Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

doi: 10.3791/55496 Published: March 18, 2017
* These authors contributed equally

Summary

G4 Resolvase1 связывается с G-квадруплексных (G4) структур с тайтового сообщенной сродства к G4-связывающего белка и представляет большинство разматывания активности G4-ДНК в клетках HeLa. Мы опишем протокол романа, использующую сродство и АТФ-зависимый разматывания активность G4-Resolvase1 специфически очистить каталитически активный рекомбинантный G4R1.

Abstract

структуры высшего порядка нуклеиновых кислот под названием G-квадруплексы (G4S, G4 структуры) могут образовываться в гуанин богатых регионах ДНК и РНК и высокой термостойкостью. Есть> 375000 предположительные G4 формирования последовательностей в геноме человека, и они обогащены промоторной области, нетранслируемые области (НТО), и в пределах теломерном повтора. Из-за возможности эти структуры, чтобы влиять на клеточные процессы, такие как репликации и транскрипции, клетка эволюционировала ферменты, чтобы управлять ими. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase 1 (G4R1), который биохимически совместно характеризуется нашей лаборатории и Нагамине и др. и нашел чрезвычайно плотно и к G4-ДНК и РНК-G4 (K D в диапазоне низких фазовую) связываться. G4R1 является источником большинства G4-разрешения активности в лизатах HeLa клеток и с тех пор было вовлечено играть определенную роль в теломер метаболизма, развитие лимфатического, транскрипции генов, кроветворения и иммунного надзора. Возможность Е.Ф.статочно экспрессировать и очистить каталитически активным G4R1 имеет важное значение для лабораторий, заинтересованных в получении дальнейшее понимание кинетического взаимодействия G4 структур и G4-решения ферментов. Здесь мы опишем подробный способ очистки рекомбинантного G4R1 (rG4R1). Описанная процедура включает традиционные аффинной очистки на основе из С-концевого гистидина-меченый фермент, экспрессированный в человеческих оптимизированной в отношении кодонов бактерий с использованием способности rG4R1 связывать и разматывать G4-ДНК для очистки высоко активного фермента в АТФ зависимой стадию элюирования. Протокол также включает в себя этап контроля качества, где ферментативная активность rG4R1 измеряется путем изучения способности очищенного фермента раскрутиться G4-ДНК. Способ также описывается, что позволяет для количественного определения очищенного rG4R1. Альтернативные приспособления этого протокола обсуждаются.

Introduction

G4 структуры обладают высокой стабильностью нуклеиновых кислот, вторичные структуры, которые формируются в пределах гуанин богатых участков ДНК и РНК. G4 структуры стабилизируются с помощью Хугстена-связывающих взаимодействий и координировать соединение в пределах центральной полости с одновалентных катионов (например. K + и Na +) , которые вносят значительный вклад в замечательный термостойкости G4 конструкций 1, 2. Ранние биоинформатики исследования позволяют предположить , что геном человека содержит> 375000 "потенциальные G4 образующие мотивы" 3, 4. Другие оценки недавние исследования позволяют предположить , что число G4 мотивов раза выше 2-5 5, в то время как другое исследование предсказывает 716,310 различные потенциальные последовательности G4 формирования в геноме человека 6. G4-формовка последовательности эволюционно консервативны и не рассредоточено вгеном. G4 мотивы обогащены генов , кодирующих областей, и свыше 40% всех промоторов генов содержат G4 мотивы 7. Интересно отметить, что степень обогащения G4 мотивов в гене было продемонстрировано, чтобы предложить функцию гена. Например, прото-онкогенов и генов , участвующих в развитии , имеют значительно большее обогащение G4 структур , чем генов - супрессоров 8, 9.

С высокой термостабильности, почти повсеместное присутствие по всему геному, и потенциал, чтобы существенно повлиять на основные клеточные процессы, то неудивительно, чтобы обнаружить, что клетка эволюционировала ферменты для управления этими структурами. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36), которое мы охарактеризовали как источник большинства tetramolecular G4-ДНК - разрешающего активности в человека (HeLa) клеток 10. С тех пор было показано, тхат G4R1 прочно связывается и каталитически раскручивается tetramolecular и мономолекулярному G4-ДНК и РНК-G4 с стесненных сообщившим KDS для G4-связывающего белка 11, 12, 13. Кроме того, G4-разрешения активность G4R1 участвует в широком диапазоне биохимических и клеточных процессов, в том числе теломер / теломеразы биологии 11, 14, 15, 16, транскрипции и сплайсинга 17, 18, 19, 20, развитие 21, кроветворение 21 и регуляции иммунной системы 22, 23. С перевес G4 последовательностей специфически расположенной по всему геному и разнообразной клеточной рrocesses, что G4R1 недавно был замешан быть связан с, способностью выражать и эффективно очищать высокоактивной rG4R1 будет иметь огромное значение для выяснения биохимических механизмов и поведения этого белка.

Здесь мы покажем новую схему экспрессии и очистки (Рисунок 1) , который использует АТФ-зависимый, G4-разрешения деятельности rG4R1 эффективно изолировать активный фермент. Эта схема может быть приспособлена для очистки других АТФ-зависимых ферментов нуклеиновых кислот, для которых продукт ферментативной реакции больше не является субстратом для связывания, как это имеет место для G4R1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение структур G4-ДНК, предназначенных для очистки rG4R1 (образование биотинилированного G4-ДНК G-Quadruplex)

