Summary
这里描述的方法允许通过非侵入性生物发光成像（BLI）在小鼠肺中IL-8启动子依赖性炎症激活的可视化。荧光素酶报告基因构建体的交付时间可以将相同的动物多次进行BLI多至两个月。
Abstract
气道炎症通常与细菌感染相关，代表肺部疾病的主要决定因素。各种因素的促炎能力的体内测定是具有挑战性的，并且需要终端程序，例如支气管肺泡灌洗和用于原位分析的肺的去除，排除了在同一只小鼠中的纵向可视化。在这里，通过在异源IL-8牛启动子的控制下，表达荧光素酶报告基因的瞬时转基因小鼠气管内滴注铜绿假单胞菌培养上清（SN）诱导肺部炎症。通过在滴注后2.5至48小时的时间范围内的体内生物发光图像（BLI）分析来监测肺中的荧光素酶表达。该过程可在2-3个月内重复多次，从而允许评估同一小鼠的炎症反应需要终止动物。这种方法允许实时监测在肺中起作用的促炎症因子和抗炎因子，并且似乎适合于功能和药理学研究。
Introduction
慢性肺部疾病，如哮喘，慢性阻塞性肺疾病（COPD），囊性纤维化（CF）和支气管扩张，其特征在于气道炎症。气道炎症的特征在于水肿，细胞浸润，T淋巴细胞和肥大细胞活化，气道分泌增加和胶原沉积过多。 CF是多系统疾病，其主要死因和发病原因是肺细菌感染与肺部恶化加重。肺功能的下降预测显着较差的结果1，2，3，4 。
呼吸道的炎症状态通常通过评估在炎症过程中引发的免疫标记来观察，所述免疫标记来源于下呼吸道和上呼吸道，例如痰液，其提供可变的resULTS。支气管镜也进行5 。鼠模型是研究以气道炎症为特征的疾病的发病机理和进展的有价值的工具，并且尚未确定有效的治疗或治疗方法。肺部感染和炎症的动物模型已被用于研究哮喘和宿主 - 病原体相互作用，包括模拟人类病症的化学物质的作用（ 例如，香烟烟雾暴露，LPS，弹性蛋白酶，卵白蛋白，poly I：C 等 ，作为以及上述的组合） 6 。炎症相关参数的测量需要牺牲动物，因为需要侵入性方法来测量诸如细菌负荷，肺中的细胞因子和收集的支气管肺泡灌洗液（BAL）液体等因素。此外，通常需要进行组织学检查。获得关于炎症反应动力学的信息的可能性需要使用numerous小鼠因此，在技术，道德，经济和运营基础上，无需牺牲动物就可以获得这种信息的技术是有价值的。
IL-8是炎症过程中的重要参与者，将白细胞募集到发炎组织。它代表了炎症途径激活研究的分子读数。 MIP-2和KC可以是小鼠中人IL-8的功能同源物。小鼠仅表达一种潜在的IL-8受体，即人CXCR2,7,8的同系物，但它们能够调节驱动报告基因的异源IL-8基因启动子。在观察到牛IL-8启动子/荧光素酶报告基因构建体可以在小鼠中反式激活之后，最近开发了肺炎症鼠模型。该功能允许利用生物发光成像（BLI）监测生活中的炎症反应小数9 。
该模型已经适应于研究由细菌外源产物（ 例如 LPS或细菌株释放的产物）或TNFα10,11引起的炎症。药物发现过程的重点是开发和优化可以治疗肺部疾病如CF，哮喘和COPD的新旧抗炎分子。这些新的化学实体必须在可以与特定临床表型相关联的动物模型中快速方便地进行测试，以便于智能临床试验的设计。
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Protocol
描述的所有动物实验由维罗纳大学实验研究服务部门间动物实验室内动物福利委员会批准，并遵守欧洲指令2010/63 UE，意大利D.Lgs 26/2014和修订版“实验动物护理和使用指南”，华盛顿特区：国家科学院出版社，1996年。该方案和实验由美国国家卫生研究院（n 273/15）批准。动物可以自由进入标准的啮齿动物食物和软化的自来水，并且适应环境至少5天到当地的生殖条件（室温：20-24℃;相对湿度：40-70％;光暗周期：12小时）在任何治疗之前。
体内基因递送
- 使用层流罩来制备体内递送试剂/核酸复合物。
- 定义实验方案and参数遵循制造商的体内指示。
- 每只小鼠使用200μL复合物的总注射体积。
- 从悬浮在无内毒素水中的40μgDNA开始;优化范围可达60μg。
注意：根据制造商的说明，注射体积中核酸的最终浓度不得超过0.5μg/μL。 - 使用N / P比为6-8（每克核酸为0.12-0.16μL的递送试剂）。计算相应的输送试剂体积。
注意：复合物应该是阳离子的，用于有效的细胞进入。 N / P比定义为每个磷酸核酸（P）的体内递送试剂上的氮残基数（N），并表示复合物内离子平衡的量度。
- 在5％葡萄糖（最终浓度）中稀释计算量（参见步骤1.2.1）核酸使用10％葡萄糖储备溶液（提供）和无菌水。确保稀释体积是最终进样体积的一半。轻轻旋转或通过上下移动混合。
- 使用10％葡萄糖储备溶液（提供）和无菌水将计算量（见步骤1.2.3）稀释为5％葡萄糖（终浓度）的一半注射体积。轻轻涡旋，旋转13,000 xg 15秒。
- 将上述稀释的递送试剂一次性加入到稀释的核酸中。通过温和涡旋混合，并以13,000 xg的速度旋转15秒。
- 在室温下将混合物从步骤1.5中孵育15分钟。
注意：从这一点开始，复合物在室温下稳定4小时，在4℃下储存多达7天。 - 使用在室温下平衡的复合物进行尾静脉注射。将小鼠尾巴放入温水（50-53℃）30秒以允许静脉扩张。
- 将鼠标放在约束装置内。在20-30°角的尾静脉插入一个27至30号的针头，缓慢注射200μL。完成后，取下针头并向注射部位施加压力。
注意：注射期间尾部轻微的凸起表示定位不正确。如果发生这种情况，请取出针头并重复上一个位置附近的过程。
- 将鼠标放在约束装置内。在20-30°角的尾静脉插入一个27至30号的针头，缓慢注射200μL。完成后，取下针头并向注射部位施加压力。
- 在静脉内注射后24和48 h，通过体内 BLI（见步骤2）显示基因表达。
2. 体内 BLI
注意事项：事先准备，在DPBS中制备15 mg / mL D-荧光素的新鲜溶液，使用0.22μm过滤装置对其进行过滤灭菌，并将其储存在-20°C。
- 将小鼠放入透明有机玻璃麻醉室。确保异氟醚室已满。准备麻醉动物时，确保泵（left）和室（右）开关打开。将异氟烷表盘转换为2.5％的感应和2％的维护。 IVIS室内的动物在图像采集期间保持在2.5％异氟烷麻醉下。
- 在小鼠完全麻醉后，在成像前15分钟通过腹膜内途径注射10mL / kg体重的D-萤光素溶液。
注意：应该对D荧光素进行动力学研究以确定给予D-荧光素后信号峰的时间。 - 打开体内成像系统，并通过用一块黑色卡片衬垫来准备成像室（完成时丢弃）。根据需要放置鼻锥，以进行正确的麻醉（每只小鼠使用一个锥体）。
注意：将麻醉用于仪器的管是分开的，使得相同浓度的麻醉被引导到位于成像系统内部的麻醉歧管。 - 从b转移小鼠（最多5个）牛到连接到成像系统中的歧管的鼻锥并且关闭门。图像采集持续5分钟。
- 使用制造商的软件获取BLI，如下所示。
- 初始化软件在体内成像系统采集控制面板中，在Luminescent旁边加上一个复选标记。确认激励滤波器设置为阻塞，发射滤波器设置为打开。
- 点击箭头：对于发光成像模式，选择5分钟的曝光时间，Binning 8和F / Stop 1;对于照相成像模式，选择Binning 4和F / stop 8。
- 从“视野”下拉列表中，选择D，19厘米，主题高度为1.5厘米。准备好获取图像时单击“获取”。
- 图像采集完成后，将鼠标放回笼子中。
- 使用制造商的软件量化从特定地区发射的光子。
- 点击
- 点击Square图标，绘制一个平方的ROI，其尺寸适当，以覆盖一只动物的胸部。复制并粘贴每只动物的ROI，以获得具有相同尺寸的ROI。在“ROI工具”面板中，单击“ 测量ROI”以获取ROI中总强度的度量。
- 观察在会话期间在图像或序列中创建的所有ROI的ROI测量数据（每行一个ROI）。单击导出并选择文件将被保存的文件夹。
- 点击
3.炎症刺激的老鼠挑战
注意：在用促炎症刺激进行小鼠攻击之前，通过体内 BLI检查基线激活（参见步骤2）。至少7天必须在体内基因传递和摩尔之间通过挑战来让轻度和短暂的炎症消失。
- 准备用于气管内滴注的设备（参见图1和图2 ）。
- 将5 ml一次性注射器与弹簧（C，E），100μL注射器（B）和一次性量规（D）连接到三通旋塞阀（A）。将系统放在支架（H）上。将系统放在支架（H）上。
- 将PE190微型医疗管（F）连接到一次性量规（D）和笔世纪（G）。
- 向5 mL注射器中注入800μL空气，然后转动3路旋塞。
注意：通过在100μl注射器中吸出50μl向铜管填充铜绿假单胞菌培养物上清液。
图1：示意图代码气管内装置的单一组成部分。
（A） 3路旋塞阀， （B） 100μL汉密尔顿注射器， （C）一次性5 mL注射器， （D）一次性计量器， （E）一次性5 mL带弹簧的注射器， （F） PE190微型医用管， （G）笔世纪和（H）支持。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：组装的气管内装置的表示。
标识与图1相同。 请点击这里可以查看这个数字的较大版本。
- 使用设在2.5％异氟烷与氧气混合的异氟烷蒸发器室麻醉小鼠。
- 监测动物，评估3-5分钟麻醉后的效果。
注意：要确认鼠标完全麻醉，请仔细监测以下标志：呼吸速度减慢，颈部捡起时手臂伸展不足，后肢刺激时缺乏反应。再等几分钟，再检查一下，如果不符合这些条件，则继续下一步。 - 将麻醉的小鼠放在有机玻璃插管平台上，将其悬挂在门牙上，将其放置在电线上。
- 用左手打开喉镜（右手研究人员），并抓住一双平头镊子。使用喉镜尖和镊子轻轻撬开口。
- 拉舌头和h使用镊子将其老化到侧面。将喉镜刀片引导到嘴巴的后面。保持喉镜以90°的角度非常缓慢的按压直到气管的开口可见。握住喉镜就位。
- 另一方面，将输送管连接到PE管的末端并将其插入气管。旋转三通阀以递送接种物。尽快将气管拔出气管。将鼠标悬挂几秒钟，让接种物吸入肺部。
注意：如果气管阻塞太久，小鼠会窒息死亡。 - 从平台上移除鼠标。恢复时间可能会因应变而有所不同;仔细监测小鼠，确保动物在手术后30分钟内完全清醒。
- 腹膜内注射150 mg / kg D-荧光素，并在气管内4,24和48 h后使用体内成像系统对肺进行成像滴注刺激。使用制造商的软件量化从特定地区发射的光子。
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Representative Results
将bIL-8-Luc瞬时转基因小鼠模型用于体内监测用含有分泌的毒力因子的浓缩细菌上清液（30x）攻击的小鼠的肺部炎症。诱导的炎症反应可通过体内成像检测，因为BLI信号的增加。尽管BLI信号在5和24小时之间达到最高峰，并且在48小时仍然是可检测的，但在滴注后2.5小时可清楚地检测出促炎活性。
图3：在白介素-8瞬时转基因小鼠中由铜绿假单胞菌 SN诱导的肺炎的代表性体内成像。
上图：气管插入的小鼠的代表性图像（每组n = 2）在用bIL-8-Luc进行瞬时转基因后，用来自铜绿假单胞菌菌株（Pae）的细菌细胞的30x SN进行研磨。在刺激后2.5,5,4,44和48小时通过BLI监测小鼠，感兴趣的区域画在胸部。下图：以光子/ s / cm 2表示的组合数据。每个值代表平均值±SEM。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：转染后的瞬时肺炎。
第一次评估（第3天），bIL-8-Luc IV接种后胸部BLI降低。数据表示为光子/ s / cm 2 ±SEM（n = 6）。
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Discussion
在以前的工作11中 ，显示了bIL-8-Luc依赖性BLI和BAL标记之间的对比。它依赖于小鼠品系12的敏感程度差异。因此，bIL-8-Luc模型首次应用于不同的小鼠品系需要对BLI和更标准化的炎症标记物进行初步的炎症反应研究。
小鼠转染引起轻度肺部炎症和bIL-8-Luc的活化，这可以通过BLI在DNA注射后3〜4天可以检测到（ 图4 ）。 1周后完全消失1 。基因传递后bIL-8-Luc的表达应始终通过体内 BLI进行验证，因为这是以下实验步骤成功的必要条件。 7天后，在小鼠攻击之前，应记录基线激活确认转染诱导的炎症消失。
这种方法已经在炎症的急性期进行了测试，但其对慢性期的应用尚未测试。不知道活微生物攻击如何影响在这种情况下使用的启动子的活性。对急性和慢性炎症的发病机理的更多了解以及由此导致的肺功能的改变对于开发许多慢性肺部疾病的有效治疗是至关重要的。动物模型为此目的仍然是必要的，尽管存在精确反映人类疾病病理生理学的局限性。
使用来自其他物种的荧光素酶报告基因，小型啮齿动物的炎症参数的体内监测具有重要的价值。这种方法允许研究病理生理炎症反应的逻辑，以及测试针对其调节的干预的能力。使用以前良好表征的牛IL-8启动子/荧光素酶瞬时转化（bovinized）小鼠模型1成功测试。此外，最近的一项研究10表明，这里描述的模型适用于监测由细菌外产物引起的肺炎症反应和调查感兴趣的化合物的作用机制。 BLI是一种非侵入性方法，允许气管内滴注后的肺炎症过程的纵向观察与相关刺激，包括铜绿假单胞菌培养物上清液9,10,11 。与传统方法相比，这是研究急性肺部炎症的明显优势，需要牺牲动物至肠道选BAL液和肺。其慢性感染/炎症研究的价值尚未得到解决。
本模型可用于深化肺炎性疾病发病机理的现有知识，包括细菌/非细菌因子与促炎活性的鉴定。此外，它可以促进评估具有已知/推定的抗炎作用的分子的可能的治疗效果。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到意大利囊性纤维化基金会项目FFC＃18/2013，FFC＃29/2015和意大利囊性纤维变性联盟的支持，该联盟通过威尼托分公司 - 协奏曲Veneta Lotta控制Fibrosi Cistica Onlus。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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