Summary
El método descrito aquí permite la visualización de la activación de la inflamación dependiente del promotor de IL-8 en los pulmones de ratones a través de imágenes de bioluminiscencia no invasivas (BLI). El mismo animal puede ser sometido a BLI múltiples veces durante hasta dos meses a partir del momento de la entrega de la construcción de indicador de luciferasa.
Abstract
La inflamación de las vías respiratorias se asocia a menudo con infecciones bacterianas y representa un determinante principal de la enfermedad pulmonar. La determinación in vivo de las capacidades proinflamatorias de diversos factores es desafiante y requiere procedimientos terminales, como el lavado broncoalveolar y la extirpación de los pulmones para el análisis in situ , impidiendo la visualización longitudinal en el mismo ratón. Aquí, la inflamación pulmonar se induce a través de la instilación intratraqueal de sobrenadante de cultivo de Pseudomonas aeruginosa (SN) en ratones transgénicos transitoriamente expresando el gen indicador de luciferasa bajo el control de un promotor bovino heterólogo de IL-8. La expresión de luciferasa en el pulmón se monitoriza mediante análisis de imagen bioluminiscente in vivo (BLI) en un intervalo de tiempo de 2,5 a 48 h después de la instilación. El procedimiento puede repetirse varias veces dentro de 2 - 3 meses, permitiendo así la evaluación de la respuesta inflamatoria en los mismos ratones conLa necesidad de terminar con los animales. Este enfoque permite el monitoreo de factores pro y antiinflamatorios que actúan en el pulmón en tiempo real y parece adecuado para estudios funcionales y farmacológicos.
Introduction
Las enfermedades pulmonares crónicas, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (fibrosis quística) y la bronquiectasia, se caracterizan por la inflamación de las vías respiratorias. La inflamación de las vías respiratorias se caracteriza por edema, infiltración celular, linfocitos T y activación de los mastocitos, aumento de las secreciones de las vías respiratorias y deposición excesiva de colágeno. La CF es un trastorno multisistémico, y su principal causa de mortalidad y morbilidad es la infección bacteriana pulmonar con aumento de la exacerbación pulmonar. La disminución de la función pulmonar predice un resultado significativamente peor 1 , 2 , 3 , 4 .
El estado inflamatorio del tracto respiratorio suele observarse a través de la evaluación de marcadores inmunológicos reclutados durante el proceso inflamatorio en material derivado de las vías respiratorias inferiores y superiores, como el esputo, que proporciona res variablesUlts. También se realizan broncoscopias 5 . Los modelos murinos son herramientas valiosas para investigar la patogénesis y la evolución de enfermedades caracterizadas por inflamación de las vías respiratorias y para las que aún no se han identificado tratamientos o curas eficaces. Se han utilizado modelos animales de infección pulmonar e inflamación para estudiar las interacciones entre el asma y el huésped, incluyendo el papel de los químicos que simulan las condiciones humanas ( por ejemplo, exposición al humo del cigarrillo, LPS, elastasa, ovalbúmina, poli I: C etc. Así como combinaciones de los anteriores) 6 . La medición de los parámetros relacionados con la inflamación requiere el sacrificio de los animales, ya que se requieren abordajes invasivos para medir factores tales como carga bacteriana, citocinas en los pulmones y líquido de lavado broncoalveolar (BAL) recogido. Además, a menudo se requieren exámenes histológicos. La posibilidad de obtener información sobre la cinética de respuesta inflamatoria requiere el uso deErous. Por lo tanto, una técnica que permita obtener dicha información sin la necesidad de sacrificar los animales es valiosa en bases técnicas, éticas, económicas y operativas.
La IL-8 es un agente esencial en el proceso inflamatorio, reclutando leucocitos al tejido inflamado. Representa una lectura molecular para el estudio de la activación de la vía inflamatoria. MIP-2 y KC pueden ser homólogos funcionales de IL-8 humana en ratones. Los ratones expresan sólo un potencial receptor de IL-8, un homólogo de CXCR2 humano 7 , 8 , pero son capaces de modular un promotor del gen de IL-8 heterólogo que conduce un gen reportero. Recientemente se ha desarrollado un modelo murino de inflamación pulmonar después de la observación de que un promotor de IL-8 bovino / reportero de luciferasa puede ser transactivado en ratones. Esta característica permite la utilización de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para controlar la respuesta inflamatoria en la vida aNimals 9 .
Este modelo ha sido adaptado para estudiar la inflamación desencadenada por exoproductos bacterianos ( por ejemplo, LPS o productos liberados por cepas bacterianas) o TNFalfa 10 , 11 . El proceso de descubrimiento de fármacos se centra en el desarrollo y optimización de antiguas y nuevas moléculas anti-inflamatorias que pueden tratar enfermedades pulmonares, como la FC, el asma y la EPOC. Estas nuevas entidades químicas deben ser rápidamente y convenientemente probadas en modelos animales que pueden estar vinculados a fenotipos clínicos específicos con el fin de facilitar el diseño de ensayos clínicos inteligentes.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Interministerial de Experimentación Animal del Centro Interdepartamental de Investigación Experimental de la Universidad de Verona y aprobados por el Comité de Bienestar Animal para la experimentación animal y cumplen con la Directiva Europea 2010/63 UE, la D.Lgs 26/2014 y la Revisada "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Este protocolo y experimentación fueron aprobados por los Institutos Nacionales de Salud (n 273/15). Los animales tuvieron acceso libre a la comida estándar de roedores y al agua del grifo suavizada y se aclimataron durante al menos 5 días a las condiciones locales del vivero (temperatura ambiente: 20 - 24 ° C, humedad relativa: 40 - 70% ) Antes de cualquier tratamiento.
1. In Vivo Gene Delivery
- Utilizar una campana de flujo laminar para preparar los complejos de reactivo de entrega in vivo / ácido nucleico.
- Definir el protocolo experimental aNd parámetros siguiendo las instrucciones in vivo del fabricante.
- Utilizar un volumen de inyección total de 200 μl de complejos por ratón.
- Comience con 40 μg de ADN suspendido en agua exenta de endotoxina; El rango de optimización puede alcanzar 60 μg.
NOTA: La concentración final de ácido nucleico en el volumen de inyección no debe exceder 0,5 μg / μl, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. - Utilice una relación N / P de 6 - 8 (0,12 - 0,16 μL de reactivo de suministro por μg de ácido nucleico). Calcular el volumen correspondiente del reactivo de suministro.
NOTA: Los complejos deben ser catiónicos para la entrada efectiva de células. La relación N / P se define como el número de residuos de nitrógeno (N) en el reactivo de suministro in vivo por fosfato de ácido nucleico (P) y representa la medida del equilibrio iónico dentro de los complejos.
- Diluir la cantidad calculada (véase el paso 1.2.1) de ácido nucleico en glucosa al 5% (concentración finalRación) usando solución madre de glucosa al 10% (proporcionada) y agua estéril. Asegúrese de que el volumen de dilución es la mitad del volumen de inyección final. Vortex suavemente o mezcle pipeteando arriba y abajo.
- Diluir la cantidad calculada (ver paso 1.2.3) del reactivo de suministro en la mitad del volumen de inyección de glucosa al 5% (concentración final) utilizando la solución madre de glucosa al 10% (proporcionada) y agua estéril. Vórtice suavemente y centrifugue a 13.000 xg durante 15 s.
- Añadir los reactivos de suministro diluidos anteriores al ácido nucleico diluido de una vez. Mezclarlos con vórtice suave y girar a 13.000 xg durante 15 s.
- Incubar la mezcla de la etapa 1.5 durante 15 min a temperatura ambiente.
NOTA: A partir de este punto, los complejos son estables durante 4 h a temperatura ambiente y hasta 7 días cuando se almacenan a 4ºC. - Realizar inyecciones de la vena de la cola utilizando complejos equilibrados a temperatura ambiente. Coloque la cola del ratón en agua tibia (50-53 ° C) durante 30 s para permitir la dilatación de las venas.
- Coloque el ratón dentro del dispositivo de sujeción. Inserte una aguja de calibre 27 a 30 en la vena de la cola en un ángulo de 20-30 ° y inyecte lentamente 200 μl. Al finalizar, retire la aguja y aplique presión al lugar de la inyección.
NOTA: Una ligera protuberancia en la cola durante la inyección indica un posicionamiento incorrecto. Si esto ocurre, retire la aguja y repita el proceso proximal al sitio anterior.
- Coloque el ratón dentro del dispositivo de sujeción. Inserte una aguja de calibre 27 a 30 en la vena de la cola en un ángulo de 20-30 ° y inyecte lentamente 200 μl. Al finalizar, retire la aguja y aplique presión al lugar de la inyección.
- Visualizar la expresión génica mediante la realización de BLI in vivo (ver paso 2) a las 24 y 48 h después de la inyección intravenosa.
2. In Vivo BLI
NOTA: Previamente, preparar una solución madre fresca de 15 mg / mL de D-luciferina en DPBS, esterilizar con filtro utilizando una unidad de filtración de 0,22 μm y almacenarla a -20 ° C.
- Coloque los ratones en una cámara de anestesia de plexiglás transparente. Asegúrese de que la cámara de isoflurano esté llena. Cuando esté listo para anestesiar a los animales, asegúrese de que la bombaEft) y los interruptores de cámara (derecha) están encendidos. Gire el dial de isoflurano al 2,5% para la inducción y al 2% para el mantenimiento. Los animales dentro de la cámara IVIS se mantienen bajo anestesia con isofluorano al 2,5% durante la adquisición de la imagen.
- Después de que los ratones están completamente anestesiados, inyectar 10 ml / kg de peso corporal de la solución de luciferina D por una vía intraperitoneal 15 minutos antes de la formación de imágenes.
NOTA: Se debe realizar un estudio cinético sobre D-luciferina para determinar el tiempo del pico de la señal después de la administración de D-luciferina. - Abrir el sistema de imagen in vivo y preparar la cámara de imagen por el revestimiento con un pedazo de cartulina negro (descarte al finalizar). Coloque los conos nasales según sea necesario para una anestesia correcta (use un cono por ratón).
NOTA: El tubo que suministra la anestesia al instrumento se divide de manera que la misma concentración de anestesia se aplique a los colectores de anestesia localizados dentro del sistema de formación de imágenes. - Transferir los ratones (hasta 5) de la bBuey a los conos de nariz unidos al colector en el sistema de imagen y cierre la puerta. La adquisición de imágenes dura 5 min.
- Adquiera un BLI utilizando el software del fabricante, como se indica a continuación.
- Inicialice el software. En el panel de control de adquisición del sistema de imágenes in vivo , coloque una marca de verificación junto a Luminescente . Confirme que el ajuste de Filtro de excitación es Bloque y el ajuste Filtro de emisión es Abrir.
- Haga clic en las flechas: para el Modo de imágenes luminescentes, seleccione un tiempo de exposición de 5 minutos, Binning 8 y F / Stop 1; Para el modo de imagen de fotografía, seleccione Binning 4 y F / stop 8.
- En la lista desplegable Campo de visión, seleccione D, 19 cm y una Altura del sujeto de 1,5 cm. Haga clic en Adquirir cuando esté listo para adquirir la imagen.
- Cuando la adquisición de la imagen sea completa, coloque los ratones de nuevo en sus jaulas.
- Cuantificar los fotones emitidos desde regiones específicas utilizando el software del fabricante.
- Hacer clic
- Haga clic en el icono Cuadrado y dibuje un ROI cuadrado con las dimensiones adecuadas para cubrir el tórax de un animal. Copie y pegue el ROI de cada animal para obtener ROIs con las mismas dimensiones. En el panel Herramientas de ROI, haga clic en Medir ROI para obtener las mediciones de la intensidad total en los ROI.
- Observe los datos de Mediciones de ROI de todos los ROI creados en las imágenes o secuencias durante una sesión (un ROI por fila). Haga clic en Exportar y seleccione la carpeta donde se guardará el archivo.
- Hacer clic
3. Desafío del ratón con estímulos proinflamatorios
NOTA: Antes del desafío del ratón con estímulos proinflamatorios, compruebe la activación de la línea de base por BLI in vivo (ver paso 2). Por lo menos 7 días deben pasar entre la entrega de genes in vivo y mousE desafío para permitir que la inflamación leve y transitoria desaparezca.
