Introduction
원자 힘 현미경 (AFM)은 단백질 -DNA 상호 작용 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분석을위한 강력한 기술입니다. 단일 분자 수준의 분해능으로 이종 샘플을 직접 시각화하기 위해서는 적은 양의 시료가 필요합니다. 이질성은 단백질의 상이한 형태 또는 올리고머 상태에 기인 할 수있다. 특히, 단백질 -DNA 샘플과 관련하여, 단백질 복합체는 일반적으로 DNA 결합 또는 DNA 내의 특정 표적 부위에 결합함으로써 유도 된 상이한 화학 양론 및 / 또는 형태를 나타낼 수있다. 이종 샘플은 또한 2 종 (또는 그 이상)의 상이한 종류의 단백질 및 상이한 단백질 복합체형태 ( 예를 들어 , 하나의 유형의 단백질 대 헤테로 메릭 복합체로 이루어진)는 DNA와 다르게 상호 작용할 수있다. 여기서 논의 된 연구는 공기 중의 AFM 이미징을 이용하여이 단백질의 표적을 나타내는 병변을 포함하는 긴 (~ 900 염기쌍, bp) DNA 단편에 결합 된 DNA 복구 단백질의 정적 건조 샘플을 이용한다. AFM의 분자 분해능이 높기 때문에 여러 종류의 단백질 복합체를 구별 할 수 있으며 DNA 조각에 결합하는 단백질의 결합 위치를 결정할 수 있습니다. 중요하게도, 병변은 잘 정의 된 위치에서 DNA 기질에 도입됩니다. DNA에 병변 부위의 위치가 알려지기 때문에 DNA에 결합 된 단백질의 분포는 (상이한) 단백질 복합체의 (상이한) 병변 인식 특성, 예를 들어 그들이 특정 유형의 병변을 얼마나 잘인지하는지에 대한 통찰력을 제공한다 손상되지 않은 DNA에) 2 , 3 ,
여기에 초점을 맞춘 DNA 복구 단백질은 핵산 절삭 수선 (NER) 경로에서 병변 인식을 담당하는 헬리 카아 제입니다. 박테리아에서 NER은 단백질 UvrA, UvrB 및 UvrC에 의해 달성됩니다. UvrA는 UvaA 2 / UvrB 2 DNA 스캐닝 복합체에서 초기 병변 감지를 담당합니다. UvrB에 의한 병변 검증시,이 복합체는 병변 부위에서 결합 된 단량체 UvrB로 전환되고,이 특정 복합체는 p원핵 세포 NER 엔도 뉴 클레아 제 UvrC. UvrC는 병변이있는 짧은 (12-13nt) 스트레치의 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 절단합니다. 누락 된 스트레치는 DNA 폴리머 라제에 의해 재충전됩니다. 마지막으로, DNA 리가 제가 원래 합성 된 DNA 9,10 으로 새로 합성 된 신축성을 봉인합니다. 진핵 생물에서 NER 캐스케이드의 대부분의 단백질은 대형의 다중 전사 인자 II H (TFIIH) 복합체의 일부입니다. 삼량 체 CEN2-XPC-HR23B 복합체 를 통한 초기 병변 감지 후, TFIIH는 DNA 표적 부위로 모집된다. 복합체 내의 XPD가 NER 표적 병변의 존재를 확인하면, 진핵 생물 NER 엔도 뉴 클레아 제인 XPG 및 XPF는 병변 9 , 10을 함유 한 짧은 (24-32 nt) ssDNA 스트레치를 모집하도록 모집된다. 여기서는 원핵 생물과 진핵 생물 NER의 헬리 케이즈 UvrB와 XPD를 연구했습니다. 이 헬리콥터에는DNA (DNA bubble)는 두 개의 DNA 단일 가닥 중 하나에 연결되고,이어서 ATP 가수 분해에 의해 연료 가닥을 따라 이동합니다. 따라서 DNA 병변 이외에 DNA 버블이 단백질의 로딩 위치로 기능하는 기질에 도입되었습니다.
특정 병변 DNA 기판의 준비 절차는 이전에 11에서 설명 했습니다. 그것은 니카아제를위한 2 개의 밀접하게 이격 된 제한 부위를 갖는 원형 DNA 구조체 (플라스미드)를 필요로한다. 이 연구의 맥락에서, 플라스미드 pUC19N (2729 BP)이 사용되었다 (S. Wilson의 실험실, NIEHS에 의해 만들어졌다). 이 플라스미드는 48 뉴클레오타이드 (nt) 스트레치를 구성하는 니카타아제 Nt.BstNBI를위한 3 개의 밀접하게 이격 된 제한 사이트를 포함한다. 니카아제로 배양 한 후, 이들 부위 사이의 ssDNA의 스트레치를 제거하고 임의의 표적 특징을 함유하는 올리고 뉴클레오타이드로 대체 할 수있다. 각 단계 후, 완전한 효소 소화를 아가 로즈 겔로 시험한다전기 영동. Nicked 원형 DNA는 원래 supercoiled 플라스미드에 비해 낮은 전기 영동 이동성으로 인해 구별하실 수 있습니다. DNA의 갭핑 및 제거 된 스트레치의 특정 기질 올리고 뉴클레오타이드에 의한 대체는 닉 사이의 영역 내에서만 기질을 절개하는 제한 효소로 분해함으로써 평가 될 수있다. 효소에 의한 원형 플라스미드의 선형화는 따라서 갭 DNA에 대해 억제되고 특정 올리고 뉴클레오타이드의 삽입 후에 회복 될 것이다. 마지막으로, 두 endonuclease 제한 사이트 (이상적으로 단일 커터) 원하는대로 길이와 정의 된 위치뿐만 아니라 병변에서 거리에있는 DNA 버블에서 특정 대상 사이트와 선형 DNA 기판의 생성을 허용 5 '또는 3'방향.
NER 헬리 케이즈에 의한 병변의인지 는 AFM 영상 을 통해 조사 할 수 있습니다. t에서 헬리 카스의 DNA 전좌가 스톨 된그 병변 부위는 DNA상의 단백질 위치 분포의 첨단으로 볼 수 있으며 병변 인식을 나타낸다. 이 헬리 카제의 DNA 전좌가 5 '에서 3'극성으로 나아가 방향성을 갖기 때문에 로딩 위치 (병변의 상류 또는 하류의 DNA 버블)의 위치에 대한 병변 인식의 의존성도 병변이 우선적으로인지되는지 여부를 나타냅니다 (translocated) 또는 반대쪽으로, 비 - 전위 된 ssDNA 가닥 5 , 9 . 다음 섹션에서는 사용 된 방법을 소개하고이 실험의 주요 결과를 간단히 설명합니다. 중요한 것은 여기에 제시된 DNA 수리에 대한 모범 사례와 유사하게 AFM 이미징은 DNA 복제 또는 전사 8 , 12 , 13 , 14 와 같은 서로 다른 DNA 상호 작용 시스템의 연구에 적용될 수 있습니다
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Protocol
1. 샘플 준비
- DNA 기판 준비 11
- 플라스미드에서 ssDNA 갭 생성
- 적절한 니카아제 (여기 Nt.BstNBI)와 효소 열 불 활성화와 반응 튜브에서 플라스미드 (여기에 : 수정 된 pUC19, pUC19N)의 샘플을 완전히 소화기 제조 업체의 프로토콜에 따라 조건을 사용하여 소화 (그림 1 참조 설계도 표시). 충분한 수율을 얻기 위해 ~ 50 μL와 ~ 500 nM 플라스미드로 시작하십시오.
- 묽게 한 견본 (~ 20 nM) 15 에 아가로 오스 젤 전기 이동 법에 의하여 플라스마 새싹을 확인하십시오. DNA 시각화에 사용되는 DNA 결합 염료에 대한 보호용 장갑을 착용하십시오.
참고 : 다른 전기 영동 이동성은 nicked (relaxed)와 supercoiled 원형 플라스미드 DNA ( 그림 1 )를 구분할 수 있습니다. - 플라스미드로부터 절개 된 ssDNA 스트레치 (닉 사이트 사이)를열 블록 ( 도 1 )에서 올리고 뉴클레오타이드의 용융 온도 (여기서는 68 ℃, pUC19N의 경우) 근처에서 30 분 동안 300rpm으로 흔들어 ~ 10 배 초과하는 상보 적 올리고 뉴클레오타이드 ( 표 1 의 올리고 뉴클레오타이드 1) ).
- 테이블 원심 분리기 ( 그림 1 )에서 10,000 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 50 kDa 분자량 차단 (MWCO) 필터를 사용하여 작은 DNA 조각에서 gapped 플라스미드를 분리합니다. 필터에서 농축 된 DNA를 추출하려면 필터를 뒤집고 새로운 1.5 mL 반응 튜브에 삽입하십시오. 1,000 x g에서 3 분간 원심 분리하십시오.
- 추출한 여과수로 500μL로 농축 된 DNA 샘플을 보충하고, 상보 적 올리고 뉴클레오타이드를 ~ 5 배 초과하여 추가로 3 회 이상 단계 1.1.1.3과 1.1.1.4를 반복한다.
- conditi를 사용하여 적절한 제한 효소 (여기 : XhoI 또는 BglII)와 함께 항온 배양하여 DNA의 완전한 갭을 테스트합니다.제조업체의 설명에 따라 작동합니다. 희석 된 (흠집 대 갭이있는) DNA 샘플을 사용하십시오 (~ 20nM). nicked DNA를 양성 대조군으로 사용하여 선형화 된 플라스미드 (ssDNA 간격 포함)와 비 절개 DNA (gapped DNA)를 구별하기 위해 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행하십시오 (참조 용 DNA 사다리 포함, 그림 1 ). 장갑을 착용하십시오.
- 변형 된 ssDNA 올리고 뉴클레오타이드와의 갭 재충전
- 선택한 특정 표적 부위가 들어있는 5 '인산화 올리고 뉴클레오티드의 ~ 25 배 초과 배양액을 사용하여 갭 플라스 미를 제거한 후 ~ 45 ° C에서 4 시간 동안 배양합니다 ( 그림 1 ). 여기에서, 병변 (형광 증식 된 티민 또는 시클로 부탄 피리 미딘 다이머 (CPD)) 및 DNA 버블 생성을위한 짧은 (8nt) 비 상보 서열을 함유하는 48 nt ssDNA를 사용한다 ( 표 1 참조).
- 인큐베이터로 어닐링 한 인서트를 플라스미드에 공유 결합T4 DNA ligase로 상온에서 하룻밤 동안 배양 하였다 ( 그림 1 ). 이 반응을 위해, 농축 완충액 원액을 포함하는 ATP를 첨가하여 리가 아제 ( 예 : UvrB 반응 완충액 : 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
- 희석 된 시료를 적절한 제한 효소 (1.1.1.6에서와 동일)로 소화시켜 제조사의 프로토콜에 따라 특정 올리고 뉴클레오타이드를 삽입 한 플라스미드에 삽입 한 후 아가로 오스 겔 전기 영동 (1.1.1.6, 그림 1 ).
- 선형 DNA 기질의 제조
- 제한 효소 (이상적으로 플라스미드의 단일 제한 사이트와 함께) 수정 된 플라스미드 DNA를 제조사에서 권장 한 조건을 사용하여 분해하십시오 ( 그림 1 ). 이 단계는 다음을 포함하는 선형 조각을 생성합니다.삽입 된 수정을 정의 된 위치에 놓습니다. 여기에서 SspI와 BspQI를 삽입물의 상류와 하류의 위치 613과 255bp에서 절단하여 DNA 길이의 ~ 30 %에 특정 병변 부위를 포함하는 916 bp DNA 단편을 만듭니다.
참고 : 여기에 설명 된 AFM 이미징 실험의 경우 ~ 200bp와 ~ 2,000bp 사이의 길이를 갖는 DNA 조각이 적합한 기질입니다. - 상업용 키트를 사용하여 아가 로스 겔 전기 영동 및 겔 추출을 통해 표적 단편 을 단리한다. 보호 장갑을 착용하십시오.
- 선택적으로 메스로 아가로 오스 겔을 절단하여 DNA 사다리와 희석 된 샘플 레인 (처음 2 레인)을 정제 할 농축 DNA가 들어있는 레인에서 분리합니다. 첫 번째 두 차선이있는 젤 부분 만 UV 젤에이 젤 부분을 두어 UV 조사에 노출 시키십시오.
- 선택한 조각에 해당하는 밴드를 메스로 잘라냅니다. 두 개의 젤 부품을 다시 결합하십시오 (UV 탭에서 분리하십시오).르). 원하는 DNA 기질의 밴드 위치에 대한 방향으로 희석 샘플에서 excised 밴드의 위치를 사용하십시오. 묽게 한 통제보다는 경미하게 더 넓은 조각을 잘라서 더 높은 농도를 고려하십시오.
참고 : 여기에서 UV 병소의 인식이 조사되었으므로 UV 조사 를 통한 추가 UV 병소의 도입은이 방법으로 DNA 기질에서 조심스럽게 회피되었습니다.
- 선택한 조각에 해당하는 밴드를 메스로 잘라냅니다. 두 개의 젤 부품을 다시 결합하십시오 (UV 탭에서 분리하십시오).르). 원하는 DNA 기질의 밴드 위치에 대한 방향으로 희석 샘플에서 excised 밴드의 위치를 사용하십시오. 묽게 한 통제보다는 경미하게 더 넓은 조각을 잘라서 더 높은 농도를 고려하십시오.
- UV-Vis 분광 광도계에 의해 측정 된 260 nm에서의 흡수로부터 DNA 농도 c 를 계산한다. 이중 가닥 DNA (dsDNA) 평균 몰 흡광 계수 ε 260nm ~ 6,700 M - 1 cm -1 bp 당 Lambert-Beer의 법칙을 사용한다 :
여기서 L 은 경로 길이 (측정 챔버 길이, 일반적으로 1cm)입니다.
- 제한 효소 (이상적으로 플라스미드의 단일 제한 사이트와 함께) 수정 된 플라스미드 DNA를 제조사에서 권장 한 조건을 사용하여 분해하십시오 ( 그림 1 ). 이 단계는 다음을 포함하는 선형 조각을 생성합니다.삽입 된 수정을 정의 된 위치에 놓습니다. 여기에서 SspI와 BspQI를 삽입물의 상류와 하류의 위치 613과 255bp에서 절단하여 DNA 길이의 ~ 30 %에 특정 병변 부위를 포함하는 916 bp DNA 단편을 만듭니다.
- 플라스미드에서 ssDNA 갭 생성
- 단백질 발현 및 정제
- E. coli 에서 UvrB를 재조합 발현하고 표준 키틴 비드 친 화성 15 및 크기 배제 크로마토 그래피 15 를 통해 단백질 을 정제한다.
참고 : Bacillus caldotenax 의 uvrB 유전자는 pTYB1 벡터에 클로닝되었습니다. - 대장균 에서 XPD를 익스프레션하고 표준 니켈 IDA 친화도 15 및 크기 배제 크로마토 그래피 15, 이어서 음이온 교환 크로마토 그래피 15 를 통해 단백질 을 정제한다.
참고 : Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum 그룹 D 단백질 (XPD) 유전자는 pBADM11 벡터에 클로닝되었습니다. C. thermophilum p44는 캐롤라인 키스 커 (Caroline Kisker)의 실험실에서 표현한 선물이었고 puri17 .
- E. coli 에서 UvrB를 재조합 발현하고 표준 키틴 비드 친 화성 15 및 크기 배제 크로마토 그래피 15 를 통해 단백질 을 정제한다.
2. AFM 실험
- 샘플 준비
- 선택적으로, 가열 블록에서 65 ℃에서 10 분간 DNA 기질을 사전 배양하여 냉장고에 보관하는 동안 형성 될 수있는 잠재적 인 미세 염 결정을 제거합니다.
- 10 배 농도 (10x 버퍼)에서 반응 버퍼를 준비합니다.
참고 : 1X 농도의 XPD 반응 완충액은 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1x UvrB 반응 완충액은 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT 및 1 mM ATP를 함유 하였다. - 복잡한 형성을 향상시키기 위해 적절한 배양 조건에서보다 높은 농도로 단백질을 미리 배양하십시오. 원하는 농도로 1x 단백질 반응 완충액에 소량의 단백질 ( 예 : 1 μL)을 희석하고 작은 양 ( 예 : 1 μL)의 t그는 0.5 mL 반응 튜브에서 개별 단백질 용액을 얻었다.
- 튜브를 실온보다 높은 배양 온도를위한 열 블록에 넣으십시오. 등몰 또는 해당 농도의 복잡한 화학 양론에 따라 농도 비율을 선택하십시오. 여기에 1 μL XPD (1 x XPD 반응 완충액에 20 μM)와 1 μL p44 (1 x XPD 반응 완충액에 20 μM)를 10 μM 씩 37 ° C에서 10 분간 품어 둔다.
- 0.5 ML 반응 튜브에 단백질 반응 버퍼에 적절한 단백질과 DNA 농도 샘플을 품다. 여기에 500 nM UvrB 또는 1 μM XPD + 1 μM p44와 100 nM DNA를 사용하십시오. 피펫 작은 볼륨, 예를 들어 , 0.25-0.5 μL 단백질 (10 배 배양 농도에 미리 희석) 및 DNA 1x 단백질 반응 버퍼 2.5-5 μL의 총 볼륨에 저장합니다. 여기, 열 블록에서 37 ° C에서 30 분 품어. 원심 분리기에서 반응 튜브에서 잠깐 (~ 1 초) 스핀 다운작은 부피의 혼합을 보장한다.
- 샘플 증착
- 운모 기질 준비 : 메스를 사용하여 큰 스트립에서 약 1 x 1cm 2 운모를 자릅니다. 점착 테이프를 사용하여 다층 운모 광물 조각의 상단 레이어를 벗겨 깨끗하고 평평하며 원자 적으로 평탄한 소재 표면을 나타냅니다.
참고 : 운모 조각은 여러 층을 벗겨내어 여러 번 실험을 할 때 다시 사용할 수 있습니다. - 25 MM HEPES pH 7.5, 25 MM Na 아세테이트, 10 MM Mg 아세테이트와 같은 탈 이온수로 AFM 증착 버퍼를 준비하십시오. 0.02 μm 주사기 필터를 통해 여과하십시오.
참고 : 증착 버퍼의 2가 양이온은 마이너스로 대전 된 DNA 분자를 운모 표면에 킬레이트시키는 역할을하며, 운모 표면은 또한 중성 pH에서 음으로 대전됩니다. 침전 완충액 중 비교적 높은 Mg 2+ 이온 농도가 특정 단백질 -DNA 시스템에 문제를 제기한다면,운모 표면은 앵커 링을위한 양전하를 제공하기 위해 실라 트레인 기반 화학을 사용하여 아미노 그룹으로 사전로드 될 수 있습니다. 샘플 증착은 2가 양이온을 함유하지 않거나 단지 적은 양의 양이온을 함유하는 완충액에서 수행 될 수있다. - 침전 완충액에있는 운모에 즉시 침착시키기 위해 시료를 희석한다 (2.1 참조). 작은 양의 침전물 (여기에는 20 μL).
참고 : 희석 인자는 시료 농도에 따라 다릅니다. 여기, 희석 샘플 50-100x. 경험적으로 ~ 1nM의 DNA는 ~ 1,000bp의 우수한 표면 커버리지를 제공합니다. - 몇 밀리리터의 여과 된 탈 이온수로 시료를 즉시 3 ~ 4 회 헹구고 과량의 액체를 털어 내고 부드러운 질소 흐름으로 불어 건조시킵니다. 샘플 증착에서부터 건조 샘플까지의 전체 프로세스는 30 초 이내에 수행 될 수 있습니다.
- 가장자리에 접착 테이프를 사용하여 현미경 슬라이드에 운모 조각을 고정시킵니다.
참고 : 다른 AFM 시스템에는 d무대에 샘플을 고정하기위한 다른 요구 사항. 다른 AFM은 자기 단계를 가지고 있으며, 운모 조각은 열 접착제를 사용하여 자기 디스크에 고정됩니다. 여기에 사용 된 AFM 시스템의 세부 사항은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
- 운모 기질 준비 : 메스를 사용하여 큰 스트립에서 약 1 x 1cm 2 운모를 자릅니다. 점착 테이프를 사용하여 다층 운모 광물 조각의 상단 레이어를 벗겨 깨끗하고 평평하며 원자 적으로 평탄한 소재 표면을 나타냅니다.
- AFM 이미징
- 샘플을 (2.2.5 참조) AFM 스테이지 중앙에 놓고 자석 패드가 달린 스테이지에 현미경 슬라이드를 고정시킵니다.
- AFM 팁을 팁 홀더에 삽입하십시오. 공기 중 진동, 간헐적 접촉 모드 이미징에 적합한 날카로운 (<10 nm) AFM 프로브가있는 캔틸레버를 사용하십시오. 예를 들어, 재료 표에 나열된 AFM 프로브를 사용하십시오. 여기 (AFM에 따라 다름) 클램프 나사를 조여 (손으로 조여서) 클램프 아래의 홀더에 팁을 고정시킵니다. 팁 홀더를 AFM 측정 헤드에 삽입하십시오. 이 단계를 위해 머리를 뒤로 눕혀 라.
- AFM 측정 헤드를 샘플 위에 놓습니다. 세부 사항은 AFM 모델에 따라 다릅니다. 여기서, m무대 안의 안쪽에 머리가 안정적으로 놓여 있는지 확인하십시오. 운모가 AFM 팁이 위에 놓일 무대에 있는지 확인하십시오. 스테이지 오른쪽에있는 마이크로 미터 나사를 사용하여 샘플을 정밀하게 배치 할 수 있습니다.
- 레이저가 반사되는 위치 감지 광 검출기의 최적 신호 강도를 위해 AFM 레이저를 캔틸레버 뒷면에 맞 춥니 다. 세부 사항은 AFM 모델에 따라 다릅니다.
- 여기에서 AFM 측정 헤드의 오른쪽과 뒤쪽의 휠을 돌려서 AFM 레이저의 x 및 y 위치를 조정하여 캔틸레버의 끝 부분에 초점을 맞 춥니 다. AFM 비디오 창에서 반사 신호를 봅니다 (사용 가능한 경우 여기 : 카메라 아이콘을 누르고 입력 : Svideo를 선택).
- 조잡한 위치에 놓은 후 두 바퀴로 레이저 위치를 미세 조정하여 검출기 합 신호 (AFM 소프트웨어의 누적 합계 및 편향 미터 창에서 합계)를 최적화합니다 (캔틸레버 끝 부분에 머물러 있으십시오.AFM과 캔틸레버 유형에 따라 달라집니다. 여기서는 sum> 5)를 목표로합니다.
- AFM 레이저 반사를 감지기 중심으로 향하게하여 감지기 배열의 상단 및 하단 다이오드 (여기서는 편차 및 편향 미터 창에서의 편향 신호)와의 차이 신호를 제로화합니다 (여기에서는 AFM 측정의 왼쪽에서 휠을 돌립니다). 머리).
참고 : 0에서의 편차는 AFM에 의해 높이 정보로 변환되는 표면 상호 작용으로 인한 캔틸레버의 처짐을 나타냅니다. - AFM 소프트웨어에 구현 된 주파수 튠에 의해 캔틸레버 공진 주파수를 결정합니다 (여기에서는 마스터 패널 / 튜닝 윈도우의 명령 자동 튜닝). 캔틸레버 진동을 일으키는 피에조에 대한 1V 입력에 해당하는 진폭을 선택하십시오. 발진 주파수를 공진 주파수보다 약간 (5 %) 낮추고 발진의 위상을 0으로 설정하십시오.
- Crucial engaged 모드를 사용하여 팁을 샘플 표면에 접근e (여기 : 마스터 패널 창에서 명령) 보호 설정 (설정치)에 도달 할 때까지 기다립니다. 프리 레벨 진동 진폭의 ~ 2 %를 설정 점으로 사용하십시오 (여기서는 마스터 패널에서 설정 점 980mV로 입력하십시오).
- AFM 소프트웨어를 사용하여 설정 포인트를 낮춤으로써 AFM 팁을 샘플 표면에 미세하게 맞 춥니 다. 프리 레벨 위상 바로 아래의 캔틸레버 진동 위상 (Phase in Sum and Deflection Meter window)을 사용하여 반발 모드 이미징을 목표로하십시오. 여기에서 프리 레벨 진폭 (1V)의 70-80 % 정도의 순서로 전형적인 최종 설정 점을 사용하십시오.
- 스캔하기 전에 마스터 채널 패널에 녹음 할 신호를 선택하십시오. 높이 (Ht)와 진폭 (Am)을 선택하십시오.
- 샘플 스캐닝을 시작하십시오 (여기에서는 마스터 패널 창에서 명령 수행). 2.5 μm / s 스캔 속도 (마스터 패널의 스캔 속도 명령)를 사용하여 4 μm x 4 μm 또는 8 μm x 8 μm의 표면 영역을 이미지화합니다 (마스터 패널의 스캔 크기 입력).l)의 픽셀 해상도가 2,048 또는 4,096 (마스터 패널의 스캔 포인트 및 스캔 라인)입니다.
- 피팅 수정없이 이미지 파일 (마스터 패널에 이미지 저장 명령)을 저장하십시오 (마스터 채널 패널에서 없음 / 평면 저장을 선택하십시오).
- 추가 분석을 위해 저장된 이미지를 처리하십시오. 이미지를 불러옵니다 (AFM 분석 메뉴에서 저장된 데이터 찾아보기 명령). 수정 패널을여십시오 (이미지의 맨 위 섹션에서 M을 누르십시오). 높이 이미지 (확장 HtR)에 x 및 y 치수로 planefit을 적용합니다 (Modify Panel의 Planefit 창에서 XY를 명령하고 Planefit Order 3을 선택합니다). 그런 다음 이미지 병합 (Modify Panel의 Flatten 창에서 Flatten 명령)을 선택하여 Flatten Order 3을 선택하십시오.
- 추가 분석을 위해 이미지를 TIFF 파일로 내 보냅니다 (이미지의 상단 섹션에있는 명령을 누르고 2,048 픽셀 해상도에 해당하는 TIFF 내보내기 2x를 선택하십시오).
3. AFM 분석
- 단백질 복합체 부피
- 사전 -AFM 소프트웨어의 이미지를 직접 육안 검사하여 관련 단백질 -DNA 복합체를 선택하고, 서로 다른 크기의 복합체의 다양한 모습을 최대화하는 데 적합한 색상 구성표를 사용합니다 ( 그림 2 의 다양한 색상 및 크기의 복합체 참조, 그림 : SeaLandAndFire AFM 소프트웨어). XPD 샘플의 경우 XPD (~ 95 kDa)와 p44 (~ 40 kDa)의 상대적으로 큰 분자량으로 인해 크기가 뚜렷한 XPD / DNA 와 p44-DNA 는 물론 XPD / p44- .
- 복합 형을 확인하기 위해 DNA상의 개별 단백질 피크의 부피를 측정합니다. 이것은 다른 이미지 소프트웨어 (여기에서는 AFM 소프트웨어의 섹션 도구)를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
- 섹션 윈도우 커서를 사용하여 단백질 피크 섹션의 높이 (h)와 직경 (d)을 측정합니다. 입자 섹션의 바닥에 가까운 직경을 측정하십시오.
- 완두콩의 부피 (V)를 결정하십시오구형 캡 모델을 기반으로하는 다음 수식을 사용하여 간단한 수학 모델을 사용하여 ks를 계산합니다.
- 측정 된 부피를 대략 단백질 분자량으로 변환합니다.
- 분자량이 알려진 단백질의 범위를 사용하여 분자량 (MW)의 부피를 측정하기 위해 AFM 시스템을 보정하십시오. 여기에서 각각 25와 851 데이터 포인트를 갖는 총 12 개의 실험이 단량체, 이량 체 (dimeric) , 삼량 체 또는 사량 체 상태) 4 , 19 , 20 . 위에서 설명한 바와 같이 (2.2 및 2.3에서) 단백질을 축적하고 이미지화하고 (3.1.2) 위에서 설명한대로 볼륨을 측정합니다. 알려진 분자량에 걸쳐 볼륨을 플롯합니다. 결과 그래프는 V와 MW 사이의 선형 관계를 보여 주며,이 방정식은데이터에 맞는 선. 여기에 사용 된 AFM 시스템의 경우, 다음과 같은 관계가 얻어졌다. 19 :
참고 :이 단계는 각 측정 전에 반복하지 않아도되지만 한 번만 수행됩니다. MW 보정의 부피는 직경이 약간 다른 AFM 프로브를 사용하여 유사한 이미징 조건에서 얻어진 이미지에 적용 할 수 있습니다. - 측정 된 부피 (3.1.2)와 V-to-MW 보정 (3.1.3.1)을 기반으로 분자 복합체의 분자량에 대한 정보를 제공하는 단백질 복합체 20 의 근사 분자량을 결정합니다. 예 를 들어 XPD / p44 샘플의 경우 p44-DNA 복합체 (또는 단순한 DNA 상부 구조에 의한 피크), XPD만의 피크 및 XPD / p44 피크와 각각 일치하여 ~ 50kDa, ~ 100kDa 및 ~ 140kDa가 얻어졌습니다 .
- 분자량이 알려진 단백질의 범위를 사용하여 분자량 (MW)의 부피를 측정하기 위해 AFM 시스템을 보정하십시오. 여기에서 각각 25와 851 데이터 포인트를 갖는 총 12 개의 실험이 단량체, 이량 체 (dimeric) , 삼량 체 또는 사량 체 상태) 4 , 19 , 20 . 위에서 설명한 바와 같이 (2.2 및 2.3에서) 단백질을 축적하고 이미지화하고 (3.1.2) 위에서 설명한대로 볼륨을 측정합니다. 알려진 분자량에 걸쳐 볼륨을 플롯합니다. 결과 그래프는 V와 MW 사이의 선형 관계를 보여 주며,이 방정식은데이터에 맞는 선. 여기에 사용 된 AFM 시스템의 경우, 다음과 같은 관계가 얻어졌다. 19 :
- DNA의 단백질 복합체 위치
- DNA를 결정하십시오.조각 길이.
- AFM 이미지의 DNA 조각을 추적하십시오 ( 예 : 적절한 이미지 분석 소프트웨어의 프리 핸드 라인 기능 (예 : 표표 참조)). 그리고 선의 길이를 측정하십시오.
참고 : DNA 집합체와 이미지 여백으로 잘라낸 조각은 제외하십시오. - 적절한 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 히스토그램에서 전체 실험의 DNA 길이를 표시하고 플롯합니다 ( 예 : 표 재료 참조).
- 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어에서 가우스 곡선을 사용하여 길이 분포를 맞추어 DNA 단편의 길이를 결정합니다. 삽입 된 DNA 표적 위치 (1.1 참조)의 위치를 알기 위해서는, 가우스 곡선의 중심으로부터 2 표준 편차 이내의 정확한 길이를 갖는 DNA 단편만을 포함시킨다 (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 )이며, 여기서 z는 표준 인자이고 x c 와 w는 중심이며Gaussian의 최대 최대 반값 폭).
참고 : 가우스 곡선의 중심에있는 DNA 길이는 DNA 단편의 이론적 길이 (0.34 nm / bp를 사용하여 계산)에 근접해야합니다. 이론 값보다 최대 10 % 더 짧은 길이가 일반적이며 AFM 분해능 한계로 인해 발생할 수 있습니다.
- AFM 이미지의 DNA 조각을 추적하십시오 ( 예 : 적절한 이미지 분석 소프트웨어의 프리 핸드 라인 기능 (예 : 표표 참조)). 그리고 선의 길이를 측정하십시오.
- DNA 기질의 단백질 피크 위치를 결정하십시오.
- 3.2.1.1에서 설명한대로 가까운 DNA 단편 말단에서 단백질 피크의 거리를 측정하고 총 DNA 길이로 나누어 DNA 길이 분율의 단위로 거리를 구하십시오.
- 적절한 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어 ( 그림 3 참조)를 사용하여 히스토그램에서 측정 된 거리를 저장하고 플롯합니다. 일반적으로 n 개의 데이터 포인트에 대해 대략 √ bin을 제공하는 bin 크기를 선택하십시오.
참고 : DNA 끝은 여기에서 구별 할 수 없으므로 DNA 길이의 0.5 분의 1까지만 작도하십시오 (DNA frag의 중심ment). DNA 최종 바인딩은 연구의 초점이 아니기 때문에, 위치 0 이후 약간 위치 데이터를 bin에 시작하여 분석에서 DNA 끝 부분을 제외하십시오 ( 예 : 여기에서 : DNA 길이 부분 0.02에서부터 binning).
- 단백질 복합체 위치 분포로부터 목표 부위 특이성을 결정하십시오.
- 3.2.1.3에서와 같이 Gauss 커브를 사용하여 위치 분포에서 최대 값 (향상된 바인딩 발생)을 맞추지 만 배경 바인딩의 높이에 맞추십시오 ( 그림 3 참조).
- 특정 사이트에 대한 특이성 S 대 비특이적 DNA 배경 (비특이적 인 DNA 사이트에 결합 된 단백질 분자)을 다음의 수식 21로 계산하십시오
A sp : 특정 복합물의 수 (가우시안 곡선 아래 영역)
A nsp : 비특이적 복합체의 수 (배경 영역,
N : 가능한 DNA 결합 부위의 수 (여기서는 DNA 말단을 제외한 N = 914)
- DNA를 결정하십시오.조각 길이.
- DNA 벤드 각도
- 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 각도 도구를 사용하여 DNA 백본을 따라 중앙에 위치하고 단백질 피크를 중심으로 두 선 사이의 각도 β를 측정합니다 ( 그림 4의 삽화 참조). 통계적으로 적절한 수의 단백질 -DNA 복합체 (> 50 이상, 이상적으로는> 100) 2 , 3 , 5에 대한 각도를 측정합니다.
참고 : DNA 굽힘 각도는 180 ° -β 2 , 3 , 5 로 정의됩니다. - 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어 사용(재료 표 참조)는 DNA 굽힘 각도를 비닝하여 굽힘 각도 분포 히스토그램을 생성합니다.
- 굽힘 각도 분포를 가우스 곡선에 맞 춥니 다. 분포에서 최대 값이 두 개 이상이면 여러 가우스 피크 적합성을 선택하십시오. 가우시안 곡선의 중심은 특정 종의 평균 굴곡 각 상태를 나타냅니다.
- 굴곡 각 (Gaussian fit (s))의 변화가 다른 단백질 변이체 또는 다른 단백질 복합체와 같은 분포에 대해 명백한 경우 학생의 t- 테스트를 적용하여 변경.
- 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 각도 도구를 사용하여 DNA 백본을 따라 중앙에 위치하고 단백질 피크를 중심으로 두 선 사이의 각도 β를 측정합니다 ( 그림 4의 삽화 참조). 통계적으로 적절한 수의 단백질 -DNA 복합체 (> 50 이상, 이상적으로는> 100) 2 , 3 , 5에 대한 각도를 측정합니다.
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Representative Results
단백질 복합체 부피를 기준으로 다른 복합 형을 구별
원핵 생물 NER 헬리 케이즈 UvrB의 헬리 케이즈 활성은 DNA 결합에 의해 자극된다 22 , 23 . UvrB는 두 개의 단일 ssDNA 가닥 중 하나에 올바르게로드하기 위해 DNA에 짝을 이루지 않은 영역 (DNA 버블)이 필요합니다. 생체 내 에서,이 DNA 구조는 NER 캐스케이드의 다른 단백질을 통한 DNA 상호 작용에 의해 제공됩니다. 시험 관내 실험에서, 거품은 표적 병변에 근접하여 dsDNA 단편에 인위적으로 도입 될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 또한 UvrB 9 에 의한 DNA 결합을 향상시킵니다. 그러나 일단 UvrB가 DNA에로드되면 그 활성은 단백질 보조 인자에 의존하지 않는 것으로 보인다 9 . 대조적으로, 진핵 생물 NER 헬리 카아 제 XPD는 상호 작용XPD와 마찬가지로 in vivo 에서 다중 소대 전사 인자 IIH (TFIIH) 복합체 의 일부인 헬리나아제 활성을 활성화시키는 단백질 p44와 결합하지만이 상호 작용은 XPD가 DNA 17에 결합하는 데 영향을 미치지 않는다. XPD만으로는 DNA 버블에서 DNA에로드되지만 병변으로 이동하지는 않습니다 (헬리 카아 제 활성화 보조 인자가없는 경우). 따라서 p44가없는 XPD는 병소 부위로부터 멀리 떨어진 곳에서 로딩 될 때 병변과 상호 작용하고 식별 할 수 없어야합니다. DNA 기질을 함유하는 병변이있는 상태에서 p44와 XPD를 부화 시키면 XPD- 또는 XPD / p44-DNA 복합체 (및 DNA에 결합 된 p44만의 작은 종)가 혼합된다. XPD / p44와 XPD에 의한 병변 인식을 개별적으로 분석하기 위해 위의 프로토콜 3.1에 설명 된 것처럼 AFM 이미지 ( 그림 2 ) 9 의 볼륨을 기준으로 이러한 복잡한 유형을 구별 할 수 있습니다. AFM 시스템은 p의 범위를 사용하여 보정 될 수 있습니다.알려진 분자량을 갖는 로틴은 AFM 부피와 단백질 (복합체) 20 의 대략적인 분자 질량 사이의 선형 관계를 나타내어 측정 된 부피의 해석을 허용합니다. 따라서 DNA상의 결합 위치는 헬리 카제 불활성 단량체 XPD (약 95 kDa, 그림 2 의 ~ 100 nm 3 등급 2 종과 일치) 및 헬리 카제 활성 XPD / p44 복합체 (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 종 3 종)을 각각 다른 AFM 양에 기초하여 분석 하였다.
DNA에 단백질 결합 위치에서 돌연변이 승인 결정
여기에는 DNA 길이의 ~ 30 %에 병변이있는 긴 (916 bp) DNA 기질이 사용되었습니다. DNA 기질 내의 병변의 정확한 위치에 대한 제어는 특이적인 (DNA 길이의 약 30 %에서의 병변 - 결합) 및 비 -cific (lesion search) 복합체는 DNA에서의 위치에 의존한다. NER의 표적 인 2 개의 다른 병변이 선택되었다. DNA 기질은 플루오 레세 인 (F) 부가 물 또는 시클로 부탄 피리 미딘 이량 체 (CPB)를 함유 하였다. 병변 부위 이외에, DNA는 헬리 케이즈를위한 로딩 사이트 (loading site)로 작용하는 비평면 영역 (unpaired region) (8nt DNA 버블)을 함유 하였다. 이 로딩 사이트는 병변으로부터 5 '또는 3'( 표 1 참조) 중 26nt (F 함유 DNA 기질의 경우) 또는 23nt (CPD 함유 기질의 경우)의 거리에 위치한다. 병변 인식은 표적 부위에서 헬리 케이즈 UvrB 및 XPD의 DNA 전좌가 정지되고, DNA상의 AFM 단백질 위치 분포가 병변의 위치에서 피크로서 명백해진다. 이 기판의 병변 및 버블 위치는 AFM 이미징 (<10 nm 거리)의 분해능 한계 내에서 구분할 수 없습니다. 그러나, 특정 복합체의 분율은병변에서 실속 한 분자의 마운트는 병변 인식을 나타내며, 병변이 버블에서 3 '또는 5'위치에 있는지 여부에 크게 의존합니다 ( 그림 3 ).
특정 부위 (Gaussian fit 피크 아래의 영역 대 비특이적으로 결합 된 백그라운드의 영역)에서의 복합체의 분율로부터, 조사 된 2 가지 병변 유형에 대한 UvrB 및 XPD의 특이성 S가 계산되었다 (상기 프로토콜 3.2 참조). UvrB의 경우, 병소 위치에서 5 '로딩하면 병변 (3 번 , F3 및 SB, CPD3 ~ 100)에서 3'로딩하는 것보다 높은 특이성 (S B, F 5 ~ 200 및 S B, CPD 5 ~ 두 가지 병변 유형. XPD의 경우, XPD ( 도 2의 클래스 2)만을 함유하는 복합체 및 XPD뿐만 아니라 헬리 케이즈 활성화 보조 - 인자 단백질 p44 ( 도 2의 클래스 3)를 함유하는 복합체는 descr이전 섹션에서 ibed. Class 2 단백질 피크 (XPD 만, 헬리 케이즈 비활성)는 5 '또는 3'로드 여부에 관계없이 병변 유형에 독립적으로 병변 부위에 우선적으로 위치하지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 대조적으로, XPD / p44 (class 3) 복합체에 대한 위치 분포는 병변에서 5 '로딩하는 경우 F 병변에서 강화 된 결합을 보였으 나 (S XPD / p44, F5 ~ 300 대 S XPD / p44, F3 ~ 100) CPD (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 대 S XPD / p44, CPD5 ~ 100, 그림 3 ). UvrB와 XPD는 5'-to-3 '헬리 케이즈이기 때문에, 이들 데이터는 svRNA 가닥 내에서 병변과의 상호 작용을 통해 복합체가 정지되는지 여부에 대한 정보를 제공합니다 (전좌 된 가닥, 병변에서 5'로드). 또는 반대편의 비 - 전좌 된 가닥 내에서 (병변으로부터 3 '을 로딩하기 위해). 이 개념은 XPD에 의한 병변 확인시 입체적인 변화 조사 AFM 이미지 (위의 프로토콜 3.3 참조)에서 바운드 복합체의 사이트에서 DNA로 도입 된 굽힘 측정은 복잡한 구조 변화에 대한 중요한 정보를 나타낼 수 있습니다. 헬리 카제 활성을위한 단백질 보조 인자 상호 작용을 필요로하지 않는 고세 XPD 5 에 대해 DNA 굴곡 각을 측정 하였다. 이 연구에서, 플루 오레 신 병변은 direcDNA 조각의 길이의 ~ 30 %에서 병변에서의 단백질 로딩 향상을위한 DNA 버블의 맥락에서 볼 때, 그림 4는 비특이적 (손상되지 않은) DNA 위치와 DNA 길이의 ~ 30 %에서 단백질 복합체에 대해 얻은 DNA 굽힘 각 분포에 대한 가우시안 적합을 나타내며, 형광 물질 병변 (특정 복합체)의 위치에서 XPD 바인딩과 일치합니다. 데이터는 비 특정 복합체에 대해 ~ 50 °, 특정 복합체에 대해 ~ 65 °의 평균 굽힘 각도를 나타냅니다. 이 DNA 굴곡 각도 변화는 ATP 또는 ATPs의 존재에 의존적이었으며, ATP (재) 결합은 가수 분해가 아닌 구조적 재배 열에 필수적임을 나타냅니다. 표 1 : DNA 기판 준비를위한 DNA 올리고 뉴클레오티드. 모든 올리고 뉴클레오타이드는 길이가 48 nt이며 상단 스트랜드 (올리고 뉴클레오타이드 2-6)는 5 '말단에서 인산화되어 얻어지는 DNA에 결합된다 (Protocol 1.1 참조). F = 플루 오레 신 부가 티민, TT = 사이클로 부탄 피리 미딘 (티민) 이합체 (CPD), 비상 용적 영역 (DNA 버블 형성 영역)에 밑줄을 그었다. F를 함유하는 올리고 뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technologies (IDT)로부터 수득하였고, 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 CPD는 Thomas Carell의 실험실 (Ludwig-Maximilian University Munich, Germany)에 의해 친절하게 제공되었다. 
그림 1 : DNA 기판의 준비. ssDNA 갭은 원형 플라스미드 DNA 내로 플라스크 (여기서는 니코 아제 N.BstNBI)를 틴트 (clo)여분의 상보적인 올리고 뉴클레오타이드의 존재하에 열 불안정 화 후 원심 분리 여과 를 통해 밀폐 된 ssDNA 스트레치 를 제거하는 단계를 포함한다. 선택한 특징을 포함하는 특정 올리고 뉴클레오티드를 어닐링하고 갭 영역 내로 연결시킬 수있다. 마지막으로, 제한 효소 (여기서는 SspI와 BspQI)로 소화하면 정확히 알려진 위치 (여기서는 DNA 단편 길이의 30 %)에 표적 특징을 갖는 선형 DNA 기질이 생성된다. 대조군 분석법은 아가로 오스 겔 전기 영동 (검은 색 화살표는 3000bp 를 나타냄) 을 통해 개별 단계 (아래에 표시)의 테스트를 허용합니다. Nicking은 supercoiled plasmid 대 차가운, 이완 된 원형 DNA (control nicking, lane 2)의 변형 된 전기 영동 이동성 (lane 1)으로 시험 할 수있다. 특정 oligo의 후속 삽입뿐만 아니라 DNA의 완전한 갭 핑 (gap)은 갭 영역에서 절단하는 제한 효소로 분해하여 시험 할 수있다 (여기에서 : XhoI, in레인 2, 4 및 6)을 사용하여 DNA 절개의 결여가 갭 형성 (레인 1, 2, DNA가 차선 3,4, 갭 DNA) 및 재 협착 절개가 특정 올리고 (레인 5,6) . 특정 특징을 포함하는 최종 선형 기판은 아가로 오스 겔 전기 영동 후 겔로부터 정제 될 수 있고 AFM 이미징 을 통해 균질성 및 순도 를 테스트 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2 : 서로 다른 복합 유형을 AFM 볼륨과 구별하기. ( A ) XPD / p44 - DNA (회색 화살표)와 XPD - DNA (검은 색 화살표) 단지의 AFM 이미지. ( B ) 세 가지 유형의 DNA 결합 복합체 (p44 또는 단순한 DNA 상부 구조 (1 등급)로 해석 됨)XPM (클래스 2, 블랙 프레임), XPD / p44 (클래스 3, 그레이 프레임) 콤플렉스는 AFM 볼륨을 기반으로합니다 (오른쪽 그림 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 3 : 원핵 및 원핵 NER 헬리 케이즈의 다양한 병변 인식 전략. 병변 인식 NER 헬리 카아 제 UvrB 및 XPD (헬리 카아 제 활성화 보조 인자 p44와 복합체)에 의한 유능한 DNA 전좌는 비균질 DNA 영역 (DNA 버블)에서 단백질의 로딩을 필요로한다. 그런 다음 단백질은로드 된 ssDNA 가닥을 따라 5 '에서 3'방향으로 이동합니다. 전좌 된 가닥 (5 '기포 로딩) 또는 반대편의 비 - 전좌 가닥 (foop)에있는 헬리 카제에 의한 DNA 병변 (여기서는 CPD)의 인식3 '기포로 로딩)는 DNA 전좌가 정지되는 결과를 초래한다. 위치 분포에서 이는 피크 (Gaussian fit lines)로 나타나며 병변 위치에서 향상된 결합을 나타냅니다 (여기에 표시된 DNA 기질의 경우 DNA 길이의 ~ 30 %). 원핵 생물 NER helicase UvrB와 그 진핵 세포 XPD는 다른 DNA 가닥 선호도를 나타내는 CPD 병변 인식의 다른 전략을 보여준다. 구체적으로, CPD 병변은 UvrB에 의해 전위 된 가닥 상에 인식되지만, 우선적으로 XPD에 의해 반대의 비 - 전위 된 가닥 상에 인식된다. 참고 문헌 9 에서 수정 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 4 : 병변 확인시 XPD-DNA 복합체의 입체 구조 변화. XPD에 의해 유도 된 DNA 굴곡 각의 분포는 fluorescein 병변에서 단백질 -DNA 복합체의 구조 변화를 나타낸다. 이러한 conformational rearrangements는 ATP (B) 또는 ATPS (C)의 존재에 의존했다. ( A ) ATP가없는 경우, 병변 부위의 비 특정 굴곡 각 (회색)과 굴곡 각 (특정 굴곡 각, 검정색)은 ~ 50 °의 중심을 갖는 가우스 곡선과 유사하고 적합합니다. ( B , C ) ATP 또는 ATPS의 존재 하에서, 특정 굴곡 각 분포 (흑색)는 ~ 65 °의 평균 굴곡 각으로 유의 한 변화 (P = 2.5 x 10 -7 )를 나타낸다. 병변 부위에서 구부러진이 DNA는 병변 유형 (CPD 또는 fluorescein 부가 물) 또는 DNA 버블의 존재 또는 부재와는 무관합니다. 그림은 참고 문헌 5 에서 재현되었습니다. (C)의 삽 입은 굴곡 각 (180 ° -β)이 어떻게 결정되었는지를 보여줍니다.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 번호 순서 기술 1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 바닥 2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC F / 5 '버블 삼 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC F / 3 '버블 4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC CPD / 5 기포 5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC CPD / 3 '버블 6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC F / 버블
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Discussion
특정 표적 부위를 포함하는 긴 DNA 단편에 대한 단백질의 결합 위치에 대한 AFM 통계 분석은 단백질이 이들 부위 2 , 3 , 4 , 5 , 6 을 인식하기 위해 사용하는 특정 전략에 대한 흥미로운 세부 사항을 나타낼 수있다. 결과적인 위치 분포를 해석하기 위해, DNA 내 표적의 위치를 정확히 알아야한다. 이것은 원형 플라스미드 DNA에 잘 정의 된 서열 위치의 특정 부위를 도입하고 제한 효소 기술을 사용하여이 특정 부위를 포함하는 DNA의 단편을 절단함으로써 달성된다. 단백질 결합 위치의 AFM 이미지 분석에서 정확한 길이를 가진 DNA 단편 (절단 된 단편의 전체 길이와 일치 함) 만 포함될 수 있습니다. 왜냐하면 이들만이 대상 위치의 위치가 알려져 있기 때문입니다. 가치가 없다.여기에 설명 된 준비 절차로 인해 두 개의 구별 할 수없는 조각 단이있는 선형 DNA 기질이 생성됩니다. 따라서 위치 분포는 0 x DNA 길이 (DNA 단편 말단에서 결합 된 단백질)에서 0.5 x DNA 길이 (단편의 중심에서 결합 된 단백질)까지 측정 및 계획 할 수 있습니다. 또한, 기질의 중심에 정확히 위치하지 않는 표적 위치의 경우, 이들 분포는 항상 다른 DNA 말단으로부터 동일한 거리에 비특이적으로 결합 된 단백질의 작은 배경을 포함한다. 그러나 가우시안 곡선을 평균 배경 높이에 달린 분포에 맞추는 것은 (비특이적으로 결합 된 단백질, 그림 3 ) 이러한 복합체를 설명합니다. 또는, DNA 말단 중 하나를 표지 할 수 있습니다 (예 : ssDNA 돌출부를 형성하는 2 차 구조의 작은 부피의 피크 24) . 이러한 위치 분석의 일반적인 해상도 제한은 대상 si의 100 배 우선 순위 범위입니다비 특정 사이트 바인딩 이상. 또한, DNA 단편 말단은 비특이적 dsDNA 부위를 구성하는 것이 아니라 dsDNA 단절을 대표한다. DNA 수리 단백질은 종종 내부적으로 도입 된 특정 표적 부위 이외에 불안정한 조각 단편에도 결합합니다. DNA 말단 결합은 AFM 분석에 의해 밝혀 질 수 있으며 단백질의 기능에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. DNA 최종 바인딩이 관심의 대상이 아니라면,이 위치는> 0 위치 ( 예 : 0.02 DNA 길이)에서 플롯을 시작하여 위치 분포에서 쉽게 생략 할 수 있습니다.
단일 분자 기술의 특별한 이점, 사실상 정의되고 공통된 성질 중 하나는 샘플에 존재하는 개별적인 다른 상태의 분해능이며 이는 매우 다른 성질과 활동을 가질 수 있습니다. 관심있는 특정 종의 시료가 드문 경우라도 이러한 접근법은앙상블 측정에서 그 비중이 왜소 해지는이 종에 초점을 맞춘다. 예를 들어, 단백질 샘플의 경우, AFM 이미징은 개별 단백질의 크기가 충분히 다른 경우 (복잡한 분해능 한계는 약 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . AFM 시스템은 측정 된 부피를 단백질 분자량 (Protocol 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 로 변환 할 수 있도록 보정 할 수 있습니다. 또는 알려진 크기의 단백질 표준이 이미지 1 , 6 의 직접 참조로 사용되었습니다. 에서따라서 여기에 초점을 맞춘 DNA에서의 결합 위치는 헬리 카아 제 불활성 단량체 XPD와 헬리 케이즈 활성 이종이 량체 XPD / p44 복합체에 대해 개별적으로 결정될 수있다. DNA의 잘 정의 된 위치에서 병변 부위에 우선적으로 결합하면 단백질 복합체에 의한 DNA 병변 인식이 나타났다. 단백질 로딩 및 병변 부위가 공간적으로 분리 되었기 때문에, 여기에 사용 된 DNA 기질의 병변 인식을 위해 DNA 전좌가 필요했다. 헤테로 다이머의 XPD / p44 복합체 만 헬리 카아 제 활성 분석 결과와 일치하여 DNA 전이가 가능했다 ( 그림 3 ) 9 . 따라서 AFM 부피 분석은 서로 다른 단백질 복합체 형태의 상이한 활동에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다.
헬리 케이즈 활성 XPD / p44 복합체에 의한 병변 상호 작용 및 인식은 헬리 케이즈 전좌의 정지로 인해 표적 부위에서 강화 된 결합을 초래 하였다 ( 도 3 도 3의 개략도 참조)의 5 '에서 3'방향성 때문에,이 발견은 효소가 전좌 된 가닥에서 우선적으로 플루오 레세 인을 검출하지만, 반대의 비 전좌 된 가닥에서 우선적으로 CPD를 검출한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 원핵 생물 NER helicase UvrB는 병변, 즉 전좌 된 가닥에서 5 '로딩시에 플루오 레세 인 및 CPD 병변 모두를 우선적으로 인식 하였다 ( 도 3 ). 그들의 병변 인식 특성에서의 이러한 특징적인 차이점은 두 개의 헬리 케이즈의 상이한 구조적 특성으로부터 이해 될 수있다. UvrB는 잠재적 인 목표와 상호 작용합니다.n translocated strand가 나사산이있는 효소에서 β-hairpin 특징의 안쪽에있는 아미노산 잔기 를 통한 DNA 16 , 25 . 반면에 XPD는 FeS (iron-sulfur) 클러스터에 근접한 작은 기공을 가지고있다. 형질 전환 된 DNA 가닥은이 기공 (26) 을 통과 할 가능성이 있습니다. Fluorescein과 같은 불규칙한 병변은이 기공 내의 잔류 물과의 상호 작용 을 통한 헬리 카아 제 전좌 (helicase translocation )를 멈출 수 있지만, 덜 부피가 큰 CPD 병변은 FeS 클러스터와의 상호 작용을 통해 보다 쉽게 확인 될 수 있습니다. 원핵 시스템에서 UvrB의 두 분자는 두 개의 UvrB 단량체 각각이 다른 DNA 가닥을 조사 할 수있는 헤테로 4 량체 UvrA 2 -UvrB 2 복합체에서 표적 부위 탐색에 관여한다고 여겨진다. 진핵 세포 NER의 XPD는TFIIH 병변 인식 복합체. 따라서 NER 수리 시스템의 매우 큰 표적 부위 스펙트럼을 인식 할 수 있도록하기 위해서는 진핵 생물 효소의 병변 상호 작용 접근법의 유연성이 요구 될 수 있습니다.
DNA상의 위치에 따라 AFM 이미지에서 특정 (표적 사이트 결합) 및 비 특이성 복합체를 구별 할 수 있기 때문에 이러한 복잡한 유형을 개별적으로 분석하고 비교할 수 있습니다. 단일 분자 AFM은 종종 일시적이거나 가변적 인 특성으로 인해 DNA에 비특이적으로 결합 된 단백질 복합체의 구조적 특성에 대한 접근을 제공하는 매우 소수의 접근법 중 하나입니다. 여기, 효소에 의해 DNA에 도입 된 굽힘을 기반으로 archaeal XPD에서 표적 인식에 대한 구조 변화가 시각화되고 특성화되었습니다. AFM 데이터는 비특이적 인 DNA에 결합 된 XPD 대 병변 부위에 결합 된 XPD에 대한 DNA 굽힘 각도의 작지만 명확하고 중요한 변화를 나타냈다 5 . 입체 구조표적 부위 확인시 DNA 결합 단백질의 변화는 병변을 포함하는 짧은 스트레치의 ssDNA의 절제를 수행하는 NER 엔도 뉴 클레아 제 (XPER 및 XPF 및 진핵 생물 NER)의 모집을 유발할 수있다. 흥미롭게도, 이러한 변화와 구조적 재 배열은 ATP가 효소에 결합하는 것을 요구했다 (그러나 가수 분해는 아님). 원주민 NER 28,29에서 UvrB에 대한 목표 부위 확인 및 UvrC 엔도 뉴 클레아 제의 후속 모집에 대한 ATP- 리 바인딩의 유사한 접근법이보고되었다.
요약하면, AFM 단일 분자 이미징은 원핵 및 진핵 NER 헬리 카아 제에 의한 표적 부위 인식에 미묘한 차이를 나타냈다. 일단 표적 병변이 효소에 의해 동정되면, 병변에서 선택적으로 ATP 결합 유도 된 구조적 재 배열 을 통해 NER 엔도 뉴 클레아 제 를 모집하는 유사한 전략을 공유한다. com의 AFM 기술조사 된 시스템의 필수 특성을 모방하기위한 신중한 DNA 기질 디자인의 결합은 DNA 수리뿐만 아니라 일반적으로 DNA 결합 단백질 시스템의 표적 부위 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 낮은 나노 미터 범위 (AFM 프로브에 의해 제한된 분자 수준)의 분해능을 가진 특정 및 비특이적 복합체에 대한 구조 정보는 관련된 메커니즘의 이해에 크게 기여할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
PUC19N, CPD- 함유 올리고 뉴클레오타이드 및 p44는 Samuel Wilson, Korbinian Heil 및 Thomas Carell, Gudrun Michels 및 Caroline Kisker에 의해 각각 제공되었다. 이 연구는 도이체 Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 및 TE-671 / 4에서 IT 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 mL block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
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