Summary
O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.
Abstract
A inflamação das vias aéreas é freqüentemente associada a infecções bacterianas e representa um importante determinante da doença pulmonar. A determinação in vivo das capacidades pró-inflamatórias de vários fatores é desafiadora e requer procedimentos terminais, como lavagem broncoalveolar e remoção de pulmões para análise in situ , impedindo a visualização longitudinal no mesmo mouse. Aqui, a inflamação do pulmão é induzida através da instilação intratraqueal do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa (SN) em camundongos transitórios transgenizados que expressam o gene repórter de luciferase sob o controle de um promotor bovino de IL-8 heteróloga. A expressão da luciferase no pulmão é monitorada por análise de imagem bioluminescente in vivo (BLI) em um período de 2,5 a 48 h após a instilação. O procedimento pode ser repetido várias vezes em 2 a 3 meses, permitindo a avaliação da resposta inflamatória nos mesmos ratos comA necessidade de terminar os animais. Esta abordagem permite o monitoramento de fatores pró e anti-inflamatórios atuando no pulmão em tempo real e parece adequado para estudos funcionais e farmacológicos.
Introduction
Doenças pulmonares crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC) e bronquiectasias, são caracterizadas por inflamação das vias aéreas. A inflamação das vias aéreas é caracterizada por edema, infiltração celular, ativação de linfócitos T e mastócitos, aumento das secreções das vias aéreas e deposição excessiva de colágeno. A FC é uma desordem multissistêmica e sua principal causa de mortalidade e morbidade é a infecção bacteriana do pulmão com aumento da exacerbação pulmonar. O declínio da função pulmonar prevê um resultado significativamente mais desfavorável 1 , 2 , 3 , 4 .
O estado inflamatório do trato respiratório geralmente é observado através da avaliação de marcadores imunológicos recrutados durante o processo inflamatório em material derivado das vias aéreas inferior e superior, como o escarro, que fornece res variávelUlts. Broncoscopias também são realizadas 5 . Os modelos murinos são ferramentas valiosas para investigar a patogênese e a evolução das doenças caracterizadas pela inflamação das vias aéreas e para as quais tratamentos ou curas efetivos ainda não foram identificados. Modelos animais de infecção pulmonar e inflamação têm sido utilizados para estudar a asma e as interações hospedeiro-patógeno, incluindo o papel dos produtos químicos que simulam condições humanas ( por exemplo, exposição ao fumo do cigarro, LPS, elastase, ovalbumina, poli I: C, etc. Bem como combinações do acima) 6 . A medida dos parâmetros relacionados à inflamação requer o sacrifício dos animais, uma vez que são necessárias abordagens invasivas para medir fatores como carga bacteriana, citoquinas nos pulmões e líquido lavado broncoalveolar coletado (BAL). Além disso, os exames histológicos são freqüentemente necessários. A possibilidade de obter informações sobre a cinética de resposta inflamatória requer o uso de numRatos erosos. Portanto, uma técnica que permita obter essa informação sem a necessidade de sacrificar os animais é valiosa em bases técnicas, éticas, econômicas e operacionais.
A IL-8 é um jogador essencial no processo de inflamação, recrutando leucócitos para o tecido inflamado. Representa uma leitura molecular para o estudo da ativação da via inflamatória. MIP-2 e KC podem ser homólogos funcionais de IL-8 humana em camundongos. Os ratos expressam apenas um potencial receptor de IL-8, um homólogo de CXCR2 7 humano , 8 , mas são capazes de modular um promotor de gene de IL-8 heteróloga que conduz um gene repórter. Um modelo murino de inflamação pulmonar foi recentemente desenvolvido após a observação de que uma construção repórter de IL-8 bovina / repórter de luciferase pode ser transactivada em camundongos. Este recurso permite a utilização de imagens de bioluminescência (BLI) para monitorar a resposta inflamatória ao viver umNimals 9 .
Este modelo foi adaptado para estudar a inflamação desencadeada por exoprodutos bacterianos ( por exemplo, LPS ou produtos liberados por estirpes bacterianas) ou TNFalpha 10 , 11 . O processo de descoberta de drogas está focado no desenvolvimento e otimização de moléculas anti-inflamatórias antigas e novas que podem tratar doenças pulmonares, como CF, asma e DPOC. Essas novas entidades químicas devem ser testadas rápida e convenientemente em modelos animais que podem ser vinculados a fenótipos clínicos específicos para facilitar o projeto de ensaios clínicos inteligentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comité intramural de bem-estar animal para experimentação animal pelo Centro Interdepartamental de Serviço de Pesquisa Experimental na Universidade de Verona e cumprem a Diretiva Européia 2010/63 UE, D.Lgs 26/2014 italiano e a revista "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Este protocolo e experimentação foram aprovados pelos Institutos Nacionais de Saúde (n 273/15). Os animais tinham acesso gratuito a comida de roedor padrão e água de torneira suavizada e foram acalmadas durante pelo menos 5 dias nas condições locais do viveiro (temperatura ambiente: 20 - 24 ° C; umidade relativa: 40 - 70%; ciclo luz-escuro: 12 h ) Antes de qualquer tratamento.
1. Em entrega de genes Vivo
- Use uma cobertura de fluxo laminar para preparar os reagentes de entrega in vivo / complexos de ácido nucleico.
- Definir o protocolo experimental aNd parâmetros seguindo as instruções in vivo do fabricante.
- Use um volume total de injeção de 200 μL de complexos por mouse.
- Comece com 40 μg de DNA suspenso em água isenta de endotoxina; O intervalo de otimização pode atingir 60 μg.
NOTA: A concentração final de ácido nucleico no volume de injeção não deve exceder 0,5 μg / μL, de acordo com as instruções do fabricante. - Use uma relação N / P de 6 - 8 (0,12 - 0,16 μL de reagente de entrega por μg de ácido nucleico). Calcule o volume correspondente de reagente de entrega.
NOTA: Os complexos devem ser catiônicos para a entrada efetiva de células. A relação N / P é definida como o número de resíduos de nitrogênio (N) no reagente de entrega in vivo por fosfato de ácido nucleico (P) e representa a medida do equilíbrio iónico dentro dos complexos.
- Diluir a quantidade calculada (ver passo 1.2.1) de ácido nucleico em 5% de glicose (concentrado finalRação) usando 10% de solução de reserva de glicose (fornecida) e água estéril. Certifique-se de que o volume de diluição seja metade do volume final de injeção. Vortex suavemente ou misture pipetando para cima e para baixo.
- Diluir a quantidade calculada (ver passo 1.2.3) do reagente de entrega em metade do volume de injeção de 5% de glicose (concentração final) usando a solução de reserva de glicose 10% (fornecida) e água estéril. Vortex suavemente e gire em 13.000 xg por 15 s.
- Adicione os reagentes de entrega diluídos acima ao ácido nucleico diluído de uma só vez. Misture-os com um vortex suave e gire para 13,000 xg por 15 s.
- Incubar a mistura do passo 1,5 durante 15 min à temperatura ambiente.
NOTA: A partir deste ponto, os complexos são estáveis durante 4 h à temperatura ambiente e por até 7 dias quando armazenados a 4 ° C. - Execute injeções da veia da cauda usando complexos equilibrados à temperatura ambiente. Coloque a cauda do mouse em água morna (50 - 53 ° C) por 30 s para permitir a dilatação da veia.
- Coloque o mouse dentro do dispositivo de retenção. Insira uma agulha de 27 a 30 pontos na veia da cauda com um ângulo de 20-30 ° e injete lentamente 200 μL. Após a conclusão, remova a agulha e aplique pressão no local da injeção.
NOTA: Uma ligeira protuberância na cauda durante a injeção indica um posicionamento incorreto. Se isso ocorrer, remova a agulha e repita o processo proximal ao site anterior.
- Coloque o mouse dentro do dispositivo de retenção. Insira uma agulha de 27 a 30 pontos na veia da cauda com um ângulo de 20-30 ° e injete lentamente 200 μL. Após a conclusão, remova a agulha e aplique pressão no local da injeção.
- Visualize a expressão do gene ao realizar BLI in vivo (ver passo 2) às 24 e 48 h após a injeção intravenosa.
2. In Vivo BLI
NOTA: Antes, prepare uma solução de reserva fresca de 15 mg / mL de D-luciferina em DPBS, filtre-a esterilizar usando uma unidade de filtragem de 0,22 μm e guarde-a a -20 ° C.
- Coloque os camundongos em uma câmara de anestesia de plexiglass transparente. Certifique-se de que a câmara de isoflurano esteja cheia. Quando estiver pronto para anestesiar os animais, assegure-se de que a bomba (lEft) e os interruptores da câmara (direita) estão ligados. Gire o seletor de isoflurano para 2,5% para indução e 2% para manutenção. Os animais dentro da câmara IVIS são mantidos sob 2,5% de anestesia com isofluorano durante a aquisição da imagem.
- Depois que os ratos são totalmente anestesiados, injete 10 mL / kg de peso corporal da solução de D-luciferina por via intraperitoneal 15 minutos antes da imagem.
NOTA: Um estudo cinético sobre D-luciferina deve ser realizado para determinar o tempo do pico do sinal após a administração de D-luciferina. - Abra o sistema de imagem in vivo e prepare a câmara de imagem, alinhando-a com um pedaço de papelão preto (descarte após a conclusão). Coloque os cones do nariz conforme necessário para a anestesia correta (use um cone por mouse).
NOTA: O tubo que fornece a anestesia ao instrumento é dividido de modo que a mesma concentração de anestesia é encapsulada nos colectores de anestesia localizados dentro do sistema de imagem. - Transfira os ratos (até 5) da bBoi para os cones do nariz ligado ao colector no sistema de imagem e feche a porta. A aquisição da imagem é de 5 min.
- Adquira um BLI usando o software do fabricante, da seguinte forma.
- Inicialize o software. No painel de controle de aquisição de sistema de imagem in vivo , coloque uma marca de seleção ao lado de Luminescent . Confirme se a configuração do filtro de excitação é Bloquear e a configuração do filtro de emissão está aberta.
- Clique nas setas: para o modo Luminescent Imaging, selecione um tempo de exposição de 5 minutos, Binning 8 e F / Stop 1; Para o modo de imagem fotográfica, selecione Binning 4 e F / stop 8.
- Na lista suspensa Campo de exibição, selecione D, 19 cm e Altura do assunto de 1,5 cm. Clique em Adquirir quando estiver pronto para adquirir a imagem.
- Quando a aquisição da imagem estiver completa, coloque os ratos de volta nas suas gaiolas.
- Quantifique os fótons emitidos em regiões específicas usando o software do fabricante.
- Clique
- Clique no ícone Quadrado e desenhe um ROI quadrado com as dimensões adequadas para cobrir o tórax de um animal. Copie e cole o ROI para cada animal para obter ROI com as mesmas dimensões. No painel Ferramentas de ROI, clique em Medir ROI para obter as medidas da intensidade total nos ROIs.
- Observe os dados de ROI Measurements para todos os ROIs criados nas imagens ou seqüências durante uma sessão (um ROI por linha). Clique em Exportar e selecione a pasta onde o arquivo será salvo.
- Clique
3. Desafio do mouse com estímulos pro-inflamatórios
NOTA: Antes do desafio do mouse com estímulos pró-inflamatórios, verifique a ativação da linha de base por BLI i n vivo (ver etapa 2). Pelo menos 7 dias devem passar entre entrega de genes in vivo e mousDesafio para permitir que a inflamação leve e transitória desapareça.
- Prepare o equipamento para instilação intratraqueal (consulte a Figura 1 e a Figura 2 ).
- Conecte as seringas descartáveis de 5 ml com a mola (C, E), uma seringa de 100 μL (B) e uma manivela descartável (D) na torneira de 3 vias (A). Coloque o sistema no suporte (H). Coloque o sistema no suporte (H).
- Conecte a tubulação microfônica PE190 (F) ao medidor descartável (D) e ao século da caneta (G).
- Encha a seringa de 5 mL com 800 μL de ar e gire a torneira de 3 vias.
NOTA: Encha o tubo com sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa aspirando 50 μl na seringa de 100 μl.
Figura 1: Representação esquemáticaNtation de um componente único do dispositivo intratraqueal.
(A) válvula de 3 vias, (B) seringa de Hamilton de 100 μL, (C) seringa descartável de 5 mL, (D) calibre descartable, (E) seringa descartável de 5 mL com mola, (F) tubulação médica micro PE190 (G) pen century, e (H) suporte. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Representação do Dispositivo Intratraqueal Montado.
As identificações são as mesmas da Figura 1 . Por favor cliqueAqui para ver uma versão maior dessa figura.
- Anestesiar os camundongos usando uma câmara de vaporizador de isoflurano ajustada em 2,5% de isoflurano misturado com oxigênio.
- Monitorize o animal para avaliar os efeitos do anestésico após 3 a 5 min.
NOTA: Para confirmar que o mouse está totalmente anestesiado, monitore cuidadosamente os seguintes sinais: a taxa de respiração retardada deve diminuir a velocidade, a falta de alongamento do braço quando pega pelo pescoço e a falta de resposta quando os membros traseiros são estimulados. Aguarde alguns minutos adicionais e verifique novamente antes de prosseguir para o próximo passo se estes critérios não forem cumpridos. - Coloque o mouse anestesiado na plataforma de intubação em plexiglass, pendurado por seus incisivos, que são colocados no fio.
- Ligue o laringoscópio com a mão esquerda (para pesquisadores destros) e pegue um par de fórceps de extremidade frouxa. Use a ponta do laringoscópio e as fórceps para abrir com cuidado a boca.
- Puxe a língua para fora e hVelho ao lado usando a pinça. Guie a lâmina do laringoscópio para a parte de trás da boca. Mantenha o laringoscópio pressionado suavemente em um ângulo de 90 ° até que a abertura da tráquea seja visível. Segure o laringoscópio no lugar.
- Por outro lado, pegue o tubo de entrega conectado ao final da tubulação de PE e insira-o na traquéia. Gire a válvula de três vias para entregar o inóculo. Retire o tubo da tráquea o mais rápido possível. Mantenha o mouse ereto por alguns segundos até permitir que o inóculo seja inalado nos pulmões.
NOTA: Os ratos vão sufocar e morrer se a traquéia estiver bloqueada durante muito tempo. - Remova o mouse da plataforma. O tempo de recuperação pode variar de acordo com as tensões; Monitore o mouse diligentemente, garantindo que o animal esteja completamente acordado dentro de 30 minutos após o procedimento.
- Intraperitoneally injetar 150 mg / kg de D-luciferina e imagem dos pulmões usando um sistema de imagem in vivo 4, 24 e 48 h após o intratraquealInstilação dos estímulos. Quantifique os fótons emitidos em regiões específicas usando o software do fabricante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O modelo de rato transgênico transiente BIL-8-Luc foi usado para o monitoramento in vivo da inflamação pulmonar em camundongos desafiados com sobrenadante bacteriano concentrado (30x) contendo fatores de virulência segregados. A resposta inflamatória induzida foi detectada por imagem in vivo como um aumento no sinal BLI. A atividade pró-inflamatória foi claramente detectável 2,5 h pós-instilação, embora o sinal BLI atingisse o pico mais alto entre 5 e 24 h e ainda era detectável às 48 h ( Figura 3 ).
Figura 3: Imaging representativa de Inflação pulmonar induzida por SN de P. aeruginosa em ratos transgênicos transientes de IL-8.
Painel superior: imagens representativas de camundongos (n = 2 por grupo) intratraquealmente insCultivado com 30x SN sem bactérias de uma estirpe Pseudomonas aeruginosa (Pae) após transgenização transitória com bIL-8-Luc. Os ratos foram monitorados por BLI em 2,5, 5, 4, 24 e 48 h após a estimulação, com uma região de interesse extraída sobre o tórax. Painel inferior: dados combinados expressos como fotões / s / cm 2 . Cada valor representa a média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Inflamação transitória do pulmão após a transfecção.
Diminuição do BLI do tórax a partir da primeira avaliação (dia 3) após a inoculação IV da bIL-8-Luc. Os dados são expressos como fotões / s / cm 2 ± SEM (n = 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em um trabalho anterior 11 , mostrou-se um contraste entre os marcadores BLI e BAL dependentes de BIL-8-Luc. Baseou-se no grau diferencial de sensibilidade dentro das cepas de mouse 12 . Por esta razão, a primeira aplicação do modelo bIL-8-Luc a uma estirpe de rato diferente requer um estudo inicial da resposta inflamatória, tanto em termos de BLI quanto em marcadores inflamatórios mais padronizados.
A transfecção de ratos causa inflamação pulmonar leve e a ativação de bIL-8-Luc, que é detectável por BLI até 3 a 4 dias após a injeção de DNA ( Figura 4 ). Em seguida, desaparece completamente após 1 semana 1 . A expressão de bIL-8-Luc após a administração de genes deve ser sempre verificada por BLI in vivo , uma vez que esta é uma condição necessária para o sucesso das seguintes etapas experimentais. Após 7 dias e antes do desafio do mouse, a ativação da linha de base deve ser registrada em confO desaparecimento da inflamação induzida pela transfecção.
Esta abordagem foi testada na fase aguda da inflamação, mas sua aplicação na fase crônica não foi testada. Não se sabe como o desafio do microorganismo vivo pode afetar a atividade do promotor utilizado nesta configuração. Um aumento da compreensão da patogênese da inflamação aguda e crônica e a consequente alteração da função pulmonar é essencial para o desenvolvimento de terapias efetivas para uma série de doenças pulmonares crônicas 3 , 9 . Os modelos animais continuam sendo necessários para este propósito, embora existam limitações na fatorfisiologia da doença humana com precisão.
O monitoramento in vivo de parâmetros inflamatórios em roedores pequenos usando genes repórteres de luciferase derivados de outras espécies é de grande valor. Esta abordagem permite o estudo do fisiopatológicoLogótipo de respostas inflamatórias, bem como a capacidade de testar intervenções voltadas para sua modulação. Isto foi testado com sucesso utilizando um modelo de rato IL-8 / luciferase transientemente aumentado (bovinizado) 1 previamente caracterizado. Além disso, um estudo recente 10 demonstrou que o modelo aqui descrito é apropriado para monitorar a resposta inflamatória pulmonar induzida por exoprodutos bacterianos e para investigar o mecanismo de ação dos compostos de interesse. O BLI é uma abordagem não-invasiva que permite a observação longitudinal do processo inflamatório pulmonar após a instilação intratraqueal com estímulos relevantes, incluindo o sobrenadante de cultura de P. aeruginosa 9 , 10 , 11 . Esta é uma vantagem óbvia de estudar inflamação pulmonar aguda em comparação com métodos clássicos, que exigem o sacrifício dos animais para colLeve o fluido BAL e os pulmões. Seu valor para o estudo da infecção / inflamação crônica não foi abordado.
O presente modelo pode ser usado para aprofundar o conhecimento disponível sobre a patogênese das doenças inflamatórias pulmonares, incluindo a caracterização de fatores bacterianos / não bacterianos com atividade pró-inflamatória. Além disso, pode facilitar a avaliação dos possíveis efeitos terapêuticos de moléculas com ações anti-inflamatórias conhecidas / presuntivas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Falsificação Física Fibrosis da Fisicologia Cística # 18/2013, FFC # 29/2015 e pela Liga Italiana de Fibrose Cística através do Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