- Preparar el equipo para la instilación intratraqueal (ver Figura 1 y Figura 2 ).
- Conecte las jeringas desechables de 5 ml con el muelle (C, E), una jeringa de 100 μL (B) y un calibre desechable (D) a la llave de paso de 3 vías (A). Coloque el sistema en el soporte (H). Coloque el sistema en el soporte (H).
- Conecte la tubería médica micro PE190 (F) al calibre desechable (D) y al siglo de la pluma (G).
- Llene la jeringa de 5 ml con 800 μl de aire y gire la llave de paso de 3 vías.
NOTA: Llenar el tubo con el sobrenadante del cultivo de Pseudomonas aeruginosa aspirando 50 μl en la jeringa de 100 μl.
Figura 1: Representación esquemáticaDe un único componente del dispositivo intratraqueal.
(A) Llave de paso de 3 vías, (B) jeringa de Hamilton de 100 μL, (C) jeringa de 5 ml desechable, (D) jeringa desechable, (E) jeringa de 5 ml desechable con resorte, (F) , (G) pen siglo, y (H) apoyo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación del Dispositivo Intratraqueal Ensamblado.
Las identificaciones son las mismas que en la Figura 1 . Por favor haz clickAquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Anestesiar los ratones usando una cámara de evaporador de isoflurano fijada al 2,5% de isoflurano mezclado con oxígeno.
- Monitorear al animal para evaluar los efectos del anestésico después de 3-5 min.
NOTA: Para confirmar que el ratón está completamente anestesiado, monitoree cuidadosamente los siguientes signos: la velocidad de respiración ralentizada debe disminuir, la falta de estiramiento del brazo al recogerlo y una falta de respuesta cuando se estimulan las extremidades posteriores. Espere unos minutos adicionales y vuelva a comprobarlo antes de pasar al siguiente paso si estos criterios no se cumplen. - Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación de plexiglás, colgando por sus incisivos, que se colocan en el alambre.
- Encienda el laringoscopio con la mano izquierda (para los investigadores diestros) y agarre un par de pinzas de extremos romos. Utilice la punta del laringoscopio y la pinza para abrir suavemente la boca.
- Tire de la lengua y hViejo al lado usando la pinza. Guía de la hoja de laringoscopio hacia la parte posterior de la boca. Mantenga el laringoscopio presionado muy suavemente en un ángulo de 90 ° hasta que la abertura de la tráquea sea visible. Sostenga el laringoscopio en su lugar.
- Con la otra mano, tome el tubo de suministro conectado al extremo de la tubería de PE e insértelo en la tráquea. Gire la válvula de tres vías para entregar el inóculo. Saque el tubo de la tráquea tan pronto como sea posible. Sostenga el ratón en posición vertical durante unos segundos para permitir que el inóculo se inhale en los pulmones.
NOTA: Los ratones se asfixiarán y morirán si la tráquea se bloquea durante demasiado tiempo. - Retire el ratón de la plataforma. El tiempo de recuperación puede variar en función de las cepas; Vigilar el ratón con diligencia, asegurándose de que el animal está completamente despierto dentro de los 30 minutos después del procedimiento.
- Intraperitonealmente inyectar 150 mg / kg de D-luciferina y la imagen de los pulmones utilizando un sistema de imágenes in vivo 4, 24 y 48 h después de la intratraquealInstilación de los estímulos. Cuantificar los fotones emitidos desde regiones específicas utilizando el software del fabricante.
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Representative Results
El modelo de ratón transgénico transitorio bIL-8-Luc se usó para la monitorización in vivo de la inflamación pulmonar en ratones desafiados con sobrenadante bacteriano concentrado (30x) que contenía factores de virulencia secretados. La respuesta inflamatoria inducida fue detectable por imágenes in vivo como un aumento de la señal BLI. La actividad proinflamatoria fue claramente detectable 2,5 h después de la instilación, aunque la señal BLI alcanzó el pico más alto entre 5 y 24 h y todavía era detectable a las 48 h ( Figura 3 ).
Figura 3: Representación representativa in vivo de la inflamación pulmonar inducida por P. aeruginosa SN en IL-8 transitoriamente transgénicos ratones.
Panel superior: Imágenes representativas de ratones (n = 2 por grupo) intratraquealmente insCultivadas con SN 30x celular libre de células de una cepa de Pseudomonas aeruginosa (Pae) tras transgenización transitoria con bIL-8-Luc. Los ratones fueron monitorizados por BLI a 2,5, 5, 4, 24 y 48 h después de la estimulación, con una región de interés dibujada sobre el pecho. Panel inferior: Datos combinados expresados como fotones / s / cm 2 . Cada valor representa la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inflamación pulmonar transitoria después de la transfección.
Disminución de BLI en el pecho desde la primera evaluación (día 3) después de la inoculación IV de bIL-8-Luc. Los datos se expresan como fotones / s / cm2 ± SEM (n = 6).
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Discussion
En un trabajo previo 11 , se mostró un contraste entre los marcadores BLI y BAL dependientes de bIL-8-Luc. Se basó en el grado diferencial de sensibilidad dentro de cepas de ratón [ 12] . Por esta razón, la primera aplicación del modelo bIL-8-Luc a una cepa de ratón diferente requiere un estudio inicial de la respuesta inflamatoria, tanto en términos de BLI como de marcadores inflamatorios más estandarizados.
La transfección de ratones provoca inflamación pulmonar leve y la activación de bIL-8-Luc, que es detectable por BLI hasta 3 - 4 días después de la inyección de ADN ( Figura 4 ). Luego desaparece completamente después de 1 semana 1 . La expresión de bIL-8-Luc después de la administración génica debe verificarse siempre mediante BLI in vivo , ya que ésta es una condición necesaria para el éxito de los siguientes pasos experimentales. Después de 7 días y antes de la exposición al ratón, la activación de la línea de base debe ser registrada para confLa desaparición de la inflamación inducida por transfección.
Este enfoque ha sido probado en la fase aguda de la inflamación, pero su aplicación a la fase crónica no ha sido probada. No se sabe cómo el desafío del microorganismo vivo podría afectar la actividad del promotor utilizado en este entorno. Una mayor comprensión de la patogénesis de la inflamación aguda y crónica y la consiguiente alteración de la función pulmonar es esencial para el desarrollo de terapias eficaces para una serie de enfermedades pulmonares crónicas 3 , 9 . Los modelos animales continúan siendo necesarios para este propósito, aunque las limitaciones en reflejar exactamente la patofisiología de la enfermedad humana están presentes.
El monitoreo in vivo de parámetros inflamatorios en pequeños roedores usando genes indicadores de luciferasa derivados de otras especies es de gran valor. Este enfoque permite el estudio del patófisisLogia de respuestas inflamatorias, así como la capacidad de probar intervenciones dirigidas a su modulación. Esto se ensayó con éxito usando un promotor / luciferasa de bovino previamente caracterizado de bovino transitoriamente transgénico (bovinizado) modelo de ratón 1 . Además, un estudio reciente 10 demostró que el modelo descrito aquí es apropiado para monitorizar la respuesta inflamatoria pulmonar inducida por exoproductos bacterianos y para investigar el mecanismo de acción del compuesto (s) de interés. BLI es un abordaje no invasivo que permite la observación longitudinal del proceso inflamatorio pulmonar después de la instilación intratraqueal con estímulos relevantes, incluyendo el sobrenadante del cultivo de P. aeruginosa 9 , 10 , 11 . Esta es una ventaja obvia de estudiar la inflamación pulmonar aguda en comparación con los métodos clásicos, que requieren el sacrificio de los animales a colEl líquido BAL y los pulmones. Su valor para el estudio de la infección crónica / inflamación no ha sido abordado.
El presente modelo puede utilizarse para profundizar el conocimiento disponible sobre la patogénesis de las enfermedades inflamatorias pulmonares, incluyendo la caracterización de factores bacterianos / no bacterianos con actividad pro-inflamatoria. Además, puede facilitar la evaluación de los posibles efectos terapéuticos de moléculas con acciones antiinflamatorias conocidas / presuntivas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el FFC # 18/2013 de la Fundación de Fibrosis Quística de Italia, FFC # 29/2015 y por la Liga Italiana de Fibrosis Quística a través de la Rama de Veneto-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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