  1. Заказать следующий олигомер ДНК, названный Z33-Био, в 1-масштабе мкмоль: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-биотин 3'. Убедитесь, что биотин фрагмент находится в 'конце олигомера 3.
  2. Подготовьте 10x G4 буфер: 450 мМ Трис-HCl, рН 8, 25 мМ ЭДТА и 2,500 мМ NaCl.
  3. Ресуспендируют олигомер Z33 в 250 мкл воды (так, чтобы концентрация олигомер составляет ~ 2,5 мм). Добавить 25 мкл 10-кратного буфера G4 и перемешать. Выдержите олигомера при 50 ° С в течение ~ 48 ч.
  4. Кратко спином вниз трубку для сбора конденсата (~ 1000 XG, 10 с). Добавить ~ 50 мкл большой массы, гидрофильных полисахаридных (30% Ficoll в H 2 O) и перемешать. Налейте 10% акриламид / 1x КЭ / 10% глицерина гель (размеры гель: 16 см х 16 см х 1 мм). После того, как гель полимеризуется, промойте лунки 1x КЭ и нагрузкойобразовавшийся олигомер Z33-Био равномерно по большей части геля (образец полосной нагрузки могут быть визуализированы с шлирен линиями).
    1. В одной полосе в конце геля, загрузите небольшую часть олигомера, который был нагрет при 98 ° С в течение 10 мин (это будет служить в качестве неструктурированных контроля), а также небольшое количество геля красителем в другой дорожка для контроля того, насколько гель запуска.
  5. Используйте 1x КЭ в качестве буфера гель работает и запустить гель при 120 V, пока фронт красителя не проходится по меньшей мере, 1/3 геля.
  6. Поместите тонкий слой хроматографическую пластину с ее грубой стороной вверх в защитном листе (или накрыть полиэтиленовой пленкой). Удалите одну из стеклянных пластин и передать гель на поверхности протектора листа. Выключите верхний свет и УФ-тень гель (длина волны: 365 нм). Используйте свежий лезвие бритвы и вырезать группу G-квадруплекс-Z33-Био, который будет рассматриваться как бег выше в геле (с меньшей подвижности) относительно расплавауправление ред.
  7. Поместите гель срез, содержащий образованный G4-ДНК в 50 мл пробирку и добавить достаточно просто замачивания буфер для покрытия куска геля (замачивания буфер состоит из 1/3 объема 10x TBE, 1/3 объема насыщенный ацетатом натрия, и 1/3 объем H 2 O). Поместите пробирку в 37 ° C инкубатор (nonhumidified) и инкубировать O / N.
  8. Переносят раствор в 15 мл пробирку и добавляют 1/10 объема гликоген (гликоген запаса при концентрации 20 мг / мл в 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 2,5 мМ ЭДТА, рН 8, и 0,05% азида натрия) и ~ 1.2x объем изопропаноле ,
    Примечание: азид натрия остро токсичен, поэтому используйте с осторожностью!
    1. Смешайте и поместите трубку при -20 ° С в течение не менее 2 ч. Спин трубу при 2,700 XG в настольной центрифуге охлаждают до 4 & deg; С в течение 12 мин. Аккуратно перелейте раствор из осажденной G4-ДНК. Вымойте гранул 3 раза с 70% этанола + 50 мМ NaCl (соль в стирке имеет решающее значение для стабильности G4). Фитиль прочь избыток жидкости бумажной салфеткой без ворса.
  9. Местопромытый осадок в холодильнике в течение по меньшей мере 2 ч для гидратации гранул и позволяют легче взмучивания. Ресуспендируют осадок в 50 мкл буфера TNE (10 мМ Трис-HCl, рН 8, 50 мМ NaCl и 0,05 мМ ЭДТА, рН 8).
  10. Поместите 5 мкл этой сформированной ДНК G-квадруплекс в 495 мкл H 2 O и количественно с помощью спектрофотометра , что позволяет коэффициент экстинкции , чтобы определить, введя нуклеотидный состав олигомера (коэффициент экстинкции олигомера Z33 ДНК с базовый состав а = 8, С = 3, G = 15, Т = 7 составляет 341946 л / моль / см). Введите коэффициент разрежения, 25 (не 100), а образовавшийся G-квадруплекс состоит из 4-х нитей ДНК.
  11. Алиготе объем эквивалент 3 ОР (OD 260 единиц) на пробирку и хранить при температуре -20 ° С; Например, если 5 мкл , который был добавлен к 495 мкл H 2 O дает OD 260 чтение 3, а затем подготовить 5 мкл аликвоты.

2. Получение структур G4-ДНК, чтобы использовать в ферментативной активности Количественный анализ rG4R1 (образование TAMRA-меченные G4-ДНК)

  1. Заказать следующий олигомер ДНК, называемый Z33-ТАМ, в 1-масштабе мкмоль: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Убедитесь, что фрагмент TAMRA находится в 'конце олигомера 5.
  2. Выполните ту же процедуру, как указано в разделе 1 для формирования G-квадруплекс, за исключением того, что ультрафиолетовое (УФ) затенения не является необходимым, так как тетраметилродамин (TAMRA) меченных G-квадруплекс будут легко видны невооруженным глазом. Опять же, не забудьте включить расплавленную контроль над гелем.
  3. После снятия показаний спектрофотометра в TAMRA-меченого ДНК G-квадруплекс, как на стадии 1, разбавить образованный G-Квадруплекс до 0,2 пмоль / мкл с TNE буфера. И, наконец, добавляют глицерин до конечной концентрации 10% и хранят при -20 ° С.

