Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Published: April 1, 2017 doi: 10.3791/55498
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Summary

Her presenterer vi protokoller for affinitetsrensing av proteinkomplekser og deres separasjon ved blå nativ PAGE, etterfulgt av protein korrelasjon profilering ved hjelp av etiketten fri kvantitativ massespektrometri. Denne metoden er nyttig for å løse interactomes inn i forskjellige proteinkomplekser.

Introduction

I celler, de fleste proteiner utføre sine funksjoner ved transitorisk protein-protein-interaksjoner eller ved dannelse av stabile proteinsammensetningene. Karakterisering av protein interaksjoner er avgjørende for fullt forståelse cellulære prosesser. Affinitetsrensing i kombinasjon med massespektrometri (AP-MS) er en av de mest vanlige benyttede strategier for å identifisere nativt protein interaksjoner. Betydelige forbedringer i instrument evner oppnådd i det siste tiåret har gjort denne tilnærmingen ekstremt kraftig. Det er viktig å merke seg at interaksjonene som er identifisert av AP-MS-eksperimenter inkluderer en blanding av direkte og indirekte forbindelser mellom agn og jakter. I tillegg er ofte proteiner ta del i flere forskjellige komplekser innen den samme cellulære sammenheng, som kan ha forskjellige biologiske roller, og derfor interactors som er identifisert av AP-MS kan representere en blanding av distinkte proteinsammensetningene eller funksjonelle enheter. Det er ikke mulig å utledeslik topologisk informasjon a priori fra mono-dimensjonale lister av proteiner dannet ved enkle AP-MS-eksperimenter. Imidlertid kan den teknikk utnyttes ytterligere for å definere den arkitekturen av proteinkomplekser ved å kombinere den med en eller flere metoder for å løse disse sammenstillinger.

For å løse topologien av protein interaksjoner identifisert gjennom AP-MS, har flere strategier tatt i bruk. En tilnærming er å utføre iterative AP-MS-eksperimenter ved anvendelse av byttedyr identifisert i en tidligere runde av eksperimenter som agn 1. Selv om svært informativ, dette er ganske arbeidskrevende oppgave både eksperimentelt og analytisk. Protein tverrbinding i kombinasjon med massespektrometri blir i økende grad benyttet for å utlede topologisk informasjon om proteinkomplekser 2, 3, 4, 5. Men computational analyse av tverrbundne peptider som fortsatt gjenstår en utfordrende oppgave, og følgelig er flaskehalsen i arbeidsflyten. Ankomsten av MS-spaltbare tverrbindingsmidler skal lette kartlegging av aminosyrerestene som befinner seg i umiddelbar nærhet i samspill proteiner 6, 7. Et annet alternativ er å kombinere affinitetsrensing med tidligere ortogonale separasjonsteknikker 8, 9. Kromatografisk fraksjonering ved gelfiltrering eller ionebytting, eller sukrose gradient fraksjonering har også nylig blitt anvendt i kombinasjon med kvantitativ massespektrometri for å beskrive multiprotein komplekser ved en systemomfattende nivå, og unngår komplekse isolasjonstrinnet 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyakrylamidgel-elektroforese (BN-PAGE) har blitt mye brukt for åundersøke native protein-interaksjoner, typisk de som involverer mitokondriemembranproteinkomplekser 14. Denne separasjonsteknikk ble også nylig brukt i kombinasjon med etikett-fritt protein kvantifisering og korrelasjon profilering, ikke bare på mitokondrie komplekser 15, 16, 17, men også for å rakne andre proteinkomplekser fra hele celler 18, 19. Vi antok at kombinasjonen av affinitetsrensing med påfølgende fraksjonering innfødte tilnærminger og kvantitativ MS bør gi en nyttig strategi for å løse flere proteinsammensetningene som inneholder et bestemt protein.

Her beskriver vi en fremgangsmåte som kombinerer generiske epitop-baserte affinitetsrensing med blå nativ polyakrylamidgel-elektroforese av de isolerte komplekser, etterfulgt av kvantitativ masse spectrometry og protein korrelasjon profilering, for å løse de mange sammenstillingene et protein kan være involvert i. Vi anvender muse-embryonale stamceller, hvor et protein av interesse fusjonert til en epitopmerkelapp blir uttrykt fra det endogene lokus for å oppnå nær fysiologisk overflod og sikre effektiv nativ komplekset isolasjon. Denne tilnærmingen avslører de flere interaksjoner et protein som griper inn i, løse dem inn i forskjellige sammenstillinger basert på deres korrelasjon profiler, mens ikke krever mer arbeid enn konvensjonelle geLC-MS 20.

Protocol

1. Isolering av naturlig protein komplekser av FLAG Affinity Rensing

  1. Forberedelser
    1. Sette opp et 37 ° C vannbad for å tine cellepelleten.
    2. Kjøle ned en mikro til 4 ° C.
    3. Plassere flere mikrosentrifugerør av forskjellige størrelser (1,5 ml, 15 ml) og en homogenisator i is.
    4. Fremstilles 10 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) og holde på is. Like før anvendelse av buffer, tilsett 10 ul av 1 M DTT og et knust tablett av EDTA-fri proteasehemmere.
  2. Fremstilling av antistoffbundne kuler
    MERK: antistoff-belagte perler kan være forberedt på opptil en uke på forhånd og oppbevares i kjøleskap inntil nødvendig. Protein G har høyere affinitet enn protein A for de fleste arter immunglobulin-undertyper, med unntak av kanin IgG, hvor protein A har høyere affinitet.
    1. Vask 50 ul av Protein G-belagte magnetiske kuler: Overfør 50 &# 956; l av perleoppslemming til et mikrosentrifugerør, plassere røret i magneten til å samle av kulene på den side av røret, og fjerne væsken. Resuspender perlene i 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    2. Plasser røret på magneten for å samle av kulene på den side av røret, og fjerne væsken. Resuspender perlene i 40 ul PBS-0,01% Tween-20. Tilsett 10 ug (10 ul av 1 mg / ml stamløsning) av M2 anti-FLAG-antistoff. Inkuber med rotasjon i 20 minutter ved romtemperatur.
    3. Plasser røret på magneten for å samle av kulene på den side av røret, og fjerne væsken. Vask kulene med 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    4. For kryssbinding av antistoffet til kulene, vasking av perlene to ganger med 1 ml 0,2 M trietanolamin pH 8,2. Deretter, resuspender perler i 1 ml 20 mM DMP (dimetyl pimelimidat) i 0,2 M trietanolamin pH 8,2 (DMP oppløsningen bør fremstilles friskt umiddelbart før bruk). Inkuber med rotasjon ved romtemperatur i 30 min. Plasser røret på magneten. Fjern supernatanten og resuspender kuler i 0,5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Inkuber med rotasjon ved romtemperatur i 15 min.
    5. Vask kulene 3 ganger med 0,5 ml PBS-0,1% Tween-20. La perler i siste vask inntil nødvendig.
  3. FLAG-baserte affinitetsrensing
    MERK: Pass på å ikke forlate perlene uten buffer for en lang periode. Alle buffere og rør bør holdes på is til alle tider. Følgende protokoll er optimalisert for rensing av proteinkomplekser fra 2-5 x 10 8 celler (10-20 mg protein lysat) som uttrykker endogene nivåer av en FLAG-merket protein 20.
    1. Tine cellepelleten i et vannbad ved 37 ° C inntil det begynner å smelte. Ta røret ut av badet, snurr den forsiktig til pelleten fullstendig tint, og umiddelbart plassere røret som inneholder cellesuspensjonen på is.
    2. Tilsett 5 ml av iskald lyseringsbuffer(Inneholdende DTT og proteaseinhibitorer) til cellesuspensjonen og virvel for å blande. Inkuber på is i 10 minutter.
    3. Overfør lysatet til en kald Dounce homogenisator. Lyse med 20-30 slag ved hjelp av tett støter (inntil det ikke er noen merkbar viskositet). Overfør homogenat tilsettes til kaldt mikrosentrifugerør.
    4. Sentrifuger ved 18.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
    5. Overfør det klarede lysat til en ren kald rør. La 50 ul lysat bak. Ta en 35 ul aliquot av lysatet for å måle proteinkonsentrasjon og overvåke rensing.
    6. Fjern PBS-0,1% Tween-20 fra kulene. Resuspender perlene med 1 ml av lysatet og blandes med resten av løsningen. Inkuber blandingen i en roterende hjul ved 4 ° C i 1-2 timer.
    7. Utlevering av kulene på den siden av røret med magneten. Samle en 30 ul porsjon av supernatant og kast resten av supernatanten. Resuspender kuler i 0,5 ml IPP150 buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) ved å pipettere 4-6 ganger. Overfør til et 1,5 ml kald rør.
    8. Gjenta vaskinger med 0,5 ml buffer IPP150 to ganger til.
    9. Vasking av perler tre ganger med 0,5 ml FLAG nativt elueringsbuffer (20 mM Bis-Tris, pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminokapronsyre). Med den siste vasking, overføre perlene til en ny kald rør. Fjern buffer grundig.
    10. Resuspendere kulene i 100 ul av 200 ug / ml 3x FLAG-peptid i native elueringsbuffer. Inkuber ved 4 ° C i 10 min med forsiktig rotasjon.
    11. Samle perler med magneten og Overfør supernatanten til et nytt kaldt rør.
    12. Gjenta trinn 1.3.10-1.3.11 to ganger. Pool alle eluatene.
    13. Konsentrer eluatet ned til 25 mikroliter i en sentrifugal filterenhet (10 kDa nominell molekylvektgrense cut-off, PES) ved sentrifugering ved 10.000 x g ved 4 ° C. Overfør den konsentrerte eluatet til en ny kald rør og tilsett 50% glycerol til en sluttkonsentrasjon på 5%. Det konsentrerte eluat kan oppbevares ved 4 ° C over natten om nødvendig.

2. Blå Native SIDE

  1. Forberedelser
    1. Forbered en liter 1x innfødte SIDE Anode Buffer, 1x innfødte SIDE Dark Blue Cathode Buffer og 1x innfødte SIDE Lyseblå Cathode Buffer.
    2. Fjern kammen av en prefabrikert 3-12% nativ PAGE-gel og vaske brønnene vasket to ganger med 1 x nativ PAGE Dark Blue Cathode buffer. Fyll brønnene med 1x mors SIDE Dark Blue Cathode Buffer. Sett opp gelen i driften tanken, men ikke legg Mørkeblå Katode Buffer til katoden (indre) kammer.
  2. elektro run
    1. Preparere prøven: Til 25 ul konsentrerte eluat legge til passende volum av 4x nativt prøveladningsbuffer og 0,5% G-250 prøvetilsetningsmiddel for sluttkonsentrasjoner på 1 x og 0,005% hhv.
    2. Laste prøven og nativ molekylvektmarkører og etterlot en tom brønn between dem. Belastning 10-20 ul av 1 x nativt prøveladningsbuffer i alle de tomme brønner.
    3. Fyll katoden (indre) kammer med 200 ml 1x nativ PAGE Mørkeblå Katode buffer forsiktig for ikke å forstyrre prøvene. Fyll anoden (utenfor) kammer med 550 ml av 1 x nativ PAGE Anode buffer.
    4. Kjør gelen ved 150 V i 30 minutter. Stoppe kjøringen, fjern Dark Blue Cathode buffer med en serologisk pipette og erstatte med 1x Lyseblå Cathode Buffer. Fortsett rømmen i 60 min. Gelen kan kjøres ved romtemperatur eller ved 4 ° C; temperaturen kan ha en effekt på proteinkompleks struktur.
  3. gel flekker
    1. Åpne gelen kassetten og forkaste en av kassettplatene. Gelen forblir festet til den andre kassetten plate. Overfør gelen inn i en skuff eller beholder inneholdende nok fikseringsoppløsning (40% metanol, 2% eddiksyre) for å dekke gelen og inkuber i 30 minutter med forsiktig risting.
    2. Fjern fiksativ solution og tilsett tilstrekkelig vann til å dekke gelen. Gelen kan skannes for fremtidig referanse.

3. massespektrometrianalyse

Merk: Alle etterfølgende trinn skal utføres i en laminær hette om mulig å sikre renslighet av prøvene. Alle oppløsninger må være forberedt med HPLC-kvalitet vann. Diskutere dette protokoll med massespektrometri laboratoriet som skal utføre analysen.

  1. Forberedelser
    1. Plasser en konisk bunn 96-brønn plate på toppen av en annen 96-brønners plate for å samle opp avfallet. Pierce bunnen av brønnene i den koniske bunn 96-brønn plate med en 21 G nål.
    2. Vask brønnene i den gjennomborede 96-brønners plate.
      1. Tilsett 200 ul 50% acetonitril-0,25% maursyre til brønnene i den gjennomhullede plate. Inkuber platen stabelen i en ristemaskin i 10 min.
      2. Sentrifuger ved 500 x g i 1 minutt, slik at væsken strømmer gjennom hullene i avfallssamleplaten. Kast waste væske.
      3. Gjenta trinn 3.1.2.1-3.1.2.2 to ganger til.
      4. Fylle brønnene i den gjennomhullede 96-brønns plate med 150 ul av 50 mM ammoniumbikarbonat (nylaget).
    3. Vask brønnene i en sentrifugalfiltrering 96-brønners plate.
      1. Plasser en normal 96-brønns plate under sentrifugalvirkningen filtreringsplate for å samle opp avfallet. Tilsett 200 ul 50% acetonitril-0,25% maursyre til hver brønn av sentrifugalfiltrering plate.
      2. Sentrifuger platestabelen ved 200 x g i 1 min. Kast avfallet.
      3. Gjenta trinn 3.1.3.1-3.1.3.2 to ganger til.
  2. Gel eksisjon og i-gel fordøyelse
    MERK: Mens skjære gelen, identifisere og noterer gelen skive justert til hver av proteinstandarder. De proteinstandarder kan brukes til å estimere tilnærmede molekylvekter for alle gelbiter.
    1. Plasser gelen med glassplaten på en ren overflate. Skjær kjørefelt inneholdeing av prøven i 48 identiske skiver (1,5 mm x 5 mm). Skjær hver skive i 2-3 mindre biter (med unntak av de siste fem skiver ved toppen av gelen) og plassere hver skive sekvensielt i en brønn for et gjennomhullet og vasket 96-brønners plate.
    2. Tilsett 50 ul acetonitril til hver brønn. Inkuber platen med risting i 30-60 min. Fjern væsken ved sentrifugering som i trinn 3.1.2.2.
    3. Tilsett 200 ul av 2 mM TCEP i 50 mM ammoniumbikarbonat til hver brønn. Platen inkuberes under rysting i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern væsken ved sentrifugering som i trinn 3.1.2.2.
    4. Tilsett 200 ul av 4 mM jodacetamid på 50 mM ammoniumbikarbonat til hver brønn. Platen inkuberes under rysting i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Fjern væsken ved sentrifugering som i trinn 3.1.2.2.
    5. Tilsett 150 ul av 50 mM ammoniumbikarbonat pluss 50 ul acetonitril og inkuber platen med risting i 30 min ved romtemperatur. Gjenta dette vasketrinn ens mange ganger som nødvendig inntil all den blå fargen er fjernet fra gelstykkene.
    6. Dehydrere gelbitene ved tilsetning av 200 ul av rent acetonitril og inkuber med risting ved romtemperatur i 20 min inntil gelbitene er hvite og opake. Fjern acetonitril.
    7. Tilsett 150 ul av 0,001 mg / ml trypsin (sekvenseringsgrad) i kald 50 mM ammoniumbikarbonat til hver brønn. Platen inkuberes under omrøring ved 37 ° C i 2 timer. Etter 1 time, kontrollere at gelbitene er dekket med væske; dersom dette ikke er tilfelle, legge til et 50 til 100 mL av 50 mM ammoniumbikarbonat. Etter 2 timer ved 37 ° C, fortsetter den fordøyelse ved 25 ° C over natten.
    8. Plasser en ren konisk bunnplaten under gel inneholdende plate, som sikrer korrekt orientering av platene. Samle opp væsken inneholdende peptidene ved sentrifugering ved 200 x g i 1 min.
    9. Plasser peptider inneholdende plate i et sentrifugefordamper og fordamper væsken mens utfører than neste trinn.
    10. Tilsett 150 ul 50% acetonitril-0,25% maursyre til gelbitene. Inkuber med risting ved 37 ° C i 30 min.
    11. Samle opp væsken inn i den delvis tørkede plate fra trinn 3.2.9 ved sentrifugering ved 200 x g i 1 min. Fortsett å fordampe peptider inneholdende plate mens du utfører neste trinn.
    12. Gjenta trinn 3.2.10-3.2.11.
    13. Tilsett 200 ul av rent acetonitril til hver brønn i platen inneholdende gelbitene. Inkuber med risting ved romtemperatur i 15 min.
    14. Samle opp væsken i det peptider inneholdende plate ved sentrifugering ved 200 x g i 1 min.
    15. Pass på at den endelige konsentrasjonen av acetonitril i alle brønner er over 55%. Om nødvendig, legge til ekstra ren acetonitril.
    16. Overfør peptidoppløsninger til den vaskede sentrifugalfiltrering plate. Plasser en ren konisk bunnplate under den for å samle peptider. Sentrifuger platestabelen ved 200 x g i 1 min.
    17. Evaporspiste væsken i den koniske bunnplaten til brønnene er helt tørre. Platen kan være dekket med et silikon lokk og lagret ved -20 ° C på dette stadiet.
    18. Re-oppløses peptidene i 32 pl av 0,5% maursyre med kraftig rysting i 15 min. Legg 8 pl 400 mM ammoniumbikarbonat og inkuberes med kraftig risting i 15 min. Sentrifuger plate ved 200 x g i 1 min. Dekk med et silikon lokk og lagre platen ved -20 ° C inntil massespektrometrianalyse.
  3. massespektrometri
    MERK: Analyser peptider på en høyoppløselig massespektrometer med metoder som er kompatible med hagle proteomikk. Dataavhengig kjøpet er den mest vanlig brukte LC-MS tandem oppsett for denne type analyse, og bør være optimalisert for effektiv peptid identifikasjon, å minimalisere redundante sekvensering og kandidat utvalg enn bakgrunnsstøy. Massespektra i det første trinn masse analyse skanning (MS1) bør føres inn i profil-modus. Det anbefalesed til fortrinnsvis å velge dobbelt og tredobbelt ladede ioner for andre trinn masseanalyse (MS2). Et masse område av m / z 400-1,600 er egnet til å identifisere de fleste peptider mellom 8-30 aminosyrer rekkevidde. Her er en protokoll for analyse under anvendelse av en Orbitrap massespektrometer tilgjengelig.
    1. Injiser 20 prøve ifølge analyse ved bruk av auto-sampler av en nanoLC-MS / MS-system. Avsalte og konsentrer peptider på en reversfase C18-kolonne (100 um id, 2 cm).
    2. Separate peptider på en analytisk C18-kolonne (75 pm id, 15 cm) ved anvendelse av en 30 min lineær gradient av 4-28% acetonitril / 0,1% maursyre ved 300 nL / min.
    3. Analyser peptider i et massespektrometer med en topp 10 dataavhengig overtakelsesmetoden med følgende parametre: m / z rekkevidde 380-1,600, oppløsning 30 000 ved m / z 400, isolering bredde på 2 Th, dynamisk utelukkelse på ± 10 ppm i 45 s , automatisk forsterkningskontroll mål ved 1 x 10 6 for MS og 5000 for MS / MS, maksimal injeksjons tid 150 ms for MS og100 ms for MS / MS.

4. Data Analysis

  1. Protein identifikasjon og kvantifisering ved hjelp MaxQuant
    1. Bruk fritt tilgjengelig MaxQuant programvare for å identifisere og kvantifisere protein i hver gel fraksjon fra massespektrometri rådata.
      MERK: MaxQuant fungerer på data generert av dataavhengig oppkjøpet hagle proteomikk tilnærminger. MS-data fra de opprinnelige blå gel-fraksjoner bør analyseres i batch som separate eksperimenter og ikke som fraksjoner av et eksperiment som kombinerer alle gelbiter. Sjekk iBAQ verdi for å gjennomføre støkiometri beregninger. Detaljerte protokoller for databasesøk og protein kvantifisering ved hjelp av MaxQuant er beskrevet i 21, 22.
  2. Proteinprofilanalyse ved bruk av Perseus
    1. Bruk den fritt tilgjengelig programvare Persevs å vise migrasjon profiler av de identifiserte proteiner og sammenligne dem ved hjelpStatistisk analyse.
      MERK: Generell dokumentasjon om hvordan du bruker Perseus er tilgjengelig på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Et eksempel på et datasett er tilgjengelig som supplerende data.
    2. Last den proteingroups.txt fil som returneres av MaxQuant analyse inneholder proteinet identifikasjon og kvantifisering verdier for alle gel-fraksjoner. Fylle de intensitetsverdier i hovedboksen (figur 1). En matrise vil vises som inneholder alle protein identifikasjoner i rader, med gel-fraksjoner som kolonner.
    3. Fjern oppføringer tilsvarende omvendt treff, proteiner bare identifisert ved sete og potensielle forurensninger ved å velge Filter rader basert på kategoriske kolonne i filter rader rullegardinmeny (figur 2).
    4. Normaliser fraksjons intensiteter av hvert protein på tvers av profilen mot det totale protein intensiteten ved å velge skillet i Normalrullegardinmeny, så Sum (figur 3). En ny mATRIX vises.
    5. Vise migrasjonsprofilen plott av alle proteiner ved å velge profil plott i Visualisering rullegardinmeny (figur 4).
    6. Velg Filter rader basert på gyldige verdier i filteret rekker rullegardinmenyen. Skriv inn en i antall gyldige verdier som kreves.
    7. Utføre hierarkisk gruppering av identifiserte proteiner på tvers av alle blå opprinnelige gel-fraksjoner ved å velge Hierarkisk gruppering i klynger / PCA rullegardinmeny. Fjern merket i kolonner treet (Figur 5). Klasene visualiseres i et varme-kartet i fliken klynger ved siden av matriksen (Figur 6).
    8. Lokal klyngen som inneholder agn protein i dendrogrammet. Andre komponenter i den klyngen representerer proteiner som ko-migrerer med agn, og er derfor et potensielt interagerende proteiner / subenheter av samme kompleks.

