Summary
여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.
Abstract
기도 염증은 세균 감염과 관련이 있으며 폐 질환의 주요 결정 인자입니다. 여러 요인의 염증 유발 능력을 생체 내에서 측정하는 것은 어려우며 기관지 폐포 세척 및 동일 장소 에서 종양 시각화를 배제한 현장 분석을위한 폐 제거와 같은 말단 절차가 필요합니다. 여기에서, 폐 염증은 이종 IL-8 bovine promoter의 조절하에 루시퍼 라 아제 리포터 유전자를 발현하는 transiently transgenized mice에서 Pseudomonas aeruginosa 배양 상등액 (SN)의 기관 내 점적을 통해 유도된다. 폐에서의 루시퍼 라제 발현은 점안 후 2.5-48 시간의 시간대 에 생체 내 생물 발광 이미지 (BLI) 분석에 의해 모니터링된다. 이 절차는 2 ~ 3 개월 이내에 여러 번 반복 할 수 있으므로 동일한 마우스에서 염증 반응을 평가할 수 있습니다동물을 해산 할 필요가있다. 이 접근법은 실시간으로 폐에서 작용하는 항 염증 인자의 모니터링을 허용하며, 기능적 및 약리학 적 연구에 적합하다.
Introduction
천식, 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD), 낭포 성 섬유증 (CF) 및 기관지 확장증과 같은 만성 폐 질환은기도 염증을 특징으로합니다. 기도 염증은 부종, 세포 침투, T 임파구 및 비만 세포 활성화,기도 분비 증가 및 과도한 콜라겐 침착을 특징으로합니다. CF는 다 체계 장애로 사망률 및 이환율의 주요 원인은 폐 악화의 증가로 인한 폐 세균 감염입니다. 폐 기능의 저하는 결과 1 , 2 , 3 , 4를 예견한다.
호흡기의 염증 상태는 일반적으로 가래와 같은 하부기도와 상부기도로부터 유도 된 물질에서 염증 과정 동안 모집 된 면역 마커의 평가를 통해 관찰되며,ults. 기관지 내시경도 시행됩니다 5 . Murine 모델은기도 염증으로 특징 지어지는 질병의 발병 기전과 진화를 조사하고 효과적인 치료법이나 치료법이 아직 밝혀지지 않은 유용한 도구입니다. 폐 감염과 염증의 동물 모델은 천식과 숙주 - 병원체 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다. 예를 들어, 인간의 상태 ( 예 : 담배 연기 노출, LPS, 엘라 스타 제, 오발 부민, 폴리 I : C 등 )를 모방하는 화학 물질의 역할 물론 위의 조합으로) 6 . 염증 관련 매개 변수를 측정하려면 박테리아 부하, 폐의 사이토 카인 및 기관지 폐포 세척액 (BAL)과 같은 요인을 측정하기 위해 침입 접근이 필요하므로 동물을 희생해야합니다. 또한 조직 검사가 종종 필요합니다. 염증 반응 속도론에 대한 정보를 얻을 수있는 가능성은 num쥐. 따라서 동물을 희생 할 필요없이 이러한 정보를 얻을 수있는 기술은 기술적, 윤리적, 경제적 및 운영상의 기반에 가치가 있습니다.
IL-8은 염증 과정에서 필수적인 역할을하며 백혈구를 염증 조직에 모집합니다. 그것은 염증 경로 활성화 연구를위한 분자 판독 값을 나타냅니다. MIP-2 및 KC는 마우스에서 인간 IL-8의 기능 상 동체 일 수있다. 마우스는 단지 하나의 가능한 IL-8 수용체, 인간 CXCR2 7,8 의 동족체를 발현하지만, 이들은 리포터 유전자를 유도하는 이종 IL-8 유전자 프로모터를 조절할 수있다. 폐 염증 쥐 모델은 소 IL-8 프로모터 / 루시퍼 라 아제 리포터 구조물이 마우스에서 트랜스 활성화 될 수 있다는 관찰 후에 최근에 개발되었다. 이 기능을 통해 생체 내 이미징 (BLI)을 통해 생체 내 염증 반응을 모니터링 할 수 있습니다.nimals 9 .
이 모델은 세균 exoproducts ( 예 : LPS 또는 세균성 균주에 의해 방출 된 제품) 또는 TNFα 10,11에 의해 유발 된 염증을 연구하기 위해 채택되었습니다. 약물 발견 과정은 CF, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 폐 질환을 치료할 수있는 새로운 항 염증 분자의 개발 및 최적화에 중점을두고 있습니다. 이 새로운 화학 물질은 똑똑한 임상 시험의 설계를 용이하게하기 위해 특정 임상 표현형과 연결될 수있는 동물 모델에서 신속하고 편리하게 시험되어야합니다.
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Protocol
기술 된 모든 동물 실험은 베로나 대학 (University of Verona)의 실험 연구 서비스 센터 (Interdepartmental Center of Experimental Research Service)의 동물 실험을위한 동물 실험을위한 교내 동물 복지위원회의 승인을 받았으며, European Directive 2010/63 UE, Italian D.Lgs 26/2014 및 개정 된 "실험실 동물의 관리 및 사용 안내서", 워싱턴 DC : National Academy Press, 1996.이 프로토콜과 실험은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (n 273/15)의 승인을 받았습니다. 동물들은 표준 설치 동물과 연화 된 수돗물에 자유롭게 접근 할 수 있었으며 지역의 사료 조건 (실내 온도 : 20-24 ℃, 상대 습도 : 40-70 %, 명암주기 : 12 시간)에 적어도 5 일 동안 순응했다 ).
1. 생체 내 유전자 전달
- 생체 내 전달 시약 / 핵산 복합체를 준비하려면 층류 후드를 사용하십시오.
- 실험 프로토콜 정의하기제조업체의 생체 내 지시에 따라 매개 변수를 변경합니다.
- 마우스 당 복합체 200 μL의 총 주입량을 사용하십시오.
- 내 독소가없는 물에 현탁 된 40 μg의 DNA로 시작하십시오. 최적화 범위는 60 μg에 달할 수 있습니다.
참고 : 주입량에서 핵산의 최종 농도는 제조자의 지침에 따라 0.5 μg / μL를 초과해서는 안됩니다. - N / P 비는 6 - 8 (핵산 1 g 당 0.12 - 0.16 μL의 전달 시약)을 사용하십시오. 배달 시약의 해당 볼륨을 계산합니다.
참고 : 복합체는 효과적인 세포 진입을 위해 양이온 성이어야합니다. N / P 비는 핵산 인산염 (P) 당 생체 내 전달 시약의 질소 잔류 물 (N)의 수로 정의되며 복합체 내의 이온 균형의 척도를 나타냅니다.
- 5 % 포도당 (최종 농축 물)에서 계산 된 양의 핵산을 희석한다 (단계 1.2.1 참조)10 % 포도당 스톡 용액 (제공)과 멸균 수를 사용하여 배양한다. 희석 볼륨이 최종 주입 볼륨의 절반인지 확인하십시오. 부드럽게 소용돌이 치거나 위아래로 pipetting하여 섞는다.
- 10 % 포도당 스톡 용액 (제공됨)과 멸균 수를 사용하여 5 % 포도당 (최종 농도)의 주입량의 절반으로 전달 시약의 계산 된 양 (1.2.3 참조)을 희석하십시오. 부드럽게 소용돌이 치며 13,000 xg에서 15 초 동안 스핀하십시오.
- 희석 핵산에 위의 희석 전달 시약을 한꺼번에 첨가하십시오. 부드러운 vortexing하여 그들을 혼합하고 15 초 동안 13,000 XG에서 스핀 다운.
- 실온에서 15 분 동안 1.5 단계에서 혼합물을 품어.
참고 :이 시점부터 복합체는 실온에서 4 시간 동안 안정되고 4 ℃에서 보관하면 최대 7 일 동안 안정합니다. - 실온에서 평형화 된 복합체를 사용하여 꼬리 정맥 주사를 시행하십시오. 정맥 확장을 위해 30 초 동안 마우스 꼬리를 따뜻한 물 (50 - 53 ° C)에 넣으십시오.
- 마우스를 제지 장치 안에 놓습니다. 27-30 게이지 바늘을 꼬리 정맥에 20-30 ° 각도로 삽입하고 천천히 200 μL를 주입합니다. 완료되면 바늘을 제거하고 주사 부위에 압력을가하십시오.
참고 : 주입 도중 꼬리 부분이 약간 부풀어 있으면 잘못된 위치를 나타냅니다. 이 경우 바늘을 제거하고 이전 사이트에 근접한 절차를 반복하십시오.
- 마우스를 제지 장치 안에 놓습니다. 27-30 게이지 바늘을 꼬리 정맥에 20-30 ° 각도로 삽입하고 천천히 200 μL를 주입합니다. 완료되면 바늘을 제거하고 주사 부위에 압력을가하십시오.
- 정맥 주사 후 24 및 48 시간 에 생체 내 BLI (단계 2 참조)를 수행 하여 유전자 발현을 시각화하십시오.
2. In Vivo BLI
참고 : DPBS에 15 mg / mL D-luciferin의 새로운 원액을 미리 준비하고 0.22 μm 필터링 장치를 사용하여 필터 살균 한 후 -20 ° C에 보관하십시오.
- 맑은 플렉시 유리 마취 챔버에 생쥐를 놓습니다. 이소 플루 란 챔버가 가득 차 있는지 확인하십시오. 동물을 마취 할 준비가되면 펌프 (left) 및 챔버 (오른쪽) 스위치가 켜져 있습니다. isoflurane 다이얼을 유도 용으로 2.5 %, 유지 보수 용으로 2 %로 돌립니다. IVIS 챔버 내부의 동물은 이미지 수집 중에 isofluorane 마취 2.5 % 이하로 유지됩니다.
- 마우스가 완전히 anesthetized 후, 이미징하기 전에 intraperitoneal 경로 15 분 D - luciferin 솔루션 10 ML / kg bodyweight를 주입하십시오.
참고 : D - luciferin의 운동 후 신호 피크의 시간을 결정하기 위해 D - luciferin에 대한 운동 연구가 수행되어야합니다. - 생체 내 이미징 시스템을 열고 검정 cardstock (완료시 폐기) 조각으로 줄 지어 이미지 챔버를 준비합니다. 올바른 마취를 위해 필요에 따라 코 콘을 놓습니다 (마우스 당 하나의 원추체 사용).
참고 : 마취를기구에 공급하는 튜브는 분할되어 동일한 마취 농도가 이미징 시스템 내부에있는 마취 매니 폴드에 연결됩니다. - b에서 마우스를 옮기십시오 (최대 5 개).황소를 이미징 시스템의 매니 폴드에 부착 된 코 콘에 연결하고 문을 닫습니다. 이미지 수집은 5 분간 지속됩니다.
- 다음과 같이 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 BLI를 획득하십시오.
- 소프트웨어를 초기화하십시오. 생체 내 이미징 시스템 획득 제어 패널에서 발광 (Luminescent) 옆에 체크 표시를하십시오. Excitation Filter 설정이 Block이고 Emission Filter 설정이 Open인지 확인하십시오.
- 화살표를 클릭하십시오 : 발광 이미징 모드의 경우 5 분 노출 시간, Binning 8 및 F / Stop 1을 선택하십시오. 사진 이미징 모드에서 Binning 4 및 F / stop 8을 선택하십시오.
- 필드보기 드롭 다운 목록에서 D, 19 cm 및 제목 높이 1.5 cm를 선택합니다. 이미지를 수집 할 준비가되면 획득을 클릭하십시오.
- 이미지 수집이 완료되면 마우스를 다시 새장에 넣습니다.
- 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 특정 지역에서 방출되는 광자를 정량화하십시오.
- 딸깍 하는 소리
- 사각형 아이콘을 클릭하고 한 동물의 흉부를 덮을 적절한 크기의 제곱 된 ROI를 그립니다. 각 동물에 대한 ROI를 복사하여 붙여 넣어 같은 크기의 ROI를 얻으십시오. ROI 도구 패널에서 ROI 측정을 클릭하여 ROI 의 전체 강도를 측정합니다.
- 세션 동안 이미지 또는 시퀀스에서 생성 된 모든 ROI (ROI 당 ROI)에 대한 ROI 측정 데이터를 관찰합니다. 내보내기를 클릭하고 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오.
- 딸깍 하는 소리
3. 프로 염증성 자극으로 마우스 챌린지
참고 : 친 염증성 자극으로 마우스를 공격하기 전에 생체 내 BLI로 기준 활성을 확인하십시오 (2 단계 참조). in vivo 유전자 전달과 mous 사이 에 최소 7 일이 경과해야합니다.경미하고 일시적인 염증이 사라지도록 도전하십시오.
- 기관 삽관을위한 장비를 준비하십시오 ( 그림 1 및 그림 2 참조 ).
- 스프링 (C, E), 100 μL 주사기 (B) 및 일회용 게이지 (D)가있는 5 ml 일회용 주사기를 3 방향 멈춤 쇠 (A)에 연결하십시오. 시스템을 지지대 (H) 위에 놓습니다. 시스템을 지지대 (H) 위에 놓습니다.
- PE190 마이크로 의료용 튜브 (F)를 일회용 게이지 (D)와 펜 세기 (G)에 연결하십시오.
- 공기 800 μL로 5 ML 주사기를 채우고 3 방향 stopcock을 돌려.
참고 : 100 μl 주사기에 50 μl aspirating하여 Pseudomonas aeruginosa 문화 뜨는로 튜브를 채 웁니다 .
그림 1 : 도식적 인 Represe기관 내 단일 장치 구성.
(A) 3 방향 스톱 콕, (B) 100 μL 해밀턴 주사기, (C) 일회용 5 mL 주사기, (D) 일회용 게이지, (E) 스프링이 달린 일회용 5 mL 주사기, , (G) 펜 세기, (H) 지원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 조립 된 기관 내 장치의 표현.
ID는 그림 1 과 동일합니다. 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 산소와 혼합 2.5 % isoflurane에 설정된 isoflurane 기화기 챔버를 사용하여 마우스를 마취.
- 3 ~ 5 분 후 마취의 효과를 평가하기 위해 동물을 모니터링하십시오.
참고 : 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하려면 조심스럽게 다음 징후를 모니터링하십시오. 호흡 속도가 느려야하고, 목에 걸릴 때 팔이 늘어나지 않고 뒷다리가 자극을받을 때 반응이 부족해야합니다. 이러한 기준을 충족하지 못하면 다음 단계로 진행하기 전에 몇 분 정도 기다렸다가 다시 확인하십시오. - 마취 된 마우스를 플렉시 유리 삽관 플랫폼에 놓고 전치부에 걸고 와이어 위에 놓습니다.
- 왼쪽 손으로 후두경을 켜고 (오른 손잡이 연구자 용) 뭉툭한 끝이 나는 포 셉을 잡으십시오. 후두 팁과 집게를 사용하여 부드럽게 입을 벌리십시오.
- 혀를 당기고 h포 셉를 사용하는 측면에 오래 된. 후두쪽으로 칼날을 가이드하십시오. 후두경을기도가 열릴 때까지 90 ° 각도로 매우 가볍게 누르십시오. 후두경을 제자리에 잡습니다.
- 다른 손을 사용하여 전달 튜브를 PE 튜브 끝에 연결하여 그것을 기관으로 삽입하십시오. 세 방향 밸브를 돌려 접종원을 전달하십시오. 튜브를 가능한 한 빨리 기관에서 꺼내십시오. 폐에 흡입 할 수있는 접종 물이 생길 때까지 마우스를 몇 초 동안 똑바로 세웁니다.
참고 :기도가 너무 오래 막히면 마우스가 질식하고 사망합니다. - 플랫폼에서 마우스를 제거하십시오. 회복 시간은 긴장에 따라 다를 수 있습니다. 수술 후 30 분 이내에 동물이 완전히 깨어 있도록 마우스를 부지런히 관찰하십시오.
- Intraperitoneally 150 MG / kg D - luciferin을 주사하고 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 폐를 이미지 4, 24, 48 시간 후 기관지자극의 점적. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 특정 지역에서 방출되는 광자를 정량화하십시오.
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Representative Results
bIL-8-Luc 일시적 형질 전환 마우스 모델은 분비 된 독성 인자를 함유하는 농축 된 박테리아 상등액 (30x)으로 항원 투여 된 마우스에서 폐 염증의 생체 내 모니터링을 위해 사용되었다. 유도 된 염증 반응은 BLI 신호의 증가로서 생체 내 이미징에 의해 검출 가능 하였다. BLI 시그널은 5 시간에서 24 시간 사이 최고 피크에 도달 했음에도 불구하고 프로 염증성 활성이 점안 후 2.5 시간에 명확하게 검출되었으며 48 시간 ( 그림 3 )에서 여전히 검출 가능했습니다.
도 3 : IL-8 일시적 형질 전환 마우스의 P. aeruginosa SN에 의해 유발 된 폐 염증의 대표적인 생체 내 이미징.
상부 패널 : 마우스의 대표 이미지 (그룹당 2 개) intratracheally insbIL-8-Luc을 일시적으로 형질 전환시킨 후 Pseudomonas aeruginosa 균주 (Pae)에서 박테리아 무 세포 30x SN으로 처리 하였다. 자극 후 2.5, 5, 4, 24 및 48 시간에 BLI에 의해 마우스를 모니터하고 관심 부위를 가슴 위로 끌어 당겼다. 하단 패널 : 결합 된 데이터는 광자 / s / cm 2로 표시 됩니다. 각 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Transfection 후 일시적인 폐 염증.
bIL-8-Luc의 IV 접종 후 첫 번째 평가 (3 일)로부터 흉부 BLI의 감소. 데이터는 광자 / s / cm 2 ± SEM (n = 6)으로 표시됩니다.
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Discussion
이전 연구 11 에서 bIL-8-Luc 의존성 BLI와 BAL 마커 사이의 대조가 나타났다. 그것은 마우스 균주 내 민감도 차이에 의존했다. 이러한 이유 때문에 bIL-8-Luc 모델을 다른 마우스에 처음 적용하기 위해서는 BLI와 표준화 된 염증 표지자 모두에서 염증 반응에 대한 초기 연구가 필요합니다.
마우스 transfection은 경미한 폐 염증과 DNA 주입 후 3 ~ 4 일까지 BLI가 검출 할 수있는 bIL-8-Luc의 활성화를 유발합니다 ( 그림 4 ). 그런 다음 1 주일 후에 완전히 사라집니다. 유전자 전달 후 bIL-8-Luc의 발현은 생체 내 BLI에 의해 검증되어야하는데, 이는 다음 실험 단계의 성공을위한 필수 조건이기 때문입니다. 7 일 및 마우스 챌린지 이전에 기준선 활성화를 conf에 기록해야합니다형질 감염에 의해 유발 된 염증의 소멸을 확인하십시오.
이 접근법은 염증의 급성기에 대해 시험되었지만, 만성기에의 적용은 시험되지 않았다. 살아있는 미생물 챌린지가이 환경에서 사용 된 발기인의 활동에 어떻게 영향을 줄 수 있는지는 알려지지 않았습니다. 급성 및 만성 염증의 병인에 대한 이해 증진과 결과적으로 폐 기능의 변화는 많은 만성 폐 질환 3 , 9에 대한 효과적인 치료법의 개발에 필수적이다. 인간의 질병 병태 생리학을 정확하게 반영하는 데 한계가 있지만 동물 모델은 이러한 목적을 위해 계속 필요합니다.
다른 종에서 파생 된 루시퍼 레이즈 리포터 유전자를 사용하여 작은 설치류에서 염증 매개 변수 를 생체 내 모니터링하는 것은 큰 가치가 있습니다. 이 접근법은 pathophysio염증 반응의 logy뿐만 아니라 그들의 변조를 목표로 개입을 테스트하는 능력. 이것은 이전에 잘 특성화 된 소 IL-8 프로모터 / 루시퍼 라 아제 transiently transgenized (bovinized) 마우스 모델 1을 사용하여 성공적으로 테스트되었습니다. 더욱이, 최근의 연구는 박테리아 exoproducts에 의해 유발 된 폐 염증 반응을 모니터링하고 관심있는 화합물 (들)의 작용 메카니즘을 조사하는데 적합한 모델임을 시사했다. BLI는 P. aeruginosa 배양 상등액 9 , 10 , 11을 포함한 관련 자극을 사용하여 기관 내 점적 후 폐 염증 과정을 종단 관찰 할 수있는 비 침습적 접근법입니다. 이것은 동물의 희생을 요구하는 고전적 방법에 비해 급성 폐 염증을 연구하는 명백한 이점입니다BAL 액 및 폐를 처방하십시오. 만성 감염 / 염증 연구에 대한 그 가치는 다루어지지 않았습니다.
현재 모델은 염증성 활동과 세균 / 비 박테리아 요인의 특성화를 포함하여 폐 염증성 질환의 pathogenesis에 대한 가능한 지식을 심화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 알려진 / 추정 안티 - 염증성 행동과 분자의 가능한 치료 효과의 평가를 용이하게 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 이탈리아 낭성 섬유증 재단 프로젝트 FFC # 18 / 2013, FFC # 29 / 2015 및 Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus를 통한 이탈리아 낭포 성 섬유종 연맹의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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