3. Transform (DE3) PlysS Грамотные Клетки с PTRiEx4-DHX36 (Плазмида, кодирующей человеческий G4R1) и Grow / индуцируют Большие Бактериальные культуры

  1. Получение плазмиды TriEx4-DHX36.
  2. Аликвотировать бактерии в 20 мкл аликвоты и хранить их при температуре -80 ° С. Алиготе SOC среды (2% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ КСl, 10 мМ MgCl 2, 10 мМ MgSO 4, и 20 мМ глюкозы) в 80 мкл аликвоты и хранят при -80 ° С.
  3. Приготовьте карбенициллин (CARB) / хлорамфеникол (CAM) LB-агар пластины. Концентрации запаса CARB и CAM составляет 50 мг / мл в H 2 O и 35 мг / мл в 70% этанола, соответственно, и эти 1,000x концентрируют; таким образом, чтобы конечные концентрации в отборе агаром LB, являются 50 мкг / мл и 35 мкг / мл, соответственно.
  4. Поместите 1 аликвоты бактерий на льду и поместить 1 аликвоты среды SOC при комнатной температуре. Добавьте 1 мкг pTriEx4-DHX36 плазмиды бактерий и осторожно встряхните кончиком пипетки перемешать. Инкубируют на льду в течение еще 5 мин, а затем теплового шока при 42 & #176 ° С в течение 30 с. Место на льду в течение 2 мин и добавляют СОВ среду.
  5. Пластинчатый трансформированных бактерий на предварительно нагретые тарелки отбора (как правило, плиты небольшой объем, например, 5 - 10 мкл, чтобы обеспечить низкую плотность колоний так, что отдельные колонии могут быть легко засевают в больших культурах) и инкубируют при 37 ° CO / N.
  6. Подготовьте Потрясающе Бульон в соответствии с инструкциями изготовителя 24. Сделать 500 мл в большой колбе (не забудьте добавить глицерин) и автоклав на коротком цикле жидкости.
  7. Добавить CARB / CAM (50 мкг / мл / 35 мкг / мл) в бульоне и затем инокуляции культур, принимая агаровых (используя P1000 пипетку), содержащего одну бактериальную колонию и пипетирования в бульон. Вихревой культур энергично, чтобы проветрить их, а затем инкубировать культур при 37 ° CO / N без встряхивания.
  8. На следующий день, место культуры в шейкере C 37 ° и встряхивают при температуре ~ 225 оборотов в минуту. Расти культур до OD 600 составляет около 0,4 -0,6, что обычно занимает около 4 - 6 ч, в зависимости от начальной плотности клеток.
    Примечание: Для этого потребуется периодический контроль плотности с помощью спектрофотометрических показаний, и это очень важно , чтобы не выращивать культуры гораздо выше 0,5 СОД. В качестве заготовки для спектрофотометрических чтений, спином вниз 1 мл бактерий и используют осветленный бульон в качестве раствора запирани.
  9. После того , как собственно ОД 600 получается, сразу же место культур на льду и быстро охладить их до 10 ° С. Монитор температуры с помощью термометра протирать 70% этанола. Ускорить охлаждение путем быстро враща колбы в то время как на льду, так как это ограничивает дальнейший рост бактерий перед рекомбинантного белка индукции.
  10. Добавить IPTG до конечной концентрации 1 мМ (~ 120 мг / 500 мл культуры), а затем трясти при 80 оборотах в минуту при 14 ° С в течение ~ 17 - 18 ч. Идеальная температура для индукции белков было обнаружено, что 14 & deg; С; чтобы наилучшим образом достичь этого, использовать охлаждаемый водяной бане шейкера LOCованные в обычной холодильной камере и вручную проверить температуру воды в ванне с помощью термометра.
    Примечание: В качестве альтернативы, использовать с воздушным охлаждением шейкер / инкубатор, хотя необходимо проверить , что в цифровом виде набора настройка температуры даст желаемый температуру жидкости (тест это путем инкубирования колбу воды с помощью термометра в нем и встряхивании при 80 оборотах в минуту в течение нескольких часов, регулируя цифровой не соответствующим образом параметр до 14 ° C температура достигнута).
  11. Поместите культуры на льду и охладить их быстро, как в шаге 3.9. Возьмите небольшую аликвоту бактерий и принимают OD 600 чтение; в идеале, культуры будет вдвое во время индукции до примерно 0,8 - 1,2 OD 600.
  12. Передача бактерии в 500 мл центрифужные пробирки и вручную сбалансировать их с помощью бактериальной культуры, чтобы даже вес между трубками. После того, как сбалансирован, центрифугировать их в 3840 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Слейте осветленный бульон и заморозить бактериальной PELне позволяет при -80 ° С до момента очистки белков.

