Summary
Описанный здесь способ позволяет визуализировать активацию IL-8-зависимого воспаления в легких мышей посредством неинвазивной биолюминесцентной визуализации (BLI). Одно и то же животное может быть подвергнуто BLI несколько раз в течение двух месяцев с момента доставки конструкции репортера люциферазы.
Abstract
Воспаление дыхательных путей часто ассоциируется с бактериальными инфекциями и является основным фактором, определяющим заболевание легких. Определение in vivo провоспалительных возможностей различных факторов является сложным и требует терминальных процедур, таких как бронхоальвеолярный лаваж и удаление легких для анализа in situ , исключая продольную визуализацию у той же мыши. Здесь воспаление легких индуцируется путем интратрахеальной инстилляции супернатанта культуры Pseudomonas aeruginosa (SN) у временно трансгенных мышей, экспрессирующих репортерный ген люциферазы под контролем гетерологичного промотора коровы IL-8. Экспрессия люциферазы в легких контролируется анализом биолюминесцентного изображения in vivo (BLI) в течение 2,5-48-часовой таймфрейма после инстилляции. Процедуру можно повторять несколько раз в течение 2 - 3 месяцев, что позволяет оценить воспалительную реакцию у одних и тех же мышей сНеобходимость прекращения животных. Такой подход позволяет контролировать про-и противовоспалительные факторы, действующие в легких в реальном времени, и представляется пригодным для функциональных и фармакологических исследований.
Introduction
Хронические заболевания легких, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), кистозный фиброз (CF) и бронхоэктазы, характеризуются воспалением дыхательных путей. Воспаление дыхательных путей характеризуется отеком, клеточной инфильтрацией, активацией Т-лимфоцитов и тучных клеток, увеличением выделения дыхательных путей и чрезмерным осаждением коллагена. CF является мультисистемным расстройством, и его основной причиной смертности и заболеваемости является бактериальная инфекция легких с увеличением обострения легочной артерии. Снижение функции легких предсказывает значительно худший результат 1 , 2 , 3 , 4 .
Состояние воспаления дыхательных путей обычно наблюдается путем оценки иммунологических маркеров, набранных во время воспалительного процесса, в материалах, полученных из нижних и верхних дыхательных путей, таких как мокрота, которая обеспечивает переменные resULTS. Бронхоскопия также выполняется 5 . Молекулы мурина являются ценными инструментами для исследования патогенеза и развития заболеваний, характеризующихся воспалением дыхательных путей, и для которых эффективные методы лечения или лечения еще не определены. Для изучения астмы и взаимодействия хозяина-патогена использовались животные модели инфекции легких и воспаления, включая роль химических веществ, которые имитируют состояние человека ( например, воздействие сигаретного дыма, LPS, эластаза, овальбумин, поли I: C и т. Д. , Как А также комбинации вышеуказанного). 6 . Измерение параметров, связанных с воспалением, требует жертвоприношения животных, так как необходимы инвазивные подходы для измерения таких факторов, как бактериальная нагрузка, цитокины в легких и собранная жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Кроме того, гистологические обследования часто требуются. Возможность получения информации о кинетике воспалительных реакций требует использования numМышей. Поэтому метод, позволяющий получать такую информацию без необходимости жертвовать животными, ценен на технических, этических, экономических и эксплуатационных основаниях.
IL-8 является существенным игроком в процессе воспаления, рекрутируя лейкоциты в воспаленную ткань. Он представляет собой молекулярное считывание для изучения активации воспалительного пути. MIP-2 и KC могут быть функциональными гомологами человеческого IL-8 у мышей. Мыши экспрессируют только один потенциальный рецептор IL-8, гомолог человека CXCR2 7 , 8 , но они способны модулировать гетерологичный промотор гена IL-8, который управляет репортерным геном. Недавно была разработана модель мышиного воспаления легкого, после того как было обнаружено, что конструкция мышиного рецептора IL-8 / люциферазы может быть трансактивирована у мышей. Эта функция позволяет использовать биолюминесцентную визуализацию (BLI) для мониторинга воспалительного ответа при жизни9 .
Эта модель была адаптирована для изучения воспаления, вызванного бактериальными экзопроводами ( например, LPS или продуктами, высвобождаемыми бактериальными штаммами) или TNFalpha 10 , 11 . Процесс открытия лекарств ориентирован на разработку и оптимизацию старых и новых противовоспалительных молекул, которые могут лечить заболевания легких, такие как CF, астма и ХОБЛ. Эти новые химические объекты должны быть быстро и удобно протестированы на животных моделях, которые могут быть связаны с конкретными клиническими фенотипами, чтобы облегчить разработку интеллектуальных клинических испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены комитетом по животноводству для экспериментов на животных, проведенным Межведомственным центром службы экспериментальных исследований в Веронском университете и соответствовали Европейской директиве 2010/63 UE, итальянской версии D.Lgs 26/2014 и пересмотренной «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных», Вашингтон, округ Колумбия: National Academy Press, 1996. Этот протокол и эксперименты были одобрены Национальными институтами здравоохранения (n 273/15). Животные имели свободный доступ к стандартным грызунам и смягченной водопроводной воде и акклиматизировались в течение как минимум 5 дней в условиях локального вивария (комнатная температура: 20-24 ° C, относительная влажность: 40 - 70%, светло-темный цикл: 12 ч ) Перед любым лечением.
1. Поставка гена Vivo
- Используйте ламинарный вытяжной колпак для приготовления комплексов реагентов / нуклеиновых кислот для доставки in vivo .
- Определить экспериментальный протокол aNd в соответствии с инструкциями производителя in vivo .
- Используйте общий объем инъекции 200 мкл комплексов на мышь.
- Начните с 40 мкг ДНК, суспендированной в воде, свободной от эндотоксина; Диапазон оптимизации может достигать 60 мкг.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечная концентрация нуклеиновой кислоты в объеме инъекции не должна превышать 0,5 мкг / мкл в соответствии с инструкциями производителя. - Используйте соотношение N / P 6 - 8 (0,12 - 0,16 мкл реагента для доставки на мкг нуклеиновой кислоты). Рассчитайте соответствующий объем реагента доставки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Комплексы должны быть катионными для эффективного ввода клеток. Отношение N / P определяется как количество остатков азота (N) в реакторе доставки in vivo на фосфат нуклеиновой кислоты (P) и представляет собой показатель ионного баланса внутри комплексов.
- Разбавьте рассчитанное количество (см. Шаг 1.2.1) нуклеиновой кислоты в 5% глюкозе (конечная концентрация) С использованием 10% -ного раствора глюкозы (при условии) и стерильной воды. Убедитесь, что объем разбавления составляет половину конечного объема впрыска. Вихрь осторожно или перемешайте пипетированием вверх и вниз.
- Разбавьте рассчитанное количество (см. Шаг 1.2.3) реагента доставки до половины объема инъекции 5% глюкозы (конечная концентрация) с использованием 10% -ного раствора глюкозы (при условии) и стерильной воды. Вихрь мягко и вращаться при 13000 xg в течение 15 с.
- Добавьте вышеуказанные разбавленные реагенты доставки к разбавленной нуклеиновой кислоте все сразу. Смешайте их, осторожно встряхивая и опустившись на 13 000 xg в течение 15 с.
- Инкубируйте смесь со стадии 1.5 в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. С этого момента комплексы стабильны в течение 4 ч при комнатной температуре и до 7 дней при хранении при 4 ° С. - Выполнять инъекции хвостовых вен с использованием комплексов, уравновешенных при комнатной температуре. Поместите хвост мыши в теплую воду (50 - 53 ° C) в течение 30 с, чтобы обеспечить расширение вен.
- Поместите мышь в удерживающее устройство. Вставьте иглу 27 - 30 калибра в хвостовую вену под углом 20-30 ° и медленно вводите 200 мкл. По завершении удалите иглу и подайте давление на место инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ. Небольшой выступ в хвосте во время инъекции указывает на неправильное позиционирование. Если это произойдет, удалите иглу и повторите процесс, проксимальный к предыдущему сайту.
- Поместите мышь в удерживающее устройство. Вставьте иглу 27 - 30 калибра в хвостовую вену под углом 20-30 ° и медленно вводите 200 мкл. По завершении удалите иглу и подайте давление на место инъекции.
- Визуализируйте экспрессию гена, выполнив in vivo BLI (см. Этап 2) через 24 и 48 ч после внутривенной инъекции.
2. В Vivo BLI
ПРИМЕЧАНИЕ. Предварительно подготовьте свежий исходный раствор D-люциферина 15 мг / мл в DPBS, процедите в фильтре, используя фильтр-фильтр 0,22 мкм, и храните его при -20 ° C.
- Поместите мышей в ясную камеру для анестезии из плексигласа. Убедитесь, что изофлурановая камера заполнена. Когда вы готовы обезболивать животных, убедитесь, что насос (лEft) и камеры (справа). Поверните циферблат изофлурана до 2,5% для индукции и 2% для обслуживания. Животных внутри камеры IVIS удерживают под воздействием изофлуорана под 2,5% при получении изображения.
- После того, как мышей полностью обезболивают, вводите 10 мл / кг массы тела раствора D-люциферина с помощью внутрибрюшинного маршрута за 15 мин до визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ. Необходимо провести кинетическое исследование D-люциферина, чтобы определить время пика сигнала после введения D-люциферина. - Откройте систему визуализации in vivo и подготовьте камеру для визуализации, наложив ее на кусок черного картона (отбросьте после завершения). Поместите носовые конусы, если необходимо для правильной анестезии (используйте один конус на мышь).
ПРИМЕЧАНИЕ. Трубка, которая подает анестезию к инструменту, разделяется так, чтобы та же концентрация анестезии была отнесена к анестезиологическим коллекторам, расположенным внутри системы формирования изображения. - Перенесите мышей (до 5) из bOx к носовым конусам, прикрепленным к коллектору в системе формирования изображения, и закройте дверцу. Приобретение изображения длится 5 мин.
- Приобретайте BLI, используя программное обеспечение производителя, следующим образом.
- Инициализация программного обеспечения. В панели управления приобретением системы визуализации in vivo поставьте галочку рядом с Luminescent . Убедитесь, что для параметра «Фильтр возбуждения» выбран «Блокировать», а параметр «Фильтр выбросов» - «Открыть».
- Нажмите стрелки: для режима люминесцентной визуализации выберите время экспозиции 5 минут, бит 8 и F / Stop 1; Для режима фотосъемки выберите Binning 4 и F / stop 8.
- В раскрывающемся списке «Область поля зрения» выберите D, 19 см и высоту темы 1,5 см. Нажмите «Приобрести», когда будете готовы получить изображение.
- Когда сбор изображений завершен, поместите мышей обратно в их клетки.
- Определите количество фотонов, испускаемых из определенных регионов, с помощью программного обеспечения производителя.
- Нажмите
- Нажмите на значок площади и нарисуйте квадрат ROI с соответствующими размерами, чтобы покрыть грудную клетку одного животного. Скопируйте и вставьте ROI для каждого животного, чтобы получить ROI с одинаковыми размерами. На панели инструментов ROI нажмите « Измерять ROI», чтобы получить измерения общей интенсивности в ROI.
- Соблюдайте данные измерений ROI для всех ROI, созданных в изображениях или последовательностях во время сеанса (один ROI для каждой строки). Нажмите «Экспорт» и выберите папку, в которой будет сохранен файл.
- Нажмите
3. Мышь с провоспалительными стимулами
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед вызовом мыши с провоспалительными стимулами проверьте активацию базовой линии на i n vivo BLI (см. Шаг 2). По крайней мере, 7 дней должны проходить между доставкой гена in vivo и mousE, чтобы позволить мягкому и временному воспалению исчезнуть.
- Подготовьте оборудование для интратрахеальной инстилляции (см. Рис. 1 и рисунок 2 ).
- Подключите 5 мл одноразовые шприцы с пружиной (C, E), шприцем объемом 100 мкл (B) и одноразовым датчиком (D) к трехходовому кранову (A). Поместите систему на опору (H). Поместите систему на опору (H).
- Подключите микро-медицинскую трубку PE190 (F) к одноразовому датчику (D) и к столу пера (G).
- Заполните 5-мл шприц 800 мкл воздуха и поверните трехходовой кран.
ПРИМЕЧАНИЕ. Заполните пробирку супернатантом культуры Pseudomonas aeruginosa путем аспирации 50 мкл в 100 мкл шприца.
Рисунок 1: Схематический видНитрата одного компонента внутритрахеального устройства.
(A) 3-полосный запорный кран, (B) 100 мкл гамильтонового шприца, (C) одноразовый 5-мл шприц, (D) одноразовый калибр, (E) одноразовый 5-мл шприц с пружиной (F) PE190 micro medical tubing , (G) эпохи пера и (H) . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Представление собранного внутритрахеального устройства.
Идентификация такая же, как на рисунке 1 . Пожалуйста, нажмитеЗдесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
- Анестезируйте мышей, используя камеру испарителя изофлюрана, установленную на 2,5% изофлурана, смешанного с кислородом.
- Контролируйте животное, чтобы оценить действие анестетика через 3 - 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы подтвердить, что мышь полностью обезболивается, внимательно следите за следующими признаками: замедленная скорость дыхания должна замедляться, отсутствие растяжения руки при поднятии шеи и отсутствие реакции при стимуляции задних конечностей. Подождите несколько минут и проверьте еще раз, прежде чем переходить к следующему шагу, если эти критерии не выполняются. - Поместите анестезированную мышь на платформу для интубации плексигласа, повесив ее своими резцами, которые помещаются на провод.
- Включите ларингоскоп левой рукой (для правых исследователей) и возьмите пару тупоконечных пинцетов. Используйте кончик ларингоскопа и щипцы, чтобы осторожно открыть рот.
- Вытяните язычок и hСтарый он в сторону, используя щипцы. Направляйте лезвие ларингоскопа к задней части рта. Держите ларингоскоп очень мягко под углом 90 ° до тех пор, пока не откроется отверстие трахеи. Держите ларингоскоп на месте.
- С другой стороны, возьмите подающую трубку, подключенную к концу трубки из полиэтилена, и вставьте ее в трахею. Поверните трехходовой клапан, чтобы доставить инокулум. Вытяните трубку из трахеи как можно скорее. Держите мышь в вертикальном положении на несколько секунд, чтобы позволить инокулуму вдыхать в легкие.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мыши задыхаются и умирают, если трахея блокируется слишком долго. - Удалите мышь с платформы. Время восстановления может варьироваться в зависимости от штаммов; Внимательно следите за мышью, следя за тем, чтобы животное полностью проснулось в течение 30 минут после процедуры.
- Внутрибрюшинно вводят 150 мг / кг D-люциферина и имитируют легкие с использованием системы визуализации in vivo 4, 24 и 48 ч после интратрахеальногоИнстилляция стимулов. Определите количество фотонов, испускаемых из определенных регионов, с помощью программного обеспечения производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель транзиторной трансгенной мыши bIL-8-Luc использовалась для мониторинга in vivo воспаления легких у мышей, которым была назначена концентрированная бактериальная супернатант (30x), содержащий секретируемые факторы вирулентности. Индуцированный воспалительный ответ обнаруживали посредством визуализации in vivo в качестве увеличения сигнала BLI. Провоспалительная активность отчетливо обнаруживалась через 2,5 часа после инстилляции, хотя сигнал BLI достигал наивысшего пика между 5 и 24 часами и все еще обнаруживался через 48 часов ( рисунок 3 ).
Рисунок 3: Представительская визуализация in vivo воспаления легких, индуцированная P. aeruginosa SN у транзиторно трансгенных мышей IL-8.
Верхняя панель: типичные изображения мышей (n = 2 на группу) intratracheally insОбработанных бактериальным бесклеточным 30x SN от штамма Pseudomonas aeruginosa (Pae) после переходной трансгенизации с bIL-8-Luc. Мышей контролировали BLI в 2,5, 5, 4, 24 и 48 ч после стимуляции, с областью интереса, проведенной над сундуком. Нижняя панель: комбинированные данные, выраженные в виде фотонов / с / см 2 . Каждое значение представляет среднее значение ± SEM. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Преходящее воспаление легких после трансфекции.
Снижение груди BLI с первой оценки (3-й день) после IV прививки bIL-8-Luc. Данные выражаются как фотоны / с / см 2 ± SEM (n = 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В предыдущей работе 11 был показан контраст между bIL-8-Luc-зависимыми BLI и BAL-маркерами. Он полагался на дифференциальную степень чувствительности внутри мышей 12 . По этой причине первое применение модели bIL-8-Luc к другому штамму мыши требует первоначального изучения воспалительного ответа, как с точки зрения BLI, так и с более стандартизованными воспалительными маркерами.
Трансфекция мышей вызывает легкое воспаление легких и активацию bIL-8-Luc, которая обнаруживается BLI до 3 - 4 дней после инъекции ДНК ( рисунок 4 ). Затем он полностью исчезает через 1 неделю 1 . Выражение bIL-8-Luc после доставки гена должно всегда проверяться in vivo BLI, так как это является необходимым условием успеха следующих экспериментальных шагов. Через 7 дней и до вызова мыши активацию базовой линии следует записывать в confПодтверждает исчезновение индуцированного трансфекцией воспаления.
Этот подход был испытан на острой фазе воспаления, но его применение к хронической фазе не было проверено. Неизвестно, как вызов живых микроорганизмов может повлиять на активность промотора, используемого в этой обстановке. Повышенное понимание патогенеза острого и хронического воспаления и последующего изменения функции легких имеет важное значение для развития эффективных методов лечения ряда хронических заболеваний легких 3 , 9 . Для этой цели необходимы модели животных, хотя существуют ограничения в точном отражении патофизиологии болезни человека.
Мониторинг воспалительных параметров у мелких грызунов in vivo с использованием репортерных генов люциферазы, полученных из других видов, имеет большое значение. Такой подход позволяет изучать патофизиологиюЛогика воспалительных реакций, а также способность тестировать вмешательства, направленные на их модуляцию. Это было успешно протестировано с использованием ранее хорошо охарактеризованной бычьего трансгенезированного (бовинизованного) мышиного модели мышиной мышиной модели 1 животного IL-8 промотирования / люциферазы крупного рогатого скота. Кроме того, недавнее исследование 10 продемонстрировало, что описанная здесь модель подходит для мониторинга воспалительной реакции легких, вызванной бактериальными экзопроводами, и для исследования механизма действия интересующего соединения (соединений). BLI - это неинвазивный подход, который позволяет проводить продольное наблюдение легочного воспалительного процесса после интратрахеальной инстилляции соответствующими стимулами, включая супернатант культуры P. aeruginosa 9 , 10 , 11 . Это очевидное преимущество изучения острого воспаления легких по сравнению с классическими методами, которые требуют жертвы животных для colЛечить жидкость БАЛ и легкие. Его ценность для изучения хронической инфекции / воспаления не была решена.
Настоящая модель может быть использована для углубления имеющихся знаний о патогенезе воспалительных заболеваний легких, включая характеристику бактериальных / небактериальных факторов с провоспалительной активностью. Кроме того, он может облегчить оценку возможных терапевтических эффектов молекул с известными / предполагаемыми противовоспалительными действиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана проектом итальянского проекта кистозного фиброза FFC № 18/2013, FFC № 29/2015 и итальянской линией мускулистого фиброза через Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