Figur 1 r /> Figur 1. Skjermskudd av Perseus data opplastingsvinduet. Figuren viser trinnene for å legge protein identifikasjon og kvantifisering av data inn i Perseus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjermbilde av Perseus vindu for filtrering av oppføringer tilsvarende forurensninger, reversere treff og proteinene identifisert ved sete. Valg av filter rader av kategorisk kolonne åpner et nytt vindu for å velge de typer av protein oppføringer til å bli eliminert fra datasettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/55498fig3.jpg"/>
Figur 3. Skjermbilde av Perseus normaliseringsvinduet. Velge Divide i Normalisering menyen åpner et nytt vindu, med ulike alternativer. Valg av Sum deler intensitetsverdi av et protein i hver fraksjon av den totale intensiteten av dette protein på tvers av alle fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Skjermbilde av Perseus viser migrasjonsprofil plott. Proteiner kan velges i matrisen under profilene for å fremheve deres tilsvarende profil. Verktøylinjen kan brukes til å redigere og eksportere profiler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5. Skjermbilde av Perseus hierarkisk clustering vindu. Figuren viser innstillingene for hierarkisk gruppering av proteiner ved anvendelse av Manhattan (L1) avstand metrisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Skjermbilde av Perseus viser dendrogram og protein intensiteter heatmap. Arbeidsflyten på den høyre side av hovedpanelet viser hvert trinn foretatt og den resulterende matrise, og kan brukes til å oppheve eventuelle trinn. Den arbeidsflyt kan også gren fra en hvilken som helst mellomliggende grunnmasse. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

  1. Beregning av den relative støkiometri
    1. Velg de subenheter av et proteinkompleks basert på deres ko-gruppering med agn protein og avgrenser profiltopp (e) hvor de vises.
    2. Bruk iBAQ verdiene som returneres av MaxQuant analyse for hver underenhet i hver fraksjon separat og normalisere med det tilsvarende agn iBAQ verdi i denne fraksjon.
    3. Plott de normaliserte iBAQs for agn og proteinkompleks underenheter på tvers av fraksjoner av den valgte topp og bruke lineær regresjon. Beregn relative mengde av komplekset subenhet til agn ved å sammenligne utviklingen av de normaliserte iBAQ verdier.
  2. Estimering av proteinkompleks størrelse
    1. Bruk proteinstandarder for å beregne forutsagte molekylvekter til de opprettende blå opprinnelige gelbitene fra prøve kjørefelt. Fra disse kan generere en lineær regresjonsmodell ved plotting av gelbiter i x -aksen og molekylvekter i y -aksen. Bruk modell for å beregne den observerte molekylvektområde på proteinet kompleks (er), basert på den opprinnelige blå skive (e) fra hvilken de ble identifisert.

Representative Results

Arbeidsflyten for affinitetsrensing blå native protein Korrelasjon profilering av Massespektrometri (ABC-MS) strategi er vist i figur 7. Native proteinkomplekser rundt et protein av interesse blir isolert ved affinitetsrensing ved anvendelse av antistoffer mot en epitop tag (i dette tilfellet FLAG) og konkurransedyktig eluering. Kompleksene blir løst ved BN-PAGE, og det hele gelen banen er skåret opp i 48 seksjoner, og forberedt for hagle LC-MS / MS. Kvantitativ MS informasjonen blir brukt til å generere en migrasjonsprofil for hver identifisert protein tvers over den blå naturlig separasjon. Proteiner som interagerer for å danne et distinkt kompleks oppviser like migrasjons profiler med superponerbar topper. Når et protein av interesse tar del i mer enn ett sammenstillingen, er flere topper observert i sin migrasjonsprofil, gitt de sub-komplekser er i det oppløsningsevnen av det blå nativ gel. En systematisk sammenligning av migrasjon profiler kan oppnås ved protein korrelasjon profilering ved bruk av hierarkisk gruppering. Dendrogrammet og toppintensitetene av alle fraksjonene som er visualisert i et varme-kart, som letter identifikasjon av samvirkende proteiner som hører til forskjellige proteinkomplekser (figur 8).

Vi brukte denne strategien for å analysere samspill partnere Mta2, en kjerne subenhet av Nurd kromatin remodeling kompleks 20. Som vist i figur 9, vises migrasjonsprofilen av Mta2 to topper med forskjellige intensiteter mellom 700 kDa og 1,2 MDa, med den nedre massetoppen som viser høyere overflod. Andre Nurd kjerneunderenheter, inkludert Mta1 / 3, Hdac1 / 2 og Mbd3, viste identisk skillemønster, om enn toppene av en eller annen av underenhetene, nemlig Chd4, Gatad2a / b og Rbbp4 / 7, hadde den inverse overflod fordeling (figur 9A, B). I motsetning til profilen til Cdk2ap1, en regulerende faktor som rekrutterer Nurd komplekset til WNT genpromotere 23, vises bare den høyere massetoppen (figur 9C), og det gjorde Sall4, et transkripsjonelt repressor som også er blitt vist å binde Nurd 20, 24, 25. Således, fraksjonering av affinitetsrensede Mta2-assosierte proteiner ved hjelp av blå nativ PAGE var i stand til å løse to forskjellige former av Nurd komplekset.

ABC-MS tillater også identifisering av nye interactors å tilordne dem til bestemte protein enheter. Ved undersøkelse av proteiner klynger og fraksjons intensiteter som er representert i et varme kart vi har oppdaget en sterk korrelasjon mellom Nurd underenheter og Wdr5, en regulatorisk subenhet av MLL-metyltransferase-komplekset 26, med Wdr5 viser to vandringsstopper er sammenfallende med de to Nurd peaks (figur 8), noe som antyder en ny interaksjon mellom Wdr5 og Nurd. Vi har bekreftet denne interaksjonen ved ko-immunutfelling og ko-migrasjon i størrelseseksklusjonskromatografi 20.

Valget av avstand metrisk beregning i den hierarkiske clustering vil påvirke formen av klyngene og dermed korrelasjonene. Vi anbefaler at du eksperimenterer med ulike beregninger for å oppnå best mulig passform med eksisterende samhandling kunnskap om protein eller kompleks av interesse. Generelt har vi oppnådd de beste resultater med den Manhattan (L1) avstand metrisk 20. Pearson korrelasjon eller euklidske avstand beregninger har også blitt rapportert for identifisering av komplekser basert på alternative fraksjoneringsteknikker 10, 11, 12.

QuanKvantitative MS-dataene erholdt fra de blå opprinnelige fraksjoner kan også brukes til å bestemme støkiometrien proteinkomplekser. Den iBAQ (intensitet basert absolutt kvantifisering) verdi er et mål på relative overflod av de identifiserte proteiner 27, 28. De iBAQ verdier for proteinkomplekset medlemmer i alle fraksjoner i en migrasjonsprofil topp er normalisert til den av agn protein for å oppnå relative mengder. De normaliserte iBAQs på tvers av en profiltopp for en gitt proteinkompleks medlem skal følge en horisontal trend, og trenden verdiene reflekterer støkiometrien av de samvirkende proteiner i forhold til agnet protein. For en mer detaljert fremstilling av støkiometri beregninger, se 20.

Figur 7
Figur 7: Skjematisk arbeidsflyt som oppsummerer ABC-MS strategy. Dette tallet er modifisert fra 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Hierarkisk gruppering av BN-PAGE-migrasjon profiler av Mta2 interactors. Mta2-assosierte proteiner ble gruppert basert på likheten av deres migrasjon profiler. Bare en undergruppe av varme kartet inneholder Nurd komplekset er vist (innelukket i den blå boksen). Den gule boksen fremhever den sterke korrelasjonen av Wdr5 med Nurd kompleks. De merkede molekylvekter ble beregnet fra vandringsavstander på proteinstandarder som er drevet på samme gel. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Molecular og Cellular Proteomikk 20 American Society for biokjemi og Mo lecular Biology. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. BN-PAGE migrasjonsprofil av Nurd underenheter og tilknyttede proteiner. A) Mta2 og Nurd underenheter på omtrent samme intensitetsmønster. B) Mta2 og Nurd underenheter med den inverse intensitetsmønster. C) Mta2 og Cdk2ap1, som er tilstede kun i den høyere molekylvekt Nurd enhet. De merkede molekylvekter ble beregnet fra migrasjonsprofilen av proteinstandarder. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Molecular and Cellular Proteomikk 20 American Society for biokjemi og molekylærbiologi._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental File
Supplerende data: Sample datasettet. MaxQuant-avledet proteingroups.txt fil som inneholder protein identifikasjoner og kvantifisering av verdier fra en ABC-MS eksperiment. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Molecular and Cellular Proteomikk 20 American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Her beskriver vi bruken av affinitetsrensing fulgt av blå nativ gelelektroforese i kombinasjon med kvantitativ massespektrometri for å løse proteinkomplekser. Denne fremgangsmåten gir en metode for å løse endimensjonale protein interaksjon lister til funksjonelle proteinsammensetningene.

Vi viser den metode som er basert på anvendelse av epitop-tagget proteiner. Men hvis en cellelinje som uttrykker et kodet protein ikke er tilgjengelig, kan et alternativ være å bruke antistoffer mot proteinet av interesse, forutsatt at det er et peptid som er tilgjengelig for å oppnå nativ konkurranse eluering. Mengden av utgangsmateriale og mengden av perler kan måtte modifiseres avhengig av ekspresjonsnivået av målproteinet. Vi vanligvis utføre denne protokoll med 2-5 x 10 8 celler utgangsmateriale, og dette er tilstrekkelig selv for proteiner med lavt ekspresjonsnivå. Den lyseringsbuffer Blandingen bør velges empirisk for å oppnånær til fullstendig oppløsning av agnet. Dette kan være vanskelig for enkelte typer av proteiner, spesielt kromatin binding eller membranproteiner. Alternative muligheter er å øke mengden av salt, forutsatt at det proteinkompleks som studeres er stabil i høy salt, eller ved hjelp av ultralydbehandling og / eller nukleasebehandling for kromatin bindende proteiner 20, 29. I tilfelle av membranproteiner, kan bytte vaskemiddel DDM eller digitonin være tilrådelig 30. I tilfelle av DNA-bindende proteiner, er det nyttig å inkludere en nuklease slik som benzonase i løpet av rensetrinnet 20. Fullstendig fjerning av nukleinsyrer sikrer at interaksjonene detekterte forekomme mellom proteiner og ikke formidles ved hjelp av DNA.

Et kritisk element i betraktning ved bruk av denne tilnærmingen er at stabiliteten av komplekset som skal undersøkes. Fremgangsmåten er lang og kan involvere preserving proteinkomplekset over natten. Vi har oppnådd god suksess med to kromatin remodeling komplekser (D. Bode og M. Pardo, data ikke vist), men dette bør vurderes. Affinitetsrensing Trinnet kan forkortes hvis nødvendig.

Alternative teknikker som tillater nativt fraksjonering, slik som størrelses-eksklusjonskromatografi, har vært mye brukt i over 50 år for å karakterisere proteinkomplekser. Vi og andre har vist at oppløsning av blå nativ PAGE er overlegen den som oppnås ved bruk av størrelses-eksklusjonskromatografi 20, 31, 32, 33. En annen fordel med blå nativ PAGE er at den ikke krever kromatografisystemer, som er kostbare, men i stedet bruker proteiner elektroforetiske utstyr som er utbredt i laboratorier. Når det gjelder hands-on tid, denne metoden ikke innebærer mer arbeid enn den tradisjonelle geLC-MS / MS enpproach eller frakoblet kromatografisk fraksjonering. Men som de fleste fraksjoneringsteknikker gjør, har det en grense for sitt vedtak. Komplekser som er svært homogen eller nær i masse og form kan være utenfor oppløsningen tilbys av blå innfødte PAGE, og dermed protokollen som rapportert her kan ikke være universelt lykkes i å løse forskjellige komplekser med felles underenhetene. Oppmuntrende, har vi lykkes i å separere to svært like tetramere komplekser som deler tre underenheter (M. Pardo, manuskript under forberedelse).

Siden massespektrometri har blitt stadig mer følsom, kan selv små mengder av ikke-spesifikke interactors og forurensninger påvises i AP-MS prøver. Tilnærmingen presentert her kan hjelpe til ved diskriminering av reelle interactors fra bakgrunnsforurensning i affinitetsrensing ved å fokusere oppmerksomheten på proteiner med migrasjons topper som sammenfaller med agn migrasjons topper ved høyere molekylvekt enn den forde monomere proteiner.

Flere grupper har anvendt fraksjoneringsteknikker, etterfulgt av protein korrelasjon profilering for å avgrense proteinkomplekser på celle skala uten behov for foregående isolering 10, 11, 12, 34. Men dette kan resultere i manglende evne til å oppdage substøkiometrisk interaksjoner. Inkorporeringen av en berikelse trinn gjennom affinitetsrensing kan bidra til å overvinne dette. Tilnærmingen er beskrevet her bør generelt være nyttig for å utforske topologien av proteinkomplekser og rakne flere komplekser et gitt protein tar del i løpet av den samme cellulære sammenheng. Strategien er enkel og egnet for laboratorier som ikke behøver å ha kostbart kromatografisk fraksjonering utstyr for å løse proteinkomplekser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein G Dynabeads Life Technologies 10003D
FLAG antibody M2 Sigma-Aldrich F1804
Tween-20, protein grade, 10% solution Millipore 655206
Dimethyl pimelimidate Sigma-Aldrich 80490
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 Sigma-Aldrich T0449
3x FLAG peptide Sigma-Aldrich F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES Sartorius VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel Life Technologies BN1001
20x NativePAGE Running Buffer Life Technologies BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive Life Technologies BN2002
4x NativePAGE sample loading buffer Life Technologies BN2003
NativeMARK Life Technologies LC0725
NativePAGE 5% G-250 sample additive  Life Technologies BN2004
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene Thermo 249944
Multiscreen HTS 96-well filtration system Thermo MSDVN6550
Nunc 96-well cap natural Thermo 276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich 646547
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A/0627/17
Trypsin, sequencing grade Roche 11418475001
MaxQuant (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

Tags

Biochemistry utgave 122 blå nativ PAGE protein korrelasjon profilering multiprotein kompleks affinitetsrensing kvantitativ massespektrometri interactome AP-MS proteininteraksjon
Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardo, M., Bode, D., Yu, L.,… More

Pardo, M., Bode, D., Yu, L., Choudhary, J. S. Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling. J. Vis. Exp. (122), e55498, doi:10.3791/55498 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter