Summary
本明細書に記載の方法は、非侵襲性生物発光イメージング（BLI）を介したマウスの肺におけるIL-8プロモーター依存性炎症活性化の視覚化を可能にする。同じ動物を、ルシフェラーゼレポーター構築物の送達の時点から2ヶ月まで、複数回BLIに供することができる。
Abstract
気道炎症はしばしば細菌感染に関連し、肺疾患の主要な決定要因である。 インビトロでの種々の因子の炎症誘発能力の決定は困難であり、気管支肺胞洗浄およびその場での分析のための肺の除去などの終末処置を必要とし、同じマウスにおける縦視覚化を排除する。ここで、肺炎症は、異種IL-8ウシプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する一過性にトランスジェニックされたマウスにおける緑膿菌培養上清（SN）の気管内注入により誘導される。肺におけるルシフェラーゼ発現は、点滴後の2.5~48時間の時間フレームにわたるインビボ生物発光画像（BLI）分析によってモニターされる。この手順は2〜3ヶ月以内に複数回繰り返すことができ、同じマウスの炎症反応の評価を可能にする動物を終わらせる必要があります。このアプローチは、リアルタイムで肺に作用する前炎症性因子および抗炎症因子のモニタリングを可能にし、機能的および薬理学的研究に適していると思われる。
Introduction
喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症（CF）および気管支拡張症などの慢性肺疾患は、気道炎症によって特徴付けられる。気道炎症は、浮腫、細胞浸潤、Tリンパ球および肥満細胞活性化、気道分泌の増加、および過剰なコラーゲン沈着を特徴とする。 CFは多系統障害であり、その死亡率および罹患率の主な原因は肺悪化の増大に伴う肺細菌感染である。肺機能の低下は、有意に不良な転帰1,2,3,4を予測する。
気道の炎症状態は、通常、喀痰のような下気道および上気道から誘導された物質における炎症過程中に動員された免疫学的マーカーの評価によって観察され、可変のresウルトラ。気管支鏡検査も行われる5 。マウスモデルは、気道炎症を特徴とする疾患の病因および進化を調査するための有効な治療または治癒がまだ同定されていない貴重なツールである。ヒトの状態（ 例えば、タバコの煙の曝露、LPS、エラスターゼ、オボアルブミン、ポリI：C など ）をシミュレートする化学物質の役割を含む、喘息および宿主 - 病原体の相互作用を研究するために、肺感染および炎症の動物モデルが使用されている上記の組み合わせと同様に） 6 。細菌負荷、肺のサイトカイン、および気管支肺胞洗浄液（BAL）を収集するために侵襲的アプローチが必要とされるため、炎症関連パラメータの測定には動物の犠牲が必要です。また、組織学的検査がしばしば必要とされる。炎症反応動態に関する情報を得る可能性は、numうっ血性のマウス。したがって、動物を犠牲にする必要なしにそのような情報を得ることを可能にする技術は、技術的、倫理的、経済的、および運用上の基礎上価値がある。
IL-8は、炎症過程に必須のプレーヤーであり、白血球を炎症組織に補充する。これは、炎症経路活性化の研究のための分子読み出しを表す。 MIP-2およびKCは、マウスにおけるヒトIL-8の機能相同体であり得る。マウスは、潜在的なIL-8受容体（ヒトCXCR2の相同体7,8）のみを発現するが、レポーター遺伝子を駆動する異種IL-8遺伝子プロモーターを調節することができる。ウシIL-8プロモーター/ルシフェラーゼレポーター構築物がマウスにおいてトランス活性化され得るという観察の後に、最近、肺炎症マウスモデルが開発された。この特徴は、生物発光イメージング（BLI）を利用して、ニールズ9 。
このモデルは、細菌エキソプロダクト（ 例えば、細菌株によって放出されるLPSまたは産物）またはTNFα10,11によって引き起こされる炎症を研究するために適応されている。創薬プロセスは、CF、喘息、COPDなどの肺疾患を治療することができる新旧の抗炎症分子の開発と最適化に焦点を当てています。これらの新しい化学物質は、スマートな臨床試験の設計を容易にするために、特定の臨床表現型に関連付けることができる動物モデルで迅速かつ簡便に試験されなければならない。
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Protocol
記載されたすべての動物実験は、ベローナ大学の実験研究サービス部門間動物実験のための動物実験のための教室内の動物福祉委員会によって承認され、欧州指令2010/63 UE、Italian D.Lgs 26/2014および改訂版「実験動物のケアおよび使用のためのガイド」ワシントンDC：National Academy Press、1996.このプロトコールおよび実験は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）（n 273/15）によって承認された。動物は、標準的な齧歯類の飼料および軟化した水道水に自由にアクセスし、局所飼料条件（室温：20-24℃;相対湿度：40-70％;明暗サイクル：12時間）に少なくとも5日間順化させた）。
1. インビボ遺伝子送達
- インビボ送達試薬/核酸複合体を調製するために、層流フードを使用する。
- 実験プロトコルを定義するメーカーのインビボでの指示に従って、
- マウス1匹当たり複合体200μLの総注射量を使用する。
- エンドトキシンフリーの水に懸濁したDNA40μgで開始します。最適化範囲は60μgに達する可能性があります。
注記：注入量中の核酸の最終濃度は、製造業者の指示に従って0.5μg/μLを超えてはならない。 - 6〜8のN / P比（1μgの核酸あたり0.12〜0.16μLの送達試薬）を使用してください。送達試薬の対応する容量を計算する。
注：複合体は効果的な細胞侵入のためにカチオン性でなければならない。 N / P比は、核酸リン酸塩（P）当たりのインビボ送達試薬上の窒素残基（N）の数として定義され、錯体内のイオンバランスの尺度を表す。
- 5％グルコース中の核酸の計算量（ステップ1.2.1参照）を希釈する（最終濃度10％グルコースストック溶液（提供された）および滅菌水を用いて調製した。希釈量が最終注入量の半分であることを確認してください。穏やかにボルテックスするか、ピペットで上下に混ぜる。
- 10％グルコースストック溶液（付属）と滅菌水を用いて、5％グルコース（最終濃度）の注入量の半分に、送達試薬の計算量（ステップ1.2.3参照）を希釈する。静かにボルテックスし、13,000 xgで15秒間回転させます。
- 上記の希釈された送達試薬を希釈した核酸に一度に加える。穏やかにボルテックスして混合し、13,000 xgで15秒間回転させます。
- ステップ1.5の混合物を室温で15分間インキュベートする。
注：この時点から、複合体は室温で4時間安定であり、4℃で保存した場合には最大7日間安定です。 - 室温で平衡化した複合体を用いて尾静脈注射を行う。マウスの尾を30秒間温水（50〜53℃）に入れ、静脈の拡張を可能にする。
- マウスを拘束装置の中に置きます。尾静脈に27〜30ゲージの針を20〜30°の角度で挿入し、ゆっくり200μLを注入する。完了したら、針を取り外し、注射部位に圧力を加える。
注：注射中の尾のわずかな膨らみは、誤った位置決めを示します。このような場合は、ニードルを取り外して、前のサイトの近くでプロセスを繰り返します。
- マウスを拘束装置の中に置きます。尾静脈に27〜30ゲージの針を20〜30°の角度で挿入し、ゆっくり200μLを注入する。完了したら、針を取り外し、注射部位に圧力を加える。
- 静脈注射の24および48時間後にin vivo BLI（工程2参照）を実施することによって遺伝子発現を視覚化する。
インビボ BLI
注：DPBS中の15 mg / mL D-ルシフェリンの新鮮な原液を調製し、0.22μmフィルターを使用してフィルターで滅菌し、-20°Cで保存します。
- マウスを透明なプレキシガラス麻酔チャンバーに入れる。イソフルランチャンバーがいっぱいであることを確認してください。動物を麻酔する準備ができたら、ポンプ（left）とチャンバ（右）スイッチがオンになっています。 isofluraneダイヤルを誘導の場合は2.5％、メンテナンスの場合は2％にします。 IVISチャンバー内の動物は、画像取得中に2.5％イソフルラン麻酔下に保たれる。
- マウスを完全に麻酔した後、イメージングの15分前にD-ルシフェリン溶液10mL / kg体重を腹腔内経路で注射する。
注：D-ルシフェリンの投与後のシグナルピークの時間を決定するために、D-ルシフェリンの動態研究を実施すべきである。 - インビボイメージングシステムを開き、黒いカードストック（完成時に破棄）の部分をライニングしてイメージングチャンバを準備する。正しい麻酔のために必要に応じて鼻コーンを配置します（マウスあたり1つのコーンを使用します）。
注：器具に麻酔を供給するチューブは、同じ濃度の麻酔が画像システム内にある麻酔マニホールドにつながれるように分割されています。 - bからマウス（最大5個）を移すイメージングシステムのマニホールドに取り付けられたノーズコーンに牛を押し込み、ドアを閉じます。画像取得は5分持続する。
- 次のように、製造元のソフトウェアを使用してBLIを取得します。
- ソフトウェアを初期化します。 インビボイメージングシステム取得コントロールパネルでは、 Luminescentの隣にチェックマークを付けます。 Excitation Filter設定がBlockで、Emission Filter設定がOpenであることを確認します。
- 矢印をクリックします：発光イメージングモードの場合、5分の露光時間、Binning 8、F / Stop 1を選択します。写真撮影モードでは、Binning 4とF / stop 8を選択します。
- Field of Viewドロップダウンリストから、D、19 cm、およびSubjectの高さを1.5 cmに設定します。イメージを取得する準備ができたら、「取得」をクリックします。
- 画像の取得が完了したら、マウスをケージに戻します。
- 製造元のソフトウェアを使用して、特定の地域から放出された光子を定量化します。
- クリック
- Squareアイコンをクリックし、1匹の動物の胸郭を覆う適切な寸法の二乗ROIを描きます。各動物のROIをコピー＆ペーストして、同じ次元のROIを取得します。 [ROIツール]パネルで、[ ROIの測定 ]をクリックして、ROIの合計強度の測定値を取得します。
- セッション中に画像またはシーケンスで作成されたすべてのROI（ROIごとに1つのROI）についてROI測定データを観察します。 [エクスポート]をクリックし、ファイルを保存するフォルダを選択します。
- クリック
3.炎症誘発性刺激によるマウスチャレンジ
注：炎症誘発性刺激によるマウスチャレンジの前に、 インビボ BLIによるベースライン活性化をチェックする（ステップ2参照）。 インビボ遺伝子送達とマウスの間で少なくとも7日間は経過しなければならない軽度で一過性の炎症を消失させるための挑戦。
- 気管内注入用に装置を準備する（ 図1および図2を参照）。
- スプリング（C、E）、100μLシリンジ（B）、使い捨てゲージ（D）を3方向ストップコック（A）に接続して使い捨てシリンジを接続します。システムをサポート（H）の上に置きます。システムをサポート（H）の上に置きます。
- PE190マイクロ医療チューブ（F）を使い捨てゲージ（D）とペンの世紀（G）に接続します。
- 5 mLシリンジに空気800μLを満たし、3方向停止コックを回します。
注：100μlのシリンジで50μlを吸引することにより、 Pseudomonas aeruginosa培養上清でチューブを満たします。
図1：回路図のReprese気管内装置の単一構成要素の構成。
（A）三方活栓、 （B） 100μLハミルトンシリンジ、 （C）使い捨て5mLシリンジ、 （D）使い捨てゲージ、 （E）使い捨て5mLシリンジ（バネ付き） 、 （F） PE190マイクロ医療チューブ、 （G）ペンの世紀、 （H）のサポート。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：組み立てられた気管内装置の表示。
識別は図1と同じです。 クリックしてくださいここではこの図のより大きなバージョンを表示します。
- 酸素と混合したイソフルラン2.5％にセットしたイソフルラン気化器チャンバーを用いてマウスを麻酔する。
- 3〜5分後に麻酔薬の効果を評価するために動物を監視する。
注：マウスが完全に麻酔されていることを確認するには、次の徴候を注意深く監視してください：呼吸速度が遅くなる、頸部が拾ったときに腕が伸びない、後肢が刺激されたときに反応がない、これらの基準が満たされない場合、次のステップに進む前に、さらに数分間待ってから再度確認してください。 - 麻酔したマウスをプレキシガラスの挿管台に置き、前歯で吊り下げ、ワイヤー上に置く。
- 左手で喉頭鏡をオンにして（右利きの研究者のために）、鈍端の鉗子を掴む。喉頭鏡と鉗子の先端を静かに口を開けるために使用します。
- 舌を引き出してh古いそれは鉗子を使用して側面に。喉頭鏡の刃を口の後ろに向けてガイドします。気管開口部が見えるまで喉頭鏡を90°の角度で非常に静かに押し下げてください。喉頭鏡を所定の位置に保持する。
- 他方の手でPEチューブの端に接続された送達チューブを取り出し、それを気管に挿入する。 3方向バルブを回して接種材料を送達します。チューブをできるだけ早く気管から引き抜く。肺に吸入するためにマウスを数秒間垂直に保持する。
注：気管が長時間閉塞された場合、マウスは窒息して死ぬでしょう。 - プラットフォームからマウスを取り外します。回復時間は、系統によって異なる場合があります。処置後30分以内に動物が完全に起きていることを確認して、マウスを徹底的にモニターする。
- 150mg / kgのD-ルシフェリンを腹腔内に注射し、気管内投与の4,24、および48時間後のインビボイメージングシステムを用いて肺をイメージングする。刺激の滴下。製造元のソフトウェアを使用して、特定の地域から放出された光子を定量化します。
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Representative Results
BIL-8-Luc一過性トランスジェニックマウスモデルを、分泌されたビルレンス因子を含む濃縮細菌上清（30x）でチャレンジしたマウスの肺炎症のin vivoモニタリングに使用した。誘導された炎症応答は、BLIシグナルの増加としてインビボイメージングによって検出可能であった。前炎症活性は、点眼後2.5時間ではっきりと検出可能であったが、BLIシグナルは5時間から24時間の間に最高ピークに達し、48時間でなお検出可能であった（ 図3 ）。
図3：IL-8一過性トランスジェニックマウスにおけるP.aeruginosa SNによって誘発された肺炎症の代表的なインビボイメージング。
上のパネル：マウスの代表的な画像（群当たりn = 2）気管内挿入bIL-8-Lucでの一過性トランスジェニゼーションの後にシュードモナス・アエルギノサ （ Pseudomonas aeruginosa）株（Pae）からの細菌無細胞30×SNで培養した。刺激後2.5,5,4,24および48時間にBLIによりマウスをモニターし、関心領域を胸部に描いた。下側パネル：光子/ s / cm 2として表される結合データ。各値は平均±SEMを表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：トランスフェクション後の一過性肺炎症。
bIL-8-LucのIV接種後の最初の評価（3日目）からの胸部BLIの減少。データは、光子/ s / cm 2 ±SEM（n = 6）として表される。
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Discussion
以前の研究11では、bIL-8-Luc依存性BLIマーカーとBALマーカーとの間のコントラストが示された。それはマウス系統12内の感度の差異に依存していた12 。この理由から、異なるマウス株へのbIL-8-Lucモデルの最初の適用は、BLIおよびより標準化された炎症マーカーの両方の炎症反応の初期研究を必要とする。
マウスのトランスフェクションは軽度の肺の炎症およびBIL-8-Lucの活性化を引き起こし、これはBLIによりDNA注射後3〜4日まで検出可能である（ 図4 ）。その後、1週間後に完全に消滅する。遺伝子送達後のbIL-8-Lucの発現は、以下の実験ステップの成功のための必要条件であるため、 インビボ BLIによって常に検証されるべきである。 7日後およびマウスチャレンジの前に、ベースライン活性化をconfに記録するトランスフェクションによって引き起こされる炎症の消滅を確認する。
このアプローチは、炎症の急性期において試験されているが、慢性期へのその適用は試験されていない。生きた微生物チャレンジがこの環境で使用されるプロモーターの活性にどのような影響を与えるかは知られていない。急性および慢性の炎症の病因の増加した理解と結果としての肺機能の変化は、多くの慢性肺疾患3,9の有効な治療法の開発に不可欠である。ヒト疾患の病態生理を正確に反映することの限界が存在するが、この目的のためには動物モデルが引き続き必要である。
他の種に由来するルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた小型げっ歯類における炎症パラメータのインビボモニタリングは非常に価値がある。このアプローチは、病態生理学の研究を可能にする炎症性応答のログ、ならびにそれらの調節を目的とした介入を試験する能力が含まれる。これは、以前に十分に特徴付けられたウシIL-8プロモーター/ルシフェラーゼ一過性にトランスジェニックされた（マウス）モデル1を用いて首尾よく試験された。さらに、最近の研究10は、ここに記載されたモデルが、細菌のエキソプロダクトによって誘発された肺の炎症反応をモニターし、目的の化合物の作用機序を調べるのに適切であることを実証した。 BLIは、 緑膿菌培養上清9,10,11を含む関連する刺激を伴う気管内滴下後の肺の炎症プロセスの縦方向の観察を可能にする非侵襲的アプローチである。これは、古典的方法と比較して急性肺炎を研究する明白な利点であり、動物の犠牲を必要とするBAL液と肺を読んでください。慢性感染症/炎症の研究のためのその価値は扱われていない。
本モデルは、炎症促進活性を有する細菌/非細菌因子の特徴付けを含む、肺炎症の病因に関する利用可能な知識を深めるために使用することができる。さらに、それは、既知/推定の抗炎症作用を有する分子の可能な治療効果の評価を容易にすることができる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、イタリア嚢胞性線維症プロジェクトFFC＃18/2013、FFC＃29/2015、イタリア嚢胞性線維症連盟（Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus）の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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