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Genetics

न्यूक्लियोटाइड एक्साइज मरम्मत में डीएनए घाव पहचान की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) प्रोटीन-डीएनए 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। एकल अणु स्तर पर एक संकल्प के साथ विषम नमूनों को सीधे विज़ुअलाइज़ करने के लिए केवल नमूना सामग्री की कम मात्रा की आवश्यकता होती है। विविधता एक प्रोटीन के विभिन्न गठनात्मक या ओलिगोमोरिक राज्यों से उत्पन्न हो सकती है। विशेष रूप से, प्रोटीन-डीएनए नमूनों के संदर्भ में, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स डीएनए बाध्यकारी द्वारा डीएनए के भीतर एक विशिष्ट लक्ष्य साइट के लिए अलग-अलग स्टिइचीमेट्रिक्स और / या डीएनए बाध्यकारी द्वारा प्रेरित प्रदर्शनों को प्रदर्शित कर सकते हैं। विषम नमूने में भी दो (या अधिक) विभिन्न प्रकार के प्रोटीन, और विभिन्न प्रोटीन जटिल शामिल हो सकते हैंरूपों ( उदाहरण के लिए , केवल एक प्रकार की प्रोटीन बनाम हेटेरोमेरिक कॉम्प्लेक्स) डीएनए के साथ अलग तरह से बातचीत कर सकते हैं। यहां पर चर्चा किए गए अध्ययन में लंबे समय से (~ 900 बेस जोड़े, बीपी) डीएनए टुकड़े जो कि इन प्रोटीनों के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक घाव है, के लिए बाध्य डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के स्थैतिक, सूखे नमूनों पर हवा में AFM इमेजिंग का फायदा उठाते हैं। एएफएम के उच्च, आणविक संकल्प, विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिसरों के बीच अंतर और डीएनए टुकड़ों पर प्रोटीनों की बाध्यकारी स्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, घावों को डीएनए सबस्ट्रेट्स में अच्छी तरह से परिभाषित स्थानों पर पेश किया जाता है। क्योंकि डीएनए में घाव साइट की स्थिति ज्ञात है, डीएनए पर बाध्य प्रोटीन के वितरण से (अलग) प्रोटीन परिसरों के (अलग-अलग) घाव मान्यता गुणों में अंतर्दृष्टि प्रदान होती है, उदाहरण के लिए , वे एक विशेष प्रकार के घावों की पहचान कैसे करते हैं (तुलना गैर-क्षतिग्रस्त डीएनए) 2 , 3 , , 5 , 6 डीएनए पर उनकी स्थिति डीएनए पर मौजूद अन्य जगहों पर विशेष रूप से घावों और परिसरों पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के बीच अंतर की अनुमति देती है। इन भिन्न जटिल प्रकारों (विशेष रूप से घाट बनाम गैर विषैले परिसरों पर परिसर के संकुचित) के अलग-अलग लक्षण वर्णन लक्ष्य साइट पहचान पर प्रेरित परिसरों में संभावित गठनात्मक परिवर्तनों को प्रकट कर सकते हैं।

डीएनए की मरम्मत प्रोटीन यहां पर केंद्रित हैं जो कि न्यूक्लियोटाइड छपाई की मरम्मत (एनईआर) मार्ग में घाव की पहचान के लिए जिम्मेदार हैं। बैक्टीरिया में, एनईआर प्रोटीन यूवीआरए, यूवीआरबी और यूवीआरसी द्वारा प्राप्त किया जाता है। यूवाआरए यूवाए 2 / यूवीआरबी 2 डीएनए स्कैनिंग कॉम्प्लेक्स में प्रारंभिक घावों के लिए जिम्मेदार है। यूवीआरबी द्वारा घाव सत्यापन पर यह जटिल घाव स्थल पर बंधे हुए मोनोमेरिक यूवीआरबी में धर्मान्तरित होता है और इस विशिष्ट परिसर में पीआरकोरीओटीक एनईआर एंडोन्युक्लेईज यूवीआरसी यूवीआरसी एकल फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) के घावों वाले एक छोटे (12-13 एनटी) खंड को बढ़ाता है। लापता खंड फिर डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा refilled है अंत में, डीएनए लैगेज मूल डीएनए 9 , 10 के साथ नए संश्लेषित खंड को जवानों में लगाया जाता है। यूकेरियोट्स में, एनईआर कैस्केड के अधिकांश प्रोटीन बड़े, बहुप्रवर्तक प्रतिलेखन कारक II एच (टीएफआईआईएच) जटिल का हिस्सा हैं। त्रिआमी सीएन 2-एक्सपीसी-एचआर 23 बी कॉम्प्लेक्स के माध्यम से प्रारंभिक घावों के बाद, टीएफआईआईएच को डीएनए लक्ष्य साइट पर भर्ती किया जाता है। जब परिसर में एक्सपीड एक एनईआर लक्ष्य घाव की उपस्थिति का सत्यापन करता है, तो यूकेरियोटिक एनईआर एंडोन्यूक्लूसियस एक्सपीजी और एक्सपीएफ को एसएसडीएनए के एक छोटे (24-32 एनटी) खंड को उत्पादित किया जाता है जिसमें घाव 9 , 10 होता है । यहां, विशेष रूप से, प्रोकोरियोटिक और यूकेरियोटिक एनईआर से क्रमशः यूवीआरबी और एक्सपीडी का अध्ययन किया गया। इन helicases में एक unpaired क्षेत्र की आवश्यकता होती हैडीएनए (एक डीएनए बुलबुला) दो डीएनए एकल किलों में से एक पर धागा और बाद में एटीपी जलविद्युत द्वारा प्रेरित इस किनारा पर अनुवाद करें। डीएनए घावों के अतिरिक्त, एक डीएनए बुलबुला इसलिए substrates में पेश किया गया था जो प्रोटीन के लिए लोडिंग साइट के रूप में कार्य करता है।

विशिष्ट घाव डीएनए सबस्ट्रेट्स की तैयारी की प्रक्रिया को पहले 11 वर्णित किया गया है इसके लिए एक परिपत्र डीएनए (प्लास्मिड) की आवश्यकता है जिसमें एक निकेस के लिए दो करीबी स्थान प्रतिबंध साइटों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन के संदर्भ में, प्लाज्मिड पीयूसी 1 9 एन (2729 बीपी) का इस्तेमाल किया गया (एस विल्सन की प्रयोगशाला, एनआईईएचएस द्वारा बनाई गई)। इस प्लास्मिड में निकेस एनटी। बीएसटीएनबीआई के लिए करीब तीन दूरी पर प्रतिबंध लगाने वाली साइटें हैं, जो कि 48 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) खंड के फ्रेम में हैं। निकेस के साथ ऊष्मायन के बाद, इन साइटों के बीच एसएसडीएनए के खंड को हटाया जा सकता है और किसी भी लक्ष्य सुविधा वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। प्रत्येक चरण के बाद, एंजाइमैटिक पाचन पूरी तरह से agarose जेल के माध्यम से परीक्षण किया जाता हैवैद्युतकणसंचलन। मूल सुपरकोइल प्लाज्मिड की तुलना में निचले इलेक्ट्रॉफ़ोरेटिक गतिशीलता के कारण निकी परिपत्र डीएनए को अलग किया जा सकता है। विशिष्ट सब्सट्रेट oligonucleotide द्वारा हटाए गए खंड के डीएनए और प्रतिस्थापन के प्रतिस्थापन एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पाचन के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है जो सिक्सस्ट्रेट को विशेष रूप से एनिक्स के बीच के क्षेत्र में फैलता है। एंजाइम द्वारा परिपत्र प्लाज्मिड का रेखीयकरण इसलिए विशिष्ट डीएनए के लिए दबा दिया जाएगा और विशिष्ट ओलिगोनक्लियोटाइड को सम्मिलित करने के बाद बहाल किया जाएगा। अंत में, दो एंडोन्यूसाइट प्रतिबंध साइटें (आदर्श रूप से एकल कटर) एक रेखीय डीएनए सब्सट्रेट की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, लंबाई के साथ वांछित होती है और निश्चित लक्ष्य साइट पर और साथ ही डीएनए बुलबुले भी घावों से दूरी पर 5 में 'या 3' दिशा

एनईआर हेलिसेज़ द्वारा घावों की पहचान एएफएम इमेजिंग द्वारा जांच की जा सकती है। टी में हेलिसिजों का स्थाई डीएनए स्थानांतरवह घाव साइट डीएनए पर प्रोटीन की स्थिति के वितरण में शिखर के रूप में दिखाई देता है और घाव मान्यता को इंगित करता है। क्योंकि इन हेलिसेज़ों के डीएनए ट्रांसपोर्लेशन 5'-ते-3 'ध्रुवीकरण के साथ दिशात्मक है, लोडिंग साइट (डीएनए बबल अपस्ट्रीम या घावों से नीचे की ओर) की स्थिति पर घाव की मान्यता पर निर्भर करता है यह भी इंगित करता है कि क्या घाव को प्राथमिकता से मान्यता प्राप्त है अनुवादित या विपरीत, गैर अनुवादित एसएसडीएनए किनारा 5 , 9 पर निम्नलिखित खंडों में, इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके पेश किए जाएंगे और इन प्रयोगों से प्रमुख निष्कर्षों पर संक्षेप में चर्चा की जाएगी। महत्वपूर्ण रूप से, यहां दिखाए गए डीएनए की मरम्मत पर अनुकरणीय कार्य के समान, एएमएएम इमेजिंग डीएनए प्रतिकृति या ट्रांसक्रिप्शन 8 , 12 , 13 , 14 जैसे विभिन्न डीएनए बातचीत प्रणालियों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है

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Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. डीएनए सबस्ट्रेट्स 11 की तैयारी
    1. प्लाज्मिड में एक एसएसडीएनए अंतर बना रहा है
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्थितियों का उपयोग करते हुए एंजाइम गर्मी निष्क्रियता के बाद एक उपयुक्त निकेस (यहां: एनटी। बीएसटीएनबीआई) के साथ एक प्रतिक्रिया ट्यूब में प्लाज्मिड का नमूना पूरी तरह से (यहां: संशोधित पीयूसी 1 9, पीयूसी 1 9 एन) (एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें) प्रदर्शन)। पर्याप्त उपज के लिए ~ 50 μL और ~ 500 एनएम प्लाज्मिड के साथ शुरू करें
      2. पतला नमूनों (~ 20 एनएम) 15 पर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्लाज्मिड निकी सत्यापित करें डीएनए दृश्य के लिए डीएनए बाइंडिंग डाई के इस्तेमाल के लिए सुरक्षा के लिए दस्ताने पहनें।
        नोट: विभिन्न इलेक्ट्रोफोरेक्टिक मोबिलिटी में निकल (आराम से) और सुपरकोइंडेड परिपत्र प्लाज्मिड डीएनए ( चित्रा 1 ) के बीच अंतर की अनुमति है।
      3. प्लाज्मिड से चिपकने वाला एसएसडीएनए खंड (निक साइट्स के बीच) को निकालेंओलिगोन्यूक्लियोटाइड के पिघलने के तापमान (यहां: पीयूसी 1 9 एन के लिए 68 डिग्री सेल्सियस के लिए), गर्मी ब्लॉक ( चित्रा 1 ) में 30 मिलीमीटर के लिए 300 आरपीएम पर मिलाकर पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 1 तालिका 1 में ) के ~ 10 गुना अधिक के साथ ऊष्मायन )।
      4. 50 डीडीए आणविक वजन काट (एमडब्ल्यूसीओ) का उपयोग करके छोटे डीएनए टुकड़ों से छिद्रित प्लास्मिड को अलग करें, एक सेंटीफ्यूज ( चित्रा 1 ) में 10 डिग्री सेल्सियस से 10,000 एक्सजी तक सेंटीफ्यूगेशन द्वारा फिल्टर करें। फ़िल्टर से केंद्रित डीएनए निकालने के लिए, फिल्टर को पलटना और एक नई 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में डालें। 1000 मिनट में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
      5. परिणामस्वरूप केंद्रित डीएनए नमूना को विआयनीकृत, फ़िल्टर्ड पानी से 500 μL तक भरें, पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के अतिरिक्त ~ 5 गुना अतिरिक्त और 1.1.1.3 और 1.1.1.4 दोहराए चरण कम से कम 3 बार जोड़ें।
      6. एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम (यहाँ: XhoI या BglII) conditi का उपयोग कर के साथ ऊष्मायन द्वारा डीएनए के पूरा गैपिंग के लिए टेस्टनिर्माता के विवरण के अनुसार ओन्स डीएनए नमूने (~ 20 एनएम) पतला (निकी बनाम बनाम) का उपयोग करें रेखीय प्लाज्मिड (कोई एसएसडीएनए अंतर नहीं) के बीच अंतर करने के लिए एगरोस जेल वैद्युतोसोरिसिस को चलाएं और एनआईटी डीएनए को सकारात्मक नियंत्रण (संदर्भ के लिए एक डीएनए सीढ़ी, चित्रा 1 ) के रूप में उपयोग करते हुए गैर इन्सटाइज्ड डीएनए (गैप डीएनए) का उपयोग करें। दस्ताने पहनें।
    2. संशोधित एसएसडीएनए oligonucleotides के साथ अंतर को फिर से भरना
      1. 4 'एच' ( चित्रा 1 ) के लिए ~ 45 डिग्री सेल्सियस पर incubating, पसंद के विशिष्ट लक्ष्य साइट (एस) में एक 5 'फॉस्फोरिलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के ~ 25 गुना अधिक के साथ ऊष्मायन के माध्यम से ग्लेड प्लाज्मिड एनील। यहां, 48 एनटी एसएसडीएनए में एक घाव है, या तो एक फ्लोरोसिसिन एड्यूक्टेड थिइमाइन या साइक्लोबूटैन पाइरीमिडीन डिमर (सीपीडी) का प्रयोग करें, और इसके अतिरिक्त डीएनए बुलबुले ( तालिका 1 देखें) के लिए एक लघु (8 एनटी) गैर पूरक अनुक्रम का उपयोग करें।
      2. कॉवाल्वसल ऐन्वेनल डाइक्ट को प्लास्मिड इनक्यूबा द्वारा लिंक करेंनिर्माता के प्रोटोकॉल ( चित्रा 1 ) के अनुसार कमरे के तापमान पर टी -4 डीएनए ligase के साथ रातोंरात tion। इस प्रतिक्रिया के लिए, एटीपी युक्त केंद्रित बफर स्टॉक समाधान को लेगेज के लिए उपयुक्त बफर स्थितियों का निर्माण करने के लिए जोड़ें ( जैसे , यूवीआरबी प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करें: 50 मिमी त्रि-एचसीएल पीएच 7.5, 10 मिमी एमजीसी 2 , 50 एमएम केसीएल, 5 एमएम डीटीटी, 1 एमएम एटीपी)।
      3. विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के सम्मिलन के लिए एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के साथ पतला नमूनों के पाचन द्वारा गिप्प प्लाज्मिड में प्रवेश (1.1.1.6 के समान ही) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (1.1.1.6 के रूप में), चित्रा 1 )।
    3. रैखिक डीएनए सब्सट्रेट की तैयारी
      1. निर्माता द्वारा अनुशंसित शर्तों ( चित्रा 1 ) के अनुसार प्रतिबंध एंजाइमों के साथ संशोधित प्लाज्मिड डीएनए को डाइजेस्ट (आदर्श रूप से प्लाज्मिड में एक प्रतिबंध साइट के साथ)। यह कदम रेखीय टुकड़े शामिल होते हैंएक परिभाषित स्थिति में सम्मिलित संशोधन यहां, एसएसपीआई और बीएसपीक्यूआई का उपयोग क्रमशः 613 और 255 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम की जगह, क्रमशः 9 6 बीपी डीएनए टुकड़ा जिसमें डीएनए की लंबाई के ~ 30% विशिष्ट घाव साइट युक्त है।
        नोट: यहां वर्णित एएफएम इमेजिंग प्रयोगों के लिए, ~ 200 बीपी और ~ 2,000 बीपी के बीच की लंबाई के साथ डीएनए टुकड़े उपयुक्त सबस्ट्रेट्स हैं
      2. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके एग्रोस जेल वैद्युतकणसंचलन और जेल निष्कर्षण के माध्यम से लक्षित टुकड़ा को अलग करें। सुरक्षा के लिए दस्ताने पहनें
      3. वैकल्पिक रूप से, डीएनए सीढ़ी को अलग करने के लिए स्केलपेल के साथ agarose जेल काट और केंद्रित डीएनए युक्त गलियों से पतला नमूना लेन (पहले दो लेन) को शुद्ध करना। केवल यूवी तालिका पर जेल के इस हिस्से को रखकर यूवी विकिरण के लिए पहले दो गलियों के साथ जेल भाग का पर्दाफाश करें।
        1. एक स्केलपेल के साथ पसंद के टुकड़े के अनुरूप बैंड को बाहर काटें। दो जेल भागों को फिर से संगठित करें (यूवी टैब बंद करेंle)। वांछित डीएनए सब्सट्रेट के बैंड की स्थिति के लिए अभिविन्यास के रूप में पतला नमूना से एक्जीज्ड बैंड की स्थिति का उपयोग करें। पतला नियंत्रण की तुलना में थोड़ी व्यापक स्लाइस काटकर उच्च एकाग्रता के लिए खाता।
          नोट: क्योंकि यूवी-घावों की पहचान की जांच की गई थी, यूवी विकिरण के माध्यम से अतिरिक्त यूवी घावों का परिचय इस दृष्टिकोण से डीएनए सब्सट्रेट में ध्यान से बचाया गया था।
      4. यूएवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा लम्बेर्ट-बीयर के कानून का उपयोग करके डबल एसी डीएनए (डीएसडीएनए) औसत दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक के साथ ε 260 एनएम ~ 6,700 एम -1 सेमी - बीपी 1 - 1 सेमी के साथ डीएनए एकाग्रता सी का अवशोषण से गणना करें।
        समीकरण
        जहां एल पथ की लंबाई है (माप कक्ष लंबाई, आमतौर पर 1 सेमी)।
    </ Li>
  2. अभिव्यक्ति और प्रोटीन की शुद्धि
    1. ई कोलाई में पुनः संयोजक रूप से यूवीआरबी दिखाएं और मानक चिटिन मनका आत्मीयता 15 और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी 15 के द्वारा प्रोटीन शुद्ध करें जैसा कि पहले 16 वर्णित है।
      नोट: बैसिलस कैलडोटेनैक्स से यूवीआरबी जीन को pTYB1 वेक्टर में क्लोन किया गया था।
    2. ई। कोली में एक्सपीस एक्सपीडी और मानक निकेल आईडीए एनालिटी 15 और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी 15 के बाद प्रोटीन को शुद्ध करना , 15 आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी 15 के अनुसार , जैसा कि पहले 17 वर्णित है।
      नोट: चैएटोमियम थर्मोफिलम जेरोडर्मा पिग्मेंटोसम समूह डी प्रोटीन ( एक्सपीडी ) के जीन को पीबीएडीएम 11 वेक्टर में क्लोन किया गया था। सी। थर्मोफिलम पी 444 कैरोलीन किस्कर की प्रयोगशाला से एक खास तरह का उपहार था, व्यक्त और पुरीके रूप में वर्णित 17 fied

2. एएफएम प्रयोग

  1. नमूना तैयार करना
    1. वैकल्पिक रूप से, डीएनए सब्सट्रेट को 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए संभावित सूक्ष्म नमक क्रिस्टल को निकालने के लिए पूर्व-सेते हैं जो फ्रिज में भंडारण के दौरान बन सकते हैं।
    2. एक 10 गुना एकाग्रता (10x बफर) पर प्रतिक्रिया बफर () तैयार करें।
      नोट: 1x एकाग्रता में एक्सपीडी प्रतिक्रिया बफर 20 मिमी त्रि-एचसीएल पीएच 7.5, 10 मिमी केएलएल, 5 मिमी एमजीसीएल 2 , 1 एमएम टीसीईपी, 2 एमएम एटीपी; 1x यूवीआरबी प्रतिक्रिया बफर में 50 मिमी त्रि-एचसीएल पीएच 7.5, 50 मिमी केएलएल, 10 मिमी एमजीसीएल 2 , 5 एमएम डीटीटी, और 1 एमएम एटीपी शामिल है।
    3. जटिल संरचना को बढ़ाने के लिए उपयुक्त ऊष्मायन परिस्थितियों में उच्च एकाग्रता पर प्रोटीन से पहले सेते हैं। वांछित एकाग्रता के लिए 1x प्रोटीन प्रतिक्रिया बफर में अलग-अलग प्रोटीनों की एक छोटी मात्रा ( जैसे , 1 μL) पतला करें और छोटे मात्रा ( जैसे 1 μL) को मिलाएंवह एक 0.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में व्यक्तिगत प्रोटीन समाधान।
      1. कमरे के तापमान से अधिक ऊष्मायन तापमान के लिए एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब रखें। अपेक्षाकृत जटिल स्टोइकीओमेट्री के आधार पर एकाग्रता अनुपात चुनें, या तो समीवल या संबंधित सांद्रता यहां 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक 10 μM पर 1 μL XPD (1 एक्स XPD प्रतिक्रिया बफर में 20 सुक्ष्ममापी) और 1 μL p44 (1x XPD प्रतिक्रिया बफर में 20 सुक्ष्ममापी) सेते हैं।
    4. 0.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रोटीन प्रतिक्रिया बफर में उपयुक्त प्रोटीन और डीएनए सांद्रता के नमूने सेते हैं। यहां, 500 एनएम यूवीआरबी या 1 माइक्रोन एक्सपीडी + 1 माइक्रोब पी 44 और 100 एनएम डीएनए का उपयोग करें। सामग्री को बचाने के लिए छोटी मात्रा के पिपेट, जैसे , 0.25-0.5 μL प्रोटीन (10 गुना ऊष्मायन एकाग्रता के लिए पहले से पतला) और डीएनए की मात्रा 2.5-5 μL 1x प्रोटीन प्रतिक्रिया बफर की कुल मात्रा में है। यहां, गर्मी ब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। एक प्रतिक्रिया केंद्र में संक्षेप में (~ 1 एस) एक तालिका centrifug में स्पिनई छोटी मात्रा के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए
  2. नमूना बयान
    1. एक अभ्रक सब्सट्रेट तैयार करें: एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए बड़े स्ट्रिप्स से लगभग 1 x 1 सेमी 2 छिद्र का अभ्रक काटा। चिपकने वाली टेप का उपयोग करके बहु-स्तरीय अभ्रक खनिज टुकड़े के शीर्ष परतों को एक साफ, सपाट, और परमाणु रूप से चिकनी सब्सट्रेट सतह प्रकट करने के लिए बंद करें।
      नोट: अभ्रक का टुकड़ा फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. विआयनीकृत, फ़िल्टर किए गए पानी के साथ एएफएम बयान बफर तैयार करें, जैसे , 25 मिमी एचईपीईएस पीएच 7.5, 25 एमएम ना-एसीटेट, 10 मिमी एमजी-एसीटेट। 0.02 सुक्ष्ममापी सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      नोट: बयान बफर में द्विपक्षीय संबंधों ने अभ्रक सतह पर नकारात्मक आरोप लगाए डीएनए अणुओं को छेड़छाड़ की है, जो कि तटस्थ पीएच पर भी नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है। यदि बयान बफर में अपेक्षाकृत उच्च मिलीग्राम 2+ आयन एकाग्रता एक विशेष प्रोटीन डीएनए प्रणाली के लिए एक समस्या है, वैकल्पिक रूप से,अभ्रक की सतह 18 एन्केरिंग के लिए सकारात्मक सतह के प्रभार प्रदान करने के लिए सिल्टाट्रान आधारित रसायन विज्ञान का उपयोग कर एमिनो समूहों के साथ पूर्व लोड हो सकता है। नमूना बयान तब बफर में किया जा सकता है जिसमें कोई भी या कम मात्रा में द्विपक्षीय संबंध नहीं होते हैं।
    3. नमूना बफर में अभ्रक पर तुरंत बयान के लिए नमूना (2.1 देखें) पतला। एक छोटी मात्रा जमा करें (यहां: 20 μL)।
      नोट: सौम्य कारक नमूना एकाग्रता पर निर्भर करते हैं। यहां, पतला नमूने 50-100x अंगूठे के नियम के रूप में, ~ 1 एनएम डीएनए का परिणाम ~ 1000 बीपी के लिए अच्छी सतह कवरेज में होता है
    4. तुरंत फ़िल्टर करें, विआयनीकृत पानी के कुछ मिलीलीटर के साथ तीन से चार बार नमूना कुल्ला, अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें, और नाइट्रोजन के कोमल प्रवाह में सूखी झटका। नमूना जमाव से सूखे नमूनों की पूरी प्रक्रिया को 30 से कम के भीतर किया जा सकता है
    5. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर चिपकने वाला टेप का उपयोग करके उसके किनारों पर अभ्रक का टुकड़ा ठीक करें।
      नोट: विभिन्न एएफएम सिस्टम घ हैंमंच पर नमूना फिक्स करने के लिए तरजीही आवश्यकताएं। अन्य एएफएम में चुंबकीय अवस्थाएं होती हैं, और अभ्रक के टुकड़े चुंबकीय डिस्क पर तय होते हैं, जैसे , थर्मल गोंद का उपयोग करते हुए। यहां इस्तेमाल एएफएम सिस्टम का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।
  3. एएफएम इमेजिंग
    1. एएफएम चरण पर केंद्र में नमूना रखें (देखें 2.2.5) और चुंबकीय पैड के साथ मंच पर माइक्रोस्कोप स्लाइड को ठीक करें।
    2. टिप धारक में एएफएम टिप डालें हवा में आंतरायिक संपर्क मोड इमेजिंग के लिए उपयुक्त तेज (<10 एनएम) एएफएम जांच के साथ ब्रैकट का उपयोग करें। एएफएम जांच का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, जैसा कि सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है यहां (एएफएम पर निर्भर करता है), क्लैंप स्क्रू (उंगली तंग) को कस कर एक क्लैम्प के तहत धारक में टिप को ठीक करें। टिप धारक को AFM माप सिर में डालें। इस कदम के लिए अपनी पीठ पर सिर को आराम करो।
    3. नमूना के शीर्ष पर AFM माप सिर रखें। विवरण AFM मॉडल पर निर्भर करते हैं। यहां, मीएके यकीन है कि सिर स्टेज इंडेंटेशन के अंदर अपने पैरों के साथ स्थिर रूप से खड़ा है। सुनिश्चित करें कि अभ्रक उस स्तर पर स्थित है जहां एएफएम टिप सीधे इसके ऊपर होवर कर देगा। मंच के दायरे पर स्थित माइक्रोमीटर पेंच नमूना के ठीक स्थिति के लिए अनुमति देते हैं।
    4. एलएसीएएम लेजर को कैंटीलेवर के पीछे स्थिति संवेदी फोटोडेटेक्टर से इष्टतम सिग्नल की शक्ति के लिए संरेखित करें जिस पर लेजर परिलक्षित होता है। विवरण AFM मॉडल पर निर्भर करते हैं।
      1. यहां, एएफएम लेजर के एक्स- और वाई-पोजीशन को समायोजित करने के लिए ब्रैकेट के अंत में इसे केंद्रीय रूप से निर्देशित करने के लिए एएफएम मापन सिर के दाईं ओर और पीछे के पहियों को चालू करें। AFM वीडियो विंडो में प्रतिबिंब संकेत देखें (यदि उपलब्ध है, तो यहां: कैमरा आइकन दबाएं और इनपुट चुना गया है: Svideo)।
      2. दो पहियों के साथ लेजर की स्थिति को ठीक करने के द्वारा (ब्रैकट के अंत में रहें, राशि संकेत), बेकार की स्थिति में, डिटेक्टर राशि संकेत (एएफएम सॉफ़्टवेयर में योग और विक्षेपन मीटर विंडो में योग) का अनुकूलन करेंएल एएफएम और ब्रैकट प्रकार पर निर्भर करता है, यहां: राशि के लिए लक्ष्य> 5)
    5. जीएमए डिटेक्टर सरणी के शीर्ष और निचले डायोड से अंतर सिग्नल (यहां: एएमएएम लेजर रिफ्बैक्शन को डिटेक्टर सेंटर पर निर्देशित करके) और एएफएम मापन के बाईं तरफ व्हील चालू करें। सिर)।
      नोट: शून्य से विचलन तब सतह पर होने वाली बातचीत के कारण ब्रैकट के विक्षेपन को इंगित करता है, जिसे एएफएम द्वारा ऊंची जानकारी में अनुवाद किया जाता है।
    6. एएफएम सॉफ़्टवेयर में कार्यान्वित आवृत्ति ट्यून द्वारा कैंटिलीवर अनुनाद आवृत्ति निर्धारित करें (यहां: मास्टर पैनल / ट्यून विंडो में कमांड ऑटो ट्यून)। ब्रैकट दोलन को चलाए जाने वाले पीजो के लिए 1 वी इनपुट के बराबर एक आयाम चुनें। दोलन आवृत्ति को प्रतिध्वनि आवृत्ति से थोड़े (5%) कम सेट करें और दोलन के चरण को शून्य करें।
    7. क्रूड संलग्न मॉड का उपयोग करके नमूना सतह पर टिप से संपर्क करेंई (यहां: मास्टर पैनल विंडो में आदेश संलग्न) जब तक सुरक्षात्मक सेटिंग (सेट-पॉइंट) तक नहीं पहुंच जाता है। सेट-पॉइंट के रूप में फ्री स्तर दोलन आयाम के ~ 2% काटने का उपयोग करें (यहां, मास्टर पैनल में सेट प्वाइंट 980 एमवी दर्ज करें)
    8. AFM सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सेट पॉइंट को कम करके नमूना सतह के साथ एएफएम टिप को ठीक से संलग्न करें ब्रैकट दोलन चरण (योग और विक्षेपन मीटर विंडो में चरण) के साथ प्रतिकूल मोड इमेजिंग के लिए निशाना लगाओ (निस्तारण से पहले, यहां आमतौर पर ~ 70)। यहां, मुक्त स्तर के आयाम (1 वी) के 70-80% के आदेश पर सामान्य अंतिम सेट अंक का उपयोग करें।
    9. स्कैनिंग से पहले, मास्टर चैनल पैनल में रिकॉर्डिंग के लिए सिग्नल चुनें। ऊंचाई (एचटी) और आयाम (एम) चुनें
    10. नमूना स्कैनिंग शुरू करें (यहां: मास्टर डॉक्स विंडो में कमांड डू स्कैन)। 4 माइक्रोग्राम x 4 माइक्रोन या 8 माइक्रोन x 8 माइक्रोन (मास्टर फलक में स्कैन साइज़ दर्ज करें) की छवि सतह के क्षेत्रों में उदाहरण के लिए स्कैन गति का उपयोग करें, 2.5 माइक्रोग्राम / एस (मास्टर पैनल में कमांड स्कैन स्पीड)एल) क्रमशः 2,048 या 4,0 9 6 (स्कैन अंक और मास्टर पैनल में स्कैन लाइन) के पिक्सेल संकल्प के साथ।
    11. कोई उपयुक्त संशोधन नहीं के साथ छवि फ़ाइल (आदेश मास्टर चित्र में सहेजें छवि) सहेजें (मास्टर चैनल पैनल में कोई भी नहीं चुनें / प्लेन फ़िट सहेजें)।
    12. अधिक विश्लेषण के लिए, सहेजी गई छवि को संसाधित करें। छवि लोड करें (एएफएम विश्लेषण मेनू में सहेजा गया डेटा ब्राउज़ करें) संशोधित पैनल खोलें (छवि के ऊपरी भाग में एम दबाएं) ऊँचाई की छवि (एक्सटेंशन एचटीआर) में एक्स और वाई आयामों में एक प्लेसैटिफ़ लागू करें (प्लेयैफ़ेट विंडो में संशोधित पैनल में कमांड XY, प्लेनएफ़ आर्डर 3 चुनें)। फिर ऑप्शन फ्लैटन ऑर्डर 3 को चुनकर छवि को समतल करें (संशोधित पैनल में फ़्लेटन विंडो में कमांड फ़्लैटन करें)
    13. आगे की विश्लेषण के लिए छवि को TIFF फ़ाइल के रूप में निर्यात करें (छवि के ऊपरी भाग में आदेश दबाएं, 2,048 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन के लिए टिफ़ एक्सपोर्ट 2x का चयन करें)

3. एएफएम विश्लेषण

  1. प्रोटीन जटिल मात्रा
    1. के पूर्वAFM सॉफ़्टवेयर में छवियों के प्रत्यक्ष दृश्य निरीक्षण द्वारा प्रासंगिक प्रोटीन-डीएनए परिसरों का चयन करें, विभिन्न आकार परिसरों के विभिन्न रूपों को अधिकतम करने के लिए एक उपयुक्त रंग योजना का उपयोग करें (अलग-अलग रंगों और चित्रा 2 में विभिन्न परिसरों के आकार देखें; यहां: रंग स्कीम SeaLandAndFire एएफएम सॉफ्टवेयर) XPD के नमूनों के लिए, संभवतः डीपीएडी / पी 44-डीएनए के साथ - साथ एक्सपीडी -डीएनए और पी -44-डीएनए शामिल हैं, जो कि अपेक्षाकृत बड़े, अलग-अलग आणविक जनरलों के कारण XPD (~ 95 केडीए) और पी 44 (~ 40 केडीए) ।
    2. जटिल प्रकार को सत्यापित करने के लिए डीएनए पर अलग-अलग प्रोटीन चोटियों की मात्रा का आकलन करें। इसे अलग-अलग छवि सॉफ़्टवेयर के साथ हासिल किया जा सकता है (यहां: एएफएम सॉफ्टवेयर का खंड उपकरण)।
      1. अनुभाग विंडो कर्सर के साथ प्रोटीन चोटी के वर्गों की ऊँचाई (एच) और व्यास (डी) को मापें। कण खंड के आधार के करीब व्यास को मापें
      2. मटर की मात्रा (वी) निर्धारित करेंकेएस सरल गणितीय मॉडल का उपयोग करते हुए, उदाहरण के लिए , निम्न सूत्र का उपयोग कर, जो गोलाकार टोपी मॉडल पर आधारित है:
        समीकरण
    3. मापित मात्रा का अनुमानित प्रोटीन आणविक द्रव्यमान में।
      1. प्रारंभ में, एएफएम प्रणाली को आणविक भार (मेगावाट) रूपांतरण के लिए ज्ञात आणविक भार वाले कई प्रोटीनों का उपयोग करने के लिए (यहां: 25 और 851 डेटा अंक के बीच में 12 प्रयोगों का एक-एक करके 5 अलग प्रोटीन पर monomeric, dimeric , ट्रिमरिक, या टेट्रामेरिक राज्यों) 4 , 1 9 , 20 जमा और छवि प्रोटीन (जैसा कि ऊपर वर्णित है, 2.2 और 2.3 में) और ऊपर वर्णित के रूप में उनके खंडों को मापें (3.1.2)। अपने ज्ञात आणविक भार से अधिक मात्रा का प्लॉट करें। परिणामी ग्राफ़, वी और मेगावाट के बीच एक रेखीय संबंध दिखाएगा, जिसके लिए समीकरण जिसके द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैडेटा के लिए एक लाइन फिट है यहां एएफएम प्रणाली के लिए, निम्नलिखित रिश्ते को प्राप्त किया गया था 1 9 :
        समीकरण
        नोट: प्रत्येक कदम से पहले यह चरण दोहराया जाना आवश्यक नहीं है, लेकिन केवल एक बार किया जाता है। मैग्रा कैलिब्रेशन के लिए वॉल्यूम समान इमेजिंग स्थितियों के तहत प्राप्त छवियों पर लागू किया जा सकता है जो एएफएम जांच का उपयोग कर थोड़ा अलग व्यास के साथ।
      2. उनके मापा संस्करणों (3.1.2) और वी-टू-मेग कॅलिब्रेशन (3.1.3.1) के आधार पर, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की अनुमानित मेगावाट 20 निर्धारित करता है, जो इसकी आणविक सामग्री पर जानकारी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए , XPD / p44 नमूने, ~ 50 केडीए, ~ 100 केडीए, और ~ 140 केडीए, पी -44-डीएनए परिसरों (यानी केवल डीएनए अधिरचना के कारण चोटियों), एक्सपीडी केवल चोटियों, और एक्सपीडी / पी 144 चोटियों के अनुरूप क्रमशः प्राप्त किए गए थे ।
  2. डीएनए पर प्रोटीन जटिल स्थिति
    1. डीएनए निर्धारित करेंटुकड़ा लंबाई
      1. एएफएम छवियों में डीएनए के टुकड़ों को ट्रेस करें, उदाहरण के लिए , एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के मुक्त हेंड फंक्शन के साथ (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) और लाइन की लंबाई को मापें
        नोट: डीएनए समुच्चय के साथ-साथ इमेज मार्जिन के टुकड़ों को हटा दें।
      2. बिन और हिस्टोग्राम में पूरे प्रयोग से डीएनए लंबाई साजिश करें, उपयुक्त डेटा विश्लेषण और ग्राफ़िंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ( जैसे , सामग्री की तालिका देखें)।
      3. डीएनए के टुकड़ों की लंबाई निर्धारित करने के लिए डेटा विश्लेषण और ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में गाऊसी कर्व के साथ लंबाई के वितरण को फ़िट करें। डाला डीएनए लक्ष्य साइट (1.1 देखें) की स्थिति जानने के लिए, केवल गॉस वक्र के केंद्र से दो मानक विचलन के भीतर डीएनए टुकड़े शामिल हैं (y = y 0 + z एक्स्प (-2 x x सी) ) 2 / w 2 ), जहां z एक आदर्श कारक है और एक्स सी और डब्ल्यू केंद्र हैं औरगाऊसी की पूर्ण अधिकतम आधा चौड़ाई) आगे के विश्लेषण में।
        नोट: गॉस वक्र के केंद्र में डीएनए लंबाई डीएनए टुकड़ा (0.34 एनएम / बीपी का उपयोग करके गणना) की सैद्धांतिक लंबाई के करीब होना चाहिए। सैद्धांतिक मूल्य की तुलना में 10% तक की अवधि सामान्य होती है और एएफएम रिज़ॉल्यूशन सीमाओं की वजह से इसकी संभावना होती है।
    2. डीएनए substrates पर प्रोटीन चोटियों की स्थिति निर्धारित
      1. 3.2.1.1 में वर्णित अनुसार डीएनए टुकड़ा अंत के करीब से प्रोटीन चोटियों की दूरी को मापें और डीएनए लंबाई के अंश की इकाइयों में दूरी प्राप्त करने के लिए कुल डीएनए लंबाई से विभाजित करें।
      2. एक उपयुक्त डेटा विश्लेषण और ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर ( उदाहरण के लिए , चित्रा 3 ) का उपयोग करके हिस्टोग्राम में मापा दूरी को बिन और प्लॉट करें। अंगूठे का एक नियम के रूप में, एक बिन आकार चुनें जो एन डेटा पॉइंट के लिए लगभग एनबीआई देता है।
        नोट: चूंकि डीएनए को समाप्त नहीं किया जा सकता है, इसलिए इसे डीएनए लंबाई 0.5 (डीएनए फ्रैग का केंद्र)जाहिर)। क्योंकि डीएनए अंत बाध्यकारी अध्ययन का ध्यान नहीं है, बाहर की स्थिति 0 ( उदाहरण के लिए , 0.02 के एक डीएनए लंबाई अंश से binning ) के बाद स्थिति डेटा थोड़ा बिन शुरू करने से डीएनए विश्लेषण से समाप्त नहीं है।
    3. प्रोटीन जटिल स्थिति वितरण से लक्ष्य साइट विशिष्टता निर्धारित करें
      1. 3.2.1.3 में गॉस वक्र के साथ स्थिति वितरण में अधिकतम (बढ़ाया बाध्यकारी घटनाएं) फ़िट करें, लेकिन पृष्ठभूमि बाइंडिंग की ऊंचाई पर पैर ( चित्रा 3 देखें)।
      2. निम्नलिखित फार्मूले के साथ विशिष्ट साइट के लिए विशिष्टता एस की गणना गैर-विशिष्ट डीएनए पृष्ठभूमि (गैर-विशिष्ट डीएनए साइटों से जुड़ी प्रोटीन अणुओं) बनाम 21
        समीकरण
        एक एसपी : विशिष्ट परिसरों की संख्या (गाऊसीय कर्व के नीचे क्षेत्र)
        एक एनएसपी: गैर-विशिष्ट परिसरों की संख्या (पृष्ठभूमि का क्षेत्रफल, 0 ); 0.02 डीएनए लंबाई से शुरू होने वाले हिस्टोग्राम के लिए यहां पर डीएनए की लंबाई का अंश 0.48 है)
        एन: संभव डीएनए बाध्यकारी साइटों की संख्या (यहां: एन = 914 डीएनए समाप्ति को छोड़कर)
  3. डीएनए मोड़ कोण
    1. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कोण टूल का उपयोग करना, डीएनए रीढ़ की हड्डी के साथ केंद्रीय रूप से लगाए जाने वाले दो लाइनों के बीच के कोण β को मापें और प्रोटीन शिखर पर केंद्रित हो (देखें, चित्रा 4 में दिमागी) प्रोटीन-डीएनए परिसरों की एक सांख्यिकीय रूप से प्रासंगिक संख्या (> 50, आदर्श> 100) के लिए कोणों को मापें 2 , 3 , 5
      नोट: डीएनए बेंड कोण को 180 डिग्री-बीओ 2 , 3 , 5 के रूप में परिभाषित किया गया है।
    2. डेटा विश्लेषण और ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना(सामग्री की तालिका देखें) डीएनए मोड़ कोणों को लगाकर एक मोड़ कोण वितरण हिस्टोग्राम का उत्पादन करता है।
    3. गॉस वक्र के साथ मोड़ कोण के वितरण को फ़िट करें। यदि वितरण में एक से अधिक अधिकतम स्पष्ट है, तो कई चोटी गॉस फिट चुनें। गाऊसीय कर्व (ओं) का केंद्र (एस) विशेष प्रजातियों की औसत मोड़ कोण स्थिति देता है।
    4. यदि मोड़ कोण (ओं) में सबसे बड़ा बदलाव, वितरकों के लिए स्पष्ट है, उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रोटीन वेरिएंट या विभिन्न प्रोटीन जटिल प्रजातियों का एक छात्र टी-टेस्ट लागू करने के महत्व स्तर का मूल्यांकन करने के लिए परिवर्तन।

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Representative Results

प्रोटीन कॉम्प्लेक्स वॉल्यूम पर आधारित विभिन्न जटिल प्रकार के बीच अंतर

प्रोकैरिकोटिक एनईआर हेलीकस यूवीआरबी की हेलिसेज गतिविधि डीएनए बाइंडिंग 22 , 23 द्वारा प्रेरित है। यूवीआरबी को दो एकल एसएसडीएनए किस्में में से किसी एक पर सही ढंग से लोड करने के लिए डीएनए (एक डीएनए बबल) में एक अनपेक्षित क्षेत्र की आवश्यकता होती है। विवो में , यह डीएनए संरचना डीएनए बातचीत द्वारा एनईआर कैस्केड की एक और प्रोटीन द्वारा प्रदान की जाती है; इन इन विट्रो प्रयोगों में, बुलबुले को कृत्रिम रूप से डीएसडीएनए के टुकड़ों में पेश किया जा सकता है ताकि लक्ष्य घाव के करीब हो। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन भी यूवीआरबी 9 द्वारा डीएनए बाइंडिंग बढ़ाता है। हालांकि, यूवीआरबी एक बार डीएनए पर लोड हो जाता है, इसकी गतिविधि प्रोटीन सह-कारकों 9 पर निर्भर नहीं होती है। इसके विपरीत, यूकेरियोटिक एनईआर हेलिसेज एक्सपीडडी इंटरैक्टि की आवश्यकता हैप्रोटीन पी 44 के साथ, जिसकी तरह XPD मल्टी-सबिनिट ट्रांस्क्रिप्शन फॉक्टर आईआईएच (टीएफआईआईएच) का हिस्सा है, जो कि इसके हेलिसेज गतिविधि के सक्रियण के लिए है, लेकिन यह इंटरैक्शन डीपीए के लिए डीपीए बाइंडिंग को प्रभावित नहीं करता है। अकेले एक्सपीडी से डीएनए बबल पर डीएनए पर लोड होने की उम्मीद है, लेकिन घावों के लिए इसका अनुवाद नहीं किया जाता है (इसकी हेलिकेज़ को सह-कारक को सक्रिय करने के लिए)। बिना पी -44 के एक्सपीड इसलिए घावों की जगह से दूरी पर लोड होने पर घावों के साथ बातचीत करने और पहचानने में सक्षम नहीं होना चाहिए। XPD- या XPD / p44-डीएनए परिसरों के मिश्रण में डीएनए सब्सट्रेट परिणाम युक्त घाव की उपस्थिति में पीबीटी के साथ पीपीटी का इन्क्यूबेशन्स (और संभवत: अकेले डीएनए के लिए पी -44 की छोटी प्रजातियां) XPD / p44 और XPD द्वारा घाव की मान्यता को अलग से विश्लेषण करने के लिए, इन भिन्न जटिल प्रकारों को AFM छवियों ( चित्रा 2 ) 9 में उनके संस्करणों के आधार पर अलग किया जा सकता है, जैसा ऊपर प्रोटोकॉल 3.1 में वर्णित है। एपीएम सिस्टम को पी की एक श्रेणी का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जा सकता हैज्ञात आणविक भार वाले पेटी, एपीएम मात्रा और एक प्रोटीन (जटिल) 20 के अनुमानित आणविक द्रव्यमान के बीच एक रैखिक संबंध प्रकट करने के लिए, मापा मात्राओं की व्याख्या करने की अनुमति देता है डीएनए पर बाध्यकारी स्थिति अलग-अलग हेलिसिज़ निष्क्रिय मोनोमेरिक एक्सपी (~ 95 केडीए, 2 चित्रा में 100 एनएम 3 वर्ग 2 प्रजातियों के अनुरूप) के लिए और हेलिकेज़ सक्रिय एक्सपी / पी 44 कॉम्प्लेक्स (~ 135 केडीए, ~ 150 एनएम 3 वर्ग 3 प्रजातियों), उनके अलग एएफएम संस्करणों के आधार पर।

डीएनए पर प्रोटीन बाध्यकारी स्थितियों से घाव मान्यता निर्धारण

यहां, लंबे समय तक (9 6 बीपी) डीएनए सब्सट्रेट्स जिसमें डीएनए की लंबाई का ~ 30% घाव होता था। डीएनए सब्सट्रेट के भीतर घावों की सही स्थिति पर नियंत्रण विशिष्ट (घाव-बाउंड, डीएनए लंबाई के ~ 30%) और नापसंद के बीच अंतर की अनुमति देता हैसीजीआर (घाव खोज) डीएनए पर अपनी स्थिति पर निर्भर परिसरों। दो अलग-अलग घावों को चुना गया, जो एनईआर के लक्ष्य हैं; डीएनए सबस्ट्रेट्स में एक फ्लोरोसिसिन (एफ) नलिका या एक साइक्लोब्यूटैन पाइरीमिडीन डिमर (सीपीडी) शामिल था। घाव स्थल के अलावा, डीएनए में एक अनपेक्षित क्षेत्र (8 एनटी डीएनए बुलबुला) शामिल था जो हेलिसेस के लिए लोडिंग साइट के रूप में कार्य करता था। यह लोडिंग साइट 26 एनटी (डी के डीएनए सबस्ट्रेट्स युक्त) या 23 एनटी (सीपीडी युक्त सबस्ट्रेट्स के लिए) की दूरी पर या तो 5 'या 3' घावों से ( तालिका 1 देखें) की दूरी पर स्थित थी। घाव की मान्यता ने घाव की स्थिति पर शिखर के रूप में डीएनए पर एएफएम प्रोटीन की स्थिति के वितरण में जाहिरा तौर पर लक्ष्य साइट पर यूआरआरबी और एक्सपीडी के हेलिसिजों के डीएनए स्थानांतर को रोक दिया। इन सबस्ट्रेट्स में घाव और बुलबुले स्थितियों को एएफएम इमेजिंग (<10 एनएम दूरी) की संकल्प सीमा के भीतर अलग नहीं किया जा सकता है। हालांकि, विशिष्ट परिसरों के अंश जो कि एक का प्रतिनिधित्व करता हैघाव पर रुक अणुओं का माउंट और घाव की पहचान को इंगित करता है, यह दृढ़ता से निर्भर करता है कि क्या घाव को बुलबुले ( चित्रा 3 ) 9 से 3 'या 5' रखा गया था।

विशिष्ट स्थल (गॉस्यस फिट शिखर बनाम क्षेत्र के तहत विशिष्ट क्षेत्र में परिसर के अंश से), दो जांच घावों के प्रकार के लिए विशिष्टता, एस, यूवीआरबी और एक्सपीडी की विशिष्टता (गणना प्रोटोकॉल 3.2) की गई थी। यूवीआरबी के लिए, घावों की स्थिति से 5 'लोड हो रहा है, जिसके परिणामस्वरूप घाव (एस बी, एफ 3 और एस बी, सीपीडी 3 ~ 100) से 3' लोड करने की तुलना में उच्च विशिष्टता (एस बी, एफ 5 ~ 200 और एस बी, सीपीडी 5 ~ 400) में हुई है। दोनों घाव प्रकार XPD के लिए, केवल XPD (2 चित्रा में 2 वर्ग) वाले परिसरों और एक्सपीडी वाले कॉम्प्लेक्स के साथ-साथ हेलिसेज सक्रिय सह-कारक प्रोटीन पी 44 ( चित्रा 2 में कक्षा 3) को श्रेणीबद्ध किया गया थापिछले खंड में आईबीड क्लास 2 प्रोटीन चोटियों (केवल एक्सपीडीडी, हेलिसेज निष्क्रिय) वे घायल साइटों पर अलग-अलग स्थानीयकृत नहीं करते थे, चाहे वे 5 'या 3' लोड किए गए हों और घावों के प्रकार से अलग (डेटा न दिखाया गया)। इसके विपरीत, XPD / p44 (कक्षा 3) परिसरों के लिए स्थिति के वितरण ने घावों से 5 'लोड करने के लिए एफ घावों में बढ़ाया बाध्यकारी दिखाया ( एसपीपी / पी 44, एफ 5 ~ 300 बनाम एस एक्सपीडी / पी 44, एफ 3 ~ 100) लेकिन सीपीडी पर घावों से 3 'लोड करने के लिए घाव (एस एक्सपीडी / पी 44, सीपीडी 3 ~ 600 बनाम एस एक्सपीडी / पी 44, सीपीडी 5 ~ 100, चित्रा 3 )। क्योंकि यूवीआरबी और एक्सपीडी 5'-टू-3 'हेलीकॉसिज़ हैं, ये आंकड़े एसएसडीएनए किनारा में घावों के साथ परस्पर संपर्क के माध्यम से स्थगित हैं कि क्या वे (अनुवादित भूग्रस्त, घावों से 5' लोड करने के लिए) को स्थानांतरित करते हैं, के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। या विपरीत, गैर-अनुवादित किनारा (घावों से 3 'लोड करने के लिए) के भीतर। अवधारणा को schematically में दिखाया गया है

XPD द्वारा घाव पहचान पर गठनात्मक परिवर्तन की जांच करना

एएफएम छवियों से बाध्य परिसरों की साइट पर डीएनए में पेश किया झुकने को मापना (ऊपर प्रोटोकॉल 3.3 देखें) जटिल गठनात्मक परिवर्तनों पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं डीएनए बेंड कोणों को पुरातांत्रिक XPD 5 के लिए मापा गया था, जो कि हेलिकेज़ गतिविधि के लिए प्रोटीन सह-कारक की आवश्यकता नहीं है। इन अध्ययनों में, एक फ्लोरोसिसिन घाव निदेशक मंडल में स्थित थाडीएनए टुकड़ा की लंबाई के ~ 30% पर, घावों पर बढ़ी हुई प्रोटीन लोडिंग के लिए डीएनए बबल के संदर्भ में टिली। चित्रा 4 से पता चलता है कि गौसीन डीएनए बेंड कोण डिब्बों के लिए फिट है, जो गैर-विशिष्ट (गैर-क्षतिग्रस्त) डीएनए पदों पर प्रोटीन परिसरों के लिए प्राप्त होता है और डीएनए की ~ 30%, फ्लूसेसेन घाव (विशिष्ट परिसरों) की स्थिति में एक्सपीडी के अनुरूप होता है। डेटा विशिष्ट परिसरों के लिए ~ 65 डिग्री बनाम गैर-विशिष्ट परिसरों के लिए ~ 50 डिग्री का मतलब बेंड कोण दर्शाता है। यह डीएनए बेंड कोण पारी एटीपी या एटीपीबी की उपस्थिति पर निर्भर था, जो एटीपी (पुनः) बाध्यकारी था, लेकिन गठनात्मक पुनर्व्यवस्था 5 के लिए हाइड्रोलिसिस आवश्यक नहीं था।

आकृति 1
चित्रा 1: डीएनए सबस्ट्रेट्स की तैयारी एक एसएसडीएनए अंतर को प्लास्मिड (यहां निकसे एन.बीएसटीएनबीआई के साथ) को क्लोरो पर चक्राकार करके परिपत्र प्लाज्मिड डीएनए में पेश किया जाता हैसूक्ष्म अंतर स्थान और पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के अतिरिक्त की उपस्थिति में गर्मी अस्थिरता के बाद सेंटीप्रूग निस्पंदन के माध्यम से संलग्न एसएसडीएनए खंड को निकालना। पसंद की सुविधा वाले एक विशिष्ट ओलिगोनक्लियोटाइड को तब अंतराल और अंतर क्षेत्र में लगीकृत किया जा सकता है। अंत में, प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन (यहां एसएसपीआई और बीएसपीक्यूआई के साथ) एक रेखीय डीएनए सब्सट्रेट के साथ एक ज्ञात स्थिति (यहां पर डीएनए टुकड़ा लंबाई का 30%) पर लक्ष्य सुविधा के साथ होता है। एंजारास जेल वैद्युतकणसंचलन (काला तीर 3000 बीपी इंगित करता है) के माध्यम से व्यक्तिगत नियंत्रण (नीचे दिखाए गए) के परीक्षण के लिए अनुमति देता है सिकुड़ा हुआ प्लाज्मिड (लेन 1) बनाम निकल, आराम से परिपत्र डीएनए (नियंत्रण नाक, लेन 2) की बदली हुई इलेक्ट्रोफोरेक्टिक गतिशीलता द्वारा चिपकने का परीक्षण किया जा सकता है। विशिष्ट ओलगो के डीएनए के साथ-साथ सम्मिलित सम्मिलन को पूरा करने के लिए पाचन द्वारा एक पाचन एंजाइम के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है जो अंतर क्षेत्र में कटौती करता है (यहां: XhoI, मेंलेन 2, 4, और 6) ताकि डीएनए चीरा की कमी इंगित करता है कि अंतर का गठन (लेन 1, 2 डीएनए, 3,4 गैलेक्ट डीएनए) और पुनः थका हुआ चीरा विशिष्ट ओलिगो (लेन 5,6) । अंतिम रेखीय सब्सट्रेट जिसमें विशिष्ट फीचर शामिल है, जार से agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद शुद्ध किया जा सकता है और एफ़एम इमेजिंग के माध्यम से समरूपता और शुद्धता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: अपने एएफएम संस्करणों से भिन्न जटिल प्रकारों को भेदना। ( ए ) XPD / p44-डीएनए (ग्रे तीर) और एक्सपीडी-डीएनए (काला तीर) परिसरों की एएफएम छवि। ( बी ) तीन विभिन्न प्रकार के डीएनए बाध्य परिसरों के उदाहरण, p44 या केवल डीएनए अधिरचना (कक्षा 1) के रूप में व्याख्या की गई है,XPD (क्लास 2, ब्लैक फ़्रेम), और एक्सपीडी / पी 44 (क्लास 3, ग्रे फ़्रेम) उनके एएफएम संस्करणों के आधार पर परिसरों (दाईं ओर दिखाए गए)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रोकोरियोटिक और यूकेरियोटिक एनईआर हेलीकैसेस के विभिन्न घावों की पहचान रणनीतियों। एनआईआर हेलीकॉसेज यूवीआरबी और एक्सपीडी (इसकी जटिलता में सह-कारक p44 को सक्रिय करने के साथ परिसर में) एक डीपीए डीएनए क्षेत्र (डीएनए बबल) पर प्रोटीन लोड करने की आवश्यकता होती है। प्रोटीन तब एसएसडीएनए किनारा पर 5'-ते -3 'दिशा में आगे बढ़ते हैं, जिस पर वे लोड होते हैं। एक डीएनए घाव (यहां: सीपीडी) को हेलिसीज़ द्वारा अनुवादित भूग्रस्त (5 'बुलबुले पर लोड करने के लिए) या विपरीत, गैर-ट्रांसलोकेटेड किनारा पर3 'बुलबुले पर लोड हो रहा है) परिणाम में रुके हुए डीएनए स्थानान्तरण स्थिति वितरण में यह एक शिखर (गाऊसी फिट लाइनों) के रूप में दिखाया गया है, जो घावों की स्थिति में बढ़ाया बाध्यकारी (इंगित करता है कि डीएनए के लिए 30% डीएनए लंबाई पर दिखाया गया है)। प्रोकैरिकोटिक एनईआर हेलिसेज यूवीआरबी और इसके यूकेरियोटिक समकक्ष एक्सपीडी सीपीडी घाव की मान्यता के विभिन्न रणनीतियों से अलग डीएनए स्ट्रैंड प्राथमिकताएं दर्शाती हैं। विशेष रूप से, सीपीडी घावों को यूवीआरबी द्वारा ट्रांसलोकेटेड स्ट्रैंड पर मान्यता प्राप्त है, लेकिन एक्सपीडी द्वारा विपरीत, गैर-ट्रांसपोर्टेड स्ट्रैंड पर अधिमान्य रूप से। 9 संदर्भ से चित्रा चित्रा इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एक्सपीडी-डीएनए परिसरों में घाव पहचान पर गठनात्मक परिवर्तन। एक्सपीडी द्वारा प्रेरित डीएनए बेंड कोणों का वितरण फ्लोरसेसेन घाव पर प्रोटीन-डीएनए परिसरों में गठनात्मक परिवर्तन दर्शाता है। ये गठनात्मक पुनर्गठन एटीपी (बी) या एटीपीडीएस (सी) की उपस्थिति पर निर्भर थे। ( ए ) एटीपी की अनुपस्थिति में, भूरे रंग के कोण (ग्रे) और घावों वाले स्थल (विशिष्ट मोड़ के कोण, काले) के कोणों के समान हैं और गाऊसीय वक्र द्वारा ~ 50 डिग्री पर केंद्र के साथ फिट होते हैं। ( बी , सी ) एटीपी या एटीपीडीएस की उपस्थिति में, विशिष्ट मोड़ कोण वितरण (काला) एक महत्वपूर्ण बदलाव (पी = 2.5 x 10 -7 ) को ~ 65 डिग्री के औसत बेंड कोण से दर्शाता है घाव स्थल पर झुकने वाला यह डीएनए घाव के प्रकार (सीपीडी या फ्लुरेससेन अपक्ट) या डीएनए बुलबुले 5 की उपस्थिति या अनुपस्थिति से स्वतंत्र था। चित्रा 5 संदर्भ से पुन: उत्पन्न किया गया था (सी) में इनसेट दर्शाता है कि कैसे मोड़ कोण (180 ° -β) निर्धारित किया गया।Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संख्या अनुक्रम विवरण
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		तल
2 / फॉसफोरस / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		एफ / 5 'बुलबुला
3 / फॉसफोरस / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		एफ / 3 'बुलबुला
4 / फॉसफोरस / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		सीपीडी / 5'bubble
5 / फॉसफोरस / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		सीपीडी / 3'bubble
6 / फास / जीसीए टीजीसीसीटीसीजीएगटीक्टएगाएटीसीएफ
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		एफ / बबल

तालिका 1: डीएनए ऑलिगोनक्लियोटाइड्स डीएनए सब्सट्रेट की तैयारी के लिए। सभी ऑलिगोनक्लियोटाइड्स 48 एनटी लंबे और शीर्ष किस्में (ओलिगोनक्लियोटियोटिड 2-6) को गैप डीएनए (प्रोटोकॉल 1.1 देखें) में बाध्यकारी के लिए अपने 5 'अंत में फास्फोरियम प्राप्त किया गया था। एफ = फ्लुरेससेन एड्यूक्टेड थिइमाइन, टीटी = साइक्लोब्यूटैन पाइरीमिडीन (थाइमाइन) डिमर (सीपीडी), गैर-पूरक क्षेत्र (डीएनए बुलबुला बनने वाले क्षेत्र) रेखांकित होते हैं। एफ युक्त oligonucleotides इंटीग्रेटेड डीएनए टेक्नोलॉजीज (आईडीटी) से प्राप्त हुए थे, सीपीडी युक्त ओलिगोनक्लियोटाइड्स को थॉमस कैरेल की प्रयोगशाला (लुडविग-मैक्सिमिलियन यूनिवर्सिटी म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा कृपया प्रदान किया गया था।

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Discussion

एएमएएम के सांख्यिकीय विश्लेषण में लंबे समय से डीएनए के टुकड़े पर प्रोटीन के विशिष्ट स्थानों का पता लगाया जा सकता है, जो इन साइटों 2 , 3 , 4 , 5 , 6 को पहचानने के लिए प्रोटीन द्वारा नियोजित विशेष रणनीतियों पर दिलचस्प विवरण दिखा सकते हैं। परिणामस्वरूप वितरण के वितरण की व्याख्या करने के लिए, डीएनए में लक्ष्य के पदों को ठीक से जाना जाने चाहिए। यह विशिष्ट साइटों को परिरक्षित प्लाज्मिड डीएनए में अच्छी तरह से परिभाषित अनुक्रम पदों पर शुरू करने और प्रतिबंध एंजाइम प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए, इस विशिष्ट साइट सहित डीएनए के एक टुकड़े को बाहर निकालने से प्राप्त किया जाता है। एएफएम छवि प्रोटीन बाध्यकारी स्थितियों का विश्लेषण करती है, सही लंबाई (टुकड़े बाहर कटौती की पूरी लंबाई के अनुरूप) के साथ केवल डीएनए टुकड़े शामिल किया जा सकता है क्योंकि केवल इनके लिए, लक्ष्य स्थल की स्थिति ज्ञात है यह मूल्य नहीं हैTing कि तैयारी की प्रक्रिया यहाँ वर्णित दो अविवेचनीय टुकड़ा समाप्त होता है के साथ रैखिक डीएनए substrates में परिणाम है। इसलिए स्थिति के वितरण केवल मापा जा सकता है और 0 x डीएनए लंबाई (डीएनए टुकड़ा समाप्त होने वाले प्रोटीन) से 0.5 एक्स डीएनए लंबाई (टुकड़े के केंद्र में बाध्य प्रोटीन) के लिए प्लॉट किया जाता है। इसके अलावा, लक्ष्य स्थितियों के लिए जो सब्सट्रेट के केंद्र में बिल्कुल स्थित नहीं हैं, ये डिस्ट्रीब्यूशन हमेशा एक छोटे से प्रोटीन की पृष्ठभूमि में होते हैं जो अन्य डीएनए अंत से उसी दूरी पर nonspecifically बंधे होते हैं। हालांकि, गौसी की वक्र को पृष्ठभूमि के औसत औसत ऊंचाई (nonspecifically बाध्य प्रोटीन, चित्रा 3 ) के आधार पर फैले इन परिसरों के लिए खातों वैकल्पिक रूप से, एक डीएनए की समाप्ति को लेबल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माध्यमिक संरचना से एसएसडीएनए ओवरहेन्ग बनाने वाली छोटी मात्रा की चोटियों के साथ 24 इन स्थितियों के विश्लेषण की विशिष्ट संकल्प सीमा लक्ष्य की 100 गुना वरीयता में होती हैउत्तरदायी साइट पर बाध्यकारी इसके अलावा, डीएनए का टुकड़ा समाप्त होता है, डीएनडीएनए साइट्स को गैर-विशिष्ट डीएसडीएनए नहीं बनाते हैं, बल्कि इसके बजाय डीएसडीएनए ब्रेक का प्रतिनिधित्व करते हैं। डीएनए की मरम्मत प्रोटीन अक्सर इन अस्थिर टुकड़ों को बांधने के लिए बाध्य होती है, जो कि किनारा-आंतरिक रूप से शुरू किए गए विशिष्ट लक्ष्य साइटों के अतिरिक्त होता है। डीएनए अंत बंधन एएफएम विश्लेषण से पता चला जा सकता है और एक प्रोटीन के समारोह में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यदि डीएनए अंत बाध्यकारी ब्याज का फ़ोकस नहीं है, तो इन पदों पर, स्थान को आसानी से पॉट्स को स्थिति> 0 ( उदाहरण के लिए , यहां 0.02 डीएनए लंबाई) पर शुरू करके छोड़ा जा सकता है।

विशेष लाभों में से एक और, वास्तव में, एकल अणु तकनीक की परिभाषित, आम संपत्ति एक नमूने में मौजूद व्यक्तिगत, अलग-अलग राज्यों का संकल्प है, जो कि बहुत भिन्न गुणों और गतिविधियों को हासिल कर सकती है। यहां तक ​​कि ऐसे मामलों में जहां ब्याज की विशेष प्रजाति केवल एक नमूने में विलक्षण हो सकती है, इस प्रकार इन दृष्टिकोणों की अनुमति हैइस प्रजाति पर अलग-अलग फोकस जिसका योगदान एक पहनावा माप में बौने होगा। प्रोटीन नमूनों के लिए, एएफएम इमेजिंग, जटिल प्रोटीन के आकार में अलग-अलग प्रकार के प्रोटीन परिसरों के बीच प्रत्यक्ष भेद की अनुमति देता है, अगर व्यक्तिगत प्रोटीन के आकार में पर्याप्त अंतर होता है (सामान्य संकल्प सीमाएं लगभग 20 केडीए हैं) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 एपीएम सिस्टम को मापा मात्राओं का प्रोटीन आणविक भार (प्रोटोकॉल 3.1.3.1) 4 , 8 , 1 9 , 20 में अनुवाद करने के लिए कैलिब्रेट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ज्ञात आकारों वाले प्रोटीन मानकों को 1 , 6 के चित्रों में सीधा संदर्भ के रूप में उपयोग किया गया है। मेंयहां पर केंद्रित प्रणाली, डीएनए पर बाध्यकारी पदों को अलग-अलग हेलिसेज निष्क्रिय मोनोमेरिक एक्सपी के लिए निर्धारित किया जा सकता है और हेलिसेज़ सक्रिय हेरोडाइमरिक एक्सपी / पी 44 कॉम्प्लेक्स के लिए। डीएनए में एक अच्छी तरह से परिभाषित स्थिति में एक घाव स्थल के लिए बाध्यकारी प्राथमिक रूप से एक प्रोटीन जटिल द्वारा डीएनए घाव मान्यता को दर्शाता है। चूंकि प्रोटीन लोडिंग और घाव साइटों को अलग-अलग अलग किया गया था, इसलिए डीएनए ट्रांसपोलेशन एक डीएनए सबस्ट्रेट्स में घावों की पहचान के लिए एक आवश्यक पूर्व-आवश्यकता था जो यहां इस्तेमाल किया गया था। केवल हेइटरोडिमेरिक एक्सपी / पी 444 परिसरों में डीएनए ट्रांसओलोकेशन ( चित्रा 3 ) में सक्षम थे, जो हेलिसेज एक्टिविटी एसेल्स 9 के परिणाम के अनुरूप थे। एएफएम मात्रा विश्लेषण इसलिए विभिन्न प्रोटीन जटिल रूपों की अंतर गतिविधियों पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

हेलिसेज सक्रिय XPD / P44 परिसर के द्वारा व्यास के संपर्क और मान्यता के परिणामस्वरूप हेलिसिज़ स्थानान्तरण की रोकथाम के कारण लक्ष्य स्थल पर बाध्य किया गया ( चित्रा 3 चित्रा 3 में योजनाबद्ध देखें) की वजह से, यह खोज इंगित करता है कि एंजाइम ट्रांसओकेटेड भूग्रस्त पर फ्लोरोससेन को अधिमान्य रूप से पता लगाता है, लेकिन सीपीडी को विपरीत, गैर-ट्रांसपोर्टेड किनारा पर प्राथमिकता से पता चलता है। इसके विपरीत, प्रोकैरिकोटिक एनईआर हेलिसेज यूवीआरबी ने घावों से 5 'लोड करने पर ट्रांसरोक्टेड स्ट्रैंड ( चित्रा 3 ) पर फ्लोरोसिसिन और सीपीडी घावों को मान्यता दी है। उनके घाव मान्यता गुणों में ये विशिष्ट मतभेदों को दो helicases के विभिन्न संरचनात्मक गुणों से समझा जा सकता है। यूवीआरबी संभावित लक्ष्यों के साथ बातचीत करता है iएंजाइम में β-hairpin की सुविधा के अंदर एमिनो एसिड अवशेषों के माध्यम से डीएनए, जिसके पीछे translocated किनारा 16 , 25 को पिरोया गया है। दूसरी ओर, एक्सपीडी, एक लोहा-सल्फर (एफईएस) क्लस्टर 26 के करीब निकटता में एक छोटा छेद लगाता है। अनुवादित डीएनए स्ट्रैंड की संभावना धागे इस छेद के माध्यम से 26 फ्लुरेससेन जैसे थोक घावों में इस छिद्र के भीतर अवशेषों के साथ बातचीत के जरिए हेलिसीज़ ट्रांसोलोकॉल किया जा सकता है, जबकि कम भारी सीपीडी घावों को एफईएस क्लस्टर के साथ बातचीत के जरिए और आसानी से पहचाना जा सकता है। प्रॉक्रोयोरिक सिस्टम में, यूवीआरबी के दो अणुओं को हेटेरो-टेट्रामरिक यूवीआरए 2 -यूयूआरबी 2 कॉम्प्लेक्स में लक्षित साइट खोज में शामिल माना जाता है, जिसमें दो यूवीआरबी मोनोमर्स में से प्रत्येक एक अलग डीएनए स्ट्रैंड 27 की जांच कर सकता है । यूकेरियोटिक एनईआर में एक्सपीडी शायद एक प्रति के रूप में मौजूद हैटीएफआईआईएच घाव मान्यता जटिल इसलिए यूकेरियोटिक एंजाइम के घावों के संपर्क में लचीलापन के कारण एनईआर मरम्मत प्रणाली के बेहद बड़े लक्ष्य साइट स्पेक्ट्रम की पहचान को सक्षम करना आवश्यक हो सकता है।

क्योंकि विशिष्ट (लक्ष्य साइट बाध्य) और गैर-विशिष्ट परिसरों डीएमए पर अपनी स्थिति के आधार पर एएफएम चित्रों में अलग-अलग किया जा सकता है, इन अलग-अलग जटिल प्रकारों का विश्लेषण अलग-अलग किया जा सकता है और उनकी तुलना में किया जा सकता है। एकल अणु एएफएम बहुत ही कुछ दृष्टिकोणों में से एक है जो प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक गुणों तक पहुँच प्रदान करता है जो कि उनके अक्सर क्षणिक या चर प्रकृति के कारण डीएनए के लिए अनिवार्य रूप से बाध्य होते हैं। यहां, लक्ष्य साइट की पहचान पर गठनात्मक बदलाव एंजाइम द्वारा डीएनए में पेश किए गए झुकने के आधार पर आर्चियाल एक्सपीडी में चित्रित किया गया था। एएफएम डेटा ने एक्सपीडी के लिए डीएनए बेंड एंगल्स में एक छोटी लेकिन अलग, महत्वपूर्ण बदलाव का खुलासा किया, जो घाव स्थल बनाम एक्सपीडी पर अनिर्धारणीय डीएनए 5 तक ही सीमित था। गठनात्मकलक्षित साइट पहचान पर डीएनए बाध्य प्रोटीनों में परिवर्तन ने एनईआर एंडोन्यूक्लेज़स (एक्सपीजी और एक्सपीएफ इन यूकेरियोटिक एनईआर) की भर्ती को ट्रिगर किया है जो कि एसएसडीएनए के एक छोटे से छिद्र को घावों से युक्त करता है। दिलचस्प बात यह है कि इस बदलाव और इसलिए गठनात्मक पुनः व्यवस्था एन्जॉय (लेकिन जल निकासी नहीं) को एटीपी की बाध्यकारी आवश्यकता थी। एटीपी के एक समान दृष्टिकोण का लक्ष्य साइट पहचान पर और बाद में यूवीआरसी एंडोन्यूच्योर की भर्ती के बारे में बताया गया है जो यूवीआरबी के लिए प्रॉक्रोरीोटिक एनईआर 28 , 2 9 में रिपोर्ट किया गया है।

संक्षेप में, एएफएम एकल अणु इमेजिंग ने प्रोकोरियोटिक और यूकेरियोटिक एनईआर हेलीकेशंस द्वारा लक्षित साइट पहचान में सूक्ष्म अंतर प्रकट किया है। एंजाइम द्वारा एक लक्षित घाव की पहचान करने के बाद, वे एनएआर एंडोन्यूक्ल्यूज की भर्ती के लिए एटीपी-बाध्यकारी प्रेरणायुक्त पुनर्जन्म के माध्यम से चुनिंदा घावों पर एक समान रणनीति साझा करते हैं। कॉम में एएफएम की तकनीकजांच प्रणाली के आवश्यक गुणों की नकल करने के लिए सावधान डीएनए सब्सट्रेट डिज़ाइन के साथ बीनिंग इसलिए डीएनए की न केवल न केवल डीएनए की मरम्मत के लिए लक्ष्य स्थल के इंटरैक्शन में जानकारी प्रदान कर सकती है, लेकिन डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन सिस्टम सामान्य तौर पर। निम्न नैनोमीटर सीमा (आणविक स्तर पर, एएफएम जांच द्वारा सीमित) में संकल्प के साथ विशिष्ट और गैर-विशिष्ट परिसरों पर संरचनात्मक जानकारी शामिल तंत्र की समझ के लिए काफी योगदान दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

पीयूसी19 एन, सीपीडी युक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और पी 44 को क्रमशः शमूएल विल्सन, कोरबिनियन हेइल और थॉमस कैरेल और गुडरुन मिशेल और कैरोलीन किस्कर द्वारा प्रदान किया गया था। इस काम को ड्यूश फोर्सचुंगस्सेमिंस्काफ्ट (डीएफजी) एफजे 82 और ते -671 / 4 से आईटी के अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

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References

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आनुवंशिकी अंक 123 परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) प्रोटीन-डीएनए इंटरेक्शन डीएनए की मरम्मत न्यूक्लियोटाइड एक्साइज रिचार्ज (एनईआर) डीएनए घाव मान्यता डीएनए संशोधन एएफएम नमूना तैयार करने एएफएम वॉल्यूम विश्लेषण डीएनए बाध्यकारी स्थिति विश्लेषण।
न्यूक्लियोटाइड एक्साइज मरम्मत में डीएनए घाव पहचान की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच
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Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

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