4. Очистка человека rG4R1

  1. Оттепель и лизиса бактериальных гранул.
    1. Разморозить бактериальный осадок в 3 мл буфера TN при КТ (TN буфер состоит из 100 мМ Трис, рН 7,5 и 50 мМ NaCl). Держите бутылки в руке и вихрем растаять / ресуспендирования бактериальных гранул. После размораживания и относительно равномерно приостановлено, довести объем до 5 мл с буфером TN (далее суспензии может быть достигнуто с помощью пипетки вверх и вниз с 5 мл пипетки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это типично оттаивать / Prep либо 2 или 4 бутылки на день подготовки, в зависимости от уровня пользователя комфорта с процедурой очистки.
    2. Растворите 20 мг лизоцима в 250 мкл H 2 O (в культуре) и добавить к ресуспендировали бактерий. Дайте лизоцим переваривать бактерии в течение ~ 5 - 10 мин при закрученной бутылки в руке.
      Примечание: Цвет SUSпенсия начнет светлеть слегка варочных средств, а подвеска будет относительно невязкой. Если Культуры слишком зарастает (т.е. намного больше , чем 1,2 OD 600), а затем хромосомную ДНК микобактерий может вызывать нежелательную вязкость на данном этапе.
    3. Добавьте 250 мкл ингибиторов протеаз (ПОС) и один 10 мкл аликвоты леупептином. Тщательно перемешать.
    4. Место на льду и добавляют 10 мл холодного буфера TN и 22 мкл BME. Передача в пробирку 50 мл.
    5. Разрушать ультразвуком бактерии на льду с цифровым ультразвуковом равным амплитуде 30%. Пульс 2 с ВКЛ и ВЫКЛ 2 сек в течение 1 мин. Повторите ультразвуковую обработку в 3 раза, что позволяет образцы для охлаждения на льду в течение, по крайней мере 2 мин между шагами обработки ультразвуком.
      Примечание: При наличии нескольких культур, разрушать ультразвуком каждый из них в свою очередь , прежде чем повторять итерации обработки ультразвуком. Во время озвучивания, будьте осторожны, чтобы держать кончик Ультразвуком достаточно погруженной в бактериальном лизате, но не прикасаясь-ее стороны трубки, так как это будет генерировать избыточное тепло.
    6. Добавить равный объем (15 мл) холодной 4x SSC + 20 мкл BME + 50 мкл PIC + 1 аликвоты лейпептина и перемешать.
    7. В настольной центрифуге предварительно охлаждают до 4 & deg; С, центрифугировать лизатов при 2,300 мкг в течение 20 мин. Передача супернатант к свежей, предварительно охлажденный 50 мл пробирок (1 туба на большой культуры быть нацелен).
  2. Приготовьте G4-магнитные шарики.
    1. Принимать по 1 мл стрептавидин парамагнитного шарик (SPB) подвеска (на 1 л культуры) и передать его в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Гранул SPB с магнитом и моют 2 раза с 2 x SSC + 5 мМ ЭДТА, рН 8. ресуспендируют промытый SPB в 200 мкл того же раствора, используемого для мытья шариков.
    2. Добавьте одну 3 OD аликвоты G4-ДНК (Z33-Bio G4, полученного в разделе 1) к суспензии SPB и быстро перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Место труб на ротатор и вращать при комнатной температуре в течение не менее 30 мин (и до 60 мин).
    3. в кормовой частиэр этот период вращения, блокируют G4 переплете SPB путем добавления 1 мл 0,4% лактальбумина, и держать на льду до тех пор, пока это необходимо. Развести 0,4% лактальбумин от 4% лактальбумина запаса с использованием 1x Трис-глицин.
      Примечание: Шток 4% лактальбумина (вес / объем) сначала получают путем растворения в 2 М глицина , рН 7,5, с последующим добавлением 1x PIC и 0,05% азида натрия.
  3. Bind гистидин-меченый rG4R1 к гранулам кобальта (CB) (продолжение с шага 4.1).
    1. Добавляют 1 мл суспензии CB (эквивалент мл объема шарика 0,5) в каждую 50 мл пробирку, содержащую осветленный лизат бактерий. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре на ротатора.
      Примечание: 0,5 мл объема шарика используется на 1 л осветленного лизата; например, если два 500 бактериальных культур мл готовят, только добавить CB в пробирку 50 мл раствора , содержащего осветленный лизат из одной из культур в этот момент, в качестве лизата из второй культуры будут последовательно связаны с тем же 0,5 мл СВ в стер 4.3.3).
    2. Спин вниз CB при 110 х г в течение 5 мин в 4 & deg; С настольной центрифуге. Отсасывает жидкость осторожно, и оставить пару мл жидкости таким образом, чтобы не мешать Осажденный CB. Мытье с 10 - 15 мл холодного 4x SSC + BME (0,5 мкл BME / мл 4x SSC).
      Примечание: Для промываний, залить 10-15 мл непосредственно на осажденные кобальта бусинок вместо пипеткой, а пипеткой заставит гранулы застревают к внутренней стороне пипетку и белка будут потеряны.
    3. Гранул CB снова с помощью центрифугирования , а затем налить следующую осветленный лизат (30 мл, что составляет 2 - й большой индуцированную бактериальной культуры) на гранулированной CB. Инкубируют в течение еще 20 мин при комнатной температуре на ротатор и затем промыть в два раза с 10-15 мл 4-кратным SSC + BME. Гранула при 110 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    4. После второй промывки, аспирация жидкости и оставить около 2 мл бусин / жидкости в нижней части трубы. Передача связанной с белком CB в предварительно охлажденный 2-мл пробирку с помощьюс использованием 1 мл "широким отверстием" пипетку.
      Примечание: Используйте свежий лезвие , чтобы отрезать конец наконечника до передачи, как использование этого "широким отверстием" наконечником пипетки уменьшит потерю белка связанного кобальта бусин.
    5. Кратко центрифугировать бусин в трубке 2 мл на высокой скорости (~ 18,000 XG) в микроцентрифуге при 4 ° С (~ 5 - 10 лет это все, что необходимо для быстрой грануляции). Аккуратно снимите и выбросьте супернатант с помощью пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не потерять связанной с белком CB.
  4. Элюции rG4R1 из CB.
    1. Выдержите CB в 0,5 мл буфера для элюции гистидин (ВЭП) на ротатор в течение 5 мин в холодном помещении. Опять же, при добавлении СЭп, просто пипеткой 0,5 мл на шарики (для устранения потери CB) и ресуспендируют бусины путем переворачивания пробирки. Древнеевр составляет 0,7 М L-гистидин рН 6 (рН регулируют с использованием уксусной кислоты).
    2. Центрифуга при 18000 х г в 4 ° C микроцентрифуге в течение 1 мин. Передача супернатантв предварительно охлажденный 15 мл трубки. Осторожно удалите и перенесите содержащие белок супернатант путем тщательного пипеткой, оставляя небольшое количество жидкости в верхней части CB.
    3. Повторите шаги 4.4.1 и 4.4.2 в общей сложности 3 СЭп ELUTIONS.
    4. Элюции один раз 0,2 М ЭДТА, рН 6,0; цвет CB изменится от розового до белого, как ЭДТА способствует образованию хелатных комплексов кобальта.
    5. После этого четвертый и последний элюирования был переведен в 15 мл трубки, пипетки остаточный элюирующий буфер из CB с помощью кончика гель загрузки на конец 1 мл кончика пипетки; погрузив кончик в нижней части трубки, остаточный белок, содержащий буфер для элюирования может быть собрана.
  5. Свяжите rG4R1 к G4 переплете SPB и элюции рекомбинантный фермент АТФ-зависимым образом.
    1. Подготовка 5x Res буфер: 250 мМ Трис-ацетата рН 7,8, 250 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl 2, и 50% глицерина. Приготовьте 3x Res Буфер: 0,915 мл H 2 O, 2 мл 5x Res буфера, 0,33 мл 0,4% лактальбумина (дiluted от 4% лактальбумина с 1x Трис-глицин), 0,010 мл, 0,015 BME мл 1 М MgCl 2, 0,050 мл ПИК и 0,010 мл леупептина. Держите на льду.
      Примечание: Шток 4% лактальбумина (вес / объем) сначала получают путем растворения в 2 М глицина , рН 7,5, с последующим добавлением 1x PIC и 0,05% азида натрия.
    2. Гранула G4-SPB к стороне трубки с магнитом и отбросить супернатант (G4-Spb, а полученный на стадии 4.2). Добавить 1 мл 3x Res буфера к G4-SPB и пипетки перемешать.
    3. Пипетировать этот 1 мл G4-SPB суспендировали в буфере 3x Рез в трубку 15 мл, содержащей ~ 2 мл содержащего белок HEB / ЭДТА (элюата со стадии 4.4). Выдержите в течение 15 мин в водяной бане 37 ° с периодическом перемешивании, так что шарики не соглашайтесь.
    4. На льду, осадить протеин-связанный G4-Spb на стороне трубки с магнитом. Для того, чтобы помыть, добавить 1 мл 4-кратный SSC + 0,4% лактальбумина (+ 0,5 мкл / мл BME) и пипетки для ресуспендирования бисером. Пелле бусины с тон магнит на льду. Повторите эту стирку в общей сложности 2 стирок.
      Примечание: Терпение требуется во время процедуры промывки , чтобы гарантировать , что все магнитные шарики были осаждали между промывками. Это особенно верно, учитывая увеличение вязкости раствора из-за глицерина, содержащегося в буферах Res.
    5. Вымойте G4-SPB 1x 1 мл 3x Res буфера.
    6. Подготовка буфера для элюции (EB): 0,5 мл 3 - кратным Res буфера, 0,1 мл 0,1 М АТФ и 0,4 мл H 2 O.
    7. Предварительно теплой 1 мл ЭБ до 37 ° С в ПЦР пробирки, распределенных по нагревательному блоку амплификатор, установленной на 37 ° С.
    8. Гранула G4-SPB с магнитом на льду и ресуспендирования бусин в 100 мкл подогретого EB. Немедленно передать бусинки на предварительно нагретый ПЦР-пробирку и инкубируют в течение 30 с при 37 ° С.
    9. Оперативно добавить 12 мкл 5 М NaCl и пипеткой вверх и вниз энергично 20 - 30 раз. Сочетание высокой концентрации соли и АТФ, содержащийся в EBслужит для вымывания rG4R1 от G4 бусинок.
      Примечание: Очень важно , чтобы свести к минимуму количество пузырьков , образованных в процессе пипетирования, как пузырьки могут денатурации белка.
    10. Сразу осаждени G4-Spb с магнитом и передать содержащие белок элюата в свежую ПЦР-пробирку на льду (помеченный с датой).
    11. Повторите элюирование и передачи, описанные в шагах 4.5.8-4.5.10; конечный продукт этого процесса, таким образом, ~ 200 мкл ЕВ, содержащие очищенный rG4R1. Отложите два 7 мкл аликвоты (в ПЦР-пробирки, меченных соответствующую дату) для использования в анализе ферментативной активности контроля качества, которая проверит ли действительно был очищен очень активным rG4R1.
    12. Храните очищенный rG4R1 при -80 ° С до момента анализа активности.

5. Контроль качества ферментативной активности Анализ очищенного rG4R1

  1. Для каждого препарата rG4R1 быть проанализированы, готовят 300 мклиз resolvase буфера для анализа (RAB), где каждый из 30 мкл содержит от 0,2 пмоль TAMRA-меченого Z33 G4-ДНК (полученного на стадии 2); составе БОА следующим образом : 0,1 мл 3 - кратным Res Буфер, 0,01 мл 0,2 пмоль / мкл G4-Z33-ТАМ, 0,03 мл 0,1 М АТФ, и 0,16 мл H 2 O. В полосе 6 ПЦР пробирки, пипетки 40 мкл РБА в первую пробирку и 30 мкл РБА в оставшиеся пробирки (держать пробирки на лед в этот момент).
  2. Получить один из 7 мкл rG4R1 аликвоты (из стадии 4.5.11) и поместите его на льду. С р20 пипеткой установлен в 5 мкл, осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать rG4R1 в аликвоты и передачи 5 мкл на первой трубе полосы 6 PCR трубок (тот, который содержит 40 мкл RAB-регулирование). Затем установите пипеткой 10 мкл и последовательно передать 10 мкл на оставшиеся пробирки для ПЦР, содержащих РБА.
  3. Сразу инкубировать эту полосу ПЦР пробирки при 37 ° С в течение 30 мин в амплификатор, а затем C проведет 4 °.Открыть трубы в то время как их держат при температуре 4 ° С и добавляют по 2 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8 в каждую пробирку (для остановки ферментативной реакции).
  4. Налейте 10% акриламид / 1x КЭ / 10% глицерина геле. После удаления расческу, промойте лунки 1x КЭ. Добавьте 5 мкл большой массы, гидрофильных полисахаридных (30% Ficoll в H 2 O) в каждую пробирку и нагрузки 15 мкл из каждой пробирки (загрузка лунки снова можно наблюдать с помощью шлирен - линий).
    1. В качестве контроля для обеспечения мобильности G4-ДНК, добавьте 4 мкл высокой массы, гидрофильный полисахарид до 20 мкл RAB-регулирование, и нагрузка 15 мкл; в качестве контроля для размотанному мономерного Z33, тепла 20 мкл РБА при 98 ° С в течение 10 мин, добавляют 4 мкл высокой массы, гидрофильного полисахарида и нагрузки 15 мкл.
  5. Запустите гель при 120 V в течение 2 ч с 1x КЭ в качестве рабочего буфера. Изображение гель на мультимодальной формирования изображений с возможностью флуоресцентной визуализации с использованием Tamra конкретных фильтров (возбуждения с 532 нм зеленый лазер и использовать 580 нм полосовой фильтр 30 (580 BP 30)).
    Примечание: Очень активная подготовка rG4R1 даст полное разрешение TAMRA-меченого Z33 в первые 3 полосы , которые были загружены на геле, как показано на рисунке 2.

6. Аккумулирование высокоактивных rG4R1 Preps, аликвоты и хранение

Примечание: Этот шаг требует 2 -х человек. Число и ферментативные требования вниз по течению анализов, которые очищенный rG4R1 будут использоваться в определит, сколько препараты необходимы до аликвоты. Типичный большой препарат состоит из объединения 8 высоко активных препаратов (таким образом, используя в общей сложности 16 индуцированных 500 мл бактериальных культур), но это произвольное число и лабораторно-специфичны.

  1. Рассчитать общий объем высокоактивных, очищенный rG4R1, который должен быть аликвоты. Как правило, 7 мкл аликвоты используют в последующих анализах. Заполните блок термического CYCLэр установить до 4 ° С с полосой ПЦР-пробирки (именно эти аликвоты, как твердый характер блока ускорит быстрое закрытие полос ПЦР).
  2. Получить пробирки для ПЦР, содержащие высокоактивный rG4R1 от -80 ° С и быстро разморозить трубы в руке; когда небольшое количество льда остается в трубе, поместите пробирки на лед. Объединить все быстро-размороженных препаратов в prechilled, 15 мл трубки и хорошо перемешать, убедившись в том, чтобы свести к минимуму пузырьки.
  3. С помощью автоматической пипеткой, дозировать нужного объема аликвоты в предварительно охлажденные ПЦР полосковых трубок в термоциклеру. Как только 1 - 2 полосы завершены, есть второй человек, закройте крышки и передавать их на 96-луночных пластин, которые плавают в жидком азоте (замораживание вспышки необходимо сохранить ферментативную активность).
    Примечание: Не принимать больше , чем приблизительно 200 мкл rG4R1 в наконечнике автоматической пипетки в то время , чтобы сократить время , что фермент не в 4° С.
  4. После того, как полоса prechilled пробирки для ПЦР в термоциклеру были заполнены аликвоты и заморожен должным образом, быстро передавать более предварительно охлажденные ПЦР стрип трубки от льда к термоциклеру и продолжают аликвоты. Продолжайте таким образом, пока оставшаяся часть фермента не было аликвоты, флэш-замораживали в жидком азоте, и переносили в сухой лед. И, наконец, передача аликвот до -80 ° С в течение длительного хранения.

7. Количественное Очищенная rG4R1 Концентрация

  1. Налейте стандартный 5% штабелирования / 12% разрешающую акриламид / SDS гель для разделения белков.
  2. Оттепель 50 мкл аликвоты rG4R1, объединяются в одну трубку, и хорошо перемешать. Измерьте точный объем с пипеткой и добавляют равное количество 2х Laemmli образца буфера (65,8 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 26,3% (вес / об) глицерина, 2,1% SDS, и 0,02% бромфенола синего) + BME (50 мкл / 950 мкл буфера 2х Laemmli). Денатурации белка при 98 ° С в течение 10 мин.
  3. Примечание: Каждый стандартный белок , содержащийся в MW маркеров широкого радиуса действия присутствует в количестве от 0,1 мкг / мкл, белок 50 кДа, который присутствует в количестве от 0,3 мкг / мкл , за исключением. Эти маркеры не должны быть денатурированные нагреванием.
  4. Удалите гребенку из геля и промыть лунки со стандартным 1x SDS / глицин рабочего буфера. Нагрузка эквивалент 25 и 12,5 мкл rG4R1 (который 50 и 25 мкл денатурированного белка), хотя оптимальный объем фермента нагрузка должна быть определена пользователем, так как концентрация ферментных препаратов будет меняться (например, 35 мкл наносили на гель на рисунке 3). Загрузите стандарты белка, полученного на стадии 7.3. Убедитесь в том, что пипеток правильно откалиброваны, и убедитесь, чтобы быть столь же точным, как possibле с техникой пипетирования для обеспечения точной количественной оценки.
  5. Запустите гель при 120 V, пока фронт красителя не проходится около 2/3 геля (для обеспечения надлежащего разделения белков, которые составляют маркеры широкого диапазона MW).
  6. Удалить гель и утилизировать часть геля, который не будет содержать белок путем разрезания его прочь с лезвием бритвы. Поместите гель в стеклянной кастрюле или эквивалентной емкости. Пятно гель Кумасси краситель (50 мг кумасси R-250 в 100 мл 50:10:40 об / об метанол: уксусная кислота: H 2 O , который был отфильтрован через фильтр-бумажной воронки) O / N при комнатной температуре на орбитальный шейкер набора, чтобы обеспечить адекватное перемешивание геля.
  7. Де-окрашивает гель с 30:10:60 об / об метанол: уксусная кислота: H 2 O с использованием сжались-вверх, не ворсистой папиросной бумаги , чтобы ускорить Обесцвечивание. Изменение решения Обесцвечивание по мере необходимости. Продолжайте Обесцвечивание, пока фон не станет достаточно низкой, чтобы визуализировать rG4R1 и ​​белковые стандарты; типичный гель при этомэтап показан на рисунке 3.
  8. Поместите гель отмывали между протектором листа и сканирования геля при ≥300 точек на дюйм. Откройте отсканированное изображение в программе программного обеспечения для анализа изображений (например, Fuji Multiguage или эквивалент) и подготовить стандартные кривые из белковых стандартов, которые соответствуют 75, 100 и 150 кДа (кривые представляют собой грамотрицательные суммы в сравнении показаний денситометрических). Убедитесь в том, чтобы вычесть фон от каждой полосы быть количественно в процессе получения денситометрические значений.
  9. Если предположить, что количество объем rG4R1, который был загружен на гель содержит некоторое количество белка, который находится в пределах линейного диапазона этих стандартных кривых, количество грамм белка на микролитр rG4R1 нагруженного могут быть экстраполированы.
  10. Преобразование экстраполированы количество грамм rG4R1 в молярном количестве, используя молекулярную массу G4R1, что 120000 г / моль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого геля, три экстраполированные значения будутгенерируется (по одному для каждого из трех белковых маркеров, используемых для генерации стандартных кривых: 75, 100 и 150 кДа). Выполните еще два гелей и пятна и количественно их, повторяя шаги 7.1 - 7.10. С результатами количественной оценки для первого геля, пользователь сможет оценить, сколько rG4R1 должен быть загружен на дальнейших гелей с получением суммы, которая находится в пределах линейного диапазона стандартов белка. В общей сложности девять экстраполировать значения, представляющие концентрацию высокоактивного, очищенного rG4R1. Усреднить значения для получения конечного пакетное конкретной концентрации rG4R1, которая обычно находится в диапазоне 20-100 нМ. Вычислить стандартное отклонение от этих значений (n = 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол (рис 1) обычно дает почти чистый, каталитически активный rG4R1. В качестве меры ферментативной активности, то , как правило , наблюдается , что 50% от 0,2 пмоль TAMRA-меченого tetramolecular G4-ДНК превращается в мономеры в пределах 0,2 - диапазоне 0,013 мкл rG4R1, анализируемый с помощью анализа G4 активности , описанной выше (рис 2). Окрашивание кумасси очищенного rG4R1 указывает на одну полосу при ожидаемой 120 размер кД, с незначительной загрязняющего полосы при ~ 75 кДа, который может представлять собой усеченный rG4R1, который сохраняет свою способность связывать бусинки G4-ДНК и для элюирования в АТФ-зависимый Способ (рисунок 3). Соответствующую полосу количественно по стандартной кривой белка, и этот протокол, как правило, получает 200 мкл 20-100 нМ очищенного фермента на 1 л культуры бактерий.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема двухступенчатого Очистка G4R1. 6xHis-меченый rG4R1 является насыпной очищенный из E.coli лизатов сначала связывания и элюирование от Co 2+ -conjugated бусинки. Шаг к G4-ДНК-сопряженных магнитных шариков связывания следующим образом. И, наконец, АТФ-зависимой Стадию элюирования необходимо получить относительно чистый и ферментативно активный rG4R1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Качество-контроль G4-ДНК разматывать анализа. Дорожки 1 - 6: постоянная концентрация TAMRA-меченого tetramolecular G4-ДНК инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин в присутствии 4x серийных разведений очищенного rG4R1, представляющего 3,9 мкл, 0,83 мкл, 0,2 мкл, 0,05 мкл, 0,013 мкл и 0 0,003 мкл, соответственно. Дорожка 7: tetramolecular G4-ДНК в отсутствие rG4R1. Дорожка 8: tetramolecular G4-ДНК вареной уменьшить структуру G4 на мономеры при отсутствии rG4R1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Количественное Очищенная rG4R1 концентрации. Широкий диапазон MW-белковые маркеры были загружены в следующих количествах: 500, 250, 125, 62,5, 31,3, и 15,7 нг на дорожках 1 - 6, соответственно, и были использованы для получения стандартной кривой концентрации белка. Дорожка 7 представляет собой 35 мкл rG4R1. Этот конкретный гель определяли количественно, как часть набора трех экземплярах гелей, в результате чего в среднем концентрации белка 62 ± 22 нм стандартное отклонение (SD, N = 9)..com / файлы / ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол представляет собой высокоэффективную экспрессии, очистки и схему количественного определения для выделения продукта гена DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36) (рисунок 1). Этот протокол использует две стадии очистки: His-Tag аффинной очистки на кобальтовых сродства бусин и ферментативную очистку на G4-ДНК-конъюгированного бусин. Последний шаг уникален тем, что он использует плотный сродства, высокой специфичности и каталитической активности, разматывания rG4R1 имеет для G4 структур. Тесная близость к G4 структур (K d в диапазоне низких пМ) позволяет высококонцентрированный солевой промывной раствор (вблизи предела растворимости NaCl) до вымывания из G4 шариков, что значительно сокращает присутствие неспецифических белков. Каталитическая активность G4R1 на G4 структур позволяет для конкретного элюирования активного rG4R1 при добавлении АТФ и MgCl 2. Эта двухступенчатая схема очистки последовательно производит высокочистый, Каталитически активный rG4R1 13 в количествах , пригодных для большинства биохимических анализов.

Несколько ключевых шагов обеспечит хороший выход с высокой степенью чистоты, каталитически активного rG4R1. Первый заключается в обеспечении надлежащих условий индукции Его-rG4R1 в бактериальной экспрессии штамма. Мы обнаружили , что лучший выход рекомбинантного белка происходит , когда клетки выращивают до OD 600 не более 0,4-0,6 непосредственно перед индукцией. Выращиванием клеток за пределами этой точки может привести к общей потере белка восстановления, возможно, вследствие включения rG4R1 в тельцах включения. Во-вторых, мы получили более высокую концентрацию очищенного белка с помощью "серийно необязательных" лизатов сходству кобальта бусинок. Например, мы связаны лизат от 0,5 л индуцированных культур к кобальтовых аффинности бусинок, а затем выполняется второе связывание другого лизата с еще 0,5 л культуры к тем же самым сродства кобальта бусинок. Эташаг обеспечивает более концентрированный препарат белка путем увеличения числа молекул rG4R1, связанных с данным объемом гранул, таким образом, используя полную мощность сродства кобальта бусинок. В-третьих, высокая мыть соль после связывания сродства кобальта ELUTIONS к G4 бусин гарантирует, что почти все неспецифическое связывание белка с шариков удаляется. В- четвертых, элюирование шаг АТФ / MgCl 2 позволяет rG4R1 привязывается к G4 бусин для каталитического разматывать tetramolecular структуру в отдельные пряди, вызывая rG4R1 быть выпущенным из бисера. Мы не можем полностью исключить возможность того, что АТФ элюирует rG4R1 в конкурентоспособный, а не каталитическим способом; Тем не менее, это менее вероятно, будет случай, так как уже ранее показали , что негидролизуемый АТФ аналогом является не достаточным для конкурентного связывания 13, 18. Близость rG4R1 для смотанной, одноцепочечной ДНК на порядок меньше, чем тон начинает tetramolecular G4-ДНК, и, таким образом, не должны rG4R1 повторную привязку к шарикам. Для того чтобы уменьшить эту возможность, однако, этот шаг должен быть сделан при 37 ° C, и объем элюции должен быть отделен от бусинок как можно быстрее. Стадию элюирования повторяют дважды, чтобы обеспечить максимальное восстановление. Если ниже по течению приложения требуют белок, чтобы быть свободным от примесей ДНК, мы рекомендуем дополнительную стадию очистки, в котором очищенный препарат повторно связанный с стрептавидином бусин, чтобы удалить любые биотинилированных ДНК, если он присутствует.

Мы обнаружили, что rG4R1 подвержен разложению, если надлежащие условия не поддерживается на протяжении протокола. Для того, чтобы сохранить целостность и активность фермента, мы используем следующие важнейшие гарантии. Ингибиторы протеаз сохраняются в ходе процедуры очистки. Протокол проводят при температуре 4 ° С, если не указано иное. Белок очищают в присутствии Лос-Анджелесеctalbumin и β-меркаптоэтанола. Протокол выполняется своевременно (в течение 1 дня для очистки). Кроме того, мы обнаружили, что многократные циклы замораживания-оттаивания отрицательно влияют на активность белка, таким образом, мы аликвоту белка в "одноразового использования", 7 мкл аликвоты После очистки и хранить их при температуре -80 ° C.

Хотя присутствие лактальбумина в препарате необходима для поддержания целостности и активности белка, как уже упоминалось выше, мы обнаружили, что это может также препятствовать вниз по течению приложений. Другие потенциальные мешающие молекулы, которые присутствуют в Очищенный препарат rG4R1 включают АТФ, бета-меркаптоэтанола, и выделил одноцепочечной ДНК. Например, мы обнаружили, этот белковый препарат несовместим с анализом BIACORE из-за высокого фонового сигнала из компонентов буфера. Кроме того, наличие лактальбумина в белковом препарате не позволяет использовать стандартный Bradfordи BCA белка Количественный анализ пробы. Тем не менее, мы разработали альтернативный гель на основе Количественный способ обойти это ограничение.

Эта процедура очистки, которая использует ферментативную активность G4R1 как средство специально очистить его, делает этот метод, отличный от других методов. Например, другие группы выразили ФЛАГ-меченый rG4R1 в клетках человека 15, 25 или GST-меченый rG4R1 в клетках насекомых 26 и очищали ее с помощью FLAG- или GST-аффинной хроматографии, соответственно. Эти методы имеют то преимущество, что делается в эукариотической системе экспрессии по сравнению с бактериальной экспрессионной системы. Были найдены Оценочные K D значения полученного очищенного GST-G4R1 для G4 структур быть на порядок выше , чем 14 наших сообщили K d значения 12, 13. Мы объясняем Тхиs расхождение в значениях K D различий , связанных с громоздким GST-таг по сравнению с 6xHis-таг, различия в чистотами , полученных из этих двух схем очистки, а также различия в степени и типа пост-трансляционных модификаций , приобретенных в бактериальной по сравнению с насекомое система экспрессии. Наш подход имеет явное преимущество перед вышеупомянутыми альтернатив, так как очистка этого белка непосредственно зависит от его ферментативной активности. Таким образом, мы в первую очередь получить фермент, который был сложен и модифицированный таким образом, чтобы сохранить свои ферментативные свойства. Другие аффинно тегов и / или гельпроникающей методы не могут отделить активный фермент из ферментативно мертвого фермента. Было бы полезно для будущего развития протокола , чтобы объединить сильные стороны протоколов очистки других групп 15, 25, 26 (т.е. человек или насекомое клеток экспрессСистема ионной) с силой нашего протокола (т.е. на основе каталитического очистки) с целью дальнейшего улучшения по этому методу.

Хотя этот протокол в настоящее время специфична для G4R1, она легко может быть адаптирована к любым АТФ-зависимый, G4-разрешения белков, в том числе, но не ограничиваясь этим, BLM, WRN, FANCJ, hnRNP белков, hPif1 и / или ChlR1 / DDX1. Изменяя последовательность нуклеиновой кислоты, связанной с стрептавидином бусин, этот протокол может быть адаптирован для очистки других АТФ-зависимых ферментов нуклеиновых кислот, для которых продукт ферментативной реакции больше не является субстратом для фермента, в том числе геликаз нуклеиновых кислот и нуклеазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить наших источников финансирования, в том числе щедрый подарок от Ware Foundation (до JPV), Национальные институты HealthGrant T32-CA079448 (к PJS), а также средства запуска Ball State University (к PJS). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl, pH 8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or from standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH 8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or from standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90, (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25, (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33, (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33, (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44, (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44, (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35, (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34, (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39, (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280, (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40, (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283, (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39, (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39, (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31, (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10, (7), e0132668 (2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42, (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40, (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13, (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10, (3), e1004012 (2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119, (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34, (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (34), 15181-15186 (2010).
  24. BD Biosciences. Available from: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf (2016).
  25. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  26. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38, (18), 6219-6233 (2010).
G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).More

Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter