Summary
Metoden som beskrivs här möjliggör visualisering av IL-8-promotorberoende inflammationsaktivering i lungorna hos möss genom icke-invasiv bioluminescensavbildning (BLI). Samma djur kan utsättas för BLI flera gånger i upp till två månader från tiden för leverans av luciferasreporterkonstruktionen.
Abstract
Luftvägsinflammation är ofta associerad med bakterieinfektioner och utgör en viktig determinant av lungsjukdomar. In vivo- bestämningen av de pro-inflammatoriska egenskaperna hos olika faktorer är utmanande och kräver terminala förfaranden, såsom bronko-alveolisk sköljning och avlägsnande av lungor för in situ- analys, vilket förhindrar longitudinell visualisering i samma mus. Här induceras lunginflammation genom intratracheal instillation av Pseudomonas aeruginosa- kultursupernatant (SN) i transientt transgeniserade möss som uttrycker luciferasreportergenen under kontroll av en heterolog IL-8 bovin promotor. Luciferasuttryck i lungan övervakas genom in vivo bioluminescerande bild (BLI) -analys över en 2,5- till 48-timmars tidsram efter instillationen. Förfarandet kan upprepas flera gånger inom 2-3 månader, vilket möjliggör utvärdering av det inflammatoriska svaret i samma möss medUt behovet av att säga upp djuren. Detta tillvägagångssätt tillåter övervakning av pro- och antiinflammatoriska faktorer som verkar i lungan i realtid och verkar lämpliga för funktionella och farmakologiska studier.
Introduction
Kroniska lungsjukdomar, såsom astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD), cystisk fibros (CF) och bronkiektas, kännetecknas av luftvägsinflammation. Luftvägsinflammation kännetecknas av ödem, cellulär infiltration, T-lymfocyt- och mastcellsaktivering, ökade luftvägssekretioner och överdriven kollagenavsättning. CF är en multisystemstörning, och dess huvudsakliga orsak till mortalitet och sjuklighet är lungbakteriell infektion med ökad lungförstärkning. Nedgången i lungfunktionen förutsätter ett signifikant fattigare resultat 1 , 2 , 3 , 4 .
Inflammationstillståndet i andningsvägarna observeras vanligen genom utvärdering av immunologiska markörer som rekryteras under inflammatorisk process i material som härrör från nedre och övre luftvägar, såsom sputum, vilket ger varierande resÜLTS. Bronkoskopier utförs också 5 . Murine-modeller är värdefulla verktyg för att undersöka patogenesen och utvecklingen av sjukdomar som kännetecknas av luftvägsinflammation och för vilka effektiva behandlingar eller botemedel ännu inte har identifierats. Djurmodeller av lunginfektion och inflammation har använts för att studera interaktioner mellan astma och värdpatogen, inklusive kemikaliers roll som simulerar mänskliga förhållanden ( t.ex. exponering för cigarettrök, LPS, elastas, ovalbumin, poly I: C, etc. , som Såväl som kombinationer av ovanstående) 6 . Mätningen av inflammationsrelaterade parametrar kräver djurens offer, eftersom invasiva metoder krävs för att mäta faktorer som bakteriell belastning, cytokiner i lungorna och uppsamlad bronkoalveolär lavage (BAL) vätska. Dessutom krävs ofta histologiska undersökningar. Möjligheten att erhålla information om inflammatorisk responskinetik kräver användning av numEroserade möss. Därför är en teknik som skulle möjliggöra att erhålla sådan information utan att behöva offra djuren värdefull på tekniska, etiska, ekonomiska och operativa grunder.
IL-8 är en viktig aktör i inflammationsprocessen och rekryterar leukocyter till inflammerad vävnad. Det representerar en molekylär avläsning för studien av aktivering av inflammatorisk väg. MIP-2 och KC kan vara funktionella homologer av humant IL-8 hos möss. Möss uttrycker endast en potentiell IL-8-receptor, en homolog av human CXCR2 7,8 , men de är kapabla att modulera en heterolog IL-8-genpromotor som driver en reportergen. En murinmodell med lunginflammation har nyligen utvecklats efter det att en bovin IL-8-promotor / luciferas-reporterkonstruktion kan transaktiveras i möss. Denna funktion möjliggör användningen av bioluminescensavbildning (BLI) för att övervaka det inflammatoriska svaret vid lever aNimaler 9 .
Denna modell har anpassats för att studera inflammation utlöst av bakteriella exoprodukter ( t.ex. LPS eller produkter som frigörs av bakteriestammar) eller TNFalpha 10 , 11 . Läkemedelsupptäcktsprocessen är inriktad på utveckling och optimering av gamla och nya antiinflammatoriska molekyler som kan behandla lungsjukdomar, såsom CF, astma och KOL. Dessa nya kemiska enheter måste testas snabbt och bekvämt i djurmodeller som kan kopplas till specifika kliniska fenotyper för att underlätta utformningen av smarta kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av den intramurala djurskyddskommittén för djurförsök av Interdepartmental Center of Experimental Research Service vid University of Verona och uppfyller Europeiska direktivet 2010/63 UE, italienska D.Lgs 26/2014 och den reviderade "Guide för vård och användning av laboratoriedjur", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Detta protokoll och experiment var godkända av National Institutes of Health (n 273/15). Djur hade fri tillgång till standard gnagare och mjukat kranvatten och acklimatiserades i minst 5 dagar till de lokala vivariumförhållandena (rumstemperatur: 20-24 ° C, relativ fuktighet: 40-70%, ljus mörk cykel: 12 h ) Före någon behandling.
1. In vivo- genleverans
- Använd en laminär strömningshuvud för att framställa in vivo- leveransreagens / nukleinsyrakomplexen.
- Definiera försöksprotokollet aNd parametrar enligt tillverkarens in vivo instruktioner.
- Använd en total injektionsvolym av 200 μl komplex per mus.
- Börja med 40 μg DNA suspenderat i endotoxinfritt vatten; Optimeringsområdet kan nå 60 μg.
OBS: Slutkoncentrationen av nukleinsyra i injektionsvolymen får inte överstiga 0,5 μg / μl, enligt tillverkarens instruktioner. - Använd ett N / P-förhållande på 6-8 (0,12 - 0,16 μL leveransreagens per μg nukleinsyra). Beräkna motsvarande volym av leveransreagens.
OBS: Komplexen ska vara katjoniska för effektiv cellinmatning. N / P-förhållandet definieras som antalet kväverester (N) på in vivo- leveransreagenset per nukleinsyrafosfat (P) och representerar måttet av jonbalansen inom komplexen.
- Späd den beräknade mängden (se steg 1.2.1) av nukleinsyra i 5% glukos (slutkoncentrationRation) med användning av 10% glukos stamlösning (tillhandahållen) och sterilt vatten. Se till att utspädningsvolymen är hälften av den slutliga injektionsvolymen. Vortex försiktigt eller blanda genom pipettering upp och ner.
- Tillsätt den beräknade mängden (se steg 1.2.3) av leveransreagens till halva injektionsvolymen 5% glukos (slutkoncentration) med användning av 10% glukosförrådslösning (medföljer) och sterilt vatten. Vortex försiktigt och snurra vid 13 000 xg under 15 s.
- Tillsätt de ovannämnda utspädda administrationsreagenserna till den utspädda nukleinsyran på en gång. Blanda dem med försiktig vortexing och snurra ner vid 13 000 xg under 15 s.
- Inkubera blandningen från steg 1,5 i 15 minuter vid rumstemperatur.
OBS! Från och med denna tidpunkt är komplexen stabila i 4 timmar vid rumstemperatur och i upp till 7 dagar vid förvaring vid 4 ° C. - Utför svansinjektioner med hjälp av komplex som är jämviktiga vid rumstemperatur. Placera svansen i varmt vatten (50-53 ° C) under 30 s för att möjliggöra vensträckning.
- Placera musen inuti fasthållningsanordningen. Sätt i en 27- till 30-gauge nål i svansvenen i 20-30 ° vinkel och injicera långsamt 200 μl. När du är färdig, ta bort nålen och tryck på injektionsstället.
OBS: En liten buk i svansen under injektionen indikerar felaktig positionering. Om detta inträffar, ta bort nålen och upprepa processen proximalt till föregående sajt.
- Placera musen inuti fasthållningsanordningen. Sätt i en 27- till 30-gauge nål i svansvenen i 20-30 ° vinkel och injicera långsamt 200 μl. När du är färdig, ta bort nålen och tryck på injektionsstället.
- Visualisera genuttryck genom att utföra in vivo BLI (se steg 2) vid 24 och 48 h efter intravenös injektion.
2. In vivo BLI
ANMÄRKNING: Förbered en nyförrådslösning av 15 mg / ml D-luciferin i DPBS, filtrera sterilisera den med en 0,22 μm filtreringsenhet och förvara den vid -20 ° C.
- Placera mössen i en klar plexiglas anestesi kammare. Se till att isoflurankammaren är full. När du är redo att bedöva djuren, se till att pumpen (lEft) och kammarens (höger) strömbrytare är på. Vrid isofluranskivan till 2,5% för induktion och 2% för underhåll. Djur inuti IVIS-kammaren hålls under 2,5% isofluorananestesi under bildförvärv.
- Efter att mössen är fullständigt bedövade, injicera 10 ml / kg kroppsvikt av D-luciferinlösningen genom en intraperitoneal väg 15 min före bildbehandling.
OBS! En kinetisk studie på D-luciferin bör utföras för att bestämma tiden för signaltoppen efter administrering av D-luciferin. - Öppna in vivo bildbehandling systemet och förbered bildkammaren genom att fodra den med en bit svart cardstock (kassera efter avslutad). Placera näskeglarna efter behov för korrekt anestesi (använd en kon i varje mus).
OBS: Röret som ger anestesen till instrumentet delas så att samma koncentration av anestesi pipas till anestesi-grenrören placerade inuti bildningssystemet. - Överför mössen (upp till 5) från bOx till näskeglarna som är fästa vid grenröret i bildsystemet och stäng dörren. Bildförvärv varar i 5 min.
- Förvärva en BLI med tillverkarens programvara, enligt följande.
- Initiera programvaran. I inkommande kontrollpanel in vivo imaging system sätter du en kryssmarkering bredvid Luminescent . Bekräfta att inställningen för exciteringsfilter är Block och inställningsfiltrets inställning är öppen.
- Klicka på pilarna: För Luminescerande bildläge väljer du en 5-minuters exponeringstid, Binning 8 och F / Stop 1; För fotograferingsläget, välj Binning 4 och F / stop 8.
- Välj rullgardinsmenyn, välj D, 19 cm och en ämneshöjd på 1,5 cm. Klicka på Acquire när du är redo att skaffa bilden.
- När bildförvärvet är klart, placera mössen tillbaka i sina burar.
- Kvantifiera foton som emitteras från specifika regioner med hjälp av tillverkarens programvara.
- Klick
- Klicka på ikonen Kvadrat och dra en kvadrerad avkastning med rätt mått för att täcka ett djurs bröstkorg. Kopiera och klistra in avkastningen för varje djur för att få avkastning med samma dimensioner. Klicka på Mät ROI för att få mätningar av den totala intensiteten i avkastningen på ROI-verktygspanelen.
- Observera ROI-mätdata för alla ROI som skapats i bilderna eller sekvenserna under en session (en ROI per rad). Klicka på Exportera och välj mappen där filen ska sparas.
- Klick
3. Musutmaning med pro-inflammatoriska stimuli
OBS! Före musutmaningen med proinflammatoriska stimuli, kontrollera baslinjens aktivering av I n vivo BLI (se steg 2). Minst 7 dagar måste passera mellan in vivo genavgivning och mousE utmaning för att tillåta mild och transient inflammation att försvinna.
- Förbered utrustningen för intratracheal instillation (se Figur 1 och Figur 2 ).
- Anslut de 5 ml engångssprutorna med fjädern (C, E), en 100 μL spruta (B) och en engångsmätare (D) till 3-vägs stoppskruven (A). Placera systemet på stödet (H). Placera systemet på stödet (H).
- Anslut PE190 mikromedicinska slangen (F) till engångsmätaren (D) och till pennhundratalet (G).
- Fyll 5 ml sprutan med 800 μL luft och vrid 3-vägs stoppskruven.
OBS: Fyll röret med Pseudomonas aeruginosa- kultursupernatant genom att suga 50 μl i 100 μl sprutan.
Figur 1: Schematisk represeNtation av en enda komponent av intratrakealanordningen.
(A) 3-vägs stopcock, (B) 100-liters Hamilton-spruta, (C) engångs-5 ml spruta, (D) engångsmätare, (E) engångsinjektionsspruta med fjäder, (F) PE190 mikromedicinsk slang , (G) nittonhundratal och (H) stöd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representation av den sammansatta intratrakeala enheten.
Identifieringarna är desamma som i Figur 1 . var god klickaHär för att se en större version av denna figur.
- Bedöva mössen med ett isofluranförångarkammare satt till 2,5% isofluran blandat med syre.
- Övervaka djuret för att utvärdera narkosens effekter efter 3 - 5 min.
OBS! För att bekräfta att musen är fullständigt bedövad, övervaka noggrant följande tecken: Långsam andningshastighet bör sakta ner, brist på armsträckning vid upptagning vid nacken och brist på respons när bakbenen stimuleras. Vänta några minuter och kolla igen innan du går vidare till nästa steg om dessa kriterier inte uppfylls. - Placera den bedövade musen på plexiglassintubationsplattformen, häng den med sina snedställningar, vilka placeras på ledningen.
- Slå på laryngoskopet med vänster hand (för högerhänta forskare) och ta ett par trubbiga tångar. Använd laryngoskopets spets och tången för att försiktigt fälla upp munen.
- Dra ut tungan och hGammal den till sidan med hjälp av tången. Styr laryngoskopbladet mot munstyckets baksida. Håll laryngoskopet nedtryckt mycket försiktigt i 90 ° vinkel tills öppningen av luftröret är synlig. Håll laryngoskopet på plats.
- Använd å andra sidan ta avleveringsröret anslutet till änden av PE-röret och sätt in det i luftröret. Vrid trevägsventilen för att leverera inokulatet. Dra röret ur luftstrupen så snart som möjligt. Håll musen upprätt i några sekunder till tillåtet inokulum att inandas i lungorna.
OBS! Möss kommer att kvävas och dö om luftstrupen är blockerad för länge. - Ta bort musen från plattformen. Återhämtningstiden kan variera beroende på stammar; Övervaka musen flitigt och se till att djuret är helt vaknat inom 30 minuter efter proceduren.
- Intraperitoneally injicera 150 mg / kg D-luciferin och bilda lungorna med hjälp av ett in vivo bildningssystem 4, 24 och 48 timmar efter intratrakealtInstillation av stimuli. Kvantifiera foton som emitteras från specifika regioner med hjälp av tillverkarens programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den transienta bIL-8-Luc-transientmusmodellen användes för in vivo övervakning av lunginflammation hos möss utmanade med koncentrerad bakteriell supernatant (30x) innehållande utsöndrade virulensfaktorer. Det inducerade inflammatoriska svaret var detekterbart genom in vivo bildbehandling som en ökning i BLI-signalen. Pro-inflammatorisk aktivitet var tydligt detekterbar 2,5 h efter instillation, även om BLI-signalen nådde den högsta toppen mellan 5 och 24 h och var fortfarande detekterbar vid 48 h ( Figur 3 ).
Figur 3: Representativ in vivo- imaging av lunginflammation inducerad av P. aeruginosa SN i transienta transgena möss IL-8.
Övre panel: Representativa bilder av möss (n = 2 per grupp) intratrachealt insBeklädnad med bakteriell cellfri 30x SN från en Pseudomonas aeruginosa- stam (Pae) efter transient transgenisering med bIL-8-Luc. Möss övervakades med BLI vid 2,5, 5, 4, 24 och 48 h efter stimulering, med en region av intresse dras över bröstet. Nedre panel: Kombinerad data uttryckt som fotoner / s / cm 2 . Varje värde representerar medelvärdet ± SEM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Övergående lunginflammation efter transfektion.
Minskning av bröstet BLI från den första bedömningen (dag 3) efter IV-inokuleringen av bIL-8-Luc. Data uttrycks som fotoner / s / cm 2 ± SEM (n = 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I ett tidigare arbete 11 visades en kontrast mellan bIL-8-Luc-beroende BLI- och BAL-markörer. Det förlitade sig på differentialgraden av känslighet inom musstammar 12 . Av den anledningen kräver den första applikationen av bIL-8-Luc-modellen till en annan musstam en initial studie av det inflammatoriska svaret, både när det gäller BLI och mer standardiserade inflammatoriska markörer.
Mösstransfektion orsakar mild lunginflammation och aktiveringen av bIL-8-Luc, som kan detekteras av BLI upp till 3 - 4 dagar efter DNA-injektion ( Figur 4 ). Det försvinner sedan helt efter 1 vecka 1 . Expressionen av bIL-8-Luc efter genleverans bör alltid verifieras av in vivo BLI, eftersom detta är ett nödvändigt villkor för framgången av följande försökssteg. Efter 7 dagar och före musutmaningen bör baslinjens aktivering registreras till konfIrma försvinnandet av den transfektionsinducerad inflammationen.
Denna metod har testats i den akuta fasen av inflammation, men dess tillämpning på den kroniska fasen har inte testats. Det är inte känt hur den levande mikroorganismerutmaningen kan påverka aktiviteten hos den promotor som används i denna inställning. En ökad förståelse för patogenesen av akut och kronisk inflammation och den därmed följande förändringen av lungfunktionen är avgörande för utvecklingen av effektiva terapier för ett antal kroniska lungsjukdomar 3 , 9 . Djurmodeller fortsätter att vara nödvändiga för detta ändamål, även om begränsningar i exakt reflekterande human sjukdomspatofysiologi är närvarande.
In vivo- övervakningen av inflammatoriska parametrar hos små gnagare med användning av luciferasreportergener härrörande från andra arter är av stort värde. Detta tillvägagångssätt tillåter studien av patofysioLogi av inflammatoriska svar, liksom förmågan att testa interventioner riktade mot deras modulering. Detta testades framgångsrikt med användning av en tidigare väl karaktäriserad bovin IL-8 promotor / luciferas transient transgenerad (boviniserad) musmodell 1 . Vidare visade en nyligen genomförd studie 10 att den modell som beskrivs här är lämplig för övervakning av lunginflammatorisk respons inducerad av bakteriella exoprodukter och för att undersöka verkningsmekanismen för intressanta föreningar av intresse. BLI är ett icke-invasivt tillvägagångssätt som möjliggör longitudinell observation av lunginflammatorisk process efter intratracheal instillation med relevanta stimuli, inklusive P. aeruginosa- kultursupernatant 9 , 10 , 11 . Detta är en uppenbar fördel att studera akut lunginflammation jämfört med klassiska metoder, vilket kräver att djuret uppoffras till kolLeka BAL-vätska och lungorna. Dess värde för studier av kronisk infektion / inflammation har inte tagits upp.
Den nuvarande modellen kan användas för att fördjupa den tillgängliga kunskapen om patogenesen av lunginflammatoriska sjukdomar, inklusive karaktärisering av bakteriella / icke-bakteriella faktorer med proinflammatorisk aktivitet. Vidare kan det underlätta utvärderingen av de möjliga terapeutiska effekterna av molekyler med kända / presumtiva antiinflammatoriska åtgärder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det italienska Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 och av den italienska Cystic Fibrosis League genom Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta Cont la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
