Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה רבת עוצמה לניתוח אינטראקציות DNA-חלבון 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . זה דורש רק כמויות נמוכות של חומר המדגם ישירות לדמיין דוגמאות הטרוגניות עם רזולוציה ברמת מולקולה אחת. ההטרוגניות יכולה לנבוע ממצבים קונפורמיים או אוליגומריים שונים של חלבון. בפרט, בהקשר של דגימות DNA חלבון, מתחמי חלבון יכול להציג stoichiometries שונים ו / או קונפורמיות המושרה על ידי DNA מחייב בכלל או מחייב לאתר יעד מסוים בתוך DNA. דגימות הטרוגניות עשויות להכיל גם שני סוגי חלבונים שונים (או יותר), וחלבונים שונים( למשל , המורכבת מסוג אחד בלבד של חלבון לעומת קומפלקסים heteromeric) עשויים לתקשר באופן שונה עם DNA. מחקרים שנדונו כאן לנצל AFM הדמיה באוויר על דגימות סטטי, מיובש של חלבונים לתקן דנ"א כרוך ארוך (~ 900 זוגות, bp) שברי DNA המכילים נגע, המייצג יעד של חלבונים אלה. רזולוציה גבוהה, מולקולרית של AFM מאפשר את ההבחנה בין סוגים שונים של קומפלקסים חלבונים כדי לקבוע את עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ"א. חשוב לציין, נגעים הם הציגו לתוך מצעים דנ"א בעמדות מוגדרים היטב. מכיוון שמיקומו של אתר הנגע בדנ"א ידוע, התפלגות החלבונים הכרוכים בדנ"א מספקת תובנה למאפייני ההזיה השונים (השונים) של מכלולי החלבון (השונים), למשל , עד כמה הם מזהים סוג מסוים של נגע (בהשוואה כדי DNA פגום) 2 , 3 , , 5 , 6 . עמדותיהם על הדנ"א גם מאפשרות את ההבחנה בין מתחמי חלבון הקשורים ספציפית לנגעים ולמתחמים שאינם קשורים באופן ספציפי למקום אחר בדנ"א. אפיון נפרד של סוגים מורכבים אלה שונים (מתחמים קשורה במיוחד הנגע לעומת קומפלקסים שאינם ספציפיים) יכול לחשוף שינויים קונפורמציה פוטנציאליים במתחמים הנגרמת על זיהוי האתר היעד.

חלבונים התיקון DNA התמקדו כאן הם helicases כי הם אחראים להכרה נגע תיקון נוקליאוטיד תיקון כריתה (NER) מסלול. בחיידקים, NER מושגת על ידי חלבונים UvrA, UvrB, ו UvrC. UvrA אחראי על חישה ראשונית של הנגע במכלול UvaA 2 / UvrB 2 . עם אימות הנגע על ידי UvrB זה מורכב ממיר מונומריק UvrB כבול באתר הנגע זה מורכבים ספציפיים יכולים ואז לגייס את pNR. UvrC מכסה טווח קצר (12-13 nt) של DNA בודד תקוע (ssDNA) המכיל את הנגע. החסר החסר הוא מילא לאחר מכן על ידי פולימראז DNA. לבסוף, ה- DNA ligase חותמת את המסור החדש מסונתז עם המקורי DNA 9 , 10 . ב eukaryotes, רוב החלבונים של מפל NER הם חלק גדול, multimeric גורם שעתוק II H (TFIIH) מורכבת. לאחר הנגע הראשונית חישה באמצעות trimeric CEN2-XPC-HR23B מורכבים, TFIIH הוא גויס לאתר היעד DNA. כאשר XPD בתוך המתחם מאמת את נוכחותו של נגע מטרה NER, האנדוקלאס NER האיקריאטי NG ו XPF הם גויסו לבלו קצר (24-32 nt) מתיחה של ssDNA המכיל את הנגע 9 , 10 . כאן, במיוחד, את helicases UvrB ו XPD מ prokaryotic ו eukaryotic NER, בהתאמה, נחקרו. אלה helicases דורשים unaired באזורDNA (בועת דנ"א) על חוט אחד של שני גדילי דנ"א יחיד ולאחר מכן לתרגם לאורך זה גדיל מונעת על ידי הידרוליזה ATP. בנוסף נגעים דנ"א, בועה דנ"א היה ולכן הציג את המצעים המתפקדים כמו טעינת האתר עבור החלבונים.

ההליך להכנת מצע DNA ספציפי מצעים תוארה בעבר 11 . זה דורש מבנה דנ"א עגול (פלסמיד) עם שני אתרי הגבלה מקרוב מרווחים עבור nickase. בהקשר של מחקר זה, נעשה שימוש ב- pUC19N (2729 bp) פלסמיד (שנוצר על ידי המעבדה של ס 'וילסון, NIEHS). זה פלסמיד מכיל שלושה אתרי הגבלה מקרוב עבור ntase Nbase כי מסגרת 48 נוקלאוטיד (nt) למתוח. לאחר הדגירה עם nickase, את המתיחה של ssDNA בין האתרים האלה ניתן להסיר והוחלף על ידי oligonucleotide המכיל כל תכונה היעד. לאחר כל צעד, עיכול אנזימטי מלא נבדק באמצעות ג'ל agaroseאלקטרופורזה. DNA מעוגל DNA ניתן להבחין בשל הניידות האלקטרופורטית נמוכה יותר לעומת פלסמיד המקורי supercoiled. Gapping של הדנ"א והחלפת מתיחה להסיר על ידי oligonucleotide המצע הספציפיים ניתן להעריך באמצעות עיכול עם אנזים הגבלה אשר חותך את המצע באופן בלעדי באזור בין nicks. לינאריזציה של פלסמיד מעגלי על ידי האנזים ולכן יהיה מדוכא עבור ה- DNA gapped ומשוחזר לאחר החדרת oligonucleotide ספציפיים. לבסוף, שני אתרי הגבלת endonuclease (אידיאלי חותכי יחיד) לאפשר את הדור של מצע דנ"א ליניארי, עם אורך כנדרש ועם אתר היעד הספציפי במיקום מוגדר, כמו גם בועת דנ"א במרחק מן הנגע או 5 'או' 3 '.

הכרה של lesions על ידי nlic helicases ניתן לחקור באמצעות הדמיה AFM. טרנספוקציה דנ"א נתקע של helicases ב tהוא אתר lesion גלוי כמו שיא בחלבון הפצה מיקום על הדנ"א ומצביע על זיהוי הנגע. מאחר שהטרנספוקציה של דנ"א של הליקזים אלה היא גם כיוונית, עם קוטביות של 5'עד 3, התלות של זיהוי הנגע על המיקום של אתר הטעינה (בועת ה- DNA במעלה הזרם או במורד הזרם מן הנגע) גם מציינת אם הנגע מוכר באופן מועדף על transocated או על ההפך, לא transocated ssDNA strand 5 , 9 . בסעיפים הבאים, השיטות שיושמו יובאו, וממצאים מרכזיים מניסויים אלה יידונו בקצרה. חשוב לציין, מקביל לעבודה המופתית על תיקון דנ"א המוצג כאן, הדמיה AFM ניתן ליישם את המחקר של מערכות שונות אינטראקציה DNA, כגון שכפול דנ"א או שעתוק 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לדוגמא

  1. הכנת מצעי דנ"א 11
    1. יצירת פער ssDNA פלסמיד
      1. לעכל לחלוטין מדגם של פלסמיד (כאן: שונה pUC19, pUC19N) בצינור תגובה עם nickase מתאים (כאן: Nt.BstNBI) ואחריו איזון חום אנזים, תוך שימוש בתנאים על פי פרוטוקול של היצרן (ראה איור 1 עבור סכמטי הַצָגָה). התחל עם ~ 50 μL ~ ~ 500 ננומטר פלסמיד לתשואה מספקת.
      2. ודא ninks פלסמיד על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל על דגימות מדולל (~ 20 ננומטר) 15 . ללבוש כפפות להגנה מפני צבע דנה מחייב המשמש להדמיה DNA.
        הערה: מובילים electrophoretic שונים מאפשרים הבחנה בין דנ"א (נינוח) ו supercoiled מעגלית פלסמיד ( איור 1 ).
      3. הסר את למתוח ssDNA למתוח (בין אתרי ניק) מן הפלסמיד על ידיהדגירה עם עודף 10 ~ של oligonucleotide משלימים (oligonucleotide 1 בטבלה 1 ), רועד בסל"ד 300 במשך 30 דקות ליד טמפרטורת ההיתוך של oligonucleotide (כאן: 68 מעלות צלזיוס עבור pUC19N) בבלוק חום ( איור 1 ).
      4. להפריד את פלסמיד gapped מ שברי DNA קטנים יותר באמצעות 50 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) מסנן על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 xg בצנטריפוגה שולחן ( איור 1 ). כדי לחלץ את ה- DNA מרוכז מן המסנן, להפוך את המסנן ולהכניס לתוך צינור תגובה 1.5 מ"ל חדש. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1,000 x גרם.
      5. מילוי הדגימה וכתוצאה מכך דנ"א מרוכז μL 500 עם מים מסוננים deionized, להוסיף עוד פי 5 ~ עודף של oligonucleotide משלים וחוזר על צעדים 1.1.1.3 ו 1.1.1.4 לפחות 3 פעמים.
      6. מבחן עבור gapping מלא של ה- DNA על ידי הדגירה עם אנזים הגבלה מתאים (כאן: Xhoi או BglII) באמצעות conditiעל פי תיאור היצרן. השתמש מדולל דגימות DNA מדולל (nicked לעומת gapped) (~ 20 ננומטר). הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose להבחין בין פלסמיד לינארי (המכיל שום פער ssDNA) ו- DNA לא חרוטים (דנ"א gapped) באמצעות דנ"א nicked כמו שליטה חיובית (כולל סולם DNA עבור התייחסות, איור 1 ). לובש כפפות.
    2. מילוי הפער עם oligonucleotides ssDNA שונה
      1. אנאל את gasm פלסמיד באמצעות הדגירה עם עודף פי 25 ~ של 5 'phosphorylated oligonlotide המכיל את אתר היעד הספציפי (S) של בחירה, דוגרים על ~ 45 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות ( איור 1 ). כאן, השתמש 48 nt ssDNA המכיל נגע, או thymine פלואורסצין adymed או דיקלר cyclobutane pyrimidine (CPD), ובנוסף רצף קצר (8 nt) לא משלימים לייצר בועות DNA (ראה טבלה 1 ).
      2. Covalently קישור את annealed להוסיף פלסמיד על ידי incubaTion עם ליגז DNA T4 לילה בטמפרטורת החדר על פי פרוטוקול של היצרן ( איור 1 ). עבור תגובה זו, להוסיף ATP המכיל מרוכז מאגר מאגר פתרון לייצר תנאים מתאימים חיץ עבור ligase ( למשל , להשתמש במאגר התגובה UvrB: 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 10 מ"מ MgCl 2 , 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ DTT, 1 מ"מ ATP).
      3. בדיקה עבור ההכנסה של oligonucleotide ספציפיים לתוך פלסמיד gapped על ידי עיכול של דגימות מדולל עם אנזים הגבלה מתאים (כמו ב 1.1.1.6) על פי פרוטוקול של היצרן ואחריו ג'ל אלקטרופורזה agarose (כמו 1.1.1.6, איור 1 ).
    3. הכנת מצע דנ"א לינארי
      1. לעכל את ה- DNA פלסמיד שונה עם אנזימים הגבלה (באופן אידיאלי עם אתר הגבלה אחת הפלסמיד) שימוש בתנאים המומלצים על ידי היצרן ( איור 1 ). שלב זה מייצר שברי ליניארי מכיליםIng את השינוי שהוכנס במיקום מוגדר. כאן, השתמש SspI ו BspQI חיתוך במיקומים 613 ו 255 bp במעלה ומורד במורד של הכנס, בהתאמה, וכתוצאה מכך 916 קטע ה- DNA bp המכיל את אתר הנגע ספציפי ב ~ 30% אורך ה- DNA.
        הערה: עבור ניסויים הדמיה AFM כמתואר כאן, שברי דנ"א עם אורכים בין ~ 200 bp ~ 2000 bp הם מצעים מתאימים.
      2. לבודד את החלק המטרה באמצעות agarose ג'ל אלקטרופורזה מיצוי ג'ל באמצעות ערכת מסחרי. ללבוש כפפות להגנה.
      3. לחלופין, לחתוך ג'ל agarose עם אזמל להפריד את סולם ה- DNA ו נתיבים מדולל מדולל (שני נתיבים הראשונים) מן הנתיבים המכילים את ה- DNA מרוכז להיות מטוהרים. רק לחשוף את החלק ג'ל עם שני נתיבים הראשונים לקרינה UV על ידי הנחת רק חלק זה של ג 'ל על שולחן UV.
        1. חותכים את הלהקה המתאימה לשבר של בחירה עם אזמל. מחדש לאחד את שני חלקים ג'ל (את הכרטיסייה UVLe). השתמש את המיקום של הלהקה הוסר מן המדגם לדלל ככוונה למיקום של הלהקה של המצע הדנ"א הרצוי. חשבון עבור ריכוז גבוה יותר על ידי חיתוך פרוסות רחב מעט יותר עבור שליטה לדלל.
          הערה: מכיוון שכאן נחקרה ההכרה בנגעים UV, הכנסת נגעים נוספים באמצעות קרינת UV נמנעה בקפדנות במצע הדנ"א על ​​ידי גישה זו.
      4. לחשב את ריכוז ה- DNA C מן הקליטה ב 260 ננומטר נמדד על ידי ספקטרופוטומטר UV-Vis באמצעות חוק למברט-באר עם דנ"א תקועים כפול (dsDNA) מקדם טוחנת הממוצע מקדם של ε 260nm ~ 6,700 M - 1 ס"מ - 1 לכל bp:
        משוואה
        שבו L הוא אורך הנתיב (אורך החדר מדידה, בדרך כלל 1 ס"מ).
    </ Li>
  2. ביטוי וטיהור של חלבונים
    1. רקומביננטי להביע UvrB ב E. coli ו לטהר את החלבון באמצעות זיקה חרוז סטנדרטי chitin 15 ואת גודל כרומטוגרפיה הדרה 15 כפי שתואר לעיל 16 .
      הערה: הגן uvrB מ Bacillus caldotenax היה משובטים לתוך וקטור pTYB1.
    2. אקספרס XPD ב E. coli ו לטהר את החלבון באמצעות תקן ניקל זיקה IDA 15 ו כרומטוגרפיה הדרה גודל 15 ואחריו חילופי אניון כרומטוגרפיה 15 , כפי שתואר לעיל 17 .
      הערה: הגן עבור chetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum קבוצת D חלבון (XPD) היה משובטים לתוך וקטור pBADM11. ג תרמופילום p44 היה מתנה מתנה מן המעבדה של קרוליין Kisker, הביע ו puriFied כמתואר 17 .

2. ניסוי AFM

  1. הכנת דוגמאות
    1. לחלופין, מראש דגירה המצע דנ"א ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום להסיר גבישים פוטנציאליים מלח מיקרו שאולי יצרו במהלך האחסון במקרר.
    2. הכן חיץ התגובה (ים) בריכוז 10 פי (מאגרים 10x).
      הערה: חיץ התגובה XPD בריכוז 1x הכיל 20 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 10 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2 , 1 מ"מ TCEP, 2 מ"מ ATP; 1x UvrB למאגר התגובה הכיל 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 50 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2 , 5 מ"מ DTT, ו 1 מ"מ ATP.
    3. טרום דגירה חלבונים בריכוז גבוה יותר בתנאים הדגירה מתאים כדי לשפר את היווצרות מורכבת. טרום לדלל נפח קטן ( למשל , 1 μL) של חלבונים בודדים במאגר התגובה 1x חלבון לריכוז הרצוי לערב כמויות קטנות ( למשל , 1 μL) של tהוא פתרונות חלבון בודדים בצינור תגובה 0.5 מ"ל.
      1. מניחים את הצינור בבלוק חום עבור הדגירה בטמפרטורות גבוהות יותר בטמפרטורת החדר. בחר יחס ריכוז בהתאם stoichiometry מורכבים צפוי, או equimolar או ריכוזים המתאימים. הנה, דגירה 1 XPL μL (20 מיקרומטר במאגר התגובה x 1 xD) ו 1 μL p44 (20 מיקרומטר במאגר תגובה 1x XPD) ב 10 מיקרומטר כל 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. דגירה דגימות חלבון מתאים ריכוזי ה- DNA במאגר התגובה חלבון בצינור תגובה 0.5 מ"ל. הנה, להשתמש 500 ננומטר UvrB או 1 מיקרומטר XPD + 1 מיקרומטר p44 ו 100 ננו-דנ"א. פיפטה כרכים קטנים כדי לשמור חומר, למשל , 0.25-0.5 חלבון μL (מראש בדילול לריכוז הדגירה 10 פי) ו DNA בנפח כולל של 2.5-5 μL של חיץ התגובה 1x חלבון. הנה, דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בבלוק חום. ספין למטה בצינור תגובה לזמן קצר (~ 1 s) בצנטריפוגה השולחןדואר כדי להבטיח ערבוב של כרכים קטנים.
  2. דוגמה בתצהיר
    1. הכן מצע נציץ: לחתוך בערך 1 x 1 ס"מ 2 חתיכת נציץ מ רצועות גדול באמצעות אזמל. הפרד את השכבות העליונות של חתיכת המינרלים הרב שכבתית באמצעות סרט דבק כדי לחשוף משטח נקי, שטוח, אטומי חלקה המצע.
      הערה: חתיכת נציץ ניתן להשתמש מחדש עבור ניסויים מרובים על ידי הפשטת את השכבה נוספת (ים).
    2. הכן את מאגר חיץ AFM עם מים מסוננים deionized, למשל , 25 מ"מ HEPES pH 7.5, 25 מ"מ Na- אצטט, 10 מ"מ Mg- אצטט. סינון דרך מסנן 0.02 מיקרומטר מזרק.
      הערה: קטיונים Divalent במאגר בתצהיר לשמש chelate של מולקולות DNA טעונה שלילית על פני נציץ, אשר גם הוא טעונה שלילית ב pH ניטרלי. אם גבוה יחסית Mg 2 + יון ריכוז במאגר בתצהיר מציב בעיה עבור מערכת חלבון DNA מסוים, לחילופין,משטח פני השטח יכול להיות טעון מראש עם קבוצות אמינו באמצעות כימיה מבוסס סילאטרן לספק חיובי משטח חיובי עבור עיגון 18 . התצהיר המדגם יכול להתבצע במאגר המכיל לא רק כמויות נמוכות של קטיונים divalent.
    3. מדולל את המדגם (ראה 2.1) עבור בתצהיר מיידי על נציץ במאגר בתצהיר. הפקדה נפח קטן (כאן: 20 μL).
      הערה: גורמי דילול תלויים בריכוז המדגם. הנה, לדלל דגימות 50-100x. ככלל אצבע, ~ 1 nm DNA תוצאות כיסוי משטח טוב ~ 1000 bp.
    4. מיד לשטוף מדגם שלוש עד ארבע פעמים עם כמה מיליליטר של מים מסוננים, deionized, כתם נוזלי עודף, מכה יבש בזרם עדין של חנקן. התהליך כולו מן בתצהיר מדגם דגימות יבשים יכול להתבצע בתוך פחות מ -30 s.
    5. תקן את פיסת נציץ על שקופית מיקרוסקופ באמצעות סרט דבק על הקצוות שלה.
      הערה: למערכות AFM שונות יש דדרישות שונות עבור תיקון המדגם לשלב. אחר AFMs יש שלבים מגנטיים, ואת חתיכות נציץ קבועים על דיסקים מגנטיים, למשל , באמצעות דבק תרמי. פרטים על מערכת AFM בשימוש כאן ניתן למצוא בטבלה של חומרים.
  3. AFM הדמיה
    1. מניחים את המדגם (ראה 2.2.5) מרכזי על שלב AFM ולתקן את השקופית מיקרוסקופ על הבמה עם רפידות מגנטיות.
    2. הכנס את קצה ה- AFM למחזיק קצה. השתמש cantilevers עם חדה (<10 ננומטר) AFM בדיקה מתאים תנודות, מתנדנד מצב הדמיה מצב באוויר. השתמש בדיקות AFM, למשל, כפי שמופיע בטבלה של חומרים . כאן (תלוי AFM), לתקן את קצה מחזיק תחת מהדק ידי הידוק בורג מהדק (אצבע חזק). הכנס את קצה קצה לתוך ראש המדידה AFM. הניחו את הראש על הגב עבור שלב זה.
    3. מניחים את ראש המדידה AFM על גבי המדגם. פרטים תלויים במודל AFM. הנה, מאקה בטוח הראש עומד ביציבות עם הרגליים שלה בתוך החריצים הבמה. ודא כי נציץ ממוקם על הבמה שבה קצה AFM ירחף מעל זה. ברגים מיקרומטר בצד ימין של הבמה לאפשר מיקום בסדר של המדגם.
    4. יישר את הלייזר AFM בצד האחורי של שלוחה עבור כוח האות אופטימלי מן photodetector רגיש המיקום שעליו הלייזר משתקף. פרטים תלויים במודל AFM.
      1. הנה, להפוך את הגלגלים בצד ימין ובחלק האחורי של ראש המדידה AFM להתאים את x ו- y עמדות של לייזר AFM לכוון אותו מרכזי על קצה שלוחה. צפה באיתות ההשתקפות בחלון הווידאו AFM (אם זמין, כאן: לחץ על סמל המצלמה ובחר קלט: Svideo).
      2. לאחר מיקומו בגסות, לייעל את סכום גלאי סכום (סכום ב סכום ו סטיה חלון Meter ב AFM תוכנה) על ידי כוונון עדין של מיקום לייזר עם שני גלגלים (להישאר בסוף שלוחה, סכום signaאני תלוי AFM ו סוג שלוחה, כאן: המטרה עבור סכום 5).
    5. אפס את אות ההבדל מהדיודות העליונות והתחתונות של מערך הגלאי (כאן: אות הטיה בחלון סכום וסטייה) על ידי הפניית השתקפות הלייזר AFM אל מרכז הגלאי (כאן: סובב את הגלגל בצד שמאל של המדידה AFM רֹאשׁ).
      הערה: סטיות מאפס מציינות את סטייה של שלוחה עקב אינטראקציות פני השטח, אשר מתורגמים למידע גובה על ידי AFM.
    6. קביעת תדר תהודה שלוחה על ידי תדר המנגינה מיושם לתוך תוכנת AFM (כאן: מנגינה אוטומטי הפקודה בלוח הורים / חלון Tune). בחר משרעת המתאימה 1 V קלט עבור piezo המניע את תנודה שלוחה. הגדר את התנודה תנודה מעט (5%) נמוך יותר בתדר תהודה ואפס את השלב של תנודה.
    7. גישה קצה למשטח המדגם באמצעות mod לעסוק גולמיE (כאן: פקודה Engage בחלון לוח מאסטר) עד להגדרת המגן (נקודת הצבע). השתמש ~ 2% חיתוך של משרעת תנודה ברמה חופשית כמו נקודת נקודת (כאן, הזן נקודת מוגדר 980 mV בלוח הראשי).
    8. עדיף לעסוק קצה AFM עם משטח המדגם על ידי הפחתת נקודת להגדיר באמצעות תוכנת AFM. לכוון הדמיה מצב דוחה עם שלב תנודה שלוחה (שלב סכום ו סטיה חלון Meter) ממש מתחת לשלב שלב חופשי (לפני לעסוק, כאן בדרך כלל ~ 70). כאן, השתמש טיפוסי סופי להגדיר נקודות על סדר של 70-80% של משרעת ברמה חופשית (1 V).
    9. לפני הסריקה, בחרו את האותות להקלטה בלוח הערוץ הראשי. בחר גובה (Ht) ומשרעת (Am).
    10. התחל סריקת מדגם (כאן: פקודה האם סרוק בחלון לוח ראשי). השתמש מהירות סריקה של למשל, 2.5 מיקרומטר / s (הפקודה מהירות סריקה בלוח הורים) על פני השטח התמונה של 4 מיקרומטר x 4 מיקרומטר או 8 מיקרומטר x 8 מיקרומטר (הזן גודל סריקה בחלונית מאסטרL) עם רזולוציות פיקסל של 2,048 או 4,096 (נקודות סריקה וקווי סריקה בלוח הראשי), בהתאמה.
    11. שמור את קובץ התמונה (פקודה שמור תמונה בלוח מאסטר) ללא שינויים מתאימים (בחר אין בלוח ערוץ ראשי / שמור מטוס Fit).
    12. לניתוח נוסף, לעבד את התמונה שנשמרה. טען את התמונה (פקודה עיין בנתונים שמורים בתפריט AFM Analysis). פתח את לוח השינוי (לחץ על M בחלק העליון של התמונה). להחיל planfit ב x ​​ו- y ממדי לתמונה גובה (הרחבה HtR) (פקודה XY בחלון Planefit ב שינוי לוח, בחר Planefit צו 3). ואז לשטח את התמונה (פקודה לשטח בחלון שטוח ב שינוי לוח) בחירה שטוח 3.
    13. לייצא את התמונה כקובץ TIFF (לחץ על פקודות בחלק העליון של התמונה, בחר TIFF ייצוא 2x המקביל ל -2,048 פיקסלים ברזולוציה) לניתוח נוסף.

3. ניתוח AFM

  1. נפח מורכב של חלבון
    1. מִרֹאשׁ-בחר מתחמי DNA רלוונטיים- DNA על ידי בדיקה חזותית ישירה של התמונות בתוכנה AFM, באמצעות ערכת צבעים מתאימה כדי למקסם הופעות שונות של קומפלקסים בגודל שונה (ראה צבעים שונים וגדלים של קומפלקסים שונים באיור 2 , כאן: ערכת צבעים SeaLandAndFire ב את AFMsoftware). עבור דגימות XPD, מכלולים אפשריים כללו XPD / p44-DNA, כמו גם XPD-DNA ו- p44-DNA, בגדלים שונים במובהק בשל המסה המולקולרית הגדולה והשונה של XPD (~ 95 kDa) ו- p44 (~ 40 kDa) .
    2. מדוד כרכים של פסגות חלבון בודדות על הדנ"א כדי לאמת את הסוג המורכב. זה יכול להיות מושגת עם תוכנות תמונה שונות (כאן: כלי סעיף של תוכנת AFM).
      1. למדוד את גובה (ח) וקוטר (ד) של קטעי חלבון שיא עם סמנים חלון סעיף. מדוד את הקוטר קרוב לבסיס החלק החלקיקים.
      2. לקבוע את נפח (V) של אפונהKs באמצעות מודלים מתמטיים פשוטים, למשל , תוך שימוש בנוסחה הבאה, המבוססת על מודל כדורי כדורי:
        משוואה
    3. תרגם את הכרכים הנמדדים למסה מולקולארית של חלבון.
      1. בתחילה, לכייל את מערכת AFM עבור נפח כדי משקל מולקולרי (MW) המרה באמצעות מגוון של חלבונים עם משקל מולקולרי ידוע (כאן: סך של 12 ניסויים עם בין 25 ו 851 נקודות נתונים כל נערכו על 5 חלבונים שונים monomeric, dimeric , Trimeric, או מדינות tetrameric) 4 , 19 , 20 . חלבונים ופיקדונות תמונה (כמתואר לעיל, ב 2.2 ו 2.3) ולמדוד כרכים שלהם כמתואר לעיל (3.1.2). תכנן את הכרכים על משקלם המולקולרי הידוע. התרשים המתקבל יציג קשר לינארי בין V לבין MW, המשוואה אשר ניתן להשיג על ידישורה המתאימה לנתונים. עבור מערכת AFM בשימוש כאן, הקשר הבא התקבל 19 :
        משוואה
        הערה: שלב זה אינו חייב לחזור על עצמו לפני כל מדידה, אך נעשה רק פעם אחת. נפח לכיול MW ניתן להחיל על תמונות שהושגו בתנאי הדמיה דומים באמצעות בדיקות AFM עם קטרים ​​משתנים מעט.
      2. בהתבסס על הכמויות הנמדדות (3.1.2) והכיול של V-to-MW (3.1.3.1), קובעים את MW המשוער של מכלולי החלבון 20 , המספק מידע על התוכן המולקולרי שלו. לדוגמה , עבור דגימות XPD / p44, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa ו ~ 140 kDa התקבלו, בהתאם למתחמי p44-DNA (או פסגות שנגרמו על ידי מבנה דנ"א בלבד), פסגות XPD בלבד, ו- XPD / p44 paks, בהתאמה .
  2. חלבונים מורכבים על דנ"א
    1. קבעו את ה- DNAאורך אור.
      1. עקוב אחר שברי ה- DNA בתמונות AFM, למשל , עם פונקציה הקו freehand של תוכנת ניתוח תמונה מתאים (ראה למשל טבלה של חומרים) ולמדוד את אורך הקו.
        הערה: לא לכלול אגרגטים דנ"א, כמו גם שברי לחתוך על ידי שולי התמונה.
      2. סל ולחתוך את אורך דנ"א מן הניסוי כולו בהיסטוגרמה, תוך שימוש בנתונים מתאימים ניתוח וגרפים תוכנה ( למשל , ראה טבלה של חומרים ).
      3. להתאים את הפצות אורך עם עקומת גאוס בניתוח נתונים תוכנת גרפים כדי לקבוע את אורך שברי ה- DNA. על מנת לדעת את המיקום של אתר היעד של ה- DNA (ראה 1.1), יש לכלול רק שברי דנ"א באורך הנכון בתוך שתי סטיות תקן ממרכז עקומת גאוס (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), כאשר z הוא גורם נורמלי ו- x c ו- w הם המרכזרוחב מקסימלי מלא למחצה של הגאוסי) בניתוחים נוספים.
        הערה: אורך ה- DNA במרכז עקומת גאוס חייב להיות קרוב לאורך התיאורטי של קטע ה- DNA (מחושב באמצעות 0.34 ננומטר / BP). אורכים של עד 10% קצרים יותר מהערך התיאורטי אופייניים ונגרמים ככל הנראה על ידי מגבלות רזולוציה של AFM.
    2. קביעת עמדות של פסגות חלבון על מצע DNA.
      1. למדוד את המרחק של פסגות חלבון מקצה הדנ"א קרוב יותר, כפי שמתואר 3.2.1.1 ולחלק את אורך הדנ"א הכולל כדי להשיג מרחקים ביחידות של שברי אורך DNA.
      2. סל וחתך את המרחקים נמדד היסטוגרמה באמצעות ניתוח נתונים מתאים תוכנת גרפים (ראה למשל , איור 3 ). ככלל אצבע, בחר גודל סל אשר נותן כ √n פחי עבור n נקודות נתונים.
        הערה: מאז מסתיימת DNA לא ניתן להבחין כאן, העלילה רק לשבריר של אורך 0.5 DNA (מרכז של שבב DNAמנט). מכיוון שהחיבור הסופי של הדנ"א אינו מוקד המחקר, אל תכלול קצוות דנ"א מהניתוחים על ידי התחלת סל נתוני המיקום במקצת לאחר המיקום 0 ( למשל : binning מקטע של דנ"א באורך 0.02).
    3. לקבוע את סגוליות האתר היעד החל חלבונים מיקום הפצות מורכבות.
      1. התאימו את המקסימום (מופעים מחברים משופרים) בהתפלגות המיקום עם עקומת גאוס כמו 3.2.1.3 אבל footed על גובה של מחייב רקע (ראה איור 3 ).
      2. לחשב את הספציפיות S עבור האתר הספציפי לעומת רקע DNA ספציפי (מולקולות חלבון קשורות לא ספציפי DNA אתרים) עם הנוסחה הבאה 21
        משוואה
        A sp : מספר מתחמים ספציפיים (אזור תחת עקומה גאוס)
        A nsp : מספר קומפלקסים לא ספציפיים (אזור של הרקע, 0 ); השבר של אורך ה- DNA מכוסה כאן הוא 0.48 עבור היסטוגרמה החל באורך 0.02 DNA)
        N: מספר אתרי DNA אפשריים מחייב (כאן: N = 914 למעט קצוות DNA)
  3. זווית לכופף זוויות
    1. באמצעות כלי זווית בתוכנה ניתוח תמונה מתאים, למדוד את הזווית β בין שתי שורות להציב מרכזי לאורך עמוד השדרה דנ"א ומרכוז בשיא חלבון (ראה למשל , הבלעה באיור 4 ). למדוד את הזוויות עבור מספר רלוונטי מבחינה סטטיסטית של DNA- מתחמי DNA (> 50, באופן אידיאלי> 100) 2 , 3 , 5 .
      הערה: זווית ה- DNA לכופף מוגדר 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. באמצעות ניתוח נתונים וגרפים תוכנה(ראה טבלה של חומרים) לייצר עקומת זווית הפצה היסטוגרמה על ידי binning זווית ה- DNA זוויות.
    3. התאם את חלוקת הזווית העקומה עם עקומת גאוס. אם אחד או יותר מרבי ניכר בהפצה, בחר מספר גאוס התאמה שיא. מרכז (ים) של עקומת גאוס (ים) לתת (ים) את הממוצע זווית לכופף המדינה של המין בפרט.
    4. אם שינוי בזווית העקמומיות (מקסימום של התאמה גאוס) (s) נראה לעין להפצות, למשל, של וריאנטים חלבונים שונים או מינים שונים של חלבון מורכב, ליישם את התלמיד t-test כדי להעריך את רמת המשמעות של שינויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבחנה בין סוגים מורכבים שונים המבוססים על כמויות מורכבות של חלבון

פעילות helicase של NER helicase prokaryotic UvrB הוא מגורה על ידי DNA מחייב 22 , 23 . UvrB דורש אזור לא מזוהה בדנ"א (בועת דנ"א) כדי לטעון נכונה על אחד משני גדילי ssDNA יחיד. ב vivo , מבנה ה- DNA הזה מסופק על ידי אינטראקציות DNA באמצעות חלבון אחר של מפל NER; ב ניסויים חוץ גופית , את הבועה ניתן להכניס באופן מלאכותי לשברים dsDNA בסמיכות לנגע ​​היעד. אינטראקציות חלבון חלבונים גם לשפר את ה- DNA מחייב ידי UvrB 9 . עם זאת, לאחר UvrB נטען על DNA, הפעילות שלה לא נראה תלוי בגורמים שיתוף חלבון 9 . לעומת זאת, ה- NER helicase XPD האיקריוטי דורש אינטראקציהעם p44 חלבון, אשר כמו XPD הוא חלק מקבוצת שעתוק מרובה תת יחידות IIH (TFIIH) מורכבים in vivo , להפעלת פעילות helicase שלה, אבל אינטראקציה זו אינה משפיעה על חיבור XPD ל- DNA 17 . XPD לבדה צפוי לטעון על דנ"א ב בועת דנ"א, אבל לא לתרגם את הנגע (בהעדר helicase שלה מפעיל שיתוף גורם). XPD ללא p44 צריך ולכן לא יוכלו לתקשר עם ולזהות את הנגע כאשר נטען במרחק של אתר הנגע. אינקובציות של XPD עם p44 בנוכחות נגעים המכילים דנה המכילה נגעים של שילוב של מתחמי XPD או XPD / p44-DNA (ואולי מינים קלים של p44 לבדם קשורים ל- DNA). כדי לנתח בנפרד את זיהוי הנגעים על ידי XPD / p44 ו XPD, אלה סוגים שונים מורכבים ניתן להבחין על בסיס הכרכים שלהם בתמונות AFM ( איור 2 ) 9 , כמתואר בפרוטוקול 3.1 לעיל. ניתן לכייל את מערכות AFM באמצעות טווח של pרוטינים עם משקל מולקולרי ידוע, לחשוף קשר ליניארי בין נפח AFM לבין המסה המולקולרית של חלבון (מורכב) 20 , המאפשר פרשנות של כרכים נמדדים. עמדות מחייב על ה- DNA יכול להיות נקבע בנפרד עבור helicase פעיל monomeric XPD (~ 95 kDa, עולה בקנה אחד עם ~ 100 ננומטר 3 מחלקה 2 מינים באיור 2 ) ו עבור helicase פעיל XPD / p44 קומפלקסים (~ 135 kDa, ~ 150 ננומטר 3 כיתה 3 מינים), על בסיס כרכים שונים שלהם AFM.

קביעת הנטייה הכרה מאת עמדות חלבון מחייב על DNA

הנה, ארוך (916 נ"ב) מצעים DNA המכיל נגע ב ~ 30% אורך ה- DNA שימשו. שליטה על המיקום המדויק של הנגע בתוך המצע הדנ"א מאפשר את ההבחנה בין ספציפי (נגע קשורה, ב ~ 30% של אורך ה- DNA) ו nonspeCif (מתחם הנגע), תלוי במיקומם על הדנ"א. נבחרו שתי נגעים שונים, שהם מטרות של NER; מצע DNA מכיל גם פלואורסצין (F) adduct או דיקלר cyclobutane pyrimidine (CPD). בנוסף לאתר הנגע, ה- DNA הכיל אזור לא מזוהה (8 בועה DNA DNA) ששימש אתר טעינה עבור helicases. אתר הטעינה נמצא במרחק של 26 נ"ט (עבור מצעי הדנ"א המכילים F) או 23 nt (עבור מצעים המכילים CPD) או 5 או 3 מהנגע (ראה טבלה 1 ). זיהוי הנגע מוביל טרנספוקציה דנ"א נתקע של helicases UvrB ו XPD באתר היעד, לכאורה בחלבון AFM הפצה מיקום על ה- DNA כמו שיא במיקום של הנגע. הנגע ועמדות הבועה מצעים אלה לא יכול להיות להבחין בין גבולות ההחלטה של ​​הדמיה AFM (מרחק <10 ננומטר). עם זאת, השבר של מתחמים ספציפיים המייצג אתהר של מולקולות תקוע על הנגע ומציין הכרה הנגע, תלוי מאוד אם הנגע הושם 3 או 5 "מן הבועה ( איור 3 ) 9 .

משבר המתחם באתר הספציפי (אזור מתחת לשיא ההתאמה הגאוסית לעומת אזור הרקע שאינו קשור ספציפית), הספציפיות, S, של UvrB ו- XPD עבור שני סוגי הנגעים שנחקרו חושבה (ראה פרוטוקול 3.2 לעיל). עבור UvrB, טעינה של 5 'ממצב הנגע הביאה לפרטיות גבוהה יותר (S B, F5 ~ 200 ו- S B, CPD5 ~ 400) מאשר טעינה של 3' מהנגע (S B, F3 ו- S B, CPD3 ~ 100) עבור שני סוגי הנגע. עבור XPD, קומפלקסים המכילים רק XPD (דרגה 2 באיור 2 ) ומורכבים המכילים XPD, כמו גם helicase הפעלת co- גורם חלבון p44 (דרגה 3 באיור 2 ) היו מובחנים כמו descrשצוין בסעיף הקודם. שינויי חלבונים מסוג Class 2 (XPD בלבד, helicase לא פעילים) לא העדיפו למקם את אתרי הנגע ללא קשר לשאלה האם הם נטענו 5 או 3 'ובלתי תלויים בסוג הנגע (הנתונים אינם מוצגים). לעומת זאת, הפוזיציות למיקומים מסוג XPD / p44 (Class 3) הראו קשר משופר ב- F lesions לטעינת 5 ' מהנגע (S XPD / p44, F5 ~ 300 לעומת S XPD / p44, F3 ~ 100), אך ב- CPD נגעים עבור טעינה 3 'מן הנגע (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 לעומת S XPD / p44, CPD5 ~ 100, איור 3 ). מאחר ש- UvrB ו- XPD הם שלישיות של 5'עד 3, נתונים אלה מספקים מידע על מורכבותם של הקומפלקסים באמצעות אינטראקציה עם הנגע בתוך גדילת ssDNA שאותם הם מתרגמים (גדיל טרנסלוקציה, לטעינת 5 'מהנגע) או בתוך החוט הנגדי, שאינו מתורגם (לטעינה 3 'מן הנגע). המושג מוצג באופן סכמטי ב

חקירת שינויים קונפורמטיביים על זיהוי הנגע על ידי XPD

מדידת הכפיפה שהוכנסו לדנ"א באתר של קומפלקסים מאוגדים מתמונות AFM (ראה פרוטוקול 3.3 לעיל) יכולה לחשוף מידע חשוב על שינויים קונפורמטיביים מורכבים. זוויות עיקול ה- DNA נמדדו עבור ארקייד XPD 5 , אשר אינו דורש אינטראקציה שיתוף פעולה חלבון עבור פעילות helicase. במחקרים אלה, נגע פלואורסצין נמצא direcTly בהקשר של בועת דנ"א עבור טעינת חלבון משופרת על הנגע, על ~ 30% אורך הדנ"א. איור 4 מראה גאוסי מתאים ל- DNA זווית הפינה זוויות שהושגו עבור קומפלקסים חלבונים ב nonspecific (לא פגום) דנ"א עמדות ב ~ 30% של אורך ה- DNA, בקנה אחד עם XPD כבול במיקום של נגע פלואורסצין (מתחמים ספציפיים). הנתונים מראים זווית עיקול ממוצע של ~ 50 מעלות עבור קומפלקסים לא ספציפיים לעומת ~ 65 ° עבור מתחמים ספציפיים. זה זווית ה- DNA משמרת זווית היה תלוי נוכחות של ATP או ATPƔs, המציין כי ATP (re-) מחייב אך לא הידרוליזה היה הכרחי עבור סידורים קונפורמיוני 5 .

איור 1
איור 1: הכנת מצע DNA. פער ssDNA הוא הציג לתוך DNA פלסמיד מעגלי ידי nicking הפלסמיד (כאן עם N.BstNBI nickase) ב cloאתרים במרווחים sely והסרה של ssDNA סגורה למתוח באמצעות סינון צנטריפוגה לאחר יציבות יציבות בנוכחות עודף של oligonucleotide משלימים. Oligonucleotide ספציפי המכיל את התכונה של בחירה יכול להיות annealed ו ligated לתוך אזור הפער. לבסוף, עיכול עם אנזימים הגבלה (כאן עם SspI ו BspQI) התוצאות של המצע DNA דנ"א עם תכונת היעד במיקום ידוע בדיוק (כאן ב 30% אורך הדנ"א קטע). מבחני בקרה מאפשרים בדיקה של שלבים בודדים (שמוצג מתחת) באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל (החץ השחור מציין 3000 bp). ניקינג ניתן לבדוק על ידי ניידות אלקטרופורטית שונה של דנ"א עגול, רגוע נינוח (שליטה nick, נתיב 2) לעומת פלסמיד supercoiled (מסלול 1). השלב המלא של ה- DNA, כמו גם ההכנסה שלאחר מכן של אוליגו מסוים ניתן לבדוק על ידי עיכול עם אנזים הגבלה כי חותך באזור הפער (כאן: XhoI, inמסלולים 2, 4 ו -6), כך חוסר חתך דנ"א מצביע על היווצרות פער (נתיבים 1,2 דנ"א nicked, נתיבים 3,4 gapped DNA) ו-חתך מחדש חתך מציין החדרת oligo ספציפי (נתיבים 5,6) . המצע ליניארי הסופי המכיל את התכונה הספציפית ניתן לטהר מן ג'ל לאחר agarose ג'ל אלקטרופורזה נבדק על הומוגניות וטוהר באמצעות הדמיה AFM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הבחנה בין סוגים מורכבים שונים מהכרכים שלהם. ( A ) תמונה AFM של XPD / p44-DNA (חץ אפור) ו- XPD-DNA (חץ שחור) מתחמי. ( ב ) דוגמאות של שלושה סוגים שונים של מתחמי ה- DNA קשור, לפרש כמו p44 או סתם DNA מבנה (בכיתה 1),XPD (סוג 2, מסגרת שחורה), ו XPD / p44 (בכיתה 3, מסגרת אפור) מתחמי מבוסס על כרכים AFM שלהם (שמוצג בצד ימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: אסטרטגיות שונות של זיהוי הנגע של helicases noc prokaryotic ו eukaryotic. הזיהוי הדנ"א המוסמך על ידי NER helicases UvrB ו XPD (במורכבות עם helicase להפעיל את שיתוף גורם p44) דורש טעינה של חלבונים באזור DNA לא מזוהה (בועת דנ"א). החלבונים ואז לזוז ב -5 ל -3 "לכיוון לאורך ssDNA גדיל שבו הם נטענים. זיהוי של דלקת DNA (כאן: CPD) על ידי helicases או על גדיל translocated (לטעינה ב 5 'בועה) או על ההפך, לא translocated strand (עבורR טוען ב 3 'בועה) תוצאות טרנספורמציה דנ"א נתקע. במצב הפצות זה מראה כמו שיא (שורות גאוס מתאים), אשר מציין מחייב משופר על המיקום הנגע (ב ~ 30% אורך DNA עבור מצעים דנ"א שמוצג כאן). פרוקריוט NER helicase UvrB ו עמיתו האיקריוטי XPD להראות אסטרטגיות שונות של זיהוי נגע CPD המציינים העדפות גדילה שונות DNA. באופן ספציפי, נגעים CPD מזוהים על גדיל translocated ידי UvrB, אבל מעדיף על גדיל, שאינם translocated על ידי XPD. איור שונה מן התייחסות 9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: שינויים קונפורמטיביים במתחמי XPD-DNA על זיהוי הנגע. ההתפלגות של זווית כיפוף דנ"א הנגרמת על ידי XPD מצביעה על שינויים קונפורמטיביים במתחמי ה- DNA של החלבון בנגע פלואורסצין. הסדרים קונפורמטיביים אלה היו תלויים בנוכחות ATP (B) או ATPƔS (C). ( A ) בהיעדר ATP, זוויות עיקול לא ספציפיות (אפור) וזוויות עיקול באתר הנגע (זוויות כפוף ספציפיות, שחורות) דומות ומתאימות על ידי עקומת גאוס עם מרכז ב ~ 50 מעלות. ( B , C ) בנוכחות ATP או ATPƔS, חלוקת הזווית הספציפית (שחור) מראה שינוי משמעותי (P = 2.5 x 10 -7 ) לזווית עיקול ממוצעת של 65 מעלות. זה DNA כיפוף באתר הנגע היה עצמאי של סוג של נגע (CPD או פלואורצין adduct) או נוכחות או היעדר של בועת דנ"א 5 . איור שוכן מתוך התייחסות 5 . הבלעה ב (C) ממחישה כיצד נקבעו זוויות (180 ° -β)."Target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מספר סדר פעולות תאור
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGG 		תַחתִית
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 'בועה
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
אגאקטקטהאגאגאגאג 		F / 3 'בועה
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
אקגהTCTCTAAAGTAAGAGTCACACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCFF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / בועה

טבלה 1: oligonucleotides DNA להכנת המצע דנ"א. כל oligonucleotides הם 48 nt ארוך וגידים העליון (oligonucleotides 2-6) התקבלו phosphorylated בקצה שלהם 5 'עבור קשירת לתוך ה- DNA gapped (ראה פרוטוקול 1.1). F = פלואורסצין תימן, TT = cyclobutane pyrimidine (thymine) dimer (CPD), אזורים שאינם משלימים (בועת דנ"א להרכיב אזורים) מודגשים. F המכיל oligonucleotides התקבלו משולב DNA טכנולוגיות (IDT), CPD המכיל oligonucleotides סופקו בחביבות על ידי מעבדה של תומאס קארל (לודוויג- Maximilian אוניברסיטת מינכן, גרמניה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח סטטיסטי AFM של עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ"א ארוכים המכילים אתרים ספציפיים היעד יכול לחשוף פרטים מעניינים על אסטרטגיות מסוימות המשמשים את החלבון לזהות אתרים אלה 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . כדי לפרש את הפצות המיקום וכתוצאה מכך, את המיקום של המטרות ב- DNA צריך להיות מוכר במדויק. זו מושגת על ידי הצגת אתרים ספציפיים על עמדות רצף מוגדר היטב לתוך DNA פלסמיד מעגל חיתוך לחתוך של ה- DNA כולל אתר ספציפי זה, תוך שימוש בטכנולוגיה אנזים הגבלה. ב AFM ניתוח תמונות של עמדות חלבון מחייב, רק שברי DNA עם אורכים נכונה (בקנה אחד עם אורך מלא של לחתוך את שבר) ניתן לכלול רק עבור אלה, את המיקום של אתר היעד ידוע. זה שווה לאTing כי הליך ההכנה המתואר כאן תוצאות מצעים דנ"א לינארית עם שני קצוות שברי לא ניתן להבחין. הפצות מיקום יכול לפיכך להיות רק נמדד ו זממו מ 0 x אורך DNA (חלבונים הקשורים מסתיים קטע דנ"א) כדי 0.5 x אורך DNA (חלבונים הקשורים במרכז שברי). יתר על כן, עבור מיקודים היעד שאינם ממוקמים בדיוק במרכז המצע, התפלגויות אלה תמיד מכילים רקע קטן של חלבונים שאינם קשורים באופן ספציפי באותו מרחק מן סוף DNA אחרים. עם זאת, התאמה עקומה גאוס כדי הפצה על רגל גובה ממוצע (חלבונים קשורה לא ספציפית, איור 3 ) חשבונות עבור קומפלקסים אלה. לחלופין, אחד מסופי ה- DNA יכול להיות מתויג, למשל עם פסגות נפח קטן מהמבנה המשני להרכיב ssDNA overhangs 24 . גבולות רזולוציה אופייניים של ניתוחי מיקום אלה הם בטווח של העדפה 100 פי של יעד siTe מעל מחייב אתר לא ספציפי. בנוסף, קצוות דנ"א מסתיים אינם מהווים אתרי dsDNA שאינם ספציפיים אלא מייצגים מעברי dsDNA. חלבונים לתקן דנ"א לעתים קרובות לאגד אלה מסתיים קטע יציבות, בנוסף strand- הציג אתרי יעד ספציפי. DNA מחייב סוף יכול להתגלות על ידי ניתוח AFM והוא יכול לספק מידע חשוב על הפונקציה של חלבון. אם מחייב סוף DNA הוא לא עניין של עניין, עמדות אלה יכולים, עם זאת, להשמיט בקלות מן הפצות המיקום על ידי הפעלת מגרשים במיקום 0 ( למשל , כאן 0.02 דנ"א אורכים).

אחד היתרונות הספציפיים, ולמעשה, המאפיין המשותף של טכניקות מולקולות בודדות הוא הפתרון של מצבים אינדיבידואליים, שונים, הנמצאים במדגם, אשר יכול להיות בעל מאפיינים שונים ופעילויות שונים. גם במקרים בהם מינים מסוימים של עניין עשוי להיות רק לעתים רחוקות במדגם, גישות אלה מאפשרים את זההתמקדות נפרדת במינים האלה שתרומתם תהיה מגמדת במדידת האנסמבל. עבור דגימות חלבון, למשל, הדמיה AFM מאפשר הבחנה ישירה בין סוגים שונים של קומפלקסים חלבונים המבוססים על נפח מורכב, אם גדלים של חלבונים בודדים שונים דיים (גבולות רזולוציה טיפוסי הם סביב 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . ניתן לכייל את מערכות AFM על מנת לאפשר תרגום של הכרכים הנמדדים למשקל מולקולרי של חלבון (פרוטוקול 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . לחלופין, תקנים חלבון עם גדלים ידוע שימשו התייחסות ישירה בתמונות 1 , 6 . בתוך ההמערכת התמקדה כאן, עמדות מחייב על ה- DNA יכול בנפרד נקבעו עבור helicase פעיל monomeric XPD ו עבור helicase פעיל heterodimeric XPD / p44 מתחמי. החיבור המועדף לאתר הנגע במיקום מוגדר היטב בדנ"א הצביע על זיהוי נגע דנ"א על ​​ידי קומפלקס חלבונים. מאז טעינת חלבון האתרים נגע היו מופרדים מרחבית, טרנסלוקציה דנ"א היה הכרחי מראש הכרחי עבור זיהוי הנגע מצעים DNA בשימוש כאן. רק הטרודימריים XPD / p44 קומפלקסים היו מסוגלים טרנספורמציה DNA ( איור 3 ), עולה בקנה אחד עם תוצאות מבחני helicase פעילות 9 . ניתוח AFM נפח ולכן יכול לספק מידע חשוב על פעילויות שונות של צורות חלבונים שונים.

אינטראקציה הלסיון והכרה על ידי helicase פעיל XPD / p44 מורכבות הביאה מחייב משופר באתר היעד עקב השתהות של טרנסלוקציה helicase ( איור 3 בתרשים 3 ), ממצא זה מציין כי האנזים מזהה פלואורסצין מועדף על גדיל translocated אבל CPD מועדף על גדיל, לא translocated. לעומת זאת, ה- NER helicase UvrB הפרוקריוטי זיהה באופן מועדף הן נגעים של פלואורסצין והן CPD בעת הטעינה של 5 'מהנגע, כלומר על גדיל טרנסלוקציה ( איור 3 ). הבדלים ייחודיים אלה במאפיינים של זיהוי הנגעים שלהם יכולים להיות מובנים מהמאפיינים המבניים השונים של שתי ההליקזות. UvrB מקיים אינטראקציה עם מטרות פוטנציאליותN DNA באמצעות שאריות חומצות אמיניות על החלק הפנימי של תכונה סיכה β באנזים שמאחוריו strand translocated סביר מושחל 16 , 25 . XPD, לעומת זאת, מארחת נקבובית קטנה בסמיכות לאשכול ברזל-גופרית 26 . דנ"א טרנסלוקטיבי גדיל את החוטים סביר דרך הנקבוביות האלה 26 . Bulcier lesions כגון פלואורסצין עלול להידחק טרנספורמציה helicase באמצעות אינטראקציות עם שאריות בתוך הנקבובית הזו, בעוד נגעים CPD מגושם פחות מזוהה בקלות רבה יותר באמצעות אינטראקציות עם אשכול FeS. במערכת הפרוקריוטית, שתי המולקולות של UvrB נחשבות כמעורבות בחיפוש של אתרי יעד במתחם hetero-tetrameric UvrA 2 -UvrB 2 , שבו כל אחד משני מונומרים של UvrB מסוגל לחקור דנ"א שונה 27 . XPD ב NER eukaryotic ככל הנראה קיים עותק יחיד בTFIIH מורכבות זיהוי הנגע. גמישות גישות אינטראקציה הנגע של האנזים eukaryotic עשוי ולכן יש צורך לאפשר הכרה של הספקטרום אתר היעד הגדול ביותר של מערכת תיקון NER.

בגלל ספציפי (אתר היעד קשורה) ו מתחמים לא ספציפי ניתן להבחין בתמונות AFM מבוסס על עמדותיהם על ה- DNA, אלה סוגים שונים מורכבים ניתן לנתח בנפרד ולהשוות. מולקולה אחת AFM הוא אחד גישות מעטים המספקים גישה תכונות מבניות של קומפלקסים חלבונים כבול nonspececially ל- DNA בשל אופי חולף שלהם לעתים קרובות או משתנה. כאן, שינויים קונפורמטיביים על זיהוי האתר היעד היו דמיינו מאופיין ב- ardeal XPD מבוסס על כיפוף הציג את ה- DNA על ידי האנזים. הנתונים AFM חשף שינוי קטן אך מובהק, משמעותי זוויות ה- DNA לכופף עבור XPD כבול באתר הנגע לעומת XPD קשור ל- DNA ספציפי 5 . קונפורמציהשינויים DNA חלבונים הקשורים לאתר היעד זיהוי סביר להפעיל את הגיוס של endonucleases NER (XPG ו XPF ב NER eukaryotic) המבצעים כריתה של קטע קצר של ssDNA המכיל את הנגע. מעניין, שינוי זה ומכאן הסדר מחדש קונפורמיטיבי נדרש מחייב של ה- ATP לאנזים (אבל לא הידרוליזה). גישה דומה של ATP-rebinding על זיהוי אתר היעד ולאחר מכן גיוס של endonuclease Uvrc דווחה עבור UvrB ב 28 פרוקריוטית NR 29 .

לסיכום, הדמיה מולקולה בודדת AFM חשף הבדלים מתוחכמים בזיהוי האתר היעד על ידי prolicaryotic ו eukaryotic NER helicases. לאחר נגע היעד זוהה על ידי האנזימים, הם חולקים אסטרטגיה דומה של גיוס endonuclees NR דרך ATP מחייב המושרה קונפורמציה מחדש הסדרים סלקטיבי על הנגע. הטכניקה של AFM ב comBination עם עיצוב המצע דנה זהיר לחקות את המאפיינים החיוניים של המערכת הנחקרת יכול לספק תובנה לאינטראקציות האתר היעד של לא רק תיקון DNA אבל DNA מחייב מערכות חלבון בכלל. מידע מבני על מורכבות ספציפית ולא ספציפית עם רזולוציה בטווח ננומטר נמוך (ברמה המולקולרית, מוגבל על ידי בדיקה AFM) יכול לתרום באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני מעורב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

PUC19N, oligonucleotides המכיל CPD, ו- p44 סופקו בחביבות על ידי סמואל וילסון, Korbinian Heil ותומאס קארל, ואת Gudrun Michels ו Caroline Kisker, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 ו TE-671/4 ל- IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

גנטיקה גליון 123 מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) אינטראקציה DNA- חלבון תיקון דנ"א תיקון כריתה נוקליאוטידים (NER) זיהוי הנגע DNA שינוי DNA הכנת מדגם AFM ניתוח נפח AFM ניתוח מיקום ה- DNA מחייב.
כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter