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Immunology and Infection

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il doi: 10.3791/55499 Published: July 7, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.

Abstract

L'infiammazione delle vie aeree è spesso associata a infezioni batteriche e rappresenta un determinante importante della malattia polmonare. La determinazione in vivo delle capacità proinfiammatorie di vari fattori è impegnativa e richiede procedure terminali, come lavaggio broncoalveolare e rimozione dei polmoni per analisi in situ , escludendo la visualizzazione longitudinale nello stesso topo. Qui, l'infiammazione del polmone è indotta attraverso l'instillazione intratracheale del supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa (SN) in topi transientemente transgeniati che esprimono il gene reporter del luciferasi sotto il controllo di un promotore bovino eterologo IL-8. L'espressione della luciferasi nel polmone è controllata dall'analisi bioluminescente (BLI) in vivo su un tempo di 2,5 a 48 ore dopo l'instillazione. La procedura può essere ripetuta più volte entro 2 - 3 mesi, consentendo così la valutazione della risposta infiammatoria negli stessi topi conLa necessità di terminare gli animali. Questo approccio consente di monitorare in tempo reale i fattori pro e anti-infiammatori che agiscono nel polmone e sembra adatto per studi funzionali e farmacologici.

Introduction

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Malattie polmonari croniche, come l'asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (CF) e la bronchiectasia, sono caratterizzati da infiammazioni delle vie aeree. L'infiammazione delle vie aeree è caratterizzata da edema, infiltrazione cellulare, linfocita T e attivazione delle cellule mastiche, aumento delle secrezioni delle vie aeree e deposizione eccessiva di collagene. CF è un disturbo multisystem e la sua principale causa di mortalità e morbilità è l'infezione batterica polmonare con aggravamento dell'esacerbazione polmonare. Il declino della funzione polmonare prevede un risultato significativamente più povero 1 , 2 , 3 , 4 .

Lo stato infiammatorio del tratto respiratorio è solitamente osservato attraverso la valutazione di marcatori immunologici reclutati durante il processo infiammatorio in materiale derivato dalle vie aeree inferiori e superiori, come l'espettorato, che fornisce resistenza variabileULT. Le broncoscopie sono anche eseguite 5 . I modelli murini sono strumenti preziosi per indagare la patogenesi e l'evoluzione delle malattie caratterizzate da infiammazioni delle vie aeree e per i quali non sono ancora stati identificati trattamenti o cure efficaci. I modelli animali di infezione polmonare e infiammazione sono stati utilizzati per studiare l'interazione tra asma e patogeno, compreso il ruolo di sostanze chimiche che simulano le condizioni umane ( es. Esposizione al fumo di sigarette, LPS, elastasi, ovalbumina, poli I: C ecc. Nonché combinazioni di quanto sopra) 6 . La misura dei parametri legati all'infiammazione richiede il sacrificio degli animali, in quanto sono necessari approcci invasivi per misurare fattori quali il carico batterico, le citochine nei polmoni e il fluido di lavaggio broncoalveolare (BAL). Inoltre, gli esami istologici sono spesso necessari. La possibilità di ottenere informazioni sulla cinetica di risposta infiammatoria richiede l'uso di numTopi erosi. Pertanto, una tecnica che consentirebbe di ottenere tali informazioni senza la necessità di sacrificare gli animali è preziosa su basi tecniche, etiche, economiche e operative.

IL-8 è un giocatore essenziale nel processo infiammatorio, recluta leucociti al tessuto infiammato. Rappresenta una lettura molecolare per lo studio dell'attivazione della via infiammatoria. MIP-2 e KC possono essere omologhi funzionali di umano IL-8 nei topi. I topi esprimono solo un potenziale recettore IL-8, un omologo del CXCR2 umano 7 , 8 , ma sono in grado di modulare un promotore di gene ET-8 eterologo che guida un gene reporter. Un modello murino di infiammazione polmonare è stato recentemente sviluppato dopo l'osservazione che un topo bovino IL-8 promotore / luciferasi reporter construct può essere transactivated nei topi. Questa caratteristica consente l'utilizzo della bioluminescenza imaging (BLI) per monitorare la risposta infiammatoria nel vivere unNomi 9 .

Questo modello è stato adattato per studiare l'infiammazione attivata da esoproduzioni batteriche ( ad es. LPS o prodotti rilasciati da ceppi batterici) o TNFalfa 10 , 11 . Il processo di scoperta di droga è incentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di vecchie e nuove molecole antinfiammatorie che possono trattare le malattie polmonari, come CF, asma e BPCO. Queste nuove entità chimiche devono essere testate rapidamente e convenientemente in modelli animali che possono essere collegati a specifici fenotipi clinici per facilitare la progettazione di studi clinici intelligenti.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti animali descritti sono stati approvati dal comitato intramurale per la sperimentazione animale del Centro Interdipartimentale di Ricerca Sperimentale presso l'Università degli Studi di Verona e rispettano la Direttiva Europea 2010/63 UE, il D.Lgs 26/2014 e la revisione "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Questo protocollo e la sperimentazione sono stati approvati dal National Institutes of Health (n 273/15). Gli animali avevano accesso libero ai normali mangimi di roditori e all'acqua del rubinetto ammorbidito e sono stati acclimatati per almeno 5 giorni alle condizioni locali del vivarium (temperatura ambiente: 20 - 24 ° C, umidità relativa: 40-70%, ciclo chiaro e scuro: 12 h ) Prima di qualsiasi trattamento.

1. In Vivo Gene Delivery

  1. Utilizzare un cappuccio di flusso laminare per preparare i complessi di reagenti / nucleic acido di erogazione in vivo .
  2. Definire il protocollo sperimentale aNd parametri seguendo le istruzioni in vivo del produttore.
    1. Utilizzare un volume totale di iniezione di 200 μL di complessi per mouse.
    2. Inizia con 40 μg di DNA sospeso in acqua senza endotossina; L'intervallo di ottimizzazione può raggiungere 60 μg.
      NOTA: La concentrazione finale dell'acido nucleico nel volume di iniezione non deve superare 0,5 μg / μL, secondo le istruzioni del produttore.
    3. Utilizzare un rapporto N / P di 6 - 8 (0,12 - 0,16 μL di reagente di erogazione per μg di acido nucleico). Calcolare il corrispondente volume di reagente di erogazione.
      NOTA: i complessi dovrebbero essere cationici per un'entrata efficace delle cellule. Il rapporto N / P è definito come il numero di residui di azoto (N) sul reagente di erogazione in vivo per fosfato acido nucleico (P) e rappresenta la misura dell'equilibrio ionico all'interno dei complessi.
  3. Diluire l'importo calcolato (vedere la fase 1.2.1) dell'acido nucleico nel 5% di glucosio (concentrato finale) Utilizzando la soluzione di zucchero da 10% (fornita) e l'acqua sterile. Assicurarsi che il volume di diluizione sia la metà del volume di iniezione finale. Vortice dolcemente o mescolate pipettando su e giù.
  4. Diluire l'importo calcolato (vedere la fase 1.2.3) del reagente di erogazione a metà del volume d'iniezione del 5% di glucosio (concentrazione finale) utilizzando la soluzione di base del glucosio al 10% (fornita) e l'acqua sterile. Vortice dolcemente e giri a 13.000 xg per 15 s.
  5. Aggiungere immediatamente i reagenti di erogazione suddetti diluiti all'acido nucleico diluito. Mescolarli con vortice dolce e spin giù a 13.000 xg per 15 s.
  6. Incubare la miscela dal punto 1.5 per 15 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Da questo punto i complessi sono stabili per 4 ore a temperatura ambiente e per un massimo di 7 giorni se conservati a 4 ° C.
  7. Eseguire iniezioni di coda-vena utilizzando complessi equilibrati a temperatura ambiente. Mettere la coda del topo in acqua calda (50-53 ° C) per 30 s per consentire la dilatazione delle vene.
    1. Posizionare il mouse all'interno del dispositivo di ritenzione. Inserire un ago da 27 a 30 gauge nella vena della coda ad un angolo di 20-30 ° e iniettare lentamente 200 μL. Al termine, rimuovere l'ago e applicare pressione sul sito di iniezione.
      NOTA: Un leggero sporgimento nella coda durante l'iniezione indica un posizionamento errato. Se ciò accade, rimuovere l'ago e ripetere il processo prossimale al sito precedente.
  8. Visualizzare l'espressione genica eseguendo BLI in vivo (vedere la fase 2) a 24 e 48 h dopo l'iniezione endovenosa.

2. In Vivo BLI

NOTA: Prima di tutto, preparare una soluzione di stock fresca di D-luciferina da 15 mg / ml in DPBS, sterilizzarla a filtro utilizzando un'unità di filtraggio da 0,22 μm e conservarla a -20 ° C.

  1. Posizionare i topi in una chiara camera di anestesia in plexiglass. Assicurarsi che la camera isoflurana sia piena. Quando è pronto ad anestetizzare gli animali, assicurarsi che la pompa (lEft) e gli interruttori a camera (destra) sono accesi. Ruotare il quadrante isoflurano al 2,5% per l'induzione e il 2% per la manutenzione. Gli animali all'interno della camera IVIS sono tenuti sotto l'anestesia isofluorena del 2,5% durante l'acquisizione di immagini.
  2. Dopo che i topi sono completamente anestetizzati, iniettare 10 ml / kg di peso corporeo della soluzione D-luciferina per via intraperitoneale 15 minuti prima dell'immagine.
    NOTA: Si deve eseguire uno studio cinetico su D-luciferina per determinare il tempo del picco del segnale dopo la somministrazione di D-luciferina.
  3. Aprire il sistema di imaging in vivo e preparare la camera di imaging avvolgendola con un pezzo di cardstock nero (scartare al termine). Posizionare i coni del naso come necessario per una corretta anestesia (utilizzare un cono per mouse).
    NOTA: Il tubo che fornisce l'anestesia allo strumento viene suddiviso in modo che la stessa concentrazione di anestesia venga plasmata ai collettori di anestesia situati all'interno del sistema di imaging.
  4. Trasferire i topi (fino a 5) dalla bBussare ai coni del naso collegati al collettore del sistema di imaging e chiudere la porta. L'acquisizione di immagini dura 5 min.
  5. Acquisire un BLI utilizzando il software del produttore, come segue.
    1. Inizializzare il software. Nel pannello di controllo dell'acquisizione del sistema di imaging in vivo , mettere un segno di spunta accanto a Luminescente . Confermare che l'impostazione Filtro di eccitazione sia Blocco e l'impostazione Filtro emissioni sia aperta.
    2. Fare clic sulle frecce: per la modalità Imaging Luminescente, selezionare un tempo di esposizione di 5 minuti, Binning 8 e F / Stop 1; Per la modalità Imaging fotografica, selezionare Binning 4 e F / stop 8.
    3. Dall'elenco a discesa Vista campo, selezionare D, 19 cm e un'altezza soggetto di 1,5 cm. Fare clic su Acquisisca quando è pronto per acquisire l'immagine.
  6. Quando l'acquisizione dell'immagine è completa, posizionare i topi nelle loro gabbie.
  7. Quantificare i fotoni emessi da regioni specifiche utilizzando il software del produttore.
    1. Clic strumenti ROI , selezionare la misurazione ROI dall'elenco a discesa Tipo.
    2. Fai clic sull'icona quadrata e disegna un ROI quadrato con le giuste dimensioni per coprire il torace di un animale. Copia e incolla il ROI per ogni animale per ottenere ROI con le stesse dimensioni. Nel pannello Strumenti ROI, fai clic su Misura ROI per ottenere le misure dell'intensità totale nei ROI.
    3. Osserva i dati di misurazione ROI per tutti i ROI creati nelle immagini o nelle sequenze durante una sessione (un ROI per riga). Fare clic su Esporta e selezionare la cartella in cui verrà salvato il file.

3. Mouse Challenge con stimoli pro-infiammatori

NOTA: Prima della sfida del mouse con stimoli pro-infiammatori, controllare l'attivazione di base tramite i n vivo BLI (vedere passo 2). Almeno 7 giorni devono passare tra la consegna del gene in vivo e il mousLa sfida per permettere che l'infiammazione lieve e transitoria scompaia.

  1. Preparare l'apparecchiatura per l'instillazione intratracheale (vedere la Figura 1 e la Figura 2 ).
    1. Collegare le siringhe monouso da 5 ml con la molla (C, E), una siringa da 100 μL (B) e un misuratore monouso (D) al rubinetto a 3 vie (A). Posizionare il sistema sul supporto (H). Posizionare il sistema sul supporto (H).
    2. Collegare il tubo micro medico PE190 (F) al misuratore monouso (D) e alla penna secolo (G).
    3. Riempire la siringa da 5 ml con 800 μl di aria e girare il rubinetto a 3 vie.
      NOTA: Riempire il tubo con supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa aspirando 50 μl nella siringa da 100 μl.

Figura 1
Figura 1: Riprese SchematicheNazione di una singola componente del dispositivo intratracheale.
( C) siringa da 5 ml, (D) calibro monouso, (E) siringa da 5 ml da gettare con molla, (F) PE190 micro tubo medico (A) , (G) penna secolo e (H) sostegno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Rappresentazione del dispositivo intratracheale assemblato.
Le identificazioni sono identiche a quelle della figura 1 . Fare clic suQui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Anestetizzare i topi usando una camera di vaporizzatore isoflurana impostata al 2,5% di isoflurano mescolata all'ossigeno.
  2. Monitorare l'animale per valutare gli effetti dell'anestesia dopo 3-5 minuti.
    NOTA: Per verificare che il mouse sia completamente anestetizzato, controllare attentamente i seguenti segni: la velocità di respirazione rallentata dovrebbe rallentare, la mancanza di sollecitazione del braccio quando viene prelevata dal collo e la mancanza di risposta quando gli arti posteriori sono stimolati. Attendere qualche minuto e controllare di nuovo prima di procedere al passaggio successivo se questi criteri non vengono soddisfatti.
  3. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma di intubazione del plexiglass, appendendola dai suoi incisivi, posizionati sul filo.
  4. Accendere il laringoscopio con la mano sinistra (per i ricercatori di destra) e afferrare un paio di pinze a punta dritta. Usate la punta del laringoscopio e le pinze per aprire delicatamente la bocca.
  5. Estrarre la lingua e hVecchio a lato usando le pinze. Guida la lama del laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Tenere il laringoscopio premuto molto dolcemente ad un angolo di 90 ° fino a quando l'apertura della trachea è visibile. Tenere il laringoscopio in posizione.
  6. Utilizzando l'altra mano, prendere il tubo di mandata collegato alla fine del tubo PE e inserirlo nella trachea. Ruotare la valvola a tre vie per fornire l'inoculo. Estrarre il tubo dalla trachea appena possibile. Tenere il mouse in posizione verticale per alcuni secondi per permettere l'inoculo inalato nei polmoni.
    NOTA: I topi soffocano e muoiono se la trachea è bloccata troppo a lungo.
  7. Rimuovere il mouse dalla piattaforma. Il tempo di recupero può variare in base ai ceppi; Monitorare il mouse con diligenza, assicurandosi che l'animale sia completamente sveglio entro 30 minuti dopo la procedura.
  8. Intraperitonealmente inietta 150 mg / kg di D-luciferina e immagini i polmoni utilizzando un sistema di imaging in vivo 4, 24 e 48 h dopo l'intratrachealeInstillazione degli stimoli. Quantificare i fotoni emessi da regioni specifiche utilizzando il software del produttore.

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Representative Results

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Il modello del topo transgenico bIL-8-Luc è stato utilizzato per il monitoraggio in vivo dell'infiammazione polmonare nei topi sfidati con supernatante batterico concentrato (30x) contenente fattori di virulenza di secrezione. La risposta infiammatoria indotta è stata rilevata dall'immagine in vivo come aumento del segnale BLI. L'attività proinfiammatoria è stata chiaramente rilevabile dopo 2,5 h post-instillazione, anche se il segnale BLI ha raggiunto il picco più alto tra 5 e 24 h ed è ancora rilevabile a 48 h ( Figura 3 ).

Figura 3
Figura 3: Rappresentativa In Vivo Imaging di Infiammazione Polmonare Indotta da P. aeruginosa SN in IL-8 Mani transientemente Transgenici.
Pannello superiore: Immagini rappresentative dei topi (n = 2 per gruppo) intratrachealmente insTriturata con SN 30x senza batteri da un ceppo di Pseudomonas aeruginosa (Pae) ​​dopo transgenizzazione transitoria con bIL-8-Luc. I topi sono stati controllati da BLI a 2,5, 5, 4, 24 e 48 ore dopo la stimolazione, con una regione di interesse disegnata sul torace. Pannello inferiore: dati combinati espressi come fotoni / s / cm 2 . Ogni valore rappresenta la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Infiammazione transitoria polmonare a seguito della trasfezione.
Diminuzione del petto BLI dalla prima valutazione (giorno 3) dopo l'IV inoculazione di bIL-8-Luc. I dati sono espressi come fotoni / s / cm 2 ± SEM (n = 6).

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Discussion

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In un precedente lavoro 11 , è stato mostrato un contrasto tra i marcatori BLI e BAL dipendenti da bIL-8-Luc. Si è basata sul grado differenziale di sensibilità all'interno dei ceppi del mouse 12 . Per questa ragione, la prima applicazione del modello bIL-8-Luc su un diverso ceppo di topi richiede uno studio iniziale della risposta infiammatoria, sia in termini di BLI che di marcatori infiammatori più standardizzati.

La trasfezione dei topi provoca infiammazione del polmone lieve e l'attivazione di bIL-8-Luc, che è rilevabile da BLI fino a 3-4 giorni dopo l'iniezione del DNA ( Figura 4 ). Successivamente scompare completamente dopo 1 settimana 1 . L'espressione di bIL-8-Luc dopo la consegna del gene deve sempre essere verificata mediante BLI in vivo , in quanto questa è una condizione necessaria per il successo delle seguenti fasi sperimentali. Dopo 7 giorni e prima della sfida del mouse, l'attivazione di base deve essere registrata a confIrm la scomparsa dell'infiammazione indotta dalla trasfezione.

Questo approccio è stato testato sulla fase acuta dell'infiammazione, ma la sua applicazione alla fase cronica non è stata testata. Non è noto come la sfida del microrganismo vivo possa influire sull'attività del promotore utilizzato in questo ambiente. Una maggiore comprensione della patogenesi dell'infiammazione acuta e cronica e la conseguente alterazione della funzione polmonare sono essenziali per lo sviluppo di terapie efficaci per una serie di malattie polmonari croniche 3 , 9 . I modelli animali continuano ad essere necessari a questo scopo, anche se sono presenti limiti in modo accurato che riflettono la patofisiologia delle malattie umane.

Il monitoraggio in vivo dei parametri infiammatori nei piccoli roditori usando geni reporter del luciferasi derivato da altre specie è di grande valore. Questo approccio consente lo studio del patofisioDelle risposte infiammatorie, nonché della capacità di testare interventi mirati alla loro modulazione. Questo è stato testato con successo utilizzando un modello di topo transgenizzato (bovinato) transientemente transientemente bovino IL-8 promotore / luciferasi precedentemente ben caratterizzato. Inoltre, uno studio recente 10 ha dimostrato che il modello qui descritto è appropriato per il monitoraggio della risposta infiammatoria polmonare indotta da esoprodotti batterici e per indagare il meccanismo di azione dei composti interessati. BLI è un approccio non invasivo che consente l'osservazione longitudinale del processo infiammatorio polmonare dopo l'instillazione intratracheale con stimoli rilevanti, tra cui il supernatante di coltura P. aeruginosa 9 , 10 , 11 . Questo è un evidente vantaggio di studiare l'infiammazione polmonare acuta rispetto ai metodi classici, che richiedono il sacrificio degli animali al colIl liquido BAL e i polmoni. Il suo valore per lo studio dell'infezione / infiammazione cronica non è stato affrontato.

Il modello attuale può essere utilizzato per approfondire la conoscenza disponibile sulla patogenesi delle malattie infiammatorie polmonari, compresa la caratterizzazione di fattori batterici / non batterici con attività proinfiammatoria. Inoltre, può facilitare la valutazione dei possibili effetti terapeutici delle molecole con azioni antiinfiammatori note / presuntive.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto FFC n. 18/2013, FFC # 29/2015 e dalla Lega Cistica Fibrosa Italiana attraverso la Federazione Italiana di Fibrosi Cistica (Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

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References

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Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie
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Cite this Article

Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).More

Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).

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