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Neuroscience

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55497
* These authors contributed equally

Abstract

Ao longo da última década, os channelrhodopsins tornaram-se indispensáveis ​​na pesquisa neurocientífica onde eles são usados ​​como ferramentas para manipular não-invasivamente processos elétricos em células-alvo. Neste contexto, a selectividade iónica de uma canalrhodopsina é de particular importância. Este artigo descreve a investigação da seletividade de cloretos para uma canalrhodopsina de Proteomonas sulcata, condutora de aniões, recentemente identificada, por meio de gravações electrofisiológicas em células HEK293. O procedimento experimental para a medição de fotocorrentes de luz-gated exige uma fonte de luz rápida comutável - idealmente monocromática - acoplada ao microscópio de uma instalação de patch-clamp, de outra forma convencional. Os procedimentos preparativos antes da experiência são descritos envolvendo a preparação de soluções tamponadas, considerações sobre potenciais de junção de líquidos, semeadura e transfecção de células e puxar de pipetas de remendo. A gravação real da relação tensão-correnteS para determinar os potenciais de reversão para diferentes concentrações de cloreto ocorre 24 h a 48 h após a transfecção. Finalmente, os dados eletrofisiológicos são analisados ​​com respeito a considerações teóricas de condução de cloreto.

Introduction

Channelrhodopsins (ChR) são luz-gated canais iônicos que ocorrem na mancha do olho de algas verdes motile, e servem como fotossensores primários para phototaxis e respostas fóbicas [ 1] . Desde sua primeira descrição em 2002 2 , os CHRs abriram o caminho para o campo emergente da optogenética e podem ser aplicados em uma variedade de células excitáveis, por exemplo, dentro dos músculos esqueléticos, do coração ou do cérebro 3 , 4 , 5 . A expressão de ChRs em células alvo resulta na permeabilidade iónica controlável pela luz da respectiva célula. Num contexto neuronal, isto permite a activação 6 , 7 , 8 ou inibição 9 , 10 de potencial de acção (AP) disparando - dependendo do ião conduzido - com o espaço e temporalPrecisão da luz enfatizando como a seletividade iónica de uma variante ChR determina sua aplicação optogenética.

Os primeiros ChRs descobertos de Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri são permeáveis ​​aos prótons, mas também aos catiões monovalentes como o sódio, o potássio e, em menor grau, os catiões divalentes como o cálcio eo magnésio 11 , 12 , 13 . Actualmente, mais do que 70 canais de canal condutores naturais (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e várias variantes de engenharia 18 , 19 , 20 com propriedades diferentes tais como Tamanho da fotocorriente, sensibilidade espectral, cinética e selectividade catiónica. Considerando que em neurociência, CCRs aRe usado para ativar as células e disparar APs, bombas microbianas conduzidas pela luz foram os únicos antagonistas disponíveis para silenciar neurônios por anos. Em 2014, dois grupos demonstraram simultaneamente que os CCRs podem ser convertidos em canalrhodopsins condutores de aniões (ACRs) por alteração da polaridade ao longo do suposto poro de condução iónica através da engenharia molecular 9 , 21 . Subseqüentemente, os ACRs naturais foram identificados em várias algas criptofitas 22 , 23 , 24 . Mais importante ainda, a ativação de luz de ACRs medeia as correntes de cloreto em neurônios adultos permitindo a inibição da atividade neuronal em intensidades de luz muito menores do que as bombas microbianas que apenas transportam cargas únicas por fóton absorvido.

A actividade de ChR pode ser direccionada directamente por gravações electrofisiológicas de "patch-clamp" de correntes induzidas pela luz em células HEK293. O grampo de fixaçãoTécnica foi originalmente desenvolvida no final da década de 1970 25 e melhorada por Hamill et al. , Permitindo a gravação da entidade de correntes de uma célula pequena (modo célula inteira) com alta resolução de corrente e controle direto da tensão da membrana 26 . Aplicada em cultura de células, esta técnica proporciona um controlo preciso das condições de gravação iónicas e eléctricas e permite estudar a selectividade dos iões juntamente com a contribuição relativa dos iões para a corrente total. Aqui, exemplificamos o exame da seletividade iónica para a canalrhodopsina condutora de ânions de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 através do registro das relações tensão-corrente em várias concentrações de cloreto extracelular para provar alta condutância ao cloreto.

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Protocol

figura 1
Figura 1: Configuração do Patch-clamp. (1) fonte de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programável, (4) digitalizador, (5) obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusão, (8) computador pessoal, , (10) gaiola faraday, (11) fase de microscópio, (12) entrada de perfusão, (13) saída de perfusão, (14) câmara de gravação, (15) (22) Microscópio invertido, (21) Microscópio lâmpada, (22) Lâmpada de microscópio fonte de alimentação, (23) água-cheio U-tubo, (24) de três vias Válvula, (25) tabela anti-vibração, (26) câmera CCD. ( A ) Fotografias e ( B ) representação esquemática da configuração. Clique aqui para ver uma versão maior do tSua figura.

1. Configuração antes das gravações

Intra. Extra.1 Extra.2
Cloreto alto Cloreto alto Baixo teor de cloreto
C [mM] C [mM] C [mM]
Na-ASP 0 0 140
NaCl 110 140 0
KCl 1 1 1
CsCl 1 1 1
CaCl2 2 2 2
MgCl2 2 2 2
HEPES 10 10 10
EGTA 10 0 0
PH 7,2 7,2 7,2
Osmolaridade 290 mOsm 320 mOsm 320 mOsm

Tabela 1: Composição Iónica das Soluções Tamponadas. Composição de tampões intracelulares (intra) e extracelulares (extra) para experiências de selectividade de cloreto em células HEK. Abreviaturas utilizadas: ácido etileno glicol tetraacético (EGTA), ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) e aspartato (ASP). Todas as concentrações estão em mM.

  1. Preparar as soluções de gravação com concentrações iónicas como indicado na Tabela 1.
    1. Preparar 15 mL de soluções mãe 2 M em água ultrapura para MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
    2. Pesar os componentes sólidos para 100 mL do intracelular e500 mL das solu�es tamponadas extracelulares de acordo com a tabela 1 em taças separadas e adiciona-se a quantidade respectiva das solu�es de reserva preparadas depois. Por exemplo, para o tampão intracelular, utilizar 0,3803 g (10 mM) de EGTA, 0,2383 g (10 mM) de HEPES e 0,6428 g (110 mM) de NaCl e adicionar 100 μL de 2 M MgCl2 e CaCl2 e 50 μL do Soluções mãe KCl 2 M e CsCl.
    3. Adicionar água ultrapura e ajustar cuidadosamente o pH utilizando ácidos e bases, que não interferem com a medição, ou seja , não são conduzidos pelo ChR, como ácido cítrico e N-metil-D-glucamina (NMG + ).
    4. Ajustar a osmolaridade para 290 mOsm para o intracelular e 320 mOsm para as soluções extracelulares com glicose.
      Nota: As soluções intracelulares ligeiramente hipoosmóticas aumentam a taxa de sucesso da aplicação de patches 26 .
    5. Estéril filtra todas as soluções através de filtros de 0,22 μm. Armazenar as soluções a 4 ° C por duas semanasS ou congelar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
  2. Calcule os potenciais de junção de líquidos e prepare protocolos de gravação.
    NOTA: A alteração da concentração de cloreto extracelular após o estabelecimento da configuração de células inteiras causa um potencial de junção de líquidos significativo (LJP) que tem de ser corrigido 27 , 28 . Os LJPs podem ser diretamente medidos ou calculados, aqui a última opção é usada. Neste protocolo, a correção on-line será usada exigindo um protocolo de gravação para cada buffer externo. No entanto, para um conjunto maior de soluções externas é recomendada uma correção pós-LJP para evitar falsas correções.
    1. Abra a calculadora de junção potencial (JPC) 27 e abra o diálogo 'New Experiment'. Em seguida, selecione "Medições de grampo-patch". Selecione "Medições de célula inteira", "Eletrodo de solução de sal padrão" e insira uma temperatura de25 ° C. Entre cada passo, vá para a frente, aceitando a seleção pressionando o botão "próximo".
      NOTA: As experiências são realizadas a uma temperatura ambiente de 25 ° C num laboratório com ar condicionado. Certifique-se de que as soluções tampão têm temperatura ambiente antes de iniciar as experiências. Para variar a temperatura da amostra pode utilizar-se uma fase ou câmara de incubação. A temperatura do banho pode ser medida com freqüência com um termômetro.
    2. Adicionar todas as concentrações individuais de aniões e catiões da solução pipetada eo tampão de cloreto alto de acordo com as concentrações listadas na Tabela 1 .
      NOTA: O JPC calculará um LJP de -0,5 mV para as condições de partida.
    3. Clique em "New Bath Solution" para introduzir a composição aniónica e catiónica do tampão de baixo teor de cloreto.
      NOTA: O JPC calcula agora um novo LJP de +12,6 mV de acordo com a solução de gravação extracelular alterada.
    4. Prepare dois protocolos corrigidos por LJP paraDuas condições de medição subtraindo o LJP calculado do potencial de retenção aplicado; -0,5 mV para o alto e +12,6 mV para as soluções de baixo teor de cloretos. Assim, os protocolos começam com -79,5 mV (cloreto alto) e -92,6 mV (baixo cloreto), respectivamente, para obter um potencial de retenção inicial corrigido de LJP de -80 mV em ambos os casos.
      NOTA: As etapas a seguir se aplicam ao software de aquisição de dados mencionado na lista de materiais.
    5. Abra o editor de protocolo no software de aquisição. Mude para o menu "Modo" selecione "Estimulação episódica" e incluir 7 varreduras.
    6. Mude para o menu "Waveform" no editor e inclua um período de 200 ms com potencial de retenção de 0 mV seguido de um período de 2 s com potencial de retenção variável começando em -79,5 mV para cloreto de alta. Inclua um "nível Delta" de 20 mV para o segundo período para aumentar o potencial de retenção em 20 mV em cada varredura.
    7. Dentro dos passos de tensão da forma de onda edOu aplicar um período de iluminação de 500 ms com luz de 540 nm (3,10 mW / mm²). Para fazer isso, altere o "padrão de bits digital" do obturador conectado que controla a fonte de luz a ser ativada 500 ms após o segundo período descrito acima (veja 1.2.6).
      NOTA: A intensidade da luz pode influenciar propriedades biofísicas de correntes de canal como amplitude ou inativação. Portanto, as densidades de potência de luz devem ser sempre relatadas. Para medir a potência da luz após passar por todas as ópticas e a lamela, use um optometro calibrado. Para calcular a densidade de potência, determine o campo iluminado do objetivo por um micrômetro de objeto e divida a potência de luz medida pelo campo iluminado determinado.
    8. Salve o protocolo para a solução extracelular de cloreto alto. Modifique o protocolo e substitua o potencial de retenção do primeiro nível por -92,6 mV (cloreto externo baixo). Salve este segundo protocolo para medir a baixa condição extracelular de cloreto.
    9. Revestimento de lisina de cobertura de vidro conforme protocolo adaptado 29 .
      1. Coloque várias 100 tampas em uma placa de Petri de vidro e adicione 250 mL de HCl (1 N).
      2. Colocar a placa de Petri com as tampas em um agitador linear e agitar a 120 rpm por 72 h para limpar as tampas e depois enxaguar com água ultrapura para neutralizar o pH.
      3. Mergulhe estes em um pequeno volume de 95% de etanol para limpeza adicional.
        NOTA: As tampas de cobertura limpas podem ser armazenadas em etanol a 70% antes de prosseguir. Trabalhe sob capa de fluxo laminar para os seguintes passos.
      4. Usando um queimador Bunsen e pinças, chama cada escorregar e transferi-lo para uma nova placa de Petri.
      5. Incubar os tampões de vidro com uma solução estéril de poli-D-lisina 50 μg / mL durante pelo menos 1 h (ou durante a noite) à temperatura ambiente enquanto se agita com um agitador linear a 150 rpm.
      6. Lave as tampas com água ultrapura para remover o excesso de poli-D-lisina.
      7. Espalhe as tampas em papel estéril para secar durante 10 min e exponha-as à luz UV para esterilização (pelo menos 20 minutos).
      8. Recolher as tampas em uma placa de Petri estéril coberto em folha de alumínio até o uso.
    10. Preparar DNA do gene Ps ACR1 fundido a mCherry usando técnicas de biologia molecular padrão.
      1. Clonar a sequência do gene otimizado por codão humano que codifica Ps ACR1 num plasmídeo peGFP-C1 (promotor de CMV, resistência à kanamicina) em enquadramento com o fluoróforo mCherry utilizando enzimas de restrição ou outros métodos de clonagem estabelecidos.
        Nota: Outros fluoróforos podem ser usados ​​também, mas certifique-se de ter os correspondentes conjuntos de filtros disponíveis para observar sua fluorescência sob o microscópio na configuração.
      2. Transformar o ADN plasmídico em células de E. coli XL1Blue quimocompetentes através de choque térmico de acordo com o protocolo padrão e plaqueá-las em placas de ágar (30 μg / mL de canamicina) 30
      3. No dia seguinte, inocular 4 mL de meio de caldo de lisogénese suplementado com 30 μg / mL de canamicina com células de colónias individuais e incubar durante a noite a 37 ° C e 180 rpm numa incubadora.
      4. Após incubação durante a noite, purificar o ADN plasmídico a partir das culturas utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    11. Semear as células
      NOTA: Execute as etapas sob uma capa de fluxo laminar.
      1. Coloque até três revestimentos de vidro revestidos com lisina lado a lado em uma placa de Petri de 35 mm.
        NOTA: Pressione suavemente contra a parte inferior do prato para evitar que deslize uns nos outros.
      2. Semear 1,5 x IO5 células HEK em 2 mL de meio de Eagle Modificado Dulbecco padrão (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) em cada prato.
      3. Suplementar todos os trans- retinal emUma concentração final de 1 μM. Cultivar as células durante pelo menos um dia antes de prosseguir com o passo 1.6.
    12. Transfecção transitória das células via lipofecção [ 31] .
      1. Para cada placa de células, preparar uma solução de 2 μg de ADN plasmídico ( tal como preparado no passo 1.4) em 250 μL de DMEM sem FBS e 6 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais ).
      2. Após 15 min de incubação, adiciona-se suavemente (gota a gota) a solução às células.
    13. Preparar pontes de ágar
      1. Adicionar 0,75 g de agarose a 50 ml de solução de cloreto de sódio estéril (140 mM) e dissolvê-la por aquecimento num micro-ondas.
        NOTA: O KCl 2 - 3 M para a preparação da ponte de ágar reduz ainda mais a LJP devido à concentração mais elevada ( por exemplo, difusão constante a partir da ponte) e mobilidade igual dos iões K + e Cl - , mas foi evitada para minimizar o vazamento iónico Em t Solução de banho 32 .
      2. Encha 10 μL de pontas de pipeta (ou uma mangueira de pequeno diâmetro) com a solução de agarose líquida usando uma seringa.
        NOTA: Evite bolhas de ar na ponte.
      3. Depois de as pontes de ágar terem sido arrefecidas e solidificadas, armazená-las em solução estéril de cloreto de sódio 140 mM.
    14. Prepare os eletrodos de gravação e banho.
      1. Remova fios de prata do banho e eletrodo de gravação da configuração de patch-clamp.
      2. Polir os fios com lixa para remover cloreto de prata de experiências anteriores. Mergulhe o fio de prata limpo em KCl 3 M e ligue-o ao pólo positivo de uma bateria de 1,5 V para revestimento electrolítico com cloreto de prata.
        NOTA: Uma fonte de alimentação do laboratório pode ser usada em vez de uma bateria.
    15. Puxe as pipetas de patch de baixa resistência (1,5-3,0 MΩ) dos capilares de vidro com um extrator de micropipeta e polonês de fogo conforme descrito por Brown et alLass = "xref"> 33. Armazene pipetas sem poeira para o dia da medição.
    16. Ligue todos os componentes de configuração para aquecer até a temperatura de trabalho 30 minutos antes gravações. Certifique-se de que os tampões estejam à temperatura ambiente.

    2. Medições de seletividade

    1. Iniciar as gravações 24 a 48 h após transfecção transitória das células descritas em 1.6.
    2. Coloque uma tampa deslizante na câmara de medição e feche-a com silicone para evitar vazamento do tampão externo. Armazenar a placa de Petri com a outra tampa desliza em uma incubadora para o próximo conjunto de experiências.
    3. Cuidadosamente preencher a câmara com tampão extracelular (alta [Cl - ]) para evitar a separação das células, em seguida, colocá-lo sob o microscópio e usar o objetivo 40X para a visualização celular.
    4. Coloque uma ponte de ágar sobre o eletrodo de banho e coloque-o na câmara, juntamente com o sensor de nível de fluido ea saída de perfusão do manipulador do banho.
    5. Troque o exTracelular duas vezes com 1 mL de solução externa fresca (alta [Cl - ]) para remover o meio de cultura residual e as células desprendidas.
    6. Coloque as células em foco e procure por uma célula transfectada (fluorescente), que precisa ser isolada de outras células. Use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja (590 nm, largura de banda 15 nm, 100% de intensidade) para excitar e visualizar mCherry.
      NOTA: As células HEK podem ser acopladas electricamente aos seus vizinhos por junções de intervalo 34 resultando em baixa resistência à membrana na configuração de células inteiras.
    7. Encha uma das pipetas com solução intracelular e remova as bolhas de ar, movendo a pipeta várias vezes.
    8. Monte a pipeta no suporte da pipeta e aplique alguma pressão positiva para impedir o entupimento da ponta.
    9. Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue perto da célula usando o micromanipulador.
      NOTA: As etapas a seguir se aplicam ao aMplifier, aquisição de dados e software de avaliação mencionados na lista de materiais.
    10. Iniciar o "teste de membrana" no software de aquisição de dados e aplicar um passo de tensão ( por exemplo, 5 mV por 10 ms, linha de base a 0 mV), manual ou automaticamente através do software especificado usando "modo de banho" No software de aquisição de dados.
    11. Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada (1,5-3,0 MΩ).
    12. Correntes de desvio zero ajustando o potencial da pipeta rodando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador enquanto trabalha no "modo de banho" do "teste de membrana".
    13. Estabeleça um patch na configuração de células inteiras 26 .
      NOTA: As etapas a seguir requerem a aplicação de pressão positiva e negativa entregue na porta lateral do suporte de pipeta usado. Isto pode ser feito usando uma seringa, através de uma boca ou um eletronicamente conRegulador de pressão controlado. Neste protocolo, a pressão positiva e negativa é aplicada através de uma peça bucal.
      1. Lentamente aproximar a célula com a pipeta patch a partir do topo e aliviar a pressão positiva direita antes de tocá-lo.
        NOTA: Quando a ponta está perto da célula, a resistência aumentará ligeiramente; Isto é indicado por um tamanho reduzido do impulso de teste.
      2. Mude o "teste de membrana" de "modo de banho" para "modo de remendo", assim, o potencial de retenção para o potencial de repouso esperado das células (-30 a -40 mV).
      3. Em alguns casos, a configuração ligada às células forma-se após a libertação da pressão positiva (2.13.1), se não, aplicar suavemente pressão negativa para auxiliar a formação de gigase.
        NOTA: A configuração ligada à célula é estabelecida quando o impulso de teste é reduzido a dois pequenos picos capacitivos no início e fim do impulso ea resistência da membrana está na gama GΩ; Tensões negativas até -60 mV mPode facilitar a formação de gigase.
      4. Compensar a capacitância da pipeta girando os botões de "compensação da capacitância da pipeta" para obter uma resposta plana do pulso de teste.
      5. Rupture o remendo sem destruir o selo aplicando pulsos curtos da pressão negativa ou da pressão negativa com força crescente, para obter a conformação da pilha inteira.
        NOTA: A transição bem sucedida da configuração célula-anexada para célula inteira é indicada por um aumento dos picos capacitivos.
      6. Aplique compensação de resistência em série ajustando parâmetros de célula inteira e ajustes de compensação do amplificador usado para aperto preciso do potencial de membrana para a tensão de retenção desejada.
        1. Alternar o "teste de membrana" para "célula inteira" modo, no painel "Compensação de resistência série" ativar "previsão" e "correção" até 90% evitando overshots e oscilação da resposta capacitiva, transformar a célula inteiraA compensação liga e ajusta os parâmetros de célula inteira com os botões apropriados do painel frontal ("capacidade de célula inteira" e "resistência em série") do amplificador de uma maneira iterativa para obter uma resposta de vedação de teste idealmente plana.
          NOTA: Para uma descrição detalhada da compensação e correção da resistência da série, consulte o manual ou diretriz do amplificador, pois este procedimento varia entre diferentes fabricantes.
      7. Depois de estabelecer a configuração de células inteiras, aguarde pelo menos 2 minutos antes da gravação para assegurar a substituição suficiente da solução intracelular através da pipeta de remendo 35 .
    14. Registre as correntes induzidas pela luz em diferentes potenciais de retenção usando os protocolos que foram configurados anteriormente (em 1.2).
    15. Troque o tampão extracelular para baixo [Cl - ] na câmara pelo menos cinco vezes sem destruir o remendo e registrar outra relação tensão-corrente ( ver etapa 1.2) em tNova concentração de cloreto.
      NOTA: Um sistema de perfusão para troca automática de tampão facilita este processo, mas não é necessário.
    16. Repita 2.15. Para cada condição iónica a ser testada, mas verifica repetidamente a qualidade do adesivo entre as medições por um "teste de membrana" descrito acima.
      NOTA: Para garantir tensão de membrana precisa e composição de íons intracelular estável, a resistência da membrana deve ser acima de 500 MΩ, enquanto a resistência de acesso não deve ultrapassar 10 MΩ, veja . 2.12.6). Não se esqueça de desligar a compensação do parâmetro da célula inteira para o teste de membrana.
    17. Repetir 2.2. A 2,15. Para várias células, mas tomar uma nova capa para cada série de teste para garantir a salubridade das células.

    3. Avaliação de dados

    1. Ajuste a linha de base de cada traço corrente subtraindo a corrente média antes da iluminação.
    2. Calcular a fotocorrente estacionária média I s ( NOTA: Analise as fotocorrentes de pico ou varie o comprimento da média para determinar a fotocorrente estacionária dependendo do protocolo ou questão científica.
    3. Repita os passos 3.1) e 3.2) para todas as condições testadas e células diferentes.
    4. Trace as fotocorrentes determinadas em relação ao respectivo potencial de retenção.
      NOTA: Se medições múltiplas são médias, gravações individuais podem ser normalizadas para uma condição especificada ou a capacitância da célula.
    5. A intersecção da relação tensão-corrente com o eixo de tensão representa o potencial de reversão (corrente líquida é zero). Determine-o por interpolação linear entre os dois pontos de dados vizinhos.
      NOTA: Se não houver inversão de polaridade das fotocorrentes, extrapole linearmente a partir dos dois últimos pontos próximos de zero para obter uma aproximação do ponto de intersecção.
    6. Média do r determinadoPara as mesmas condições e traçá-las em relação à concentração de cloreto das soluções tampão externas ( ver Figura 2B ).

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Representative Results

A Figura 2 mostra resultados representativos obtidos a partir de medições seguindo o protocolo descrito. Durante a iluminação com luz verde, Ps ACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária. Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos ( Figura 2A ). A troca da concentração de cloreto extracelular provoca um deslocamento do potencial de inversão que pode ser visto directamente nos traços de fotocorrente adquiridos. A avaliação dos potenciais de reversão a partir de múltiplas medições quantifica a mudança de potencial de reversão dramática causada pela variação da concentração de cloreto externo ( Figura 2B ). Surpreendentemente, os potenciais de reversão medidos correspondem directamente a potenciais de Nernst calculados para cloreto ( Figura 2C ) confirmando a elevada selectividade de cloreto de Ps ACR1.

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Figura 2: Selectividade de cloreto de Ps ACR1 . ( A ) Traços actuais representativos de Ps ACR1 em células HEK293. A concentração de cloreto intracelular foi mantida a 120 mM, enquanto que a concentração extracelular variou de 150 mM (verde) a 10 mM (púrpura) cloreto por substituição parcial de NaCl com Na-aspartato. O potencial de retenção aumentou em passos de 20 mV de -80 mV para +40 mV (corrigido LJP). ( B ) Relações tensão-tensão médias (n = 6 correspondentes às condições em A). ( C ) Potenciais de reversão (as linhas centrais indicam medianas, os limites de caixa indicam os percentis 25 e 75, os bigodes estendem 2 vezes o desvio padrão e os círculos indicam pontos de dados únicos) extraídos das relações tensão-corrente. Para o cloreto de alta(Verde), o valor foi interpolado linearmente entre -20 mV e 0 mV de potencial de retenção, enquanto que o valor foi extrapolado linearmente acima de +40 mV (roxo, tracejado, painel B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A determinação de potenciais de reversão em condições iónicas e elétricas definidas fornece informações sobre a espécie de íons transportada após a ativação leve de ChRs. Se exclusivamente uma espécie de iões é variada num meio fisiológico complexo e o potencial de reversão obtido se desloque de acordo com o potencial teórico de Nernst, esta espécie de iões é a única transportada.

No entanto, para ChRs, reversão potenciais turnos são geralmente menos pronunciada do que o esperado a partir da equação de Nernst devido à permeabilidade para diferentes espécies iónicas, bem como a concorrência entre íons conduzidos. Neste caso, a situação torna-se mais complexa e todos os íons potencialmente conduzidos devem ser trocados separadamente exigindo uma variedade de soluções de medição. Além disso, a maioria dos CCRs e as primeiras ACRs 9 , 10 , 21 artificiais são condutoras para protões mas concentrações de protões variáveisA concentração de protões pode não só alterar os potenciais de reversão, como também influenciar a condutância iónica 9 , a cinética das fotocorriças 21 , 36 e a sensibilidade à luz espectral 11 , 37 , devido à alteração das redes de ligação de hidrogénio, ao estado de protonação de Resíduos individuais e alterações estruturais secundárias. A condut�cia do prot� pode ser direccionada por redu�o das concentra�es de todos os outros i�es potencialmente conduzidos tais como Na + , Ca 2+ ou Cl - mantendo o pH constante para evitar as altera�es de prote�as mencionadas acima. Substitutos não conduzidos são geralmente moléculas carregadas e carregadas como NMG + para os catiões 12 , e gluconato, 2- ( N- morfolino) etanossulfonato (MES) ou aspartato para aniões. Comparando potenciais de reversão em diferentes iPermite então o cálculo da permeabilidade iónica relativa em condições de equilíbrio pela equação de tensão de Goldman-Hodgkin-Katz. Quantificar a contribuição exata de diferentes íons para fotocorrentes líquidas, considerando a competição de íons além das condições de equilíbrio, exige modelos matemáticos complexos 12 , 38 .

Conhecer a composição de íons transportados por ChRs ajuda a elucidar possíveis efeitos colaterais resultantes da aplicação de ChR especialmente em um contexto neurofisiológico. Por exemplo, a activação prolongada de ChR pode causar acidificação intracelular 39 ou condução de Ca2 + pode desencadear a libertação sináptica e as vias de segundo mensageiro 40 . Uma vez que as células são habitualmente empacotadas dentro dos tecidos, a activação das rodopsinas microbianas pode não apenas influenciar a composição do ião intracelular, mas também a luz extracelular, afectando assim nCélulas vizinhas 41 .

Apesar da seletividade iónica, outras características biofísicas de ChRs como amplitudes fotocorrentes, inativação, sensibilidade espectral ou de luz e propriedades cinéticas são freqüentemente de interesse para conduzir, projetar e interpretar experimentos envolvendo técnicas optogenéticas. Algumas destas propriedades também podem ser determinadas a partir do protocolo acima como descrito em qualquer outra parte 18 , 37 , 42 . Para investigar a sensibilidade à luz da célula de expressão de ChR, a intensidade de luz pode ser variada ajustando a potência da fonte de luz ou atenuando a luz de activação com filtros de densidade neutra. Para obter a sensibilidade espectral, é necessária uma fonte de luz policromática e as intensidades têm de ser ajustadas para o fluxo de fótons e largura de banda iguais para todos os comprimentos de onda. Os espectros de alta intensidade apenas se assemelham aos espectros de absorção do fotorreceptor se pulsos de luz curtos ouSão utilizados flashes de laser, caso contrário podem ocorrer fenómenos de adaptação e reacções fotoquímicas de retorno. A recuperação de ChR parcialmente activado para ChR totalmente activo (tempo total de renovação de fotociclo) pode ser sondada aplicando um protocolo de duplo impulso com intervalos escuros crescentes entre os dois impulsos de luz. As propriedades biofísicas de ChRs discutidas acima são importantes para a escolha de um ChR adequado combinando as necessidades experimentais 40 .

Derivar estas propriedades biofísicas por técnicas eletrofisiológicas diretamente se assemelha a função de proteína que é mal coberto por métodos espectroscópicos. Após o estabelecimento bem sucedido de medições de tensão-braçadeira, a técnica pode ser combinada com abordagens de engenharia de proteínas como a mutagénese dirigida 9 , 11 , 43 , 44 , a mistura de hélice 37 , 46 ou fusão com outras proteínas 41 , 47 . Isso aumentou o conhecimento molecular sobre ChRs e seu modo de operação e criou uma grande diversidade de variantes ChR com cinética alterada, condutância, sensibilidade espectral e seletividade iónica 40 .

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Acknowledgments

Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e especialmente a Altina Klein pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e o Cluster of Excellence Unifying Concepts em Catálise, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E. coli Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E. coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

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References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
  14. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  15. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  16. Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  17. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  18. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  19. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  20. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  21. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  22. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  23. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  24. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  25. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  26. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  27. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  28. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
  29. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  30. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  31. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  32. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  33. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  34. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  35. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  36. Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
  37. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  38. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  39. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  40. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  41. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  42. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  43. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  44. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  45. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  46. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  47. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

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Neurociência Edição 123 Biofísica braçadeira de tensão de eletrodo único configuração de células inteiras célula HEK293 optogenética channelrhodopsin fotocorrente seletividade potencial de reversão potencial de junção cloreto anião
Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins
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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann,More

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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