबाल्ट आकर्षण मोती संस्कृति के एल से दूसरे lysate के एक दूसरे बाध्यकारी प्रदर्शन किया। इसकदम मोतियों की एक निश्चित मात्रा के लिए बाध्य rG4R1 अणुओं की संख्या बढ़ती जा रही है, इस प्रकार कोबाल्ट आत्मीयता के मोतियों की पूरी क्षमता का उपयोग करके प्रोटीन का एक और अधिक ध्यान केंद्रित तैयारी सुनिश्चित करता है। तीसरा, जी -4 मोती के लिए कोबाल्ट समानता elutions बाध्यकारी के बाद उच्च नमक धोने है कि लगभग सभी गैर विशिष्ट प्रोटीन मोतियों के लिए बाध्य निकाल दिया जाता है सुनिश्चित करता है। चौथे, एटीपी / 2 MgCl क्षालन कदम rG4R1 के कारण मोतियों से जारी किया जाएगा, rG4R1 जी -4 मोतियों के लिए बाध्य catalytically एकल किस्में में tetramolecular संरचना तनाव कम करने के लिए अनुमति देता है। हम पूरी तरह से संभावना है कि एटीपी बल्कि एक उत्प्रेरक ढंग से एक प्रतियोगी में elutes rG4R1 से इंकार नहीं कर सकते हैं; हालांकि, इस के बाद से हम पहले से पता चला है कि एक गैर-hydrolyzable एटीपी एनालॉग प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी 13, 18 के लिए पर्याप्त नहीं है, कम मामले होने की संभावना है। खुला हुआ के लिए rG4R1 की आत्मीयता, एकल असहाय डीएनए परिमाण के एक आदेश टी की तुलना में कम हैवह tetramolecular जी -4 डीएनए शुरू करने, और इस तरह rG4R1 फिर से बाँध नहीं करना चाहिए मोती। आदेश में इस संभावना को कम करने के लिए, हालांकि, इस कदम से 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए, और क्षालन मात्रा जितनी जल्दी संभव हो मोतियों से अलग किया जाना चाहिए। क्षालन कदम अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए दो बार दोहराया है। बहाव के अनुप्रयोगों प्रोटीन डीएनए प्रदूषणों से मुक्त होने की आवश्यकता होती है, तो हम एक अतिरिक्त सफाई कदम जिसमें शुद्ध तैयारी अगर मौजूद है, किसी भी biotinylated DNAs हटाने के लिए आदेश में streptavidin मोतियों को फिर से बाध्य है सलाह देते हैं।

हमने पाया है कि rG4R1 अगर उचित शर्तों प्रोटोकॉल भर में नहीं रखा जाता गिरावट की संभावना है। आदेश अखंडता और एंजाइम की गतिविधि को बनाए रखने के लिए, हम निम्नलिखित महत्वपूर्ण सुरक्षा उपायों को रोजगार। Protease inhibitors शोधन प्रक्रिया के दौरान मौजूद रखा जाता है। प्रोटोकॉल, 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है जब तक अन्यथा नोट। प्रोटीन ला की उपस्थिति में शुद्ध होता हैctalbumin और β-mercaptoethanol। प्रोटोकॉल (1 दिन में शुद्धि के लिए) एक समय पर फैशन में किया जाता है। इसके अतिरिक्त, हमने पाया है कि कई फ्रीज पिघलना चक्र नकारात्मक प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित है, तो हम "एक बार उपयोग करते हैं," में प्रोटीन विभाज्य 7 μL aliquots शुद्धि के बाद और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

हालांकि तैयारी में lactalbumin की उपस्थिति अखंडता और प्रोटीन की गतिविधि को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, हमने पाया है कि यह भी बहाव के अनुप्रयोगों में बाधा हो सकती है। अन्य संभावित हस्तक्षेप अणुओं है कि शुद्ध rG4R1 तैयारी में मौजूद हैं एटीपी, β-mercaptoethanol, और singled असहाय डीएनए शामिल हैं। उदाहरण के लिए, हम बफर घटकों से उच्च पृष्ठभूमि संकेत के कारण इस प्रोटीन तैयारी BIACORE विश्लेषण के साथ असंगत हो पाया है। इसके अलावा, प्रोटीन तैयारी में lactalbumin की उपस्थिति मानक ब्रैडफोर्ड का उपयोग precludesऔर बीसीए प्रोटीन quantitation assays। हालांकि, हम इस सीमा को नाकाम करने के लिए एक विकल्प के जेल आधारित quantitation तरीका विकसित किया है।

यह शोधन प्रक्रिया है, जो एक साधन के रूप में G4R1 के enzymatic गतिविधि harnesses विशेष रूप से इसे शुद्ध करने के लिए, इस विधि अन्य तरीकों से अलग बनाता है। उदाहरण के लिए, अन्य समूहों कीट कोशिकाओं 26 में मानव कोशिकाओं 15, 25 या जीएसटी टैग rG4R1 में झंडा टैग rG4R1 व्यक्त की और FLAG- या जीएसटी आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी क्रमश: इसे पवित्र किया है। इन तरीकों में एक जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली की तुलना में एक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली में किया जा रहा है का फायदा है। जी -4 संरचनाओं के लिए जिसके परिणामस्वरूप शुद्ध जीएसटी G4R1 की अनुमानित कश्मीर घ मूल्यों की तुलना में हमारे सूचना दी कश्मीर डी 12 मूल्यों परिमाण उच्च 14 के एक आदेश, 13 होना पाया गया है। हम विशेषता थीबनाम एक 6xHis टैग एक bulkier जीएसटी टैग के साथ जुड़े मतभेदों को कश्मीर घ मूल्यों में विसंगति, एक बनाम एक जीवाणु में अधिग्रहण हद तक और बाद translational संशोधनों के प्रकार में मतभेद इन दो शुद्धि योजनाओं से प्राप्त purities में मतभेद, और कीट अभिव्यक्ति प्रणाली। हमारा दृष्टिकोण क्योंकि इस प्रोटीन की शुद्धि के लिए सीधे अपनी enzymatic गतिविधि पर टिका है ऊपर उल्लिखित विकल्प पर एक विशिष्ट लाभ है। इसलिए, हम मुख्य रूप से एक एंजाइम है कि मुड़ा कर दिया गया है और संशोधित कि इस तरह से अपने एंजाइमी गुण रखता में प्राप्त करते हैं। अन्य आकर्षण-टैग और / या आकार अपवर्जन तकनीक enzymatically मृत एंजाइम से सक्रिय एंजाइम को अलग करने में असमर्थ हैं। यह अन्य समूहों 'शुद्धि प्रोटोकॉल की ताकत 15, 25, 26 (यानी एक मानव या कीट सेल एक्सप्रेस गठबंधन करने के लिए भविष्य प्रोटोकॉल के विकास के लिए उपयोगी होगाआयन प्रणाली) हमारे प्रोटोकॉल (यानी, उत्प्रेरक आधारित शुद्धि) की ताकत के साथ आगे इस विधि पर सुधार करने के लिए।

हालांकि इस प्रोटोकॉल वर्तमान में G4R1 के लिए विशिष्ट है, यह आसानी सहित किसी भी एटीपी निर्भर, जी -4 के समाधान प्रोटीन, करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन करने के लिए, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP प्रोटीन, hPif1, और / या ChlR1 / DDX1 सीमित नहीं है। streptavidin मोती के लिए बाध्य न्यूक्लिक एसिड के अनुक्रम में फेरबदल करके, इस प्रोटोकॉल अन्य एटीपी निर्भर न्यूक्लिक एसिड एंजाइमों जिसके लिए enzymatic प्रतिक्रिया के उत्पाद अब एंजाइम के लिए एक सब्सट्रेट है, न्यूक्लिक एसिड helicases और सहित शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता न्युक्लिअसिज़।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

, HealthGrant T32-CA079448 (PJS करने के लिए), और गेंद राज्य विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (PJS करने के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों हम अपने धन स्रोतों का शुक्रिया अदा करने के लिए, वेयर फाउंडेशन (JPV करने के लिए) से एक उदार उपहार सहित चाहते हैं। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl, pH 8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or from standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH 8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or from standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

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References

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जैव रसायन अंक 121 जी -4 Resolvase1, जी quadruplex एटीपी निर्भर क्षालन जी quadruplex समानता प्रोटीन शुद्धि डीएनए helicase शाही सेना helicase
Enzymatically सक्रिय जी -4 Resolvase1 की शुद्धि के लिए एक जी quadruplex डीएनए आत्मीयता दृष्टिकोण
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Routh, E. D., Creacy, S. D.,… More

Